DE69012377T2

DE69012377T2 - Polypeptid und dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE69012377T2
Application number: DE69012377T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Kaisho; Kazuo Nakahama; Reiko Sasada; Koji Yoshimura
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2010-03-09
Also published as: HK34896A; EP0386752B1; KR900014428A; JPH0780904B2; ES2059854T3; CA2011833A1; KR0132425B1; IE900785L; DE69012377D1; ATE111521T1; EP0386752A1; IE65361B1; JPH03204897A; US6709837B1; DK0386752T3; CA2011833C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Polypeptid, eine dafür kodierende DNA-Sequenz und die Verwendung desselben.
Viele Zellwachstumsfaktoren sind seit der Entdeckung des Epidermis-Wachstumsfaktors (nachstehend als EGF bezeichnet) und Nerven-Wachstumsfaktors (nachstehend als NGF bezeichnet) isoliert worden und ihre Strukturen sind aufgeklärt worden.
Zellwachstumsfaktoren sind zum Aufklären des Mechanismus der Zelldifferenzierung und des Zellvermehrungsmechanisinus nützlich und von einigen von ihnen, einschließlich des Human-EGF, wird erwartet, daß sie als Arzneimittel brauchbar sind. Dementsprechend sind Untersuchungen darüber in den letzten Jahren zunehmend häufiger geworden.
Obschon das Human-NGF-Gen isoliert worden ist, hat es keine Berichte gegeben, welche die Herstellung von Human-NGF in großen Mengen durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken betreffen.
Falls ein neues Polypeptid erhalten wird, welches das Wachstum tierischer Zellen fördert, können dadurch neue Untersuchungen angestellt werden. Derartige neue Polypeptide mit Aktivitäten, die den bekannten Wachstumsfaktoren ähnlich sind, können ebenfalls als Wirkstoffe verwendet werden.
Zum Zweck des Auffindens eines derartigen neuen Peptids, haben die Erfinder eine NGF kodierende DNA-Sequenz als Sonde verwendet und eine damit hybridisierbare DNA-Sequenz aus cDNA-Banken eines menschlichen Glioms hybridisiert. Als Ergebnis waren die Erfinder beim Erhalten einer DNA(cDNA)-Sequenz erfolgreich, die für ein neues Polypeptid kodiert. Die cDNA der vorliegenden Erfindung kann in einer Wirtszelle unter Produzieren des neuen Polypeptids exprimiert werden. Dieses Polypeptid kann weiter als Reagenz für Untersuchungen verwendet werden, die sich auf die Differenzierung, das Wachstum und Überleben tierischer Zellen beziehen. Das Polypeptid kann weiter als Arzneimittel verwendet werden. Die Erfinder haben auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen Information weitere Untersuchungen angestellt und in der Folge davon diese Erfindung abgeschlossen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Polypeptid bereitzustellen, das als Reagenz für Forschungsuntersuchungen oder als Arzneimittel brauchbar ist. Andere Ziele werden aus der folgenden Beschreibung und den angefügten Zeichnungen ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung stellt
(1) ein Polypeptid (I), das die folgende Aminosäuresequenz (II) in einem Molekül desselben einschließt:
(diese Aminosäuresequenz wird nachstehend auch der Kürze wegen als Formel [2] bezeichnet),
(2) eine für das in (1) beschriebene Polypeptid kodierende DNA,
(3) einen die in (2) beschriebene DNA-Sequenz einschließenden Vektor,
(4) eine durch den in (3) beschriebenen Vektor transformierte Transformante und
(5) ein Verfahren zum Herstellen des Polypeptids (I) bereit, welches das Kultivieren der in (4) beschriebenen Transformanten in einem Kulturmedium unter Erzeugen und Anreichern des in (1) beschriebenen Polypeptids in einer Kultur umfaßt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Restriktionsenzymkarte einer DNA, die eine Polypeptid (I)-cDNA in dem in Beispiel 1 erhaltenen Plasmid pUNK5 einschließt.
Fig. 2 zeigt eine Nukleotidsequenz der DNA, die eine Polypeptid (I)-cDNA in dein in Beispiel 1 erhaltenen Plasmid pUNK5 einschließt, und eine davon translatierte Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz (obere Reihe) des in Beispiel 1 erhaltenen Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung mit einer Aminosäuresequenz (untere Reihe) von Human- β-NGF.
Fig. 4 ist eine Restriktionsenzymkarte einer DNA, die eine Polypeptid (I)-cDNA in dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 einschließt.
Fig. 5 zeigt eine Nukleotidsequenz der DNA, die eine Polypeptid (I)-cDNA in dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 und eine davon translatierte Aminosäuresequenz einschließt,
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 3 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pENGFT102 für Escherichia coli zeigt.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung, welche den Aufbau der in Beispiel 5 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektoren pNTK26 und pNTL145 für tierische Zellen zeigt.
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung, welche den Aufbau des in Beispiel 6 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pNTS101 für tierische Zellen zeigt.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung, welche den Aufbau des in Beispiel 8 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pANT341T für Hefe zeigt.
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die den Einfluß jeder Probe auf das Überleben in Beispiel 12 erhaltener Sinnesnervenzellen des Hühnerembryos zeigt und
Fig. 11 zeigt eine Nukleotidsequenz eines in Beispiel 13 erhaltenen Ratten-Polypeptid (I)-Gens und eine davon translatierte Aminosäuresequenz.
Fig. 12 ist eine schematische Darstellung, welche den Aufbau des in Beispiel 15 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pTB1139 zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung schließt ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel [II] und ein Polypeptid ein, das weiter einen an den C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [II] angefügten Threoninrest besitzt. Weiter schließt das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid mit mehreren, an den N-Terininus und/oder C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [II] angefügten Aminosäureresten ein. Außer den vorstehend beschriebenen Polypeptiden, schließt das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung Teile der vorstehenden Polypeptide ein, welche dieselbe Aktivität besitzen wie die vorstehenden Polypeptide, und Polypeptide, in denen Teile der vorstehenden Aminosäuresequenzen durch eine oder mehrere unterschiedliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen ersetzt sind, oder bei denen eine oder mehrere unterschiedliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen an oder in die vorstehenden Aininosäuresequenzen angefügt oder eingefügt sind, und welche dieselbe Aktivität wie die vorstehenden Polypeptide besitzen.
Das Polypeptid (I) mit der folgenden Aminosäuresequenz (II'), in der Thr an den C-Terminus der Aminosäuresequenz (II) angefügt ist, wurde in den nachstehend angeführten Beispielen durch E. coli-Transformanten produziert.
Das Polypeptid (I) mit der Aminosäuresequenz (II) oder (II') kann auch mittels Tierzellen-Transformanten exprimiert werden.
Wenn das Polypeptid (I) mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wird, kann ein Methioninrest, der dem Start-Kodon ATG stromaufwärts von einem für das Polypeptid (I) kodierenden Gen entspricht, an den N-Terminus des Polypeptids (I) angefügt werden.
Die für das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung kodierende DNA kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren erhalten werden:
(1) Boten-RNA (mRNA) wird aus Polypeptid (I)-produzierenden Zellen isoliert.
(2) Einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) wird aus der mRNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese doppelsträngiger DNA.
(3) Die komplementäre DNA wird in ein Plasmid oder einen Phagen eingeführt.
(4) Eine Wirtszelle wird mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert.
(5) Nach Kultivieren der auf diese Weise erhaltenen Transformanten, wird das Plasmid oder der Phage, welche die gewünschte DNA enthalten, durch ein geeignetes Verfahren, wie etwa Plaque- Hybridisierung oder Kolonie-Hybridisierung, aus den Transformanten isoliert.
(6) Die gewünschte klonierte DNA-Sequenz wird aus dem Plasmid oder Phagen herausgeschnitten.
(7) Die klonierte DNA wird in ein geeignetes Plasinid subkloniert.
Die für das Polypeptid (I) kodierende mRNA kann durch Polypeptid (I)-produzierende Zellen, zum Beispiel Zellen, Gewebe und Organe von Tieren wie etwa Mensch und Ratte, insbesondere durch menschliche Gliome, menschliche Gliazellen, menschliche Plazenta, Rattengliomen, Nieren, Lebern, Herzen, Gehirne, Milzen, Thymi, Lungen und Speicheldrüsen, erhalten werden.
Geeignete Verfahren zum Herstellen der mRNA aus den Polypeptid (I)-produzierenden Zellen schließen das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)] und dergleichen ein.
Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Matrize wird cDNA durch Verwenden von reverser Transkriptase, zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1979); ibid. 3, 280 (1983)] oder dem Verfahren von U. Gubler und B. J. Hoffman [Gene 25, 263 (1983)], synthetisiert. Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird zum Herstellen von Human-cDNA-Banken in das Plasmid eingeführt.
Die Plasmide, in welche die cDNA eingeführt werden kann, schließen zum Beispiel pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 (Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)], pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], pUC18 [Gene 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene 33, 103 (1985)], pUC118 [Methods in Enzymology 153, 3 (1987)], puC119 [Methods in Enzymology 153, (1987)] ein. Es kann jedoch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es vermehrbar und in der Wirtszelle zu erhalten ist. Die Phagenvektoren, in welche die cDNA eingeführt werden kann, schließen zum Beispiel λgtll [R. Young und R. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1194 (1983)] ein. Es ist jedoch jeder andere Phagenvektor geeignet, falls er in der Wirtszelle gezüchtet werden kann.
Die Verfahren zum Inserieren der cDNA in das Plasmid schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren ein. Die Verfahren zum Inserieren der cDNA in den Phagenvektor schließen zum Beispiel das Verfahren von T. V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1, 49 (1985)] ein. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid oder der Phagenvektor wird in geeignete Zellen wie etwa E. coli eingeführt.
Beispiele der vorstehend beschriebenen E. coli schließen E. coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], JM103 [Nucl. Acids Res. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)] ein.
Geeignete Verfahren zur Transformation der Wirtszelle mit den Plasmiden schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschriebene Calciumchloridverfahren oder das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren ein. Weiter können Phagenvektoren zum Beispiel mittels des in Vitro-Verpackungsverfahrens in vermehrte E. coli übertragen werden.
Die die Polypeptid (I)-cDNA enthaltenden cDNA-Banken können durch die vorstehend angeführten Verfahren erhalten werden. Sie sind jedoch auch als Handelsprodukte erhältlich. Zum Beispiel sind eine von Human-Glioma stammende cDNA-Bank und von einer menschlichen Plazenta stammende cDNA-Bank von Clontech Laboratories, Inc., U.S.A., erhältlich. Beispiele geeigneter Verfahren zum Klonieren von Polypeptid (I)-cDNA aus der cDNA-Bank schließen das Plaque-Hybridisierungsverfahren mittels einer markierten Sonde oder das Kolonie-Hybridisierungsverfahren [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] ein. Jede DNA kann bei der vorstehenden Hybridisierung als eine als Sonde verwendete DNA eingesetzt werden, so lang sie mit den für das Polypeptid (I) kodierenden DNA hybridisierbar ist. Eine derartige DNA schließt zum Beispiel eine für den gesamten oder einen Teil des NGF kodierende cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA und auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von NGF chemisch synthetisierte DNA ein. Beispiele der vorstehend angeführten NGF schließen Maus-NGF [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68, 2417 (1971), Nature 302, 538 (1983)], Human-NGF [Nature 303, 821 (1983)] und NGF anderer Tiere ein.
Die auf diese Weise klonierte Polypeptid (I)-cDNA kann zum Exprimieren der Polypeptid (I)-cDNA nötigenfalls zum Beispiel in pBR322, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 subkloniert werden.
Die Nukleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen DNA wird zum Beispiel durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977)] oder das Dideoxyverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] unter Bestätigen des Vorliegens der Polypeptid (I)- cDNA bestimmt. Falls nicht die gesamte, für das Polypeptid (I) kodierende Region erfaßt wird, kann als Folge die cDNA erneut durch Plaque-Hybridisierung mittels dieses DNA-Fragments als Sonde oder Kolonie-Hybridisierung kloniert werden, um eine nicht erfaßte Region zu erhalten.
Die für das Polypeptid (I) kodierende DNA kann wie vorstehend beschrieben erhalten werden.
Außer den vorstehenden Verfahren kann die DNA einschließlich des für das Polypeptid (I) der vorstehenden Erfindung kodierenden DNA-Segments auch durch Klonieren aus Banken genomischer DNA des Menschen, der Ratte, Maus und dergleichen erhalten werden.
Weiter kann die für das Polypeptid (I) kodierende DNA durch chemische Synthese auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von Polypeptid (I) erhalten werden, welche aus der Nukleotidsequenz der DNA aus der Nukleotidsequenz der auf diese Weise klonierten DNA aufgeklärt wurde.
Jede DNA kann als DNA verwendet werden, die für das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung kodiert, solange sie für das Polypeptid (I) kodiert. Anschauliche Beispiele schließen eine DNA ein, die durch die Nukleotidsequenz der folgenden Formel [III] dargestellt wird, und eine DNA, in der weiter ACA an den 3'-Terminus der Nukleotidsequenz der folgenden Formel [III] angefügt ist:
(diese Nukleotidsequenz wird nachstehend der Kürze wegen auch als Formel [III] bezeichnet).
In einigen Fällen können Teile der diese DNA darstellenden Nukleotidsequenz entfernt oder ersetzt sein. Weiter können bei dieser DNA eine oder mehrere zusätzliche Basen angefügt oder eingefügt sein. Es ist bevorzugt, daß die Entfernung, der Ersatz oder das Anfügen von Basen durch eine Kodoneinheit ausgeführt wird, die der Expression der entsprechenden Aminosäure oder -säuren entspricht.
Die auf diese Weise erhaltene, für das Polypeptid (I) kodierende DNA kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung verwendet werden, wie sie ist, oder gewünschtenfalls mit einem Restriktionsenzym ausgeschnitten werden.
Geeignete Verfahren zum Erhalten des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung schließen (1) das Isolieren des Polypeptids (I) aus dem Organismus von Tieren einschließlich des Menschen, (2) Herstellen des Polypeptids (I) durch Peptidsynthese und (3) Herstellen des Polypeptids (I) durch Anwenden einer Genrekombination ein. Das dritte Verfahren wird industriell bevorzugt.
Beispiele von Expressionssystemen (Wirt-Vektor-Systeme) zum Herstellen des Polypeptids (I) mittels rekombinanter DNA-Techniken schließen Expressionssysteme von Bakterien, Actinomyceten Hefe, Schimineln, Insektenzellen und tierische Zellen ein.
Geeignete Expressionsverfahren schließen (a) das Herstellen und Anreichern von Genprodukten in Zellen, (b) Ausscheiden von Genprodukten aus Zellen und ihr Anreichern in Kulturmedium und (c) Ausscheiden von Genprodukten in Periplasmen ein.
Um das Polypeptid (I) in den vorstehenden Verfahren (b) und (c) auszuscheiden, können eine für ein Signalpeptid kodierende DNA oder eine für ein Signalpeptid und ein Propeptid (prepro) kodierende DNA an den 5'-Terminus der für das Polypeptid (I) kodierenden DNA ligiert werden. Jedes Peptid kann als das vorstehend angeführte Signalpeptid verwendet werden, solange es die Ausscheidung des Polypeptids (I) induzieren kann. Beispiele derartiger Signalpeptide schließen die Signalpeptide von E. coli- Enterotoxin und dessen Mutanten, Signalpeptide aus neutraler Bacillus amyloliquefaciens-Protease und α-Amylase, Signalpeptide aus mittleren Wandproteinen von Bacillus brevis, Signalpeptide von Saccharomyces cerevisiae-Invertase, Phosphatase, α-Faktor und Killer-Faktor, ein Signalpeptid aus Aspergillus awamori- Glucoamylase, ein Signalpeptid des Polypeptids (I), ein Signalpeptid des Eiweißlysozyms und seiner Mutanten, ein Signalpeptid von Human-Interleukin-2 und Signalpeptide von Human-, Maus-, Ratten-, Hühner- und Rinder-NGF ein. Beispiele geeigneter Propeptide schließen Propeptide des S. cerevisiae-α-Faktors und Killer-Faktors, ein Propeptid von A. awamori-Glucoamylase, ein Propeptid des Polypeptids (I) und Propeptide von Human-Endothelin, Human-, Maus-, Ratten-, Hühner- und Rinder-NGF ein.
Außer den vorstehenden Verfahren kann das Polypeptid (I) auch durch Herstellen eines verschmolzenen Peptids aus dem Polypeptid (I) und einem weiteren Protein und anschließend sein Spalten mit einer geeigneten Protease erhalten werden.
Ein Startkodon kann an den 5'-Terminus der vorstehenden DNA angefügt werden, welche das für das Polypeptid (I) kodierende DNA-Segment enthält, das für das Polypeptid (I) kodiert, wie etwa die das Polypeptid (I) kodierende DNA, die für das Signalpeptid und das Polypeptid (I) kodierende DNA oder die für das Signalpeptid, das Propeptid und das Polypeptid (I) kodierende DNA, und ein Terminierungskodon kann stromabwärts davon angefügt werden. Die sich daraus ergebende DNA kann stromabwärts von einem Promotor in einem Vektor inseriert werden, wodurch ein Polypeptid (I)-Expressionsvektor aufgebaut wird.
Als zur Expression des Polypeptids (I) verwendeter Vektor kann jeder Vektor verwendet werden, solange er in den ausgewählten Wirtszellen wirksam ist. Beispiele von E. coli-Expressionsvektoren schließen pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, pUC18, puC19, pUC118, pUC119 und Derivate derselben ein. Beispiele der Bacillus subtilis-Expressionsvektoren schließen pUB110, pC194, pE194, pTB5 und Derivate derselben ein und Beispiele von B. brevis- Expressionsvektoren schließen pUB110, pHY481, pC194, pHY500, pNU200 und Derivate derselben ein. Beispiele von S. cerevisiae- Expressionsvektoren schließen pSH19, pSH15 und Derivate derselben ein und Beispiele von Schizosaccharomyces pombe-Expressionsvektoren schließen pDB248, pPA-4 und Derivate derselben ein. Beispiele von Tierzellen-Expressionsvektoren schließen Retrovirusvektoren, Vaccinia-Virusvektoren, Rinderpapilloma-Viren und Vektoren der SV-40-Reihe (wie etwa pKSV-10, pSV2-dhfr und pTB389) ein.
Jeder Promotor ist geeignet, solange er in den ausgewahlten Wirtszellen wirksam ist.
Wenn zum Beispiel E. coli-Vektoren verwendet werden, schließen geeignete Promotoren den trp-Promotor, den lac-Promotor, den tac-Promotor, den λPL-Promotor, den recA-Promotor und den T7- Promotor ein. Wenn B. subtilis-Vektoren verwendet werden, schließen Beispiele geeigneter Promotoren den SPO1-Promotor, den P1-Promotor und den Promotor des neutralen Proteasegens ein. Wenn B. brevis-Vektoren verwendet werden, schließen Beispiele geeigneter Promotoren den Promotor des extrazellulären Hauptproteingens und den SPO1-Promotor ein. Wenn S. cerevisiae-Vektoren verwendet werden, schließen Beispiele geeigneter Promotoren den GLD-Promotor, den PHO5-Promotor, den GAL10-Proinotor, den GAL1- Promotor, den PGK-Promotor und den α-Faktor-Promotor ein. Wenn S. pombe-Vektoren verwendet werden, schließen Beispiele geeigneter Promotoren den GLD-Promotor und einen SV40-Promotor ein. Wenn Tierzellen-Vektoren verwendet werden, schließen Beispiele geeigneter Promotoren einen SV40-Promotor, den LTR-Promotor und den Metallothionein-Promotor ein.
Um die Expressionswirksamkeit zu erhöhen ist es bevorzugt, bei Hefen einen Terminator (wie etwa ein PGK-Terminator) stromabwärts von der für das Polypeptid (I) kodierenden DNA zu verwenden, und es ist bevorzugt, in einer tierischen Zelle einen Verstärker, ein RNA-Spleißsignal, ein Poly-A-Additionssignal oder einen selektierten Marker zu verwenden.
Verfahren zum Aufbauen des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung sind an sich bekannt und zum Beispiel in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschrieben.
Unter Verwenden des auf diese Weise hergestellten Polypeptid (I)-Expressionsvektors kann die Wirtszelle transformiert werden.
Geeignete Wirtszellen schließen Bakterien wie etwa E. coli, B. subtilis und B. brevis, Actinomyceten wie etwa Streptomyces lividans, Hefe wie etwa S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris, Schimmel wie etwa Aspergillus orizae, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, und tierische Zellen, wie etwa COS-7-Affenzelle, Vero-Zelle, Eierstockzelle des chinesischen Hamsters (CHO) und Maus-L-Zelle, ein.
Insbesondere schließen geeignete E. coli-Stämme DH1, JM103, JA221, HB101, C600, MV1184 und Mutanten derselben ein. Geeignete B. subtilis-Stämme schließen MI114, lA274 und Mutanten derselben ein. Geeignete B. brevis-Stämme schließen 47, 47-5, HPD31 und Mutanten derselben ein. Geeignete S. cerevisiae-Stämme schließen AH22R&supmin;, NA47-3A &supmin;, TB39 &supmin; und Mutanten derselben ein. Geeignete S. pombe-Stämme schließen ATCC38399, TH168 und Mutanten derselben ein.
Verfahren zur Transformation von Wirtszellen mittels der DNA- Sequenzen der vorliegenden Erfindung, wie etwa das Polypeptid (I)-Expressionsplasmid, sind in der Technik bekannt. E. coli kann zum Beispiel durch das Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972)], transformiert werden. B. subtilis kann zum Beispiel durch das Protoplastenverfahren [Molecular & General Genetics 168, 111 (1979)] oder das Kompetenzverfahren [J. Mol. Biol. 56, 209 (1971)] transformiert werden. B. brevis kann zum Beispiel durch das Verfahren von Takahashi et al. [J. Bacteriol. 156, 1130 (1983)] transformiert werden. S. cerevisiae und S. pombe können zum Beispiel durch das Verfahren von Hinnen [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978)] oder das Lithiumverfahren [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] transformiert werden. Tierische Zellen können zum Beispiel durch das Verfahren von Graham [Virology 52, 456 (1973)] transformiert werden.
Wie vorstehend beschrieben, können die Transformanten, die mit der DNA transformiert wurden, welche das für das Polypeptid (I) kodierende DNA-Segment enthält, gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Wenn Transformanten kultiviert werden, bei welchen die Wirtszellen Bakterien, Actinomyceten, Hefe oder Schimmel sind, ist ein flüssiges Medium als für die Kultur verwendetes Medium geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere, für das Wachstum der Transformante notwendige Nährstoffe sind darin enthalten. Geeignete Kohlenstoffquellen schließen zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein. Geeignete Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung ein. Geeignete anorganische Verbindungen schließen zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein.
Der pH des Mediums beträgt vorzugsweise etwa 5 bis 8.
Wenn der Wirt E. coli ist, ist es bevorzugt, daß das zur Kultivierung verwendete Medium zum Beispiel Glucose und Casaminosäuren enthaltendes M9-Medium ist [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Die Kultivierung wird üblicherweise etwa 3 bis 24 Stunden bei 14 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüftung oder Schütteln ausgeführt.
Wenn der Wirt Bacillus ist, wird die Kultivierung üblicherweise etwa 16 bis 96 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC, nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, schließen Beispiele geeigneter Medien Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4505 (1980)] ein. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird üblicherweise etwa 24 bis 144 Stunden bei etwa 20 bis 35ºC, nötigenfalls unter Belüftung oder Schütteln durchgeführt.
Wenn Tierzellentransformanten kultiviert werden, schließen Beispiele geeigneter Medien MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% fetales Kälberserum enthält [Science 122, 501 (1952)], DMEM- Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [J. Am. Med. Assoc. 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)] ein. Der pH beträgt vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Kultivierung wird üblicherweise etwa 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC, nötigenfalls unter Belüftung oder Schütteln durchgeführt.
Das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung kann innerhalb oder außerhalb der Zellen produziert und angereichert werden.
Wenn das intrazelluläre Polypeptid (I) aus den kultivierten Zellen extrahiert wird, werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die ein Proteindenaturierungsmittel, wie etwa Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein oberflächenaktives Mittel wie etwa Triton X-100 enthält, gefolgt vom Zentrifugieren unter Erhalten eines das Polypeptid (I) enthaltenden Überstandes. Wahlweise können die gesammelten Zellen durch Ultraschallbehandlung, Behandlung mit einem Enzym wie etwa Lysozym oder Einfrieren-Auftauen, gefolgt vom Zentrifugieren unter Erhalten eines das Polypeptid (I) enthaltenden Überstandes aufgebrochen werden.
Die Reinigung des Polypeptids (I), das in dem Kulturüberstand enthalten ist oder in den Zellen produziert und angereichert ist, kann durch eine geeignete Kombination bekannter Reinigungsverfahren ausgeführt werden. Diese bekannten Reinigungsverfahren schließen Verfahren ein, welche einen Unterschied in der Löslichkeit ausnützen, wie etwa Salzfällung und Lösungsmittelfällung; Verfahren, die hauptsächlich einen Unterschied im Molekulargewicht ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelpermeationschromatographie und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; Verfahren, die einen Unterschied in der elektrischen Ladung ausnützen, wie etwa Ionenaustausch-Säulenchromatographie; Verfahren, die eine spezielle Affinität ausnützen, wie etwa Affinitätschromatographie; Verfahren, die einen Unterschied in der Hydrophobie ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren, die einen Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützen, wie etwa isoelektrofokussierende Elektrophorese.
Falls das auf diese Weise erhaltene Polypeptid (I) eine Aktivität besitzt, kann es verwendet werden, wie es ist. Falls es keine Aktivität zeigt, kann es nach der Aktivierung durch ein enzymatisches oder nicht-enzymatisches Verfahren verwendet werden.
Die Aktivität des Polypeptids (T) der vorliegenden Erfindung kann durch Enzymimmuntests, Radioimmuntests oder dergleichen bestimmt werden.
Das Polypeptid (I) besitzt die Funktionen des Förderns der Differenzierung und des Wachstums der tierischen Zellen, des Förderns des Überlebens der tierischen Zellen, Verstärkens der Genexpression und des Induzierens der Produktion von Proteinen und Enzymen. Auf diese Weise kann die Aktivität des Polypeptids (I) bestimmt werden, indem diese Funktionen als Anzeige verwendet werden. Wegen seiner Homologie zu NGF kann das Polypeptid (I) zu denen von NGF ähnliche Aktivitäten und Funktionen besitzen. Veranschaulichende Beispiele derartiger Aktivitäten und Funktionen schließen das Fördern des Neuritenauswachsens in PC12-Zellen [L. A. Greene, Brain Research 133, 350 (1977); R. Heumann et al., Experimental Cell Research 145, 179 (1983)] und die fördernde Funktion des Überlebens der Hühnerembryo Sinnesganglien (Dorsalwurzelganglion) [A. M. Davies & R. M. Lindsay, Development Biology 111, 62 (1985)] ein.
Das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung ist als Reagenz für Untersuchungen nützlich, die sich auf die Differenzierung, das Wachstum und Überleben tierischer Zellen beziehen. Wenn das Polypeptid (I) zu diesen Untersuchungen verwendet wird, ist es bevorzugt, das Polypeptid (I) einem Kulturmedium für tierische Zellen zuzusetzen, um eine Endkonzentration von etwa 0,1 bis 1000 ng/ml, bevorzugter etwa 1 bis 100 ng/ml, zu ergeben. Die tierischen Zellen können in dem Kulturmedium kultiviert werden, welches das Polypeptid (T) enthält, und dadurch kann der Grad der Differenzierung, des Wachstums und Überlebens der tierischen Zellen bestimmt werden.
Das Polypeptid (I) kann auch bei der Reparatur geschädigter Gewebe und Organe wirksam sein und deshalb kann das Polypeptid (I) als Arzneimittel nützlich sein.
Weiterhin kann die für das Polypeptid (I) kodierende DNA als Sonde zum Nachweis und der Bestimmung von Polypeptid (I)-mRNA und zum Klonieren von NGF-Genen verwendet werden.
Wenn die das Polypeptid (I) kodierende DNA als Sonde verwendet wird, werden zum Beispiel 0,5 ug für das Polypeptid (I) kodierende DNA (etwa 300 bp) mit [α-³²P]dCTP ( > 400 Ci/mMol) (Amersham, UK) durch Verwenden eines von Amersham gelieferten Kits für die Nick-Translation (etwa 10&sup7; cpm) markiert. Zum Klonieren durch Plaque-Hybridisierung wird die Hybridisierung mittels 0,005 ug (10&sup5; cpm) der vorstehenden markierten Sonde je Filter ausgeführt.
Wenn Basen, Aminosäuren und so weiter durch die Abkürzungen in dieser Beschreibung und den Zeichnungen bezeichnet werden, werden die von der TUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur übernommenen Abkürzungen oder in der Technik gemeinhin verwendeten eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn im Hinblick auf eine Aminosäure optischen Isomeren existieren können, wird solange nicht anders angegeben die L-Form dargestellt.
DNA : Deoxyribonukleinsäure
A : Adenin
C : Cytosin
G : Guanin
T : Thymin
Ala : Alanin
Arg : Arginin
Asn : Asparagin
Asp : Asparaginsäure
Cys : Cystein
Gln : Glutamin
Glu : Glutaminsäure
Gly : Glycin
His : Histidin
Ile : Isoleucin
Leu : Leucin
Lys : Lysin
Met : Methionin
Phe : Phenylalanin
Pro : Prolin
Ser : Serin
Thr : Threonin
Trp : Tryptophan
Tyr : Tyrosin
Val : Valin
Boc : t-Butyloxycarbonyl
MeBzl: p-Methylbenzyl
Bzl : Benzyl
-P : Polystyrolharz für die Peptid-Feststoffsynthese
PAM : p-Oxymethylphenylacetamidomethylharz
AcOH : Essigsäure
OBzl : Benzylester
Tos : Tosyl
Br-z : 2-Brombenzyloxycarbonyl
Cl-z : 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Die im nachstehend beschriebenen Referenzbeispiel 1 erhaltenen Mikroorganismen und die in den nachstehend beschriebenen Beispielen erhaltenen Transformanten wurden beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), und weiter beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI) unter dem Budapester Vertrag hinterlegt. Ihre Zugangsnummern und Hinterlegungsdaten werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Mikroorganismen Escherichia coli MV1184/pUNK5 (Beispiel 1) Escherichia coli BL21(DE3)/pENGFT102 (Beispiel 4) Escherichia coli DH1/pNTL145 (Beispiel 5) Saccharomyces Februar 1989 Mai 1989 cerevisiae TB39 &supmin; (Referenzbeispiel 1) Saccharomyces cerevisiae TB39 &supmin;/pANT341T (Beispiel 9) Escherichia coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 (Beispiel 10) Escherichia coli DH1/pRNT18 (Beispiel 13) L-H14-1 (Beispiel 15) April 1989 Juli 1989 September 1989 Januar 1990
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit den folgenden Referenzbeispielen und Beispielen im einzelnen beschrieben. Es versteht sich, daß diese Referenzbeispiele und Beispiele nicht dazu ausersehen sind, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.

Referenzbeispiel 1 (Herstellung von S. cerevisiae TB39 -)

S. cerevisiae NA74-3A (a, pho9, his4, leu2) (IFO 10430, FERM BP- 1947) (siehe japanische Patentanmeldung (offengelegt) Nr. 63- 283716/1988, welche der EP-A-317 209A entspricht) wurde mit S. cerevisiae DK-13D (α, leu2, trp1, his3) [Molecular and Cellular Biology 4, 77 (1984)] gekreuzt. Einer der sich daraus ergebenden Stämme wurde mit Ethidiumbromid behandelt, um den Stamm S. cerevisiae TB39 &supmin; mit einem Atmungsdefekt (α, MAta, leu2, his3, pho9, &supmin;) (IFO 10467, FERM BP-2399) zu erhalten.

Referenzbeispiel 2 (Herstellung von anti-N-terminales Peptid-Antikörper)

(1) Synthese von H-Tyr-Ala-Glu-His-Lys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Tyr- Ser-Val-Cys-OH

Dieses Peptid wurde durch ein Feststoffsyntheseverfahren mittels eines automatischen Peptidsynthetisierers Modell 430A (Applied Biosystems) synthetisiert. Als Programm wurde "Standard 1" verwendet. Die Synthese wurde im wesentlichen gemäß dem in R. B. Merrifield, Adv. Enzymol. 32, 221-296 (1969) beschriebenen Verfahren ausgeführt. Boc-Cys(MeBzl) PAM-P (0,5 mMol/g) wurde als Harz verwendet und die Synthese wurde vom Carboxyl-Terminus aus sequenziell durchgeführt. Als Boc-Aminosäuren wurden Boc-Val, Boc-Ser(Bzl), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Glu(OBzl), Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-His(Tos), Boc-Lys(Cl-Z) und Boc-Ala verwendet. Ein Peptidharz wurde bis zum Amino-Terminus Tyr synthetisiert und anschließend aus dem Synthetisierer entnommen, gefolgt vom Trocknen.
1 g des Peptidharzes wurden 1,5 ml p-Kresol und 0,5 ml 1,2- Ethandithiol zugesetzt und etwa 8 ml flüssiger Fluorwasserstoff wurden weiter dazugesetzt, gefolgt von 2 Stunden Reaktion bei 0ºC. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck in einem Exsikkator entfernt und mit einer 0,1%igen Lösung von 2-Mercaptoethanol in Diethylether gewaschen, gefolgt vom Waschen mit Diethylether unter Entfernen des Großteils der enthaltenen Reagenzien. Das Peptid wurde mit 10 ml 3%iger Essigsäure extrahiert und das in der extrahierten Lösung enthaltene Harz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Gelpermeationschromatographie mittels einer Sephadex G-25-Säule gereinigt. Die Bedingungen der Gelpermeationschromatographie waren wie folgt:
Säulengröße: 2,8 x 60 cm; Nachweiswellenlänge: 280 nm;
Lösungsmittel: 3%ige Essigsäure; Durchflußgeschwindigkeit: 40 ml/h;
Das Peptid enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalten einer pulverförmigen Probe lyophilisiert. Die sich daraus ergebende pulverförmige Probe wurde weiter durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen gereinigt:
Säule: YMC-Packung, A-324 ODS 10 x 250 mm;
Säulentemperatur: 25ºC;
Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% destilliertes Wasser;
Elutionsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Acetonitril;
Elutionsprogramm: 0 Minuten (90% A + 10% B), 30 Minuten (60% A + 40% B);
Elutionsgeschwindigkeit: 2 ml/Minute;
Nachweiswellenlänge: 230 nm
Bei einer Retentionszeit von 23,0 Minuten wurden unter diesen Bedingungen die Hauptpeakfraktionen gesammelt und durch eine Bio RAD AG1 X 8-Säule (AcOH-Typ, 1,8 x 5 cm) geleitet. Die Waschflüssigkeiten wurden ebenfalls gesammelt. Anschließend wurde Acetonitril durch Destillation entfernt, gefolgt von der Lyophilisierung. Auf diese Weise wurden 56 mg weißes Pulver erhalten. Das sich daraus ergebende Produkt zeigte bei 23,0 Minuten unter denselben Bedingungen wie bei der vorgenannten Hochleisungsflüssigkeitschromatographie einen scharfen Einzelpeak.
Bestimmung der freien SH-Gruppen durch das in G. L. Elman, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 (1959), beschriebene Verfahren: 114%.
Analysenwerte der Aminosäuren: Ser 1,65 (2); Glu 2,13 (2); Gly 1,00 (1); Ala 1,04 (1); ½Cys 0,82 (1); Val 1,03 (1); Tyr 1,97 (2); Lys 0,95 (1); His 1,72 (2); Arg 1,00 (1)
Ausbeute: 74%
½Cys wurde durch das Perameisensäure-Oxidationsverfahren bestimmt. Die Werte in Klammern zeigen die theoretischen Werte.

(2) Herstellung eines Konjugats aus N-terminalem Peptid und Hämocyanin

In 4 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3) wurden 5 mg des in (1) erhaltenen, vorstehend beschriebenen N-terminalen Peptids und 10 mg Hämocyanin gelöst und 400 ul in Eiswasser gekühlter 2,5%iger Glutaraldehyd wurden unter Rühren tropfenweise zugesetzt. Nach 3 Stunden Rühren unter Eiskühlen wurde eine Dialyse gegen destilliertes Wasser durchgeführt, um ein Konjugat aus dem N- terminalen Peptid und Hämocyanin zu erhalten.

(3) Herstellung eines Konjugats aus N-terminalem Peptid und Rinderserumalbumin

3 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) wurden 132 mg Rinderserumalbumin (BSA) (Lösung A) zugesetzt. 200 ul Dimethylformamid wurden 11,2 mg N-(γ-Maleimidbutyloxy)succinimid (GMBS) (Lösung B) zugesetzt. Die Lösung B wurde der Lösung A tropfenweise zugesetzt, während mit einem Rührer gerührt wurde, und das Lösungsgemisch wurde 30 Minuten bei 30ºC umgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsprodukt durch eine Sephadex G-25-Säule (1,5 x 20 cm) mittels 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) - 0,1 M NaCl als Elutionsmittel gereinigt, um Rinderserumalbumin zu erhalten, in das Maleimidgruppen eingeführt waren.
In 0,1 M Phosphatpuffer - 5 mM EDTA wurden 5 mg des vorstehend beschriebenen, in (1) erhaltenen Peptids gelöst und 20 mg Rinderserumalbumin, in das Maleimidgruppen eingeführt waren, wurden dazugesetzt (das Gesamtvolumen beträgt nicht mehr als 5 ml), gefolgt von 60 Minuten Reaktion bei 30ºC. Anschließend wurde PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) dazugesetzt, bis das Gesamtvolumen 12 ml beträgt, und dadurch wurde ein Konjugat des N- terminalen Peptids und Rinderserumalbumin erhalten.

(4) Herstellung von anti-Polypeptid (I)-N-terminales Peptid

Das vorstehend beschriebene, in (2) erhaltene Konjugat aus dem N-terminalen Peptid und Hämocyanin wurde mit Freundschem komplettem Adjuvans gründlich gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde subkutan in die Kaninchen injiziert. Danach wurde in Intervallen von 2 Wochen das vorstehend beschriebene, in (3) erhaltene Konjugat aus dem N-terminalen Peptid und Rinderserumalbumin mit Freundschem komplettem Adjuvans gemischt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde in dieselben Kaninchen injiziert.
Aus den Kaninchen, die wie vorstehend beschrieben immunisiert waren, abgenommenes Blut wurde zentrifugiert, um einen anti- Polypeptid (I)-N-terminales Peptid-Antikörper zu erhalten.

Beispiel 1 (Klonieren von Polypeptid (I) cDNA)

Escherichia coli Y1090 wurde mit den aus menschlichem Gliom stammenden γgt11-cDNA-Banken (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und anschließend wurden etwa 6 x 10&sup5; Phagen auf einer Agarplatte ausgestrichen, die in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschriebenes NZCYM-Medium enthielt, gefolgt von 5 Stunden Kultivierung bei 37ºC. Anschließend wurde eine Nylonmembran auf die Platte gelegt und entfernt, nachdem man sie 1 Minute stehen ließ. Diese Nylonmembran wurde in 0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl, anschließend in 1,5 M NaCl - 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) und weiter in 2 X SSC [siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] getränkt. Nach Lufttrocknen ließ man die Membran 2 Stunden bei 80ºC stehen.
Eine für Human-βNGF [Nature 303, 821 (1983)] kodierende DNA (etwa 0,38 kb) wurde chemisch synthetisiert und mit [α-³²P]dCTP durch Nick-Translation markiert, wodurch eine Sonde hergestellt wurde.
Unter Verwenden einer Nylonmembran und der vorstehend erhaltenen Sonde wurde eine Hybridisierung gemäß dem in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Nylonmembran wurde in einer Hybridisierungslösung, welche die Sonde enthielt, getränkt und 16 Stunden bei 65ºC gehalten. Die Nylonmembran wurde bei Raumtemperatur mit 2 X SSC - 0,1% SDS und anschließend bei 60ºC mit 1 X SSC - 0,1% SDS gewaschen. Danach wurden durch Autoradiographie positive Klone nachgewiesen.
Ein Teil der cDNA wurde mit EcoRI aus dem auf diese Weise erhaltenen Klon βGN1321 herausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC118 (Takara Shuzo) inseriert, um das Plasmid pUNK5 zu erhalten. Unter Verwenden des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pUNK5 wurde E. coli MV1184 (Takara Shuzo) durch das Verfahren von Cohen et al. (zuvor beschrieben) transformiert, um die Transformante E. coli MV1184/pUNK5 (IFO 14832, FERM BP-2304) zu erhalten.
Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte des cDNA-Teils, welcher die in dem Plasmid pUNK5 enthaltene Polypeptid (I)-cDNA einschließt und eine Gesamtlänge von etwa 0,78 kb besitzt.
In Fig. 1 zeigt eine untranslatierte Region, zeigt eine Propeptid-Code-Region und zeigt eine für ein Polypeptid kodierende Region, das weiter einen Threoninrest am C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [II] besitzt.
Die Nukleotidsequenz des vorstehend erhaltenen cDNA-Teils wurde durch das Dideoxyverfahren [Messing et al., Nucl. Acid. Res. 9, 309 (1981)] bestimmt. Fig. 2 zeigt die bestimmte Nukleotidsequenz und die dadurch translatierte Aminosäuresequenz. In Fig. 2 ist die sich von Position -1 zum N-Terminus der Aminosäuresequenz erstreckende Region ein Teil des Propeptids und die Region der Positionen 1 bis 118 oder Positionen 1 bis 119 zeigt das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel [II] und das Polypeptid, das weiter einen Threoninrest am C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [II] besitzt.
Fig. 3 zeigt die durch das vorstehende Verfahren bestimmte Aminosäuresequenz von Polypeptid (I) im Vergleich mit der in Ullrich et al., Nature 303, 821 (1983) beschriebenen Aminosäuresequenz des Human-βNGF. In Fig. 3 zeigt die obere Reihe die Sequenz von 119 Aminosäuren des Polypeptids (I) und die untere Reihe zeigt die Aminosäuresequenz des Human-βNGF. Dieselben Aminosäuresequenzrestteile sind eingerahmt. In der Abbildung zeigt "-" nur eine chemische Bindung.
Wie aus diesem Vergleich offensichtlich ist, besitzt die Sequenz von 119 Aminosäuren des Polypeptids (I) der vorliegenden Erfindung eine Homologie von etwa 60% mit der Aminosäuresequenz des vorstehenden Human-βNGF.
Wenn weiter die Sequenz von 119 Aminosäuren des wie vorstehend beschriebenen Polypeptids (I) mit der bei Angeletti et al., Proceedings of National Academy of Sciences, U.S.A. 68, 2417 (1971), und Scott et al., Nature 302, 538 (1983), gezeigten Aminosäuresequenz des Maus-βNGF verglichen wird, besitzt sie eine Homologie von etwa 60%.
Nach dem vorstehenden Vergleich wird das Polypeptid (I) der vorliegenden Erfindung als ein neues Polypeptid angesehen.

Beispiel 2 (Reklonieren von Polypeptid (I)-cDNA)

Unter Verwenden des EcoRI-AhaIII-Fragments, das die 5'-terminale Seite des Polypeptid (I)-cDNA-Teils enthält, welche in dem in Beispiel 1 erhaltenen pUNK5 enthalten ist, als Sonde wurde eine der aus menschlicher Glioma stammenden cDNA-Banken (Clontech Laboratories, Inc.) auf eine zu der von Beispiel 1 ähnliche Weise kloniert. Ein cDNA-Teil wurde mit EcoRI aus einem der vielen, auf diese Weise erhaltenen positiven Klone, λHNT31 herausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC119 (Takara Shuzo) unter Erhalten von Plasmid pHNT2 inseriert. Fig. 4 zeigt die Restriktionsenzymkarte einer in das Plasmid pHNT2 inserierten Polypeptid (I)-cDNA (etwa 1,1 kb). In Fig. 4 zeigt eine Signalpeptid-Code-Region, zeigt eine Propeptid-Code-Region und zeigt eine für ein Polypeptid kodierende Region, das weiter einen Threoninrest am C-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [II] besitzt.
Die Nukleotidsequenz des vorstehend erhaltenen cDNA-Teils wurde durch das Dideoxyverfahren (zuvor beschrieben) bestimmt. Fig. 5 zeigt die bestimmte Nukleotidsequenz und die dadurch translatierte Aminosäuresequenz. In Fig. 5 bezeichnet "Signal" das Signalpeptid, bezeichnet "Pro" das Propeptid und bezeichnet "reif" das Polypeptid (I).

Beispiel 3 (Aufbau des Polypeptid (I)-Expressionsvektors für Escherichia coli)

Die in das in Beispiel 1 erhaltene Plasmid pUNK5 inserierte Polypeptid (I)-cDNA besitzt eine ScaI-Stelle in der Nähe der Region, die für den II. Tyrosinrest vom N-Terminus des Polypeptids (I) aus kodiert, und eine NsiI-Stelle 50 Basen stromabwärts von einem Terminationskodon des Polypeptids (I) (siehe Fig. 2, 4 und 5). Ein 0,3 kb-ScaI-NsiI-Segment wurde aus dem Plasmid pUNK5 isoliert und die Adaptoren NGFTE-1 (35mer), NGFTE-2 (33mer), NGFTE-3 (7mer) und NGFTE-4 (15mer) wurden mit T4-Ligase daran ligiert, gefolgt von der Behandlung mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI. Auf diese Weise wurde ein 0,3 kb-Ndel- BamHI-Fragment erhalten (siehe Fig. 6).
Die Adaptoren sind wie folgt:
Der Expressionsvektor pET-3C mit einem T7-Promotor [Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)] wurde ähnlich mit NdeI und BamHI gespalten, um ein 4,4 kb-NdeI-BamHI-Fragment zu isolieren.
Das vorstehend erhaltene 4,4 kb-NdeI-BamHI-Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an das 0,3 kb-Ndel-BamHI-Fragment ligiert und anschließend wurde das ligierte Fragment zum Herstellen einer Transformanten in E. coli DH1 inseriert. Ein aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformanten E. coli DH1/pENGFT102 isoliertes Plasmid wurde pENGFT102 genannt (Fig. 6).

Beispiel 4 (Isolierung der Transformanten und Expression)

Unter Verwenden des in Beispiel 3 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pENGFT102 wurde E. coli BL21(DE3) [Gene 56, 125 (1987)] transformiert, um die Transformante E. coli BL21(DE3)/pENGFT102 (IFO 14874, FERM BP-2420) zu erhalten.
Die Transformante E. coli BL21(DE3)/pENGFT102 wurde auf 5 ml LB- Kulturmedium, das 50 ug/ml Ampicillin und 0,2% Glucose enthielt, in einem Reagenzglas 16 Stunden bei 37ºC kultiviert. 1 ml der sich daraus ergebenden Kulturlösung wurde in einen 200 ml-Kolben überführt, der 20 ml desselben Mediums enthielt und bei 37ºC kultiviert. Als der Klett-Wert 170 bis 200 erreichte, wurde IPTG dazugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,4 mM zu ergeben und die Kultivierung wurde 3 Stunden weiter fortgesetzt. Aus 30 ul der sich daraus ergebenden Kulturlösung gesammelte Zellen wurden in einem Probenpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% Mercaptoethanol, 8% Glycerin, 0,025% Bromphenolblau] suspendiert und 5 Minuten erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese auf 16%igen Polyacrylamidgelen, die 0,1% SDS enthielten. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt. Als Ergebnis wurde ein Protein von 15 Kilodalton (kDa), das in E. coli BL21(DE3)/pET-3C, welches durch Transformieren von E. coli BL21(DE3) mittels des vorstehenden Vektors pET-3C erhalten wurde, nicht nachgewiesen wurde, in E. coli BL21(DE3)/pENGFT102 nachgewiesen. Die Menge des erzeugten 15 kDa-Proteins betrug etwa 10% des Gesamtproteins. Dieses Protein wurde auch durch das Western-Blotting-Verfahren mittels eines Kaninchen-anti-Maus-NGF-Antikörpers (Collaborative Research, Inc. U.S.A.) nachgewiesen.

Beispiel 5 (Aufbau des Polypeptid (I)-Expressionsvektors für tierische Zellen)

Ein 1,1 kb-EcoRI-Fragment, das die Polypeptid (I)-cDNA enthielt, wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert. Der Expressionsvektor pTB389 (in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (offengelegt) Nr. 64-2572/1989 beschrieben, welche der EP-A-251 244 entspricht) wurde mit EcoRI auf ähnliche Weise gespalten. Das sich daraus ergebende Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an das vorstehende 1,1 kb-EcoRI-Fragment ligiert, das die Polypeptid (I)-cDNA enthielt, und anschließend wurde das Ligationsgemisch zur Transformierung von E. coli DH1 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 505, (1982)) verwandt. Ein Plasmid wurde aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformanten [E. coli DH1/pNTK26] isoliert und dieses Plasmid wurde pNTK26 genannt.
Ein die Abelson-Maus-Leukämievirus (A-MuLV)-LTR-Region enthaltendes 1,1 kb-ClaI-HindIII-Fragment wurde aus dem Plasmid pTB505 (in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (offengelegt) Nr. 62-175182/1987 beschrieben, welche der EP-A-225 701 entspricht) isoliert. Das Plasmid pNTK26 wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI und HindIII auf ähnliche Weise gespalten und das kleinere Fragment wurde entfernt. Anschließend wurde das sich daraus ergebende Fragment mit T4-DNA-Ligase an das vorstehende, die A-MuLV-LTR-Region enthaltende 1,1 kb-Clal-HindIII- Fragment ligiert und das Ligationsgemisch wurde zur Transformierung von E. coli DH1 unter Ergeben einer ampicillinresistenten Transformanten E. coli DH1/pNTL145 (IFO 14873, FERM BP-2421) verwendet. Das Plasmid pNTL145 wurde aus der auf diese Weise erhaltenen Transformanten (Fig. 7) isoliert.

Beispiel 6 (Aufbau des Polypeptid (I)-Expressionsvektors für tierische Zellen)

Ein 0,83 kb-EcoRI-AhaIII-Fragment, welches die für das Signalpeptid, das Propeptid und das Polypeptid (I) in der Polypeptid (I)-cDNA kodierenden Regionen enthielt, wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert (was den Ort der Ahalll-Stelle betrifft, siehe Fig. 4 und 5). Der 5'-Terminus (EcoRI) des sich daraus ergebenden Fragments wurde mit Klenow- Fragment glatt gemacht und anschließend wurde ein XhoI-Linker pCCTCGAGG mit T4-Ligase an jeden Terminus desselben ligiert, gefolgt von der Behandlung mit XhoI. Auf diese Weise wurde ein 0,86 kb-XhoI-Fragment erhalten.
Der Expressionsvektor pKSV-10 (Pharmacia) für tierische Zellen wurde mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und anschließend wurden beide Enden (XhoI) des sich daraus ergebenden Fragments mit Klenow-Fragment glatt gemacht. Der XhoI-Linker (zuvor beschrieben) wurde dazugesetzt und dieses Fragment wurde mit T4- DNA-Ligase an das vorstehende 0,86 kb-XhoI-Fragment ligiert. Das ligierte Fragment wurde zum Transformieren von E. coli DH1 verwendet. Plasmid pNTS101 wurde aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformanten E. coli DH1/pnTS101 (Fig. 8) isoliert.

Beispiel 7 (Expression von Polypeptid (I)-cDNA in tierische Zellen)

COS-7-Affenzellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Flow Laboratories), das 10% fetales Kälberserum enthielt, in Monoschicht kultiviert, gefolgt vom Austauschen des Mediums gegen dasselbe Medium. Nach 4 Stunden seit dem Austausch wurden Calciumphosphatgele, welche den Expressionsvektor pTB389, 10 ug Polypeptid (I)-Expressionsvektor pNTK26 beziehungsweise den Polypeptid (I)-Expressionsvektor pNTL145 enthielten, gemäß dem bekannten Verfahren [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] hergestellt und Zellen zugefügt, um die Transformanten COS- 7/pTB389, COS-7/pNTK26 beziehungsweise COS-7/pNTL145 zu erhalten. Diese Zellen wurden 4 Stunden in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert und anschließend mit Glycerin behandelt [Gorman et al., Science 221, 551 (1983)], gefolgt von 3 Tagen Kultivierung. Die Kulturen wurden nach der Kultivierung zum Erhalten von Kulturüberständen zentrifugiert. PC12-Zellen wurden in Anwesenheit der entsprechenden Überstände gemäß dem in Brain Research 133, 350 (1977) und Experimental Cell Research 145, 179 (1983) beschriebenen Verfahren kultiviert und die Anteile an Zellen, deren Neuriten mehr als das zweifache des Zelldurchmessers betrugen, wurden berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Vektor Kulturüberstand (ul) Anteil an Zellen mit Neuriten (%)
Unter Verwenden eines durch ein dem vorstehend beschriebenen ähnlichen Verfahrens wurde eine Wirkung auf den Acetylcholin(ACh)-Gehalt kokultivierter septaler und basaler Frontalhirnneuronen [M. Kakihana und M. Suno, Nerve Chemistry 27, 166 (1988)] untersucht.
Septum- und Basalfrontalhirn wurden aus fetalen 17 Tage-Gehirnen präpariert und Nervenzellen wurden daraus gemäß dem Verfahren von Hatanaka et al. [Develop. Brain Res. 30, 47 (1986)] isoliert. Die Zellen wurden auf eine 48 Näpfchen-Platte, die mit 100 ug/ml Poly-L-ornithin vorbehandelt war, in einer Dichte von etwa 1 x 10&sup6; Zellen/cm²/Näpfchen beimpft und 24 Stunden in 500 ul serumfreiem DME/F12/N2-Medium kultiviert. Nach Entfernung durch Saugen wurden 500 ul DME/F12/10% FCS und der Überstand der Probe zugesetzt. Nach 2 Tagen wurde die Kulturlösung gegen 750 ul derselben Kulturlösung ausgetauscht und der Überstand wurde erneut zugesetzt, gefolgt von 2 Tagen Kultivierung. Der Überstand wurde auf zwei Wegen zugesetzt. Und zwar wurden 50 ul Überstand während der ersten beiden Tage und 75 ul desselben während der letzten zwei Tage zugesetzt, um eine Endkonzentration von 10% zu ergeben. Als von Wako Junyaku erworbener Maus- NGF (7S-NGF) verwendet wurde, wurde er mit 0,1% Ovalbumin/PBS verdünnt und 10 ul davon wurden zugesetzt.
Nach 4 Tagen seit der Zugabe des Überstands wurde der Überstand durch Saugen entfernt und 500 ul gekühlte 0,3 N PCA und 20 bis 60 pMol/20 ul EHC (Ethylhomocholin) wurden zur ACh-Messung dazugesetzt. Nach leichtem Rühren wurden 500 ul Lösung in ein Eppendorf-Mikroröhrchen überführt. Die nachfolgenden Arbeitsschritte wurden gemäß früher mitgeteilen Verfahren durchgeführt und die ACh-Menge wurde mittels HPLC/ECD (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie/elektrochemisches Nachweissystem) gemessen. Nach der Extraktion von ACh wurden die Zellen in 500 ul 1N NaOH gelöst und die Proteinmenge wurde bestimmt (Bio-RAD-Proteintest). Ein Dunnettscher t-Test wurde zur statistischen Behandlung verwendet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Versuch Probe Zahl der Näpfchen Acetylcholingehalt (pMol/mg Protein) Maus-NGF ng/ml Maus-NGF 10 ng/ml Überstand (10%) von COS-7/pTB 389 Überstand (10%) von COS-7/pNTL 145 Überstand (10%) von COS-7/pTB389

Beispiel 8 (Aufbau des Polypeptid (I)-Expressionsvektors für Hefe)

Der menschliche Lysozym-Expressionsvektor pGEL125 (durch das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 255 233 beschriebene Verfahren hergestellt) wurde mit HindIII gespalten und das sich daraus ergebende Fragment wurde mit Klenow-Fragment glatt gemacht, gefolgt von der Ligation mit T4-DNA-Ligase unter Erhalten des Plasmids pGEL125H ohne HindIII-Stelle. Anschließend wurde das Plasmid pGEL125H mit XhoI gespalten und das sich daraus ergebende Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an den XhoI-HindIII- Adaptor 5'TCGAGGCCA ligiert, wodurch ein 8,3 kb-HindIII- CCGGTTCGA5'
BamHI-Fragment erhalten wurde. Ein das 1,6 kb-EcoRI-Fragment enthaltendes α-Faktor-Gen wurde aus dem Plasmid p69A [Cell 30, 933 (1982)] isoliert und mit Klenow-Fragment glatt gemacht. Danach wurde das sich daraus ergebende Fragment mit T4-DNA- Ligase an den BamHI-Linker 5'CCGGATCCGG3' ligiert, gefolgt von der Behandlung mit BamHI und HindIII. Das auf diese Weise erhaltene 0,9 kb-BamHI-HindIII-Fragment (das einen Promotor des α- Faktor-Gens und eine für eine prepro-Region kodierende DNA enthielt) wurde mit T4-DNA-Ligase an das vorstehende 8,3 kb-HindIII-BamHI-Fragment ligiert und E. coli DH1 wurde unter Verwenden dieses Reaktionsgemisches transformiert. Ein aus der sich daraus ergebenden ampicillinresistenten Transformanten isoliertes Plasmid wurde pALFA103 (9,2 kb) genannt.
Das den Promotor des α-Faktor-Gens und die für die prepro-Region kodierende DNA-Sequenz enthaltende 0,9 kb-BamHI-HindIII-Fragment wurde isoliert und anschließend in den Phagenvektor M13mp18 inseriert. Um eine neue HindIII-Stelle 24 Basen stromaufwärts vom 3'-Terminus (HindIII-Stelle) einer für eine pro-Region kodierenden DNA herzustellen, wurde das Kodon TCT von Serin an der 81. Position in der pro-Region in AGC überführt. Und zwar wurde mittels des Starters 5'TTTATCCAAGCTTACCCCTTC3' und des vorstehenden, das 0,9 kb-BamHI-HindIII-Fragment enthaltenden Phagenvektors M13mp18 eine ortsgerichtete Mutagenese durch Verwenden eines Amersham-Kits unter Erhalten eines gewünschten Klons ausgeführt. Ein 24 bp kürzeres 0,9 kb-BamHI-HindIII-Fragment als dasjenige vor der Mutagenese wurde aus dem sich daraus ergebenden Klon isoliert und an das von pGEL125H stammende 8,3 kb-BamHI-HindIII-Fragment (zuvor beschrieben) unter Erhalten des Plasmids pALFA310 ligiert.
Ein einen PGK-Terminator enthaltendes 0,29 kb-AhaIII-SalI-Fragment wurde aus dem Plasmid pGLDp31-RcT (europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 235 430) isoliert. Der XhoI-Linker pCCTCGAGG wurde mit T4-DNA-Ligase an dieses Fragment ligiert, gefolgt von der Behandlung mit XhoI und SalI unter Erhalten eines den PGK- Terminator enthaltenden 0,29 kb-XhoI-SalI-Fragments. Dieses 0,29 kb-XhoI-SalI-Fragment wurde in eine stromabwärts von der DNA, die für die pro-Region des α-Faktors in dem Plasmid pALFA 310 kodiert (zuvor beschrieben), angeordnete XhoI-Stelle inseriert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pALFA 310T erhalten.
Ein die Polypeptid (I)-cDNA enthaltendes 1,1 kb-EcoRI-Fragment wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert. Dieses 1,1 kb-EcoRI-Fragment wurde mit AhaIII gespalten, gefolgt von der Addition des XhoI-Linkers. Das sich daraus ergebende Fragment wurde mit ScaI unter Erhalten eines 0,36 kb-ScaI-XhoI- Fragments gespalten. An dieses 0,36 kb-ScaI-XhoI-Fragment wurde die folgende synthetische DNA und der XhoI-HindIII-Adaptor ligiert (zuvor beschrieben), gefolgt von der Behandlung mit HindIII.
Auf diese Weise wurde das für das Polypeptid (I) kodierende 0,4 kb HindIII-Fragment erhalten.
Das für das Polypeptid (I) kodierende 0,4 kb-HindIII-Fragment wurde in die am 3'-Terminus der DNA, welche für die prepro- Region des α-Faktors des Plasmids pALFA310T kodiert, gelegene HindIII-Stelle inseriert und dadurch wurde ein Polypeptid (I)- Expressionsvektor pANT341T erhalten (Fig. 9).

Beispiel 9 (Isolierung einer Transformanten und Expression der Polypeptid (I)-cDNA)

Unter Verwenden des in Beispiel 8 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pANT341T wurde in Referenzbeispiel 4 erhaltenes S. cerevisiae TB39 &supmin; (IFO 10467, FERM BP-2399) durch das Lithiumverfahren [J. Bacterial. 153, 163 (1983)] transformiert, wodurch die Transformante S. cerevisiae TB39 &supmin;/pANT341T (IFO 10475, FERM BP-2530) erhalten wurde.
Die Transformante S. cerevisiae TB39 &supmin;/pANT341T wurde in 5 ml modifiziertes Burkholder-Medium (das 89 g Sucrose, 11 g Glucose, 5,6 g Asparagin und 0,44 g KH&sub2;PO&sub4; je Liter enthielt) [Amer. J. Bot. 30, 206 (1943)] in einem Reagenzglas eingeimpft und 3 Tage unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. 1 ml der sich daraus ergebenden Kultur wurde in ein 4 ml des vorstehenden Mediums enthaltendes Reagenzglas überführt und 1 Tag unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. 2 ml dieser Kultur wurden weiter in einen 200 ml- Erlenmeyerkolben überführt, der 18 ml des vorstehenden Mediums enthielt, und 3 Tage unter Schütteln bei 30ºC kultiviert.
Die auf diese Weise erhaltene Kultur wurde zentrifugiert und Trichloressigsäure wurde 750 ul seines Überstands zum Fällen von Proteinen zugesetzt. Die Fällung wurde in einem Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] gelöst und 5 Minuten auf 100ºC erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese an 15%igen, 0,5% SDS enthaltenden Polyacrylamidgelen. Die Proteine auf den Gelen wurden gemäß dem Verfahren von Burnette [Analytical Biochemistry 112, 195 (1981)] auf eine Nitrocellulosemembran überführt.
Das Western-Blotting wurde mittels eines Kaninchen-anti-Maus- NGF-Antikörpers (Collaborative Research Inc. U.S.A.) und eines affinitätsgereinigten, HRP-gebundenen Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Bio RAD, USA) durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Bande nachgewiesen, die einem Molekulargewicht von etwa 15 Kilodalton (kDa) des Polypeptids (I) entsprach. Auf der anderen Seite wurde diese Bande bei dem Überstand von S. cerevisiae TB39 &supmin;/pALFA310T nicht nachgewiesen.

Beispiel 10 (Herstellung von Polypeptid (I) durch E. coli)

Escherichia coli BL21 (DE3) [Gen 56, 125 (1987)] wurde durch Verwendung des in Beispiel 3 erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pENGFT102 und des T7-Lysozym-Expressionsvektors pLysS unter Erhalten der Transformanten E. coli BL21/(DE3)/pLysS, pENGFT102 (IFO 14903, FERM BP-2529) transformiert.
Die Transformante E. coli BL21/(DE3)/pLysS, pENGFT102 wurde in LB-Medium [1% Trypton (Difco), 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl], das 50 ug/ml Ampicillin, 10 ug/ml Chloramphenicol und 0,2% Glucose enthielt, 16 Stunden unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Die Kultur (12,5 ml) wurde in einen 250 ml desselben Mediums enthaltenden 1 Liter-Erlenmyerkolben überführt und 3 Stunden unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Darauf erreichte der Klett-Wert der Kulturlösung 170. Isopropyl-β-D-(-)-thiogalactopyranosid wurde dieser Kultur in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt und die Kultivierung wurde 3 Stunden bei 30ºC unter Schütteln fortgesetzt. Auf diese Weise aus 30 ul Kultur gesammelte Zellen wurden in 30 ul Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und 5 Minuten bei 100ºC erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese auf 0,1% SDS enthaltenden 16%igen Polyacrylamidgelen. Die Proteine auf den Gelen wurden gemäß dem Verfahren von Burnette [Analytical Biochemistry 112, 195 (1981)] auf eine Nitrocellulosemembran überführt und anschließend wurde ein Western-Blotting mittels des Kaninchen-anti-Maus-NGF-Antikörpers (Collaborative Research Inc. USA) und des affinitätsgereinigten HRP-gebundenen Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Bio RAD, USA) durchgeführt. Als Ergebnis wurde das Polypeptid (I) mit einem Molekulargewicht von 15 Kilodalton (kDa) nachgewiesen.
Wurden Gele, die in einer zu der vorstehend beschriebenen ähnlichen Weise erhalten und der Elektrophorese unterzogen wurden, mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt, wurde ein dem Polypeptid (I) entsprechendes 15 kDa-Protein nachgewiesen und die Menge seiner Herstellung wurde auf der Grundlage der Gesamtmenge Proteine als etwa 10% geschätzt.

Beispiel 11 (Isolierung von Polypeptid (I))

Die Kultur (3,75 Liter) der in Beispiel 10 erhaltenen Transformanten E. coli BL21(DE3)/pLysS, pENGFT102 wurde unter Ergeben von 17 g (feucht) Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden in 375 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, eingefroren und aufgetaut, gefolgt von der dreimaligen Behandlung mit einem Beschallungsoszillator (Kaijo Denki, 2A, 2 Minuten). Die Suspension aufgebrochener Zellen wurde zentrifugiert und die sich daraus ergebende Fällung wurde in 60 ml 5 M Guanidinhydrochlorid - 5 mM EDTA - 1 mM PMSF - 0,1 mM APMSF - 20 mM Dithiothreit (DTT) - 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) gelöst. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde auf eine Sephacryl S-200-Säule aufgebracht, die mit 2 M Guanidinhydrochlorid - 5 mM EDTA - 0,1 mM APMSF - 5 mM DTT - 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert war, und die Fraktionen, in denen das Polypeptid (I) durch das Western-Blotting-Verfahren (zuvor beschrieben) nachgewiesen wurde, wurden gesammelt (Volumen = 300 ml). Diese Lösung wurde durch Verwendung eines mit einer YM5-Membran (Amicon) ausgerüsteten Ultrafilters eingeengt und 50 ml der sich daraus ergebenden, konzentrierten Lösung wurden wie vorstehend beschrieben auf die Sephacryl S-200-Säule aufgebracht. Auf diese Weise wurden 164 ml einer 328 mg gereinigtes Polypeptid (I) enthaltenden Lösung erhalten. Die Reinheit wurde durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß das sich daraus ergebende Polypeptid (I) im wesentlichen homogen war.
Mit einer das vorstehende gereinigte Polypeptid (I) enthaltenden Lösung wurde eine Ultrapore RPSC-Säule (0,46 x 7,5 cm, Altex) beladen und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Trifluoressigsäure-Acetonitril-Elutionslösungsmittelsystems unter Erhalten des homogenen Polypeptids (I) chromatographiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz des sich daraus ergebenden Polypeptids (I) wurde mit einem Gasphasen- Proteinsequenzer (Modell 470A, Applied Biosystems) bestimmt. Demzufolge stimmte die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Polypeptids (I) mit der aus der Nukleotidsequenz der cDNA hergeleiteten N-terminalen Aminosäuresequenz des Polypeptids (I) überein, ausgenommen daß dem N-Terminus ein Methioninrest angefügt wurde (Tabelle 4). Tabelle 4 N-terminale Aminosäuresequenz aus der gereinigten Probe bestimmte Sequenz aus cDNA hergeleitete Sequenz
Die Aminosäurezusammensetzung der vorstehend erhaltenen gereinigten Probe wurde durch das Ninhydrinverfahren bestimmt. Als Ergebnis stimmten die beobachteten Werte im wesentlichen mit den aus dem Polypeptid (I), an dessen N-Terminus ein Methioninrest angefügt wurde, berechneten Werten überein (Tabelle 5). Tabelle 5 Aminosäurezusammensetzung Experimenteller1) Wert Theoretischer2) Wert 1) berechnet unter der Annahme von Glu als 11 2) berechnet mit einem an den N-Terminus des Polypeptids (I) angefügten Methioninrest
Eine das vorstehende gereinigte Polypeptid (I) (Proteinkonzentration: 2 mg/ml) enthaltende Lösung wurde so mit 2 M Guanidinhydrochlorid - 5 mM EDTA - 0,1 mM APMSF - 5 mM DTT - 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) verdünnt, daß sich eine Proteinkonzentration von 10 ug/ml ergab. Die verdünnte Lösung wurde gegen eine 50fache Menge 1 mM EDTA - 50 mM NaHCO&sub3; - Na&sub2;CO&sub3; (pH 10,0) 16 Stunden bei 4ºC dialysiert und 4 Stunden weiter gegen denselben Puffer dialysiert. Die Wirkung der sich daraus ergebenden dialysierten Flüssigkeit auf PC12-Zellen wurde gemäß dem in Brain Research 133, 350 (1979), und Experimental Cell Research 145, 179 (1983), beschriebenen Verfahren untersucht. Als Ergebnis wurde beobachtet, daß 6% der PC12-Zellen durch den Zusatz der inneren dialysierten Flüssigkeit Neuriten besaßen und 2% davon Neuriten mit einer Länge von wenigstens dem zweifachen Durchmesser des Zellkörpers besaßen. Auf der anderen Seite besaßen bei 1 mM EDTA - 50 mM NaHCO&sub3; -Na&sub2;CO&sub3; (pH 10,0) als Kontrolle nicht mehr als 0,5% der Zellen Neuriten. Es wurde beobachtet, daß das durch ein dem vorstehend beschriebenen ähnliches Verfahren erhaltene gereinigte Polypeptid (I) die Aktivität (zuvor beschrieben) des Förderns des Überlebens von Hühnerembryo-Sinnesneuronen (Dorsalwurzelganglien) besaß.

Beispiel 12 (Expression von Polypeptid (I)-cDNA in tierischen Zellen)

COS-7-Affenzellen wurden in 10% Kälberserum enthaltendem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM-Medium) in einem Kohlendioxid-Inkubator in Monoschicht kultiviert, gefolgt vom Austauschen des Mediums gegen dasselbe Medium. 4 Stunden nach dem Austausch wurden Calciumphosphatgele, die 10 ug pTB389 (in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (offengelegt) Nr. 64- 2572/1989 beschrieben, welche der EP-A-251 244 entspricht) oder 10 ug pNTL145 (siehe Beispiel 5) enthielten, gemäß einem bekannten Verfahren [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] hergestellt und Zellen zugefügt. Diese Zellen wurden 4 Stunden kultiviert und anschließend mit Glycerin behandelt [Gorman et al., Science 221, 551 (1983)], gefolgt von 16 Stunden Kultivierung in 10% Kälberserum enthaltendem DMEM. Nachdem das Medium gegen 0,5% Kälberserum enthaltendes DMEM ausgetauscht worden war, wurden die Zellen weiter 2 Tage kultiviert und die sich daraus ergebende Kultur wurde zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Kulturüberstand (Probe 1) der mit pTB389 transfizierten COS-7- Zellen und der Kulturüberstand (Probe 2) der mit pNTL145 transfizierten COS-7-Zellen wurde für die folgenden Versuche verwendet.
Trichloressigsäure wurde zum Fällen von Proteinen 0,5 ml jeder Probe zugesetzt. Die sich daraus ergebende Fällung wurde in einem Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] gelöst und 5 Minuten auf 100ºC erhitzt, gefolgt von der Elektrophorese auf 0,5% SDS enthaltenden 17%igen Polyacrylamidgelen. Die Proteine auf den Gelen wurden gemäß dem Verfahren von Burnette [Analytical Biochemistry 112, 195 (1981)] auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Das Western-Blotting wurde unter Verwenden des in Referenzbeispiel 2 erhaltenen anti-Polypeptid (I)-N-terminales Peptid-Antikörpers und affinitätsgereinigtem, HRP-gebundenem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Bio RAD, USA) durchgeführt. Als Ergebnis wurde für den Kulturüberstand (Probe 2) der mit pNTL145 transfizierten COS-7-Zellen eine Polypeptid (I) entsprechende Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 15 Kilodalton (kDa) nachgewiesen. Bei dem Kulturüberstand (Probe 1) der mit pTB389 transfizierten COS-7-Zellen wurde die Polypeptid (I) entsprechende Bande jedoch nicht nachgewiesen. Wenn ein anti-Maus-NGF- Antikörper (Collaborative Research, USA) anstelle des vorstehenden anti-Polypeptid (I)-N-terminales Peptid-Antikörpers verwendet wurde, wurde die Polypeptid (I) entsprechende Bande nachgewiesen.
Sinnesneuronen (Dorsalwurzelganglien) wurden aus 8 Tage alten Hühnerembryonen isoliert und mit 0,1% Trypsin zum Dispergieren der Zellen (kristallisiertes Trypsin aus Schweinepankreas, Wako Junyaku) in CMF (calcium-magnesiumfrei) - PBS 20 Minuten bei 37ºC behandelt. Die Vorkultivierung der Zellen wurde in 10% fetalem Kälberserum enthaltendem DMEM 2 Stunden auf einer Plastikkulturschale ausgeführt, wodurch nicht-Nervenzellen anhafteten. Anschließend wurden die nicht anhaftenden Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und auf eine mit Poly-L-ornithin überzogene 24 Näpfchen-Platte in einer Dichte von 10&sup4; bis 10&sup5; Zellen/Näpfchen geimpft. Jede gegen DMEM dialysierte Probe wurde zur Kultivierung sofort dazugesetzt, wobei ein Kulturmediumsgemisch (10% FCS, 1 uM Ara-C und 50 ug/ml Kanamycin : Hams F12 = 1 : 1 enthaltendes DMEM) als Kulturmedium verwendet wurde. Nach 4 Tagen Kultivieren wurde die Zahl der überlebenden Nervenzellen bezüglich 10 Sehfeldern je Näpfchen mit dem Maß bestimmt, daß die Zelle eine glatte Oberfläche und einen Neuriten mit einer Länge von mindestens dem zweifachen Durchmesser des Zellkörpers besaß.
Die Zusammensetzungen der Nervenzellen wurden 3 Tage, nachdem die Kultivierung begonnen wurde, miteinander verglichen.
Als 10&sup5; Zellen in jedes Näpfchen verbracht wurden und jede Probe in einer Menge von 10 Vol.-% bezogen auf die Kulturlösung dazugesetzt wurde, wurde in Probe 2 eine Anzahl überlebender Nervenzellen beobachtet und die Neuriten waren dicht verteilt. Im Gegensatz dazu wurde in der Probe 1 eine Anzahl toter Zellen (schwimmende Zellen mit ungleichen Umrissen und keine Neuriten) beobachtet und die überlebenden Zellen waren zahlenmäßig geringer als diejenigen in Beispiel 2.
Als die in einer Dichte von 10&sup4; Zellen/Näpfchen eingeimpften Zellen kultiviert wurden, zeigten alle Proben die starke Entwicklung der Neuriten bei Probenkonzentrationen von 5% und 10%. Bei einer Probenkonzentration von 2% jedoch wurden in der Probe 2 Nervenzellen mit stark entwickelten Neuriten beobachtet, wogegen in Probe 1 die Entwicklung von Neuriten schlecht war und die Zellkörper klein waren.
Als die Zellen in einer Dichte von 10&sup4; Zellen/Näpfchen kultiviert wurden, wurde die Zahl der überlebenden Nervenzellen 4 Tage, nachdem die Kultivierung begonnen wurde, gezählt (Fig. 10). Unter Bezug auf Fig. 10 zeigen offene Kreise ( ) den Kulturüberstand (Probe 1) der mit pTB389 transfizierten COS-7-Zellen und gefüllte Kreise ( ) zeigen den Kulturüberstand (Probe 2) der mit pNTL145 transfizierten COS-7-Zellen. Probe 2 erhöhte, verglichen Probe 1, das Überleben der Sinnesnervenzellen und ihre Wirkung war von der Konzentration abhängig.

Beispiel 13 (Klonieren des Ratten-Polypeptid (I)-Gens)

Ein Polypeptid (I)-cDNA enthaltendes 1,1 kb-EcoRI-DNA-Fragment wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert und zum Erhalten einer Sonde durch die Oligomarkierungsreaktion (Nippon Gene) markiert.
Die Gesamt-RNA wurde aus jedem Organ 5 Wochen alter Ratten durch das Guanidinium-CsCl-Verfahren hergestellt und Poly(A)-RNA wurde durch Verwendung von oligo-dt-Cellulose erhalten. Mittels der vorstehend beschriebenen Sonde wurde das Northern-Blotting der aus jedem Gewebe erhaltenen Poly(A)-RNA durchgeführt. Demzufolge wurde eine 1,4 kb-Boten-RNA (mRNA) von Polypeptid (I) in Niere, Leber, Herz, Gehirn, Milz, Thymus, Lunge und Speicheldrüse nachgewiesen. Das vorstehende Ergebnis legte nahe, daß das Polypeptid (I)-Gen auch in der Ratte vorlag und in vielen Geweben exprimiert wurde.
Ein für das menschliche Polypeptid (I) kodierendes 0,45 kb- EcoRI-AhaIII-Fragment wurde aus dem in Beispiel 1 erhaltenen Plasmid pUNK5 isoliert und die Southern-Hybridisierung genomischer Ratten-DNA wurde unter Verwenden dieses Fragments als Sonde durchgeführt. Diese Sonde hybridisierte mit einem ungefähr 7,4 kb EcoRI-Fragment, einem ungefähr 3,8 kb BglII-Fragment und einem ungefähr 3,8 kb HindIII-Fragment und dies legte nahe, daß ein Polypeptid (I)-Gen auch in der Ratte vorlag.
Anschließend wurde ein Polypeptid (I)-cDNA enthaltendes 1,1 kb- EcoRI-Fragment aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert und das Ratten-Polypeptid (I)-Gen wurde mittels dieses Fragments als Sonde kloniert. Eine zum Klonieren verwendete genomische Ratten-DNA-Bank, die durch teilweises Verdauen aus der Leber einer weiblichen Ratte (Sprague-Dawley) stammender DNA und Einführen des sich daraus ergebenden Fragments in einen Charon-4A-Phagen aufgebaut wurde, wurde von Clontech erworben. E. coli LE362 wurde mit dieser Phagen-Bank unter Bilden von etwa 5 x 10&sup5; Plaques je Platte infiziert. Die Phagen-DNA wurden gemäß dem bekannten Verfahren [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual] von 10 unabhängigen Platten auf eine Nitrocellulosemembran überführt und mit der vorstehenden Sonde hybridisiert. Als Ergebnis wurden 7 positive Klone erhalten. Ein positiver Klon (λrNGF2-8) enthielt ein insertiertes DNA-Fragment von ungefähr 12 kb. Aus den Ergebnissen der Southern-Hybridisierung wurde abgeleitet, daß eine für das Polypeptid (I) kodierende Region in einem 0,95 kb-BglII-HindIII-Fragment in dem DNA- Fragment vorlag. Anschließend wurde das 0,95 kb-BglII-HindIII- Fragment in Plasmid pUC118 (Takara Shuzo) unter Erhalten von Plasmid pRNT18 subkloniert. Unter Verwenden des Plasmids pRNT18 wurde E. coli DH1 transformiert, um die Transformante E. coli DH1/pRNT18 (IFO 14934, FERM BP-2618) zu erhalten.
Das vorstehende 0,95 kb-BglII-HindIII-Fragment wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und die sich daraus ergebenden Fragmente wurden in pUC118 beziehungsweise M13mp18 und dergleichen subkloniert. Anschließend wurden ihre Nukleotidsequenzen durch Verwendung von Sequenase (Toyobo) bestimmt (Fig. 11). Demzufolge wurde erkannt, daß das 0,95 kb-BglII-HindIII- Fragment eine für ein Signalpeptid kodierende Region, eine pro- Region und ein reifes Protein des Ratten-Polypeptids (I) enthielt und daß ein Intron nicht vorlag.
Beim Vergleichen der Aminosäuresequenz des Ratten-Polypeptids (I), die aus der Nukleotidsequenz gegenüber derjenigen des menschlichen Polypeptids (I) abgeleitet war, wurden Unterschiede bei 11 Resten für die Signalsequenz und die pro-Region beobachtet, aber es bestand kein Unterschied für das reife Protein (Polypeptid (I)). Es wurde auf diese Weise bewiesen, daß die Aminosäuresequenz des Ratten-Polypeptids (I) mit derjenigen des menschlichen Polypeptids (I) vollständig übereinstimmte.

Beispiel 14 (Klonieren von Polypeptid (I)-cDNA)

Ein für eine Signalsequenz, eine pro-Region und ein Polypeptid (I) kodierendes 0,83 kb-DNA-Fragment wurde zum Herstellen einer Sonde aus Polypeptid (I)-cDNA isoliert. Unter Verwenden der sich daraus ergebenden Sonde wurden 0,73 kb- und 1,1 kb-Polypeptid (I)-cDNA aus einer menschlichen Plazenta-Bank (Clontech Laboratories, Inc.) auf eine zu der in den Beispielen 1 und 2 ähnliche Weise kloniert. Die Nukleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen Polypeptid (I)-cDNA stimmte mit der Nukleotidsequenz der in Beispiel 1 und 2 klonierten Polypeptid (I)-cDNA überein.

Beispiel 15 (Aufbau eines Polypeptid (I) produzierenden Tierzellenstamms durch Einführung des Polypeptid (I)-Expressionsvektors)

(1) Aufbau des Expressionsvektors

Ein Regionen, die für ein Signalpeptid, ein Propeptid und ein Polypeptid (I) der Polypeptid (I)-cDNA kodieren, enthaltendes 0,86 kb-EcoRI-AhaIII-Fragment wurde aus dem in Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pHNT2 isoliert. Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pTB399 [Cell Struct. Funct. 12, 205 (1987)] für die Expression von Interleukin(IL)-cDNA mit BglII gespalten und anschließend mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment behandelt, gefolgt von der weiteren Spaltung mit EcoRI, um ein Fragment (etwa 3,8 kb) zu erhalten, aus dem der IL-cDNA-Teil entfernt war. An dieses Fragment wurde das vorstehende 0,86 kb-EcoRI- AhaIII-Fragment durch die T4-DNA-Ligasereaktion unter Erhalten von Plasmid pTB1091 ligiert.
Anschließend wurde ein 1,0 kb BamHI-Fragment, das ein Hygromycin-B-resistentes Gen enthielt, aus Plasmid pLG89 [Gene 25, 179 (1983)] isoliert und durch eine Region (1,0 kb-BglII-SmaI) ersetzt, die das Neomycinresistenzgen aus pTB6 [Cell Struct. Funct. 12, 205 (1987)] enthielt. Auf diese Weise wurde der Hygromycinresistenzgen-Expressionsvektor pTB681 mit einem HSV- TK-Genpromotor aufgebaut. Ein HindIII-Linker wurde an ein 1,8 kb-Fragment angefügt, das durch Spalten des Plasmids pTB681 mit PvuII erhalten wurde, und das sich daraus ergebende Fragment wurde in die HindIII-Stelle des vorstehend erhaltenen Polypeptid (I)-Expressionsvektors pTB1091 unter Aufbauen des Polypeptid (I)-Expressionsvektors pTB1139 mit dem Hygromcinresistenzgen (Fig. 12) inseriert.

(2) Aufbau eines Polypeptid (I) produzierenden Tierzellenstamms

Maus-L-Zellen (TK-Mangel-Stamm) wurden auf eine Falcon-Schale von 6 cm Durchmesser (7 x 10&sup5; Zellen/Schale) eingeimpft und in 10% FCS enthaltendem Eagles MEM kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 10 ug des Expressionsvektors pTB1139 gemäß dem Verfahren von Graham et al. [Virology 52, 456 (1973)] transfiziert, gefolgt von 2 Tagen der Kultivierung in dem vorstehenden Medium. Nach der Behandlung mit Trypsin wurden die sich daraus ergebenden Zellen erneut auf eine neue Schale geimpft und die Kultivierung wurde in 500 ug/ml Hygromycin B (Sigma) enthaltendem 10% FCS-MEM fortgesetzt. Nach 2 bis 3 Wochen wurden hygromycinresistente Zellen, die sich in Kolonienform vermehrt hatten, erhalten. Die auf diese Weise erhaltenen hygromycinresistenten L-Zellen wurden gemäß einem bekannten Verfahren wie dem Grenzverdünnungsverfahren unter Erhalten der Klone L-H1-1, L-H6- 1, L-H11-1, L-H13-1, L-H14-1 (IFO 50223, FERM BP-2754), L-H18-1, L-H19-1, L-H35-1, L-H36-1 und L-H43-1 kloniert. Die Zellen jedes Klons wurden auf eine 24 Näpfchen-Platte geimpft und kultiviert. Als die Zellen ungefähr konfluent wurden, wurde das Medium gegen 0,5 ml/Näpfchen MEM-Medium ausgetauscht, das 0,1% FCS enthielt. Nach 2 Tagen Kultivierung wurde der Überstand der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und das Polypeptid (I) wurde durch Western-Blotting mittels des in Referenzbeispiel 2 hergestellten Polypeptid (I)-N-terminales Peptid-Antikörpers nachgewiesen. Als Ergebnis wurde ermittelt, daß etwa 1 mg Polypeptid (I) in dem Medium jedes vorstehend beschriebenen Klons produziert wurde.

Claims

1. Polypeptid (I), das in einem seiner Moleküle die folgende Aminosäuresequenz (II) beinhaltet:

2. Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz (II') aufweist:

3. DNA, die für ein Polypeptid (I) codiert, das in einem seiner Moleküle die folgende Aminosäuresequenz (II) beinhaltet:

4. Vektor, der DNA enthält, die für ein Polypeptid (I) codiert, das in einem seiner Moleküle die folgende Aminosäuresequenz (II) beinhaltet:

5. Transformant, der durch einen Vektor transformiert wird, der DNA enthält, die für ein Polypeptid (I) codiert, das in einem seiner Moleküle die folgende Aminosäuresequenz (II) beinhaltet:

6. Escherichia coli BL21 (DE3)/pENGFT102 (FERM BP-2420) gemäß Anspruch 5.

7. Saccharomyces cerevisiae TB39 -/pANT341T (FERN BP-2530) gemäß Anspruch 5.

8. Escherichia coli BL21 (DE3)/pENGFT102 (FERN BP-2529) gemäß Anspruch 5.

9. L-H14-1 (FERM BP-2754) gemäß Anspruch 5.

10. Vertahren zur Herstellung eines Polypeptids (I), das in einem seiner Moleküle die folgende Aminosäuresequenz (II) beinhaltet:

umfassend das Kultivieren eines durch einen Vektor, der für das Polypeptid codierende DNA enthält, transformierten Transformanten in einem Kulturmedium, das Anreichern des Polypeptids sowie die Gewinnung des Polypeptids.