DE69123106T2

DE69123106T2 - Polypeptid, das zur Interaktion mit Thrombin fähig ist

Info

Publication number: DE69123106T2
Application number: DE69123106T
Authority: DE
Inventors: Komakazu Gomi; Akio Matsuda; Koji Suzuki; Shuji Yamamoto; Michitaka Zushi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1991-08-05
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2011-08-06
Also published as: DE69123106D1; US5574007A; EP0474273A2; EP0474273B1; HK1000968A1; ATE145241T1; KR930008093B1; ES2093674T3; KR920004419A; CA2048425A1; CA2048425C; AU632958B2; EP0474273A3

Description

Stand der Technik

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das mit Thrombin wechselwirkt. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues, im wesentlichen reines Polypeptid niedrigen Molekulargewichts, das mit Thrombin wechselwirkt, so daß sich zwischen ihnen eine Bindung ausbildet. Dadurch entsteht eine Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation und der Plättchenaggregation durch Thrombin und/oder eine Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C. Die Erfindung betrifft auch ein DNA mit einer Nucleotidseguenz zum Kodieren des Proteins; ein rekombinantes DNA-Molekül das einen replizierbaren Expressionsvektor und die DNA umfaßt; einen Transformanten mit dem rekombinanten DNA-Molekül; ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend genannten Polypeptids und eine pharmazeutische Zusammensetzung mit dem Polypeptid.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist bei der Inhibierung der Blutkoagulation und bei der Fibrinolyse der Blutkoagulation beteligt. Es besitzt eine sehr gute Aktivität zum Inhibieren der Koagulation, der Plättchenaggregation und der Thrombolyse. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist deshalb als Wirkstoff für Arzneimittel geeignet, insbesondere für diejenigen zur Behandlung von Krankheiten, in denen eine unerwünschte Blutkoagulation auftritt, z.B. Myocardinfarkte, Thrombosen, Embolien, Verschluß der peripheren Blutgefäße, Arteriosclerosis obliterans, disseminante intravasale Koagulations-(DIC) Syndrom, Angina pectoris, transiente ischemische Anfälle und Toxämien bei der Schwangerschaft.
In der Beschreibung sind die Aminosäuren und die Peptide durch die nachstehenden Abkürzungen angegeben, die von der IUPAC-IUP Kommission für die Biochemische Nomenklatur (CBN) anerkannt sind. Die als Isomere auftretenden Aminosäuren und dergl. haben bei den im folgenden dargestellten Abkürzungen die L-Konfiguration. Weiterhin sind, wenn nichts anderes angegeben ist, das linke Ende und das rechte Ende der Aninosäuresequenz der Peptide der N-Terminus bzw. der C-Terminus.
Gln: Glutaminrest
Asp: Asparginsäurerest
Pro: Prolinrest
Tyr: Tyrosinrest
Val: Valinrest
Lys: Lysinrest
Glu: Glutaminsäurerest
Ala: Alaninrest
Asn: Asparginrest
Leu: Leucinrest
Phe: Phenylalaninrest
Gly: Glycinrest
His: Histidinrest
Ser: Serinrest
Thr: Threoninrest
Ile: Isoleucinrest
Trp: Tryptophanrest
Arg: Argininrest
Met: Methioninrest
Cys: Cysteinrest
Die Polydeoxyribonukleinsäuren und Oligodeoxyribonukleinsäuren sind durch Sequenzen von Deoxynucleotidreste dargestellt, die wie folgt abgekürzt sind:
A: 2'-Deoxyadenylsäurerest
C: 2'-Deoxycytinsäurerest
G: 2'-Deoxyguaninsäurerest
T: Thyminsäurerest
Wenn nichts anderes angegeben ist, sind das linke Ende und das rechte Sequenzende der Deoxynucleotide das 5'-Ende bzw. das 3'-Ende.

Diskussion des nächsten Stands der Technik

Es ist bekannt, daß das Protein C vom Vitamin K abhängig ist und im Blutkoagulationsmechanismus eine wichtige Rolle spielt. Bisher ist bekannt, daß in der Lunge vom Kaninchen, vom Rind, vom Mensch, in der menschlichen Plazenta und dergl. eine Substanz vorliegt, die mit Thrombin wechselwirkt, so daß sich dazwischen eine Bindung ausbildet. Dadurch entsteht eine Aktivität zum Inhibieren der Plättchenaggregation und der Fibrinbildung durch die Wirkung von Thrombin und zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C. Eine derartige Substanz wird allgemein "Thrombomodulin" bezeichnet.
N.L.Esmon et al. (siehe J. Biol. Chem., 257, 859-864, 1982) berichtete, daß eine Substanz, die von der Kaninchenlunge abgetrennt und gereinigt wird, bei der Aktivierung von Protein C nach der Ausbildung einer Bindung zu Thrombin Calciumionen verlangt. Weiterhin berichtete K. Suzuki et al (siehe Biochemica et Biophysica Acta, 882, 343-352, 1986), daß eine Substanz, die von der Rinderlunge abgetrennt und gereinigt wird, bei der oben genannten Aktivierung auch Calciumionen verlangt. Es wurde von H.H. Salem et al (siehe J. Biol. Chem., 259, 12246-12251, 1984) berichtet, daß eine Substanz, die aus der menschlichen Plazenta abgetrennt und gereinigt wird, Calciumionen verlangt. S. Kurosawa et al. (siehe J. Biol. Chem., 262, 2206-2212, 1987) berichtete, daß ein lösliches Peptid, das man durch Verdauen mit Elastase der oben genannten, aus der Kaninchenlunge abgetrennten und gereinigten Substanz bei der Aktivierung von Protein C die höchste Aktivität bei einer Calciumionenkonzentration von 0,3 mM hat. Man beobachtet bei der Aktivierung von Protein C mit deletiertem Gla-Bereich (dieses Protein C wird nachfolgend mit "GDPC" bezeichnet) keine derartige Abhängigkeit von der Calciumionenkonzentration.
S.Yamanoto et al. offenbarte das Klonieren einer menschlichen Thrombomodulin-cDNA (siehe Internationale Patentanmeldung WO88/05033, entspricht der EP-A 0 312 598).
Die jüngsten Fortschritte der Gentechnik ermöglichen es nunmehr, eine oder mehrere vorgegebene Aminosäurereste in einem Protein durch andere Aminosäurereste zu ersetzen und auch eine Aminosäuresequenz von einer vorgegebenen Stelle eines Proteins zu deletieren. Verschiedene Untersuchungen wurden vorgenommen, ein neues Protein mit einer besonderen Aufgabe herzustellen, indem man ein natürliches Protein mit Hilfe der Gentechnik veränderte. Am menschlichen Thrombomodulin wurde aufgezeigt (siehe M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 264, 10351-10353, 1989), daß ein Polypeptid mit 115 Aminosäureresten die Thrombinkatalysierte Aktivierung von Protein C fördert.
Bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen unerwünschte Blutkoagulation auftreten, wird die pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Polypeptid meist durch intravenöse Infusion oder mittels PTCR (perkutane transluminale koronare Angioplastie) örtlich verabreicht. Bei der Verabreichung von menschlichem Thrombomodulin wird die intravenöse Infusion der örtlichen Verabreichung mit PTCR bevorzugt. Ein derartiges Verabreichungsverfahren ist bei einer Kurzzeitbehandlung verträglich. Es führt aber bei einer Langzeitbehandlung oder bei einer Präventivbehandlung zur seelischen und finanziellen Belastung des Patienten. Weiterhin ist die Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem Polypeptid unvermeidbar hoch, da das Molekulargewicht herkömmlicher Polypeptide im allgemeinen groß ist und nur ein begrenzter Abschnitt der Polypeptidkette pharmazeutisch aktiv ist. Dies kann beim Patienten die Gefahr einer Antigenwirkung hervorrufen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurden umfangreiche Untersuchungen vorgenommen mit dem Ziel, ein neues Thrombomodulin niedrigen Molekulargewichts mit besserer Aktivität zu entwickeln, so dar man eine pharmazeutische Zusammensetzung erhält, die zur oralen- und nasalen Verabreichung (im Vergleich zur intravenösen Infusion und zur örtlichen Verabreichung durch PTCR weniger belastend) geeignet ist, indem man einen Bereich des oben genannten Peptids mit 115 Aminosäurereste identifiziert, der wesentlich ist zur Ausbildung einer Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation und Plättchenaggregation durch Thrombin und/oder einer Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C. Es gelang einen Bereich der Thrombomodulinsequenz, der mit Protein C wechselwirkt, so daß sich dazwischen eine Bindung ausbildet und auch eine Aminosäuresequenz mit einer Thrombinbindungsstelle vom Thrombomodulin zu kennzeichnen. Darüber hinaus zeigte sich, dar ein Polypeptid, das den vorstehend genannten Bereich der Thrombomodulinsequenz und die vorstehend genannte Aminosäuresequenz mit einer Thrombinbindungsstelle besitzt, in einem Mikroorganismus oder in einer kultivierten Tierzellinie wirksam exprimiert wird. Die Erfindung erfolgte auf der Grundlage dieser Befunde.
Demzufolge ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein im wesentlichen reines Polypeptid niedrigen Molekulargewichts bereitzustellen, das eine wirksame Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation und der Plättchenaggregation und/oder eine Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist, eine DNA bereitzustellen, das das vorstehenden Polypeptid kodiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein rekombinantes DNA-Molekül bereitzustellen, das die vorstehende DNA und einen Vektor umfaßt.
Eine noch andere Aufgabe der Erfindung ist, einen Mikroorganismus oder eine kultivierte Tierzellinie bereitzustellen, die mit dem vorstehenden rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind.
Eine noch andere Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend genannten, im wesentlichen reinen Polyppeptids bereitzustellen, indem man den vorstehend genannten Transformanten verwendet.
Eine noch andere Aufgabe der Erfindung ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung mit dem vorstehend genannten, im wesentlichen reinen Polypeptids bereitzustellen, die oral und nasal verabreicht werden kann.
Die vorgehenden und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden eingehenden Beschreibung und den abhängigen Ansprüchen mit den beileigenden Zeichnungen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Es zeigt:
Fig.1 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13mp19TMJ3, mit dem ein Deletor TMd3 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Deletor mit dem Plasmid hybridisiert wird, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 2 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13TMD3, mit dem ein Deletor TMd5 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidseguenz um den Abschnitt, an dem der Deletor mit dem Plasmid hybridisiert wird, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 3 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13TMD3, mit dem ein Deletor TMd6 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Deletor mit dem Plasmid hybridisiert wird, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 4 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13mp19TMJ3, mit dem ein Deletor TMd1 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Deletor mit dem Plasmid hybridisiert wird, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 5 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(4)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13TMD1, mit dem ein Mutator TMm1 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Bereich, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäuresubstitution zu bewirken, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 6 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(4)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13TMD1, mit dem ein Mutator TMm2 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidseguenz um den Abschnitt, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäuresubstitution zu bewirken, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 7 eine Kurve, die die Wirkung der Calciumionenkonzentration auf die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C und von GDPC beim in Beispiel 1 erhaltenen Polypeptid D123Asp zeigt;
Fig. 8 eine Kurve, die die Wirkung der Calciumionenkonzentration auf die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C und von GDPC beim in Beispiel 1 erhalten Polypeptid D123Ala zeigt;
Fig. 9 eine Kurve, die die Wirkung der Calciumionenkonzentration auf die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C und von GDPC beim in Beispiel 1 erhaltenen Polypeptid D123Glu zeigt;
Fig. 10 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(b) erhalten rekombinanten Plasmids M13TMD7, mit dem ein Mutator TMm3 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäuresubstitution zu bewirken, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 11 eine Kurve, die die Wirkung der Calciumionenkonzentration auf die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C und von GDPC beim in Beispiel 3 erhalten Polypeptid E456Asp zeigt;
Fig. 12 eine Kurve, die die Wirkung der Calciumionenkonzentraticn auf die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C und von GDPC beim in Beispiel 3 erhalten Polypeptid E456Glu zeigt;
Fig. 13 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(b) erhalten rekombinanten Plasmids M13TMD7, mit dem ein Mutator TMm4 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäureinsertion zu bewirken, mit der hierdurch kodierten Aminosäuresequenz gezeigt ist;
Fig. 14 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(b) erhalten rekombinanten Plasmids M13TMD7, mit dem ein Mutator TMm5 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäureinsertion zu bewirken, mit der hierdurch kodierten Aminosäuresequenz gezeigt ist;
Fig. 15 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(b) erhalten rekombinanten Plasmids M13TMD7, mit dem ein Mutator TMm6 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Mutator mit dem Plasmid hybridisiert wird, um hierdurch eine Aminosäure zu substitutieren, mit der dadurch kodierten Aminosäuresequenz gezeigt ist;
Fig. 16 eine Kurve, die die Beziehung darstelltt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 4(5) gereinigten Polypeptids E456Asp verglichen wird;
Fig. 17 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 4(5) gereinigten Polypeptids E456Glu verglichen wird;
Fig. 18 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 4(5) gereinigten Polypeptids E456Asp2 verglichen wird;
Fig. 19 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 4(5) gereinigten Polypeptids E456Asp3 verglichen wird;
Fig. 20 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 4(5) gereinigten Polypeptids E456GluAsp verglichen wird;
Fig. 21 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 4(5) gereinigte erfindungsgemäße Polypeptid E456Asp zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig 22 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 4(5) gereinigte erfindungsgemäße Polypeptid E456Glu zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 23 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 4(5) gereinigte, erfindungsgemäße Polypeptid E456Asp2 zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 24 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 4(5) gereinigte, erfindungsgemäße Polypeptid E456Asp3 zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 25 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 4(5) gereinigte, erfindungsgemäße Polypeptid E456GluAsp zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 26 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456Asp verglichen wird, das in Beispiel 4(5) gereinigt wurde;
Fig. 27 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456Glu verglichen wird, das in Beispiel 4(5) gereinigt wurde;
Fig. 28 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456Asp2 verglichen wird, das in Beispiel 4(5) gereinigt wurde;
Fig. 29 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456Asp3 verglichen wird, das in Beispiel 4(5) gereinigt wurde;
Fig. 30 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456GluAsp verglichen wird, das in Beispiel 4(5) gereinigt wurde;
Fig. 31 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM3 darstellt;
Fig. 32 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM6 darstellt;
Fig. 33 und 34 Kurven, die die Beziehung darstellen zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht und der Reaktionsdauer, bei der ein Vergleich erfolgt zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des erfindungsgemäßen Polypeptids, nämlich des in Beispiel 4(5) gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptids E456Gla in Fig. 33 und des im Beispiel 3(3) gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptids E456Glu in Fig. 34;
Fig. 35 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, bei der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 5(4) gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptids E456GlaAsp verglichen wird;
Fig. 36 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 5(4) gereinigte erfindungsgemäße Polypeptid E456Gla zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 37 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, in die das in Beispiel 5(4) gereinigte erfindungsgemäße Polypeptid E456GlaAsp zugegeben wurde und der Menge des zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 38 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456Gla verglichen wird, das in Beispiel 5(4) gereinigt wurde;
Fig. 39 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids E456GlaAsp verglichen wird, das in Beispiel 5(4) gereinigt wurde;
Fig. 40 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pUMPGTMD7 darstellt;
Fig. 41 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pMTND7 darstellt;
Fig. 42 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pUMPGTMM3 darstellt;
Fig. 43 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pMTMM3 darstellt;
Fig. 44 und 45 Kurven, die die Beziehung darstellen zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, in der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des erfindungsgemäßen Polypeptids verglichen wird, nämlich der erfindungsgemäßen Polypeptide E456Asp und E456Glu, die im Beispiel 6(4) von Fig. 44 bzw. Fig. 45 gereinigt wurden.
Fig. 46 und 47 Kurven, die die Beziehung darstellen zwischen der Blutgerinnungszeit einer Fibrinogenlösung, die mit den in Beispiel 5(4) gereinigten erfindungsgeinäßen Polypeptide E456Asp und E456Glu versetzt wurden und der Menge des jeweils zugegebenen gereinigten Polypeptids;
Fig. 48 und 49 Kurven, die die Beziehung darstellen zwischen der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation und der Dauer, bei der zwischen der Gegenwart (B) und der Abwesenheit (A) des erfindungsgemäßen Polypeptids verglichen wird, nämlich der erfindungsgemäßen Polypeptide E456Asp und E456Glu, die im Beispiel 6(4) von Fig.48 bzw. Fig. 49 gereinigt wurden;
Fig. 50 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, bei der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 8(2) gereinigten Polypeptids E456Asp verglichen wird;
Fig. 51 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, bei der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 8(4) gereinigten Polypeptids E456Asp verglichen wird;
Fig. 52 eine Kurve, die die Beziehung darstellt zwischen der Menge aktivierten Proteins C, das durch die Umsetzung von Protein C mit Thrombin entsteht, und der Reaktionsdauer, bei der zwischen der Gegenwart (O) und der Abwesenheit ( ) des in Beispiel 8(5) gereinigten Polypeptids E456Asp verglichen wird;
Fig. 53 eine Zeichnung eines SDS-Polyacrylamid Elektrophoresemusters des Polypeptids E456Asp, das in den Beispielen 8- (2), (4) und (5) gereinigt wurde;
Fig. 54 eine Darstellung eines in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltenen rekombinanten Plasmids M13TMD7, mit dem ein Deletor TMd9 komplementär hybridisiert wird, wobei die Nucleotidsequenz um den Abschnitt, an dem der Deletor mit dem Plasmid hybridisiert wird, mit der hierdurch kodierten Aminosequenz gezeigt ist;
Fig. 55 (a) und (b) die vollständige Aminosäuresequenz vom Polypeptid des menschlichen Thrombomodulins;
Fig. 56 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pPGACY2 darstellt;
Fig. 57 eine Zeichnung, die die Herstellung der Plasmide pSFI-I und pSFI-2 darstellt;
Fig. 58 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pBSFAHY83 darstellt, in das Acremonium chrysogenum eingebracht worden war;
Fig. 59 bzw. 60 eine Restriktionskarte eines DNA- Fragments mit dem Acremonium chrysogenum PGK-Gen und eine Restriktionskarte eines DNA-Fragments mit dem Acremonium chrysogenum Act in-Gen, wobei die durch gekennzeichneten Bereiche die Exons der vorstehend genannten Gene (der 5'-Terminus des Anfangsexons und der 3'Terminus des Endexons wurden noch nicht bestimmt) bezeichnen;
Fig. 61 eine Nucleotidsequenz, die dem Bereich (A) von Fig. 59 entspricht, angegeben durch , mit der Aminosäuresequenz des PGK-Proteins, das unter der Nucleotidsequenz angegeben ist;
Fig. 62 zeigt eine Nucleotidsequenz, die dem Bereich (B) von Fig. 59 entspricht, angegeben durch , mit der Aminosäuresequenz des PGK-Proteins, das unter der Nucleotidsequenz angegeben ist;
Fig. 63 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pPGKM5 darstellt; und
Fig. 64 eine Zeichnung, die die Herstellung des Plasmids pACTAHY83 darstellt.
Die Abkürzungen in den Zeichnungen bedeuten folgendes:
B.B : Bindungsstelle zwischen BamHI und BglII
cm : Chloramphenicol-Acetyltransferase Gen
Amp : β-Lactamase Gen
acyll: SE-83 Cephalosporin C Acylase Gen
PGKP: Promotor vom Acremonium chrysogenum PGK-Gen
PGKT: Terminator vom Acremonium chrysogenum PGK-Gen
ACTP: Promotor vom Acremonium chrysogenum Actin-Gen
ACTT: Terminator vom Acremonium chrysogenum PGK-Gen
km : Neomycin-Phosphotransferase-Gen
HYB : Hygromycin B Phosphotransferase-Gen
P : PvuII
Ps : PstI
M : MluI
K : KpnI
Sma : SmaI
Sa : SalI
St : StuI
Sc : ScaI
X : XhoI
Xb : XbaI
N : NsiI
Nc : NcoI
E : EcoRI
RV : EcoRV
H : HindIII
Bs : BssHII
Ps Ns: Bindungsstelle zwischen PstI und Nsil
2µ oder i: Replikationsstartpunkt vom Hefe 2µ-Plasmid
CYCP : Promotor vom Hefe Iso-1-cytochrom-C-Gen
CYCT : Terminator vom Hefe Iso-1-cytochrom-C-Gen
GAPDP: Promotor vom Acremonium chrysogenum-GAPD-Gen
L : Insertionsstelle vom BgII-Linker (GGAAGATCTTCC)

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polypeptids einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel (I):
worin X (a) einen Aminosäurerest aus der durch Glu und Gla gebildeten Gruppe oder (b) einen Peptidrest von 2 bis 20 Aminosäureresten aus der durch Asp, Glu und Gla gebildeten Gruppe bedeutet, wobei Gla einen gamma- Carboxyglutaminsäurerest bedeutet.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer DNA mit einer Nucleotidsequenz, die das vorstehend genannte erfindungsgemäße Polypeptid kodiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das einen replizierbaren Expressionsvektor und die vorstehend genannte DNA umfaßt, die in den Expressionsvektor eingesetzt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Transformanten, der einen Mikroorganismus oder eine kultivierte Tierzellinie umfaßt, die mit dem vorstehen genannten rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung des vorstehend genannten, im wesentlichen reinen erfindungsgemäßen Polypeptids, bei dem man:
(a) den vorstehend genannten Transformanten mit einem Gehalt an einem Mikroorganismus, z.B. einem filamentösen Pilz, oder einer kultivierten Tierzellinie vorsieht, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind;
(b) den Transformanten kultiviert und ein Polypeptid bilden läßt; und (c) das Polypeptid vom kultivierten Transformanten isoliert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem Gehalt an einer wirksamen Menge des vorstehend genannten, im wesentlichen reinen erfindungsgemäßen Polypeptids und mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exipienten. Das in dieser pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete erfindungsgemäße Polypeptid besitzt eine Aktivität zum Inhibieren einer Blutkoagulation und einer Plättchenaggregation durch Thrombin und/oder eine Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C.
Bei den Untersuchungen wurde eine Stelle vom menschlichen Thrombomodulin gekennzeichnet, die an Protein C bindet. Beispielsweise wurde ein DNA-Fragment mit einer Nucleotidsequenz, die das vorstehend genannte, bereits gekennzeichnete Polypeptid mit 114 Aminosäureresten kodiert, in einen M13-Phagenvektor subkloniert. Der M13-Phagenvektor wurde einer Deletionsreaktion unterworfen, in der Abschnitte des subklonierten DNA-Fragments, die dem ersten Aminosäurerest (Val) bzw. den ersten beiden (Val Asp) Aminosäureresten vom N-Terminus des Polypeptids mit 115 Aminosäureresten entsprechen, durch das herkömmliche Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese einzeln abgetrennt wurden, um hierdurch zwei DNA-Fragmente zu erhalten. Jedes kodiert einen Deletionsmutanten vom menschlichen Thrombomodulin. Die zwei DNA-Fragmente wurden zur Anwendung in einer Tierzelle jeweils in den Expressionsvektor pSV2 eingesetzt und in COS-1 Zellen exprimiert. Es zeigte sich überraschend, daß ein Polypeptid aus 114-Aminosäuren, das durch Deletion des N- terminalen Aminosäurerests (Val) vom vorstehenden Polypeptid aus 115 Aminosäuren erhalten wurde, die gleiche spezifische Aktivitätshöhe hat wie das Polypeptid aus 115 Aminosäuren. Ein Polypeptid aus 113 Aminosäuren, das durch Deletion von zwei Aminosäureresten (Val Asp) vom N-Terminus des Polypeptids aus 115 Aminosäuren erhalten wurde, hat aber eine sehr niedrige spezifische Aktivität. Dies ist im nachstehend dargestellten Beispiel 1 gezeigt. Beispielsweise zeigte sich überraschend, daß der Asparaginsäurerest (nachstehend oft als "Asp³&sup6;&sup7;" bezeichnet), der sich an der Stelle 367 der vollständigen Aminosäuresequenz vom menschlichen Thrombomodulin befindet, gezeigt bei Fig. 55, zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protin C wesentlich ist.
Weiterhin wurde eine Deletionsmutante (E45) durch Deletion von 38 Aminosäuren vom C-Terminus des Polypeptids aus 114 Aminosäuren hergestellt. Die Aktivität von E45 wurde bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, daß E45 zwar eine ausreichende Aktivität besitzt, diese aber nur etwa zehn Prozent von der des Polypeptids aus 114 Aminosäuren beträgt.
Zur Untersuchung der Funktion von Asp³&sup6;&sup7; wurde eine DNA subkloniert, die die Aminosäuresequenz der Aminosäure 1 bis 516 der ganzen Aminosäuresequenz von menschlichem Thrombomodulin, gezeigt bei Fig. 55, in einen M13- Phagenvektor kodiert. Es wurde der Bereich des erhaltenen Plasmids substituiert, der Asp³&sup6;&sup7; durch das herkömmliche Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese kodiert, indem bei der Mutagenese eine synthetische DNA verwendet wird. Hierdurch erhält man ein DNA, die ein Polypeptid kodiert, das aus der Aminosäure 1 bis 516 der bei Fig. 55 gezeigten vollständigen Aminosäuresequenz bestand, mit der Ausnahme, daß Asp³&sup6;&sup7; von einem anderen Aminosäurerest, z.B. Ala und Glu, ersetzt wurde. Die DNA wurde in COS-1 Zellen exprimiert, wobei man bei der Anwendung in einer Tierzelle den Expressionsvektor pSV2 verwendet. Das Expressionsprodukt wurde mit Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protin C wurde gemessen. Als Ergebnis zeigte sich, daß die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protin C sehr niedrig ist (gezeigt bei nachstehend dargestelltem Beispiel 1), wenn Asp³&sup6;&sup7; durch einen Aminosäurerest, der keine elektrische Ladung besitzt, z.B. Ala, ersetzt ist. Es zeigte sich auch, daß die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protin C höher ist als die Aktivität vor der Mutagenese, wenn Asp³&sup6;&sup7; durch einen Aminosäurerest ersetzt ist, der wie Asp eine elektrische Ladung trägt, z.B. Glu und der gamma-Carboxyglutaminsäurerest (nachstehend oft als "Gla" bezeichnet). Somit zeigte sich, daß die Stelle Asp³&sup6;&sup7; vom menschlichen Thrombomodulin eine Bindung zu Protein C bereitstellen kann und die negative Ladung der Seitenkette von Asp eng mit der Funktion von Asp³&sup6;&sup7; zusammenhängt. Weiterhin zeigte sich überraschend, daß Asp³&sup6;&sup7; durch ein Peptid oder einen Polypeptidrest aus 2-20 Aminosäureresten, die aus Asp, Glu und Gla ausgewählt sind, ersetzt werden kann.
Weiterhin erfolgte zur Kennzeichnung einer Stelle vom menschlichen Thrombomodulin, das an Thrombin bindet, die Deletion einer spezifischen Aminosäuresequenz, die auf dem vorstehend genannten Polypeptid mit 115 Aminosäuren basiert, mit dem Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese. Hierdurch erhält man eine DNA, die ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäurereste 366 bis 442 vom menschlichen Thrombomodulin umfaßt und eine DNA, die ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäurereste 407 bis 480 vom menschlichen Thrombomodulin umfaßt. Diese DNAs wurden jeweils unter Verwendung des pSV2 Vektors in COS-1 Zellen exprimiert. Die hergestellten Polypeptide wurden gereinigt und hinsichtlich ihrer Bindungsfähigkeit zu Thrombin gemessen. Als Ergebnis zeigte sich, daß beide Polymere an Thrombin binden können. Unter der Voraussetzung, daß bei beiden Polypeptiden die Aminosäuresequenz gleich ist, die der Bindungsstelle zu Thrombin entspricht, wurden durch das herkömmliche Verfahren unter Verwendung einer automatischen Peptidsynthesevorrichtung drei Polypeptide hergestellt, die auf der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 406 bis 444 basieren. Die drei Polypeptide wurden hinsichtlich ihrer Aktivität zum Inhibieren der Bindung von Thrombomodulin an Thrombin gemessen. Als Ergebnis zeigte sich, daß ein Polypeptid mit einer spezifischen Aminosäuresequenz von 19 Aminosäuren, d.h. (Glu-Gys-Pro-Glu-Gly-Tyr-Ile-Leu-Asp-Asp-Gly-Phe-Ile-Cys- Thr-Asp-Ile-Asp-Glu), die Bindungsstelle vom menschlichen Thrombomodulin zu Thrombin enthält. Dies ist im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.
Basierend auf die vorstehenden Befunde wurde ein neues Polypeptid hergestellt, das sowohl eine Aminosäuresequenz, die der Stelle vom menschlichen Thrombomodulin entspricht, die eine Bindung an Protein C bereitstellt, als auch eine Aminosäuresequenz hat, die der Bindungsstelle vom menschlichen Thrombomodulin zu Thrombin (wie bei Beispiel 3, 4 und 5 angegeben) entspricht. Die Erfindung wurde somit abgerundet. Es wird ein neues Polypeptid bereitgestellt, das die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung mit dem neuen erfindungsgemäßen Polypeptid kann bei Verabreichungsverfahren angewandt werden, bei denen es sich nicht um eine intravenöse Infusion handelt, z.B. orale und intranasale Verabreichung.
Das im wesentlichen reine erfindungsgemäße Polypeptid besitzt eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel (I):
worin X
(a) einen Aminosäurerest aus der durch Glu und Gla gebildeten Gruppe oder
(b) einen Peptidrest aus der durch Asp, Glu und gebildeten Gruppe, wobei Gla einen gamma- Carboxyglutaminsäurerest bedeutet.
Der Aminosäurerest X, der der Bindungsstelle des Polypeptids an Protein C entspricht, besitzt vorzugsweise nicht mehr als 10 Aminosäurereste, bezogen auf die Zahl von Gla-Resten im Gla-Bereich vom Protein C, zu dem der Gla-Bereich das Polypeptid bindet.
Es ist weiterhin möglich, daß das erfindungsgemäße Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Formel (I) umfaßt, mindestens einen weiteren Peptid- oder Polypeptidtyp besitzt, der daran an seinem N-Terminus und/oder C-Terminus gebunden ist.
Es ist auch möglich, einen Teil der Struktur des Polypeptids durch natürliche oder künstliche Mutation zu verändern, ohne die Aktivität des Polypeptids im wesentlichen zu verändern. Das erfindungsgemäße Polypeptid umfaßt Polypeptide mit einer Struktur, die homologen Formen des Polypeptids mit der vorstehend genannten Aminosäuresequenz entspricht.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mindestens einen Zuckerrest enthalten.
Die erfindungsgemäße Deoxyribonukleinsäure umfaßt eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) kodiert, wobei die Nucleotidsequenz gemäß der Degeneration des genetischen Codes mindestens an einem Nucleotid unsubstituiert oder substituiert ist.
Die erfindungsgemäße Deoxyribonukleinsäure (DNA) umfaßt eine Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der vorstehend beschriebenen Formel (I) kodiert. Die erfindungsgemäße DNA kann die Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) kodiert und, daran an ihr 5'- und/oder 3'- ende gebunden, mindestens eine Nucleotidsequenz umfassen, bei der es sich nicht um diejenige handelt, die die Aminosäuresequenz der Formel (I) kodiert.
Erfindungsgemäß wird auch eine DNA bereitgestellt, die zur vorstehend beschriebenen DNA komplementär ist. Erfindungsgemäß können die vorstehend genannte DNA und die komplementäre DNA gegenseitig komplementär verbunden sein, so daß sich eine doppelsträngige DNA ausbildet.
Die Struktur der DNA und die Struktur des davon abgeleiteten Polypeptids können bei der natürlichen oder künstlichen Mutation zum Teil verändert werden, ohne daß die Hauptaktivität des Polypeptids verändert wird. Die erfindungsgemäße DNA kann daher auch eine Nucleotidsequenz besitzen, die ein Polypeptid mit einer Struktur kodiert, die der einer homologen Form eines der vorstehend genannten Polypeptiden entspricht.
Gemäß der Degeneration des genetischen Codes ist es möglich, mindestens ein Nucleotid aus der Nucleotidsequenz eines Gens durch ein anderes Nucleotid zu ersetzen, ohne daß die Aminosäuresequenz des Polypeptids verändert wird, das aus dem Gen hergestellt wird. Die erfindungsgemäße DNA kann daher auch irgendeine Nucleotidsequenz besitzen, die durch Substitution gemäß der Degeneration des genetischen Codes verändert worden ist. Bei diesem Beispiel ist die Aminosäuresequenz, die von der Nucleotidsequenz abgeleitet ist, die bei der vorstehend genannten Substitution erhalten wird, mit der vorstehend bestimmten Aminosäuresequenz identisch.
Die erfindungsgemäße replizierbare, rekombinante DNA umfaßt einen replizierbaren Expressionsvektor und die vorstehend genannte darin insertierte erfindungsgemäße Desoxyribonukleinsäure. Die rekombinante DNA kann in einem transformierten Mikroorganismus oder in einer Zelle ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren umfassen die Plasmide: pBR322, pBR327, pUC18, pUC19, YRp7, YEp24 (ATCC 37051), pPGACY2, pBSFAHY83, pSV2-dhfr (ATCC 37146), pBPV-1(9-1) (ATTCC 37111) und dergl. Dabei ist es notwendig, einen Expressionsvektor auszuwählen, der für einen Mikroorganismus oder eine Zelle, die als Wirt verwendet werden, geeignet ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Mikroorganismus oder eine Zellinie, die mit dem vorstehend genannten replizierbaren, rekombinanten DNA- Molekül transformiert sind. Beispiele für Mikroorganismen umfassen: Escherichia coli Stämme, z.B. E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli C600 und E. coli JM105; Bacillus Bakterien, z.B. Bacillus subtilis; Enterobacteria, bei denen es sich nicht um E. coli Stämme handelt, z.B. Salmonella typhimurium und Serratia mercasans; Pseudomonas Bakterien; Saccaromyces cerevisiae; und filamentöse Pilze, z.B. Aspargillus nidulans und Acremonium chrysogenum (ATCC 11550). Beispiele für Zellinien umfassen Tierzellinien, z.B. die Zellinien VERO (ATCC CCL-81) und HeLa, Zellinien aus dem Eierstock des Chinahamsters (CHO) und die Zellinien WI38, BHK, COS-1, MCK und dergl.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids umfaßt:
(a) das Bereitstellen eines Transformanten mit einem Mikroorganismus oder einer kultivierten Tierzellinie, die mit einem rekombinanten erfindungsgemäßen DNA-Molekül transformiert sind;
(b) das Kultivieren des Transformanten, so daß ein Polypeptid entsteht; und
(c) Isolieren des Polypeptids aus dem kultivierten Transformanten.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das vorstehend genannte erfindungsgemäße DNA an einen Expressionsvektor an dessen Abschnitt geknüpft, der sich downstream vom DNA Bereich des Vektors mit einem Promotor etc. befindet, so daß die erfindungsgemäße DNA genau in die mRNA transkribiert und die mRNA genau in ein Polypeptid translatiert werden kann. So erhält man einen replizierbaren Expressionsvektor, der die vorstehend genannte DNA enthält. Dann werden Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit dem so erhaltenen replizierbaren, rekombinanten DNA-Molekül transformiert, so daß man einen transformierten Mikroorganismus oder eine Zelle mit dem rekombinanten DNA-Molekül erhält. Der so erhaltene Transformant wird von den Mutterzellen des Mikroorganismus oder der Zelle mit Hife einer phenotypischen Ausprägung isoliert, die ihr vom recombinanten DNA-Molekül verliehen wurde. Der erhaltene Transformant wird kultiviert, so daß man die genetische Information exprimiert, die durch die vorstehend genannte Desoxyribonukleinsäure kodiert wird, um hierdurch das erfindungsgemäße Polypeptid herzustellen.
Zum Klonieren der DNA-Sequenzen, die zur Herstellung der DNA und des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA- Moleküls erforderlichen sind, verwendet man zum Beispiel einen Promotor und einen Replikationsstartpunkt, etc. Bevorzugt wird ein Wirt-Vektor-System verwendet, bei dem eine Prokaryotenzelle als Wirt eingesetzt wird. Beispiele für Prokaryotenzellen umfassen: Escherichia coli Stämme, z.B. der E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli C600, E coli C600hf1 und E. coli W3110 (F&supmin;, λ&supmin;, prototroph, ATCC 27375); Bacillus Bakterien, z.B. Bacillus subtilis; Enterobacteria, bei denen es sich nicht um E. coli Gattungen handelt, z.B. Salmonella typhimurium und Serratia mercasans; Pseudomonas Bakterien; und Saccaromyces cerevisiae. Aus diesen ist der E. coli K12 Stamm 294 am stärksten bevorzugt. Verwendet man den vorstehend genannten Mikroorganismus als Wirt, so wird ein Plasmidvektor, der für den vorstehend genannten Mikroorganismus geeignet ist, im allgemeinen als replizierbarer Expressionsvektor für das rekombinante DNA-Molekül eingesetzt. Beispielsweise können die Plasmide pBR322, pBR327, pUC18 und pUC19 als Plasmidvektor zum Transformieren eines E. coli Stamms verwendet werden. Ein Plasmidvektor enthält im allgemeinen einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor und ein Markierungsgen, das dem rekombinanten DNA eine phenotypische Ausprägung verleiht, die geeignet ist zur Auswahl einer Zellinie, die mit der rekombinanten DNA transformiert ist. Beispiele für Promotoren umfassen eine beta-Lactamase und einen Lactosepromotor, einen Tryptophanpromotor und dergl. Beispiele für Markierungsgene umfassen ein Gen zur Ampicillinresistenz, ein Gen zur Tetracylinresistenz, ein Gen zur Hygromycinresistenz und dergl. Andererseits kann bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids nicht nur das vorstehend genannte Wirt-Vektor-System, in dem eine Prokaryotenzelle als Wirt verwendet ist, verwendet werden, sondern auch ein Wirt-Vektor-System, in dem eine Eukaryotenzelle, z.B. Zellen von Wirbelsäulen, als Wirt eingesetzt ist. Beispiele für Eukaryotenzellen umfassen Zellen wie die vorstehend genannte Tierzellinie Zur Expression der erfindungsgemäßen DNA in die vorstehend genannte Eukaryotenzelle enthält das erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül allgemein funktionelle Sequenzen zum Steuern der Genexpression, z.B. einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, der sich upstream der erfindungsgemäßen DNA befinden soll, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Polyadenylierungsstelle und eine Terminationssequenz der Transkription. Diese funktionellen Sequenzen, die zur Expression der erfindungsgemäßen DNA in einer Eukaryotenzelle verwendet werden sollen, erhält man von einem Virus oder einer viralen Substanz.
Beispielsweise kann man einen Promotor, der in der Erfindung verwendet wird, vom Adeno-Virus 2, vom Polyoma Virus, vom Simian Virus 40 (SV40) und dergl. erhalten. Insbesondere sind der late Hauptpromotor vom Adenovirus 2 und der early Promotor und der late Promotor vom SV40 bevorzugt. Weiterhin kann auch ein Promotor eingesetzt werden, der selbst an einem Abschnitt upstream eines Gen liegt, das ein aus der menschlichen Lunge stammendes Peptid kodiert, das die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt, solange wie der Promotor im vorstehend genannten Wirt- Vektor-System verwendet wird.
Beim Replikationsstartpunkt können endogene Startpunkte eingesetzt werden, z.B. Replikationsursprünge, die von einem Virus wie Adenovirus, Polyomavirus, SV40, vesikularem Stomatitis Virus (VSV) und Papilloma Virus vom Rind (BPV) stammen. Der Replikationsstartpunkt des Wirtschromosoms kann auch verwendet werden, wenn ein Vektor, der in ein Wirtschromosom eingesetzt wird, als Expressionsvektor verwendet wird.
Der Mikroorganismus oder die Zellinie, transformiert mit dem erfindungsgemäßen replizierbaren, rekombinanten DNA-Molekülen, sind, wie vorstehend beschrieben, aus Stammzellen ausgewählt, die mit Hilfe mindestens einer phenotypischen Ausprägung, die ihr durch das rekombinante DNA-Molekül verliehen wurde, nicht transformiert bleiben. Eine phenotypische Ausprägung kann an ein rekombinantes DNA-Molekül weitergegeben werden, indem mindestens ein Markierungsgen in das rekombinante DNA-Molekül eingesetzt wird. Ein Markierungsgen im replizierbaren Expressionsvektor selbst kann auch verwendet werden. Beispiele für Markierungsgene umfassen ein Gen zur Arzneimittelresistenz, z.B. Neomycinresistenz und ein Gen, das Dihydrofolatreduktase (nachfolgend als "DHFR" bezeichnet) kodiert. Dabei gibt es verschiedene DHFR- Arten. Wird daher ein Gen, das DHFR kodiert, als Markierungsgen verwendet, muß die Wirtszelle, die verwendet werden soll, nach den DHFR-Arten ausgewählt werden, die durch das Markierungsgen, das eingesetzt werden soll, kodiert ist Wird z.B. ein Gen, das ein DHFR vom Wildtyp kodiert, als Markierungsgen verwendet, bevorzugt man eine wirtszelle ohne DHFR. Dieser DHFR- freie Stamm verlangt Hypoxanthin, Glycin und Thymidin. Er kann deshalb nicht in einem Medium wachsen, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält. Wird der DHFR- freie Stamm jedoch mit einem rekombinanten DNA mit einem Gen transformiert, das DHFR kodiert, so verlangt der Stamm kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin mehr. Er kann sogar in einem Medium wachsen, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält. Transformierte Zellen können deshalb leicht von nicht transformierten Zellen abgetrennt werden, wobei bei Hypoxanthin, Glycin und Thymidin als Kennzeichen eine Auxotrophie verwendet wird.
Wird ein Gen, das eine mutante DHER kodiert, das eine geringe Affinität zu Methotrexat (MTX) (das Gen ist nachfolgend als "MTX-resistentes DHFR Gen" bezeichnet) hat, als Markierungsgen verwendet, kann andererseits die Wirtszelle ein Gen enthalten, das eine normale DHFR kodiert. Sie braucht keinen Mangel an DHFR haben. Der Grund dafür ist folgender: die normale DHFR wird durch MTX inhibiert. Deshalb verlangt eine Wirtszelle mit einem Gen, das eine normale DHFR kodiert, Hypoxanthin, Glycin und Thymidin in Gegenwart von MTX. Wird eine solche Wirtszelle jedoch mit einer rekombinanten DNA transformiert, die das MTX-resistente DHFR Gen enthält, verlangt die transformierte Zelle sogar in Gegenwart von NTX kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin mehr. Die transformierte Zelle kann deshalb von nicht transformierten Zellen ausgewählt sein, wobei bei Hypoxanthin, Glycin und Thymidin in Gegenwart von MTX als Kennzeichen eine Auxotrophie verwendet wird. Dabei ist der größte Teil der Eukaryotenzellen gegenüber MTX empfindlich. Deshalb kann mit Vorteil das MTX-resistente Gen als Markierungsgen eingesetzt werden.
Weiterhin können auch Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae, als Wirt verwendet werden, um die erfindungsgemäße DNA zu exprimieren. Zur Expression der erfindungsgemäßen DNA in der Hefe kann z.B. ein Plasmid YEp24 als replizierbarer Expressionsvektor verwendet werden. Das Plasmid YEp24 enthält ein Ura3-Gen. Das Ura3- Gen kann als Markierungsgen verwendet werden.
Beispiele für Promotoren des Expressionsvektors, der bei einer Hefezelle verwendet wird, umfassen: Promotoren von Genen von Enzymen, die beim Glykolysezyklus beteiligt sind, z.B. 3-Phosphoglyceratkinase oder Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphadehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6phosphatisomerase und Glucokinase und Gene der Alkoholdehydrogenase 2, vom Isocytochrom C, der Säurephosphatase, von Enzymen, die beim Stickstoffabbau beteiligt sind, der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, von Enzymen, die bei der Verwendung von Galaktose, Maltose und Laktose beteiligt sind und dergl. Aus diesen sind Promotoren von Genen der Alkoholdehydrogenase 2, vom Isocytochrom C, der Säurephosphatase, von Enzymen, die beim Stickstoffabbau beteiligt sind, der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, von Enzymen, die bei der Verwendung von Galaktose, Maltose und Laktose beteiligt sind stärker bevorzugt, weil die Transkription durch die Wirkung dieser Promotoren gesteuert werden kann, indem man die Kultivierungsbedingungen für den Wirt ändert.
Beim Replikationsstartpunkt, Terminationskodon und bei anderen Sequenzen, die der Steuerung der Transkription und der Translation in einer Hefezelle dienen, kann irgendeine gewöhnliche Sequenz verwendet werden, solange sie für die Hefezelle geeignet ist.
Filamentöser Pilz, z.B. Aspargillus nidulans und Acremonium chrysogenum (ATCC 11550), kann auch als Wirt eingesetzt werden, um die erfindungsgemäße DNA zu exprimieren. Zur Expression der erfindungsgemäßen DNA mit filamentösem Pilz werden z.B. pPGACY2 und pBSFAHY83 als Expressionsvektoren eingesetzt, die durch das Verfahren erhalten werden, das in der Japanischen Patentanmeldung 2-219032 (Matsuda et al.), die der ungeprüften Japanischen Patentoffenlegungsschrift 4-104792 entspricht, beschrieben ist. Dies ist in den Vergleichsbeispielen 1-(1) und 1-(3) und in den Fig. 56 und 58 beschrieben.
Der Promotor und der Terminator des Expressionsvektors für Acremonium chrysogenum umfassen z.B. jene der Gene von Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPD), Actin und dergl. Es können DNA-Fragmente mit diesen Promotoren und Terminatoren z.B. aus einer Chromosomenbibliothek von Acremonium chrysogenum erhalten werden (nach dem im nachstehenden Vergleichsbeispiel 2-(1) beschrieben Verfahren).
Der transformierte Mikroorganismus oder die Zellinie können in einem gewöhnlichen Nährmedium nach dem herkömmlichen Verfahren kultiviert werden, um die DNA zu exprimieren, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, und um das erfindungsgemäße Polypeptid herzustellen. Nach dem Kultivieren kann das erfindungsgemäße Polypeptid aus der Kultur des Transformanten mit einem herkömmlichen Verfahren, z.B. einer Säulenchromatographie, etc. isoliert werden.
Das so erhaltene Polypeptid kann mindestens einen Zuckerrest enthalten, der in der Art und Länge verschieden ist. Es hängt von der eingesetzten Wirtszelle ab, ob das entstandene Polypeptid einen Zuckerrest enthält oder nicht. Weiterhin sind die Art und die Länge der Zuckerkette auch von der eingesetzten Wirtszelle abhängig.
Es ist allgemein bekannt, daß ein vom Anfangskodon ATG durch Translatlon ausgebildetes Polypeptid verarbeitet werden kann, so daß ein reifes Polypeptid entsteht, wenn das Polypeptid aus der Wirtszelle ausgeschieden wird. Das erfindungegemäße Polypeptid kann auch derart verarbeitet werden. Die Stelle, an der das Polypeptid verarbeitet wird, ändert sich je nach Wirt und den Kultivierungsbedingungen. Wird beispielsweise das erfindungsgemäße Polypeptid in einer transformierten Zelle in nicht verarbeiteter, nicht reifer Form mit der Aminosäuresequenz der Formel (I) und einer Leader-Sequenz ausgebildet, kann das nicht reife Polypeptid verarbeitet werden, indem die Leader-Sequenz abgeschnitten wird und ein reifes Polypeptid entsteht. Wie vorstehend beschrieben, ändert sich der verarbeitete Abschnitt des nicht reifen Polypeptids nach der Art des eingesetzten Wirts und den Kultivierungsbedingungen für den Wirt. Die vorstehend genannte Verarbeitung erfolgt deshalb nicht immer.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch mit einer Leader-Sequenz von anderen Proteinen exprimiert werden. Darüber hinaus können unter Verwendung einer spezifischen Protein-Leader-Sequenz die Aminosäurereste des Polypeptids nach der Leader-Sequenz verändert werden. Beispielsweise kann durch die Verwendung von Leader- Sequenzen vom Prothrombin, Blutkoagulationsfaktor IX, Blutkoagulationsfaktor X, Blutkoagulationsfaktor VII, vom Protein C, Protein S und dergl. der Glutaminsäurerest in der Nähe des N-Terminus des Polypeptids, der nach derartigen Leader-Sequenzen folgt, an der gamma Position carboxyliert werden (B.Furie et al., Blood, 75, 9 1753-1762, 1990)
Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Polypeptid mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch durch organisch-chemische Synthesen nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Verwendung einer im Handel erhältlichen automatischen Vorrichtung zur Peptidsynthese, etc.
Das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C. Protein C ist ein vom Vitamin K abhängiges Protein. Es spielt eine wichtige Rolle im Blutkoagulations-Fibrinolyse System. Es wird durch die Wirkung von Thrombin aktiviert. Es ist bekannt, daß das aktivierte Protein C im Körper die aktivierten Faktoren V und VIII der Koenzyme des Blutkoagulationssystems inaktiviert. Es ist bei der Produktion vom Plasminogenaktivator beteiligt, der thrombolytische Aktivität besitzt (Koji Suzuki, Igaku No Ayumi, History of Medicine, 125, 901, 1983) Das erfindungsgemäße Polypeptide fördert die Thrombin-katalysierte Aktivierung von Protein C, um hierdurch die Herstellung einer großen Menge an aktiviertem Protein C zu ermöglichen, das eine Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation und eine thrombolytische Aktivität besitzt. Das erfindungsgemäße Polypeptid ist daher eng mit der in vivo Inhibierung der Blutkoagulation und der Thrombolyse verbunden.
Wie vorstehend genannt, besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation, der Plättchenaggregation und der Thrombolyse. Es kann daher beispielsweise bei der Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten wie myocardialem Infarkt, Thrombose, Embolie, Verschluß von peripheren Blutgefäßen, Arteriosclerosis obliterans, disseminantem intravasalen Koagulations (DIC) Syndrom, Angina Pectoris, transienter ischemischer Störung und Toxämien bei der Schwangerschaft verwendet werden. Bei der Behandlung der vorstehend genannten Krankheiten kann das erfindungsgemäße Polypeptid als Mixtur mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exipienten verwendet werden. Beispielsweise kann eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids zur Behandlung oder Vorbeugung der vorstehend genannten Krankheiten mit einer geeigneten Menge an Träger, Verdünnungsmittel oder Exipienten zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung vermengt werden, die einem Patienten verabreicht werden kann. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann nicht nur als Injektion, sondern auch als Zusammensetzung verwendet werden, die oral und nasal, z.B. durch die Nostrilmucosa, verabreicht werden kann.
Die Dosis des erfindungsgemäßen Polypeptids hängt beim erwachsenen Patienten ab vom Alter, Geschlecht, Gewicht, Körperverfassung, etc, Die Dosis beträgt allgemein etwa 0,1 bis etwa 200 mg. Das Polypeptid kann einmal täglich, falls gewünscht mehrmals täglich, eingenommen werden.

Eingehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung ist eingehender an den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen beschrieben, die die Erfindung aber nicht einschränken sollen.
Die Herstellung des Plasmids, das in filamentösem Pilz eingesetzt werden soll, um das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren, ist in den Vergleichsbeispielen beschrieben, die nach den Beispielen beschrieben sind.

Beispiel 1

Kennzeichnung einer Aminosäuresequenz eines Abschnitts des menschlichen Thrombomodulins, durch den das Thrombomodulin an Protein C binden kann.
(1) Herstellung von pSV2TMD7 und pSV2TMD8
(a) Herstellung des Plasmids M13TMD3
Das Plasmid pSV2TMJ2 (ATCC 67283), beschrieben im Beispiel 1-(1) der internationalen ungeprüften Patentanmeldung WO88/05053, die der EP 0312598 entspricht, wird mit dem Restriktionsenzym NcoI vollständig verdaut, so daß man das Plasmid spaltet. Beide Enden des gespaltenen Plasmids werden mit E. coli- DNA-Polymerase behandelt, um die Enden abzustumpfen. Das abgetrennte Plasmid wird dann mit dem Restriktionsenzym HindIII vollständig verdaut, so daß man ein DNA-Fragment von etwa 1900 bp erhält. Das so erhaltene DNA-Fragment wird mit TMJ3 bezeichnet. Andererseits wird ein Phage M13mp19 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan, Verzeichnis Nr. 3119) mit den Restriktionsenzymen HindIII und HincII verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Das DNA-Fragment TMJ3 wird in den vorstehend genannten Vektor eingesetzt, so daß man ein rekombinantes Plasmid M13mp19TMJ3 erhält. Getrennt davon wird eine DNA-Sonde auf organochemischem Weg hergestellt, um TMd3 mit folgender Nucleotidsequenz zu deletieren (nachstehend als "Deletor" bezeichnet):
5'-GGAGGCCGCTCAACAGTCGGTGCCA-3' (25mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13mp19TMJ3 folgender Abschnittsequenz
CAC ATT GGC ACC GAC TGT TGAGCGGCCT CC
His Ile Gly Thr Asp Cys hybridisiert. Dies ist in Fig. 1 gezeigt.
Dann wird mit einem Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese eine 285 bp Nucleotidsequenz vom vorstehend erhaltenen Rekombinationsplasmid M13mp19TMJ3 deletiert, wobei der so erhaltene Deletor TMd3 nach dem Verfahren, beschrieben in Method in Enzymology, 100, 468 (1983), Academic Press, verwendet wird.
Beispielsweise werden 25 pmol Deletor TMd3 und 10 pmol M13-Primer-M3 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan, Verzeichnis Nr. 3831) mit T4- Kinase an ihren 5'-Enden phosphoryliert. Der phosphorylierte Deletor und Primer wird mit 0,5 pmol einer Einzelstrang-DNA vom rekombinanten Plasmid M13mp19TMJ3 versetzt. Das entstandene Gemisch wird bei 95ºC 5 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Dann werden in das Gemisch 5 Einheiten E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und 10 Einheiten T4- DNA-Ligase eingebracht. Das Gemisch wird bei 37ºC 30 Minuten inkubiert, so daß im Gemisch ein rekombinantes Plasmid entsteht.
Das so erhaltene Gemisch wird in eine E. coli JM105- Kultur eingebracht (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden, Verzeichnis 27-1550), so daß E. coli mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert wird. E. coli wird auf einer Agarplatte bei 37ºC über Nacht kultiviert, so daß hierdurch auf der Agarplatte Plaques entstehen. Die Plaques werden auf einem Nitrozellulosefilter eingesetzt. Dann wird mit Alkali denaturiert und mit 0,5 M Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 7,5) neutralisiert und bei 80ºC 2 Stunden erhitzt. Dann wird der Nitrozellulosefilter in einer Lösung mit 6 x SET (0,9 M NaCl, 180 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,0) und 6 mM EDTA), 5 x Denhart's (0,1 % (m/v) Polyvinylpyrrolidon und 0,1 % (m/v) Rinderserumalbumin (BSA)), 0,1 % SDS und 100 mg/ml denaturierter Lachssperma-DNA bei 55ºC 2 Stunden prähybridisiert. Anschließend wird der entstandene Nitrozellulosefilter bei 55ºC 2 Stunden in einer Lösung gleicher Zusammensetzung wie die vorstehende Lösung hybridisiert, mit dem Unterschied, daß ein ³²P-markiertes TMd3 anstelle der denaturierten Lachssperma-DNA verwendet wird. Der Nitrozellulosefilter wird dann zwei mal mit 6 x SSC (wäßrige Lösung mit 0,9 M NaCl und 0,09 M Trinatriumcitrat) bei Raumtemperatur jeweils 5 min gewaschen. Weiterhin wird der Filter mit der gleichen Lösung sukzessiv bei 55ºC, 65ºC und 75ºC gewaschen. Der vorstehende Waschvorgang erfolgt bei der jeweiligen Temperatur zweimal 5 min. Dann wird der Röntgenfilm XAR-5 (hergestellt und vertrieben von Estman Kodak Company, U.S.A.) mit dem entstandenen Nitrozellulosefilter in Kontakt gebracht und bei -80ºC über Nacht mit Röntgenstrahlen belichtet. Als Ergebnis werden mehrere stark belichtete schwarze Flecken auf dem Röntgenfilm beobachtet. Jeder Fleck entspricht den jeweiligen Klonen, die mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert worden waren. Es werden sechs Klone aus den erhaltenen Klonen ausgewählt. Das rekombinante Plasmid wird aus jedem der ausgewählten Klone isoliert. Jedes Plasmid wird hinsichtlich seiner Restriktionsstellen und Nucleotidsequenz analysiert. Es zeigte sich, daß die rekombinanten Plasmide der Klone hinsichtlich ihrer Restriktionsstellen und Nucleotidsequenz identisch sind. Es zeigte sich, daß das so erhaltenen DNA-Fragment eine Nucleotidsequenz mit dem Initiatorcodon ATG und downstream davon eine Nucleotidsequenz hat, die ein Polypeptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 480 der Sequenz von Fig. 55 umfaßt. Dieses DNA-Fragment wird mit TMD3 bezeichnet. Das rekombinante Plasmid mit diesem DNA-Fragment wird mit M13TMD3 bezeichnet. Fig. 1 beschreibt das rekombinante Plasmid M13mp19TMJ3, mit dem der Deletor TMd3 hybridisiert wird und von dem der DNA- Abschnitt, der dem DNA-Fragment TMJ3 entspricht, zum Teil deletiert wird.

(b) Herstellung vom Plasmid pSV2TMD7

Das im Beispiel 1-(1)-(a) erhaltene rekombinante Plasmid M13TMD3 wird nach dem ortsspezifischen Mutageneseverfahren im wesentlichen wie in Beispiel 1- (1)-(a) einer Teildeletion von 1044 Nucleotiden unterworfen, mit der Ausnahme, daß der Deletor TMd5 folgende Nucleotidsequenz hat.
5'-GAAGCACGGGTCGGGGAACCCCAGG-3' (25mer),
die komplementär ist zu einem Abschnitt des Plasmids M13TMD3, das die folgende, wie in Fig. 2 gezeigte Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC GAC CCG TGC TTC AGA hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet. Hierdurch erhält man ein rekombinantes Plasmid M13TMD7 in das ein DNA-Fragment insertiert ist, das als TMD7 bezeichnet ist. Dieses DNA-Fragment TMD7 besitzt eine Nucleotidsequenz mit einem Initiatorcodon ATG und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest aus, der dem Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 367 bis 480 der Sequenz von Fig. 55 umfaßt. Fig. 2 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD3, mit dem der Deletor TMd5 hybridisiert wird und von dem der DNA-Abschnitt, der dem DNA-Fragment TMD3 entspricht, zum Teil deletiert wird. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMD7-DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMD7-DNA-Fragment von etwa 580 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von 580 bp werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMD7 erhält.

(c) Herstellung vom Plasmid pSV2TMD8

Das in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltene rekombinante Plasmid M13TMD3 wird im wesentlichen wie in Beispiel 1- (1)-(a) nach dem ortsspezifischen Mutageneseverfahren einer Teildeletion von 1047 Nucleotiden unterworfen, mit der Ausnahme, daß der Deletor TMd6 folgende Nucleotidsequenz hat:
5'-TCTGAAGCACGGGGGGAACCCCAGG-3' (25 mer), die mit einem Abschnitt aus dem Plasmid M13TMD3 hybridisiert, das die folgende, wie in Fig. 3 gezeigte Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC CCG TGC TTC AGA GCC hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet. Hierdurch erhält man ein rekombinantes Plasmid M13TMD8, in das ein DNA-Fragment insertiert ist, das als TMD8 bezeichnet ist. Dieses DNA- Fragment TMD8 besitzt eine Nucleotidsequenz mit einem Initiatorcodon ATG und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das die Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurererest aus, der dem Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 368 bis 480 der Sequenz von Fig. 55 umfaßt. Fig. 3 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD3, mit dem der Deletor TMd6 hybridisiert wird und von dem der DNA-Abschnitt, der dem DNA-Fragment TMD3 entspricht, zum Teil deletiert wird. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMD8 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMD8-DNAFragment von etwa 580 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von 580 bp werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMD8 erhält.

(2) Transfektion der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 in Zellen der Zellinie COS-1

Die Zellen der Zellinie COS-1 (ATCC CRL1650) werden kultiviert in einem minimal notwendigen Medium nach Dulbecco (nachstehend als "DMEM" bezeichnet, hergestellt und vertrieben von Flow Laboratories Inc., U.S.A., Verzeichnis Nr. 10-311) mit 10 % (v/v) fetalem Kalbsserum (nachstehend als "FCS" bezeichnet, hergestellt und vertrieben von GIBCO, U.S.A.), das in einer Gewebekulturschale enthalten ist. Erreicht die Kultur eine logarithmische Wachstumsphase, werden die gezüchteten Zellen, die aneinander und an der Gewebekulturschale haften, von der Gewebekulturschale gelöst, wobei man einen Phosphat-Puffer (PBS) mit 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA verwendet. Die abgelösten Zelles werden in einem 7mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) mit 272 mM Saccharose und 1 mM MgCl 2 suspendiert, um sie einer Elektroporation mit 272 mM Saccharose und 1 mM MgCl&sub2; zu unterwerfen, so das die Zellkonzentration 8 x 10&sup6; Zellen/ml hat. Hierdurch erhält man eine Zellsupension. Zur Elektroporation wird 500 µl der entstandenen Zellsuspension in eine Küvette (hergestellt und vertrieben von Bio-rad Corp., U.S.A., Verzeichnis Nr. 165-2085) eingebracht. Jedes der beiden in Beispiel 1-(1) hergestellten Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 DNA wird in einen 0,1 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) suspendiert, so daß die DNA-Konzentration 4 µg/ml hat. Es wird 5 µl der Suspension mit 20 µg Plasmid-DNA in die vorstehend genannte COS-1 Zellsuspension in der Küvette eingebracht und 10 Minuten bei 0ºC belassen. Anschließend wird die Küvette in eine Elektroporationsvorrichtung (hergestellt und vertrieben von Bio-rad Corp., U.S.A., Verzeichnis 165-2075) übergeführt. Es wird zweimal bei 3 µF und 450 V in Abständen von 30 Sekunden ein elektrischer Impuls angewandt. Man läßt die Küvette 10 Minuten bei 0ºC. Die Zellsuspension wird in 10 ml DMEM mit 10 % (v/v) FCS eingetragen und in eine Gewebekulturschale (Durchmesser: 10 cm) gegeben. Die Zellsuspension in der Gewebekulturschale wird in einem CO&sub2; Gas-Inkubator bei 37ºC 24 Stunden kultiviert. Dann wird das Kulturmedium durch 10 ml DMEM ohne FCS ersetzt und weiter 48 Stunden inkubiert. Die Zellkultur wird der Gewebekulturschale entnommen.
(3) Aktivitätsbestimmung der Polypeptide, die durch Kultivieren von COS-1 Zellen, die durch die Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 transformiert werden, hergestellt werden, zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C.
Es wird 5 µl des Überstands der Kultur der COS-1 Zellen mit jedem der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 transformiert. Es werden 3 µl Thrombin (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, Verzeichnis Nr. T- 6759, 20ng/µl), 5 µl 10 x Bestimmungspuffer mit 1 M NaCl, 30 mM CaCl&sub2;, 1 % Kalbserumalbumin und 0,5 M Tris-HCl- Puffer (pH-Wert 8,5) und 29,5 µl destilliertes Wasser zusammen vermengt, und 5 Minuten bei 37ºC belassen. Dann wird 7,5 µl Protein C (vom Rind, 0,2 µg/µl) zur Mischung zugegeben. Die Umsetzung erfolgt 30 Minuten bei 37ºC. Sie wird durch Zugabe von 6,25 µl einer Stop-Lösung beendet (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,5, mit 100 mM NaCl, 0,3A&sub2;&sub8;&sub0; Antithrombin III und 100 µg/ml Heparin).
Die Aktivität des aktivierten Proteins C wird gemessen, indem man zuerst 10 µl Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (hergestellt und vertrieben von Peptide Institute, The Foundation (Japan), 5 mg/ml), 5 µl % M CsCl und 495 µl eines Reaktionssubstratpuffers (50 mM Tris-HCl-Puffer mit 100 mM NaCl (pH-Wert 8,5)) zugibt. Anschließend erfolgt die Umsetzung 20 Minuten bei 37ºC. Die Umsetzung wird dann durch Zugabe von 55 µl Essigsäure beendet. Die Konzentration von freigesetzter AMC (7-Amino-7-methyl- coumarin) wird schließlich mit einem Spektrofluorometer (Modell RF-540, hergestellt und vertrieben von Shimadzu Corporation, Japan) bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm gemessen. Die erhaltene Fluoreszenzintensität wird mit der Fluoreszenzintensität einer Lösung verglichen, die eine bekannte AMC Konzentration besitzt, so daß die Menge an freigesetztem AMC bestimmt wird. Die Aktivität des Polypeptids zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C ist der Differenzbetrag aus dieser Menge und der Menge AMC bei der Zugabe einer wäßrigen Lösung, die kein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält. Die Aktivität zur Bildung von 1 nM aktiviertem Protein C pro ml Reaktionsgemisch und pro Minute ist als 1 u (Einheit) definiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
(4) Bestimmung der Menge an Polypeptid, hergestellt durch Kultivierung von COS-1 Zellen, die mit jedem der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 transformiert werden.
Die Menge an Polypeptid im Überstand einer Kultur von COS-1 Zellen, die mit jedem der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMD8 transformiert werden, wird nach dem Verfahren von K. Suzuki et al. (J. Biol. Chem. 246, 4872-4876, 1989) gemäß der Enzymimmunoassay (nachfolgend als "ELISA" bezeichnet), wobei ein Kaninchenantikörper verwendet wird, der an den menschlichen Thrombomodulinantikörper bindet. Die eingehende Beschreibung ist folgende:

(a) Herstellung des Plasmids pSV2TMD1

Das in Beispiel 1-(1)-(a) erhaltene rekombinante Plasmid wird im wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) gemäß des Verfahrens der ortsspezifischen Mutagenese einer Teildeletion von 177 Nucleotiden unterworfen, mit der Ausnahme, daß der Deletor TMd1 folgende Nucleotidsequenz hat:
5'-GGAGGCCGCTCAGCCCGAATGCACG-3' (25 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13mp19TMJ3 hybridisiert, das die folgende, wie in Fig. 4 gezeigte Abschnittsequenz GGG CTC GTG CAT TCG GGC TGAGCGGCCT CCGTCCAG hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet. Hierdurch erhält man das rekombinante Plasmid M13TMD1, in das ein mit TMD1 bezeichnetes DNA-Fragment insertiert ist. Dieses DNA- Fragment TMD1 besitzt eine Nucleotidsequenz, einschließlich eines Initiatorcodon ATG und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 516 vom Aminosäurerest aus, der dem Initiatorcodon der Sequenz von Fig. 55 entspricht, umfaßt. Fig. 4 beschreibt das rekombinante Plasmid M13mp19TMJ3, mit dem der Deletor TMd1 hybridisiert wird und von dem der DNA-Bereich, der dem DNA-Fragment TMJ3 entspricht, zum Teil deletiert wird. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMD1-DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMD1-DNA-Fragment von etwa 1700 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von 1700 bp werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMD1 erhält. (b) Einbringen des Plasmids pSV2TMD1 in eine Tierzelle und Reinigung eines Polypeptids
Die Transfektion des in Beispiel 1-(4)-(a) hergestellten Plasmids pSV2TMD1 und des Plasmids pSV2dhfr (ATCC 37146) in die Zellinie CHO-dfhr&supmin; erfolgt gemäß des Verfahrens von F.L. Graham et al. (F.L. Graham, Virology, 52, 456, 1973), wobei Calciumphosphat verwendet wird. Die Zellinie CHO-dfhr&supmin; erhielt man von Dr. L. Chasin und Dr. G.U. Chasin, Columbia University, USA. Die transfizierte Zelle wird in einem minimal notwendigen Medium nach Dulbecco (DMEM, hergestellt und vertreiben von Flow Laboratories Inc., USA) kultiviert, in das 150 µg/ml Prolin und 10 % dialysiertes fetales Kalbsserum (DFCS, hergestellt und vertrieben von GIBCO, USA, Verzeichnis 220-6440AG) eingebracht werden. Nach Kultivieren von etwa einem Monat treten Kolonien der transformierten Zellen auf. Jeder Zellklon wird dann aufeinanderfolgend in Medien kultiviert, die Methotrexat (MTX, hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemicals Inc., Japan) in Konzentrationen von 20 nM, 200 nm, 2 µM bzw. 20 µM enthalten, um hierdurch eine transformierte Zellinie (9G5E) zu erhalten, mit der man sehr gut ein Polypeptid herstellen kann, das eine Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt. Die erhaltene Zellinie wächst im gleichen wie vorstehend beschrieben Kulturmedium. Es wird im gleichen, wie vorstehend genannten Medium kultiviert, mit der Ausnahme, daß die Serum-Konzentration auf 1 % verringert ist. Hierdurch erhält man 10 l Kultur.
Die erhaltene Kultur (10 Liter) wird auf eine Q- Sepharose-Säule (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert ist. Die Säule wird mit dem Puffer gewaschen, der bei der Äquilibrierung eingesetzt wird. Es wird mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) eluiert, der 1 mM NaCl enthält. Das Eluat wird einer fünffachen Verdünnung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) unterworfen Die entsalzene Fraktion wird dann auf eine mit Diisopropyl-phosphorothrombin modifizierte Agarosesäule (nachstehend als "DIP-Thrombin-Säule" bezeichnet) aufgetragen, die hergestellt ist durch Binden von Diisopropylphosphorothrombin, hergestellt nach dem Verfahren von N. L. Esmon et al. (J. Biol. Chem., 257, 859, 1982), an Agarose, die gemäß des Verfahrens nach P. Cuetrecasas (J. Biol. Chem., 245, 3059, 1970) mit Bromcyan behandelt ist, wobei die Säule mit 20 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert wurde. Die Säule wird mit dem Puffer gewaschen, wie er bei der Äquilibrierung eingesetzt wird. Sie wird mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) eluiert, der 1,0 M NaCl enthält, um hierdurch die aktive Fraktion zu erhalten. Die aktive Fraktion wird eingeengt und auf eine Sephacral S-300 Säule (17-0559-01, hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden) aufgetragen, die mit einem salzhaltigen Phosphat-Puffer (PBS) äquilibriert worden war. Die Fraktion wird mit dem gleichen Puffer entwickelt, so daß man eine aktive Fraktion erhält, die eingeengt worden war. Das so gereinigte Polypeptid wird mit D123Asp bezeichnet.

(c) Herstellung des Antikörpers

Es wird ein Anitkörper für das gereinigte Polypepteid D123Asp nach dem Verfahrens von E.Harlow et al. ("Antibodies a Laboratory Manual, 92, (1988), veröffentlicht vom Cold Spring Harbor Laboratory) hergestellt, bei dem ein Kaninchen (weiße Japanspezies, 4 Monate alt) mit dem Polypeptid immunisiert wird. Das Antiserum wird dem immunisierten Kaninchen entnommen und dann durch Ammoniumsulfatfällung gereinigt.
Die Reaktivität des erhaltenen Antikörpers mit dem Polypeptid D123Asp wird durch folgendes Verfahren bestätigt. Das in Beispiel 1-(4)-(b) hergestellte gereinigte Polypeptid (etwa 10 ng) wird z.B. auf einen Nitrozellulosefilter aufgetüpfelt. Dann wird mit Luft getrocknet. Das auf den Filter aufgetüpfelte Polypeptid wird dann mit den vorstehend erhaltenen, gereinigten Antikörperfunktionen als primärer Antikörper umgesetzt. Anschließend wird das Polypeptid mit Biotin umgesetzt, das mit Anti-Kaninchen-IgG (hergestellt und vertrieben von Zymed Laboratories Inc., U.S.A., Verzeichnis Nr. 62- 1840) behandelt wurde, das von einer Ziege hergestellt worden war. Dann wurde mit Avidin, Biotin-Meerrettich- Peroxidase (hergestellt und vertrieben von Amersham Japan, RPN 1051) und 4-Chloronaphtol angefärbt. Das Immunoreaktionsprodukt wird als ein dunkler brauner Fleck gemessen.

(d) ELISA

Die Menge an Polypeptid wird gemäß des Verfahrens nach K.Suzuki et al. (J. Biol Chem., 264, 4872-4876, 1989) durch ELISA bestimmt, wobei ein Kaninchen-Anti- Mensch-Thrombomodulin-Antikörper verwendet wird. Beispielsweise wird ein F(a b')&sub2; Antikörper aus dem Kaninchen-Anti-Mensch-Thrombomodulin-Antikörper hergestellt, der in Beispiel 1-(4)-(c) gemäß des Verfahrens von E.Harlow et al. (Antibodies, A Lboratory Manual, 630, (1988), veröffentlicht vom Cold Spring Harbor Laboratory) erhalten wird. Der hergestellte F(a b')&sub2; Antikörper wird mit einer 0,1 M Natriumbicarbonat- Pufferlösung (pH-Wert 9,2) verdünnt, so daß die entstandene Lösung eine Konzentration von 5 µg/ml hat. Die verdünnte Lösung wird portionsweise in einer Menge von 100 µl/Vertiefung in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (hergestellt und vertrieben von Dynatech Laboratories, Inc., Verzeichnis Nr. 011-010-7801) eingebracht. Nach einer Stunde wird jede Vertiefung mit einer 0,1 M Natriumbicarbonat- Pufferlösung (pH-Wert 9,2) gewaschen. Dann wird 10 % normales Kaninchenserum (hergestellt und vertrieben von Flow Laboraotries Inc., U.S.A., Verzeichnis Nr. 29-411-49) in einer Menge von 200 µl/Vertiefung zugegeben, um hierdurch zwei Stunden zu blockieren. Anschließend wird jede Vertiefung mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) gewaschen, der 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 % BSA und 0,05 % Tween-20 enthält. Getrennt dazu wird die zu bestimmende Polypeptid-Lösung mit einem Phosphat-Puffer mit 0,1 % BSA, 0,5 % Gelatine und 0,05 % Tween-20 verdünnt, so daß man 100 fache, 1000 fache, 10 000 fache und 100 000 fache Verdünnungen erhält. Die Verdünnungen werden in die Vertiefungen in einer Menge von 100 µl/Vertiefung eingebracht und zwei Stunden umgesetzt. Jede Vertiefung wird mit dem vorstehend genannten Waschpuffer gewaschen. Dazu wird eine 100 µl Antikörperlösung (1 µg/ml) eingebracht, die man durch Markierung des vorstehend genannten F(a b')&sub2; Anti-Mensch-Thrombomodulin-Antikörpers mit β-Galactosidase nach dem Verfahren von S. Yoshitake et al. (Scand. J.Immunol. 10, 81-86 (1979)) erhält. Die Umsetzung erfolgt eine Stunde. Nach der Umsetzung wird jede Vertiefung mit dem vorstehend genannten Waschpuffer gewaschen. Anschließend wird 100 µl einer Lösung, die durch Auflösen von 4-MUG (4-Methylunberipheryl-β-D- galactosid (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A., Verzeichnis M-1633) in PBS in einer Konzentration von 0,1 mg/ml erhalten wird, in jede Vertiefung eingebracht. Die Fluoreszenz wird bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und bei einer Meßwellenlänge von 450 nm gemessen, wobei ein Spektrophotoflourmeter (hergestellt und vertrieben von Pandex Laboratories, Inc., Verzeichnis 10-015-1) verwendet wurde, der bei Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen geeignet ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

(5) Herstellung des Asp³&sup6;&sup7; Mutanten.

(a) Herstellung des Plasmids pSV2TMM1

Das in Beispiel 1-(4)-(a) erhaltene rekombinante Plasmid M13TMD1 wird im wesentlichen wie in Beispiel 1- (1)-(a) gemäß des Verfahrens der ortsspezifischen Mutagenese einer Teilmutation von Asp³&sup6;&sup7; zu Ala³&sup6;&sup7; unterworfen, mit der Ausnahme, daß die DNA-Sonde TMm1 zur Mutation (nachstehend als "Mutator" bezeichnet) folgende Nucleotidsequenz besitzt:
5'-CTGAAGCACGGAGCCACGGGCTCCA-3' (25 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid hybridisiert, das die folgende, wie in Fig. 5 gezeigte Abschnittsequenz TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekombinante Plasmid M13TMM1 zu erhalten, in das ein DNA-Fragment insertiert ist, das mit TMM1 bezeichnet ist. Das DNA- Fragment TMM1 hat eine Nucleotidsequenz einschließlich des Initiatorcodons ATG und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, die Aminosäurereste bis zur Stelle 516 vom Aminosäurerest, der dem Initiatorcodon der Sequenz von Fig. 55 entspricht, umfaßt, wobei Asp 367 gegen Ala ausgetauscht ist. Fig. 5 zeigt eine Hybridisierung des Mutators TMm1 mit dem rekombinanten Plasmid M13TMD1, in dem Asp³&sup6;&sup7; gegen Ala³&sup6;&sup7; ausgetauscht ist. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMM1 DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMM1-DNA-Fragment von etwa 1700 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von 1700 bp werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMM1 erhält.

(b) Herstellung des Plasmids pSV2TMM2

Das in Beispiel 1-(4)-(a) erhaltene Plasmid M13TMD1 wird nach dem Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese im wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) einer Teilmutation von Asp³&sup6;&sup7; zu Glu³&sup6;&sup7; unterworfen, mit der Ausnahme, daß der Mutator TMm2 die folgende Nucleotidsequenz besitzt:
5'-CTGAAGCACGGTTCCACGGGCTCCA-3' (25 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13TMD1 hybridisiert wird, das die folgende, wie in Fig. 6 gezeigte Abschnittsequenz TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch ein rekombinantes Plasmid M13TMM2 zu erhalten, in das ein DNA-Fragment insertiert ist, das mit TMM2 bezeichnet ist. Das DNA-Fragment TMM2 besitzt eine Nucleotidsequenz, einschließlich eines Initiatorcodons ATG und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 516 umfaßt, gezählt von dem Aminosäurerest, der dem Initiatorcodon der Sequenz von Fig. 55 entspricht, wobei Asp 367 gegen Glu ausgetauscht ist. Fig. 6 zeigt das rekombinante Plasmid M13TMD1, das mit dem Mutator TMm2 hybridisiert wurde, um hierdurch Asp³&sup6;&sup7; gegen Glu³&sup6;&sup7; auszutauschen. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMM2 DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMM2 DNA-Fragment von etwa 1700 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) vollständig mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA- Fragment von 1700 bp werden unter Verwendung von T4-DNA- Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMM2 erhält.

(c) Transfektion des Asp³&sup6;&sup7; Mutanten in Zellender Zellinie COS-1

Die Transfektion der Plasmide pSV2TMD1, pSV2TMM1 und pSV2TMM2 in die Zellinie COS-1 erfolgt nach dem in Beispiel 1-(2) beschriebenen Verfahren. Bei jedem plasmid erfolgt 90 mal eine Elektroporation. Man erhält etwa 900 ml Kultur.

(d) Reinigung und quantitative Analyse des Polypeptids, hergestellt durch den Asp³&sup6;&sup7; Mutanten

Die in Beispiel 1-(5)-(c) erhaltene Kutur (900 ml) wird auf eine Q-Sepharose-Säule (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Schweden, Verzeichnis 17-0510-01) aufgetragen, die mit 5mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) äquilibriert wird. Die Säule wird mit 5 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,18 M NaCl enthält, gewaschen und mit 5mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) eluiert, der 0,28 M NaCl enthält. Das Eluat wird dialysiert unter Verwendung von 5 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), dem mit Chelex 100 (hergestellt und vertrieben von Bio Rad, U.S.A., Verzeichnis 143-2832) Calciumionen entfernt wurden.
Anschließend wurde nach dem in Beispiel 1-(4) beschriebenen ELISA-Verfahren die Menge jedes Polypeptids bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, daß die Menge jedes Polypeptids etwa 50 µg beträgt.
Die Polypeptide, die man aus den Überständen von Kulturen der Zellinie COS-1 isolierte, die mit den Plasmiden pSV2TMM1 und pSV2TMM2 transfiziert wurden, werden mit D123Ala bzw. D123Glu bezeichnet.

(e) Bestimmung der Aktivität des Polypeptids, hergestellt durch den Asp³&sup6;&sup7; Mutanten, zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivität von Protein C

Bei den Polypeptid-Lösungen (0,4 µg/ml), gereinigt und quantitativ bestimmt in Beispiel 1-(5)-(d), wird die Aktivität von Polypeptiden zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C gemäß des in Beispiel 1-(3) beschriebenen Verfahrens gemessen. Die CaCl&sub2; Konzentration des 10 x Assay-Puffers wird eingestellt, so daß die Aktivitäten bei Calciumionen- Konzentrationen von 0 bis 5 mM bestimmt werden. Bei Protein C ohne Gla-Bereich (nachstehend als "GDPC" bezeichnet), das durch Chymotrypsin-Behandlung gemäß des Verfahrens von N. L. Esmon (J. Biol. Chem. 258, 5548-5553 (1983)) hergestellt und das an Stelle von Protein C verwendet wird, wird die Aktivitätsmessung auch im gleichen Calcium-Konzentrationsbereich durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 7 bis 9 gezeigt.
Es zeigte sich, daß bei der Aktivierung von Protein C D123Asp eine hohe Aktivität hat, die ihren höchsten Wert bei der Calcium-Konzentrationen von 0,4 bis 0,5 mM aufweist. Andererseits wird bei der Aktivierung von GDPC eine kennzeichnende Abhängigkeit von der Calciumionen- Konzentration nicht beobachtet. Es wird übereinen weiten Bereich von Calciumionen-Konzentrationen eineniedrige Aktivität beobachtet.
Andererseits zeigte sich, daß D123Ala bei der Aktivierung von Protein C und GDPC eine niedrige Aktivität hat. Bei D123Glu wird eine Aktivität beobachtet, die zu der von D123Asp ähnlich ist. Die Aktivität von D123Glu ist aber bei der Aktivierung von Protein C 1,2 mal höher als die von D123Asp.

Beispiel 2

Kennzeichnung einer Aminosäuresequenz, die menschliches Thrombomodulin kodiert, das eine Bindungsstelle zu Thrombin enthält.

(1) Herstellung von synthetischem Polypeptid

Die Synthese von Polypeptiden erfolgt gemäß des herkömmlichen Festphasensytheseverfahrens mit einer automatischen Vorrichtung zur Peptidsynthese (Modell 431A, hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., U.S.A.). Dabei wird ein Phenylacetomethyl-Harz (PAM-Harz) als Träger verwendet. Die folgenden drei neuen Polypeptide werden durch Synthese hergestellt, indem man die Aminosäuresequenz von der Stelle 406 bis 444 von menschlichen Thrombomodulin untersucht.
Polypeptid A: Met-Phe-Cys-Asn-Gln-Thr-Ala-Ala-Pro-Ala- Asp-Cys-Asp
Polypeptid B: Ala-Cys-Pro-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Asn-Thr- Gln-Ala-Ser-Cys-Glu
Polypeptid C: Glu-Cys-Pro-Glu-Gly-Tyr-Ile-Leu-Asp-Asp-Gly-Phe-Ile-Cys-Thr-Asp-Ile-Asp-Glu
Bei der Synthese von Polypeptid A wird PAM- Asparaginsäure-Harz (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., U.S.A., Verzeichnis Nr. 400092) als Ausgangsmaterial verwendet, das durch Verbinden von t-Butyloxycarbonyl-asparaginsäure-β-Benzylester mit PAM- Harz hergestellt wird. Es werden Aminosäuren, die durch Boc geschützt sind, an den C-Terminus des PAM- Asparaginsäure-Harzes sukzessiv nacheinander verbunden, d.h. die erste Boc-Cys (4-CH&sub3;OBzl), zweite Boc-Asp (OBzl) etc. werden sukzessiv verbunden. Bei den Polypeptiden B und C wird der PAM-Glutaminsäure-Rest (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., U.S.A., Verzeichnis Nr. 400096) als Ausgangsmaterial verwendet, der durch Verbinden von t-Butyloxycarbonyl-glutaminsäure- gamma-benzylester mit PAM-Harz hergestellt wird. An den C-Terminus des PAM-Glutaminsäure-Harzes werden die Aminosäuren, geschützt durch Boc, sukzessiv nacheinander gebunden.
Folgende geschützten Aminosäuren werden verwendet:
t-Butyloxycarbonyl-L-alanin (Boc-Ala), t- Butyloxycarbonyl-L-asparaginsäure-b-benzylester (Boc-Asp (OBzl)), t-Butyloxycarbonyl-L-glutaminsäurebenzylester (Boc-Glu (OBzl)), t-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L- cystein (Boc-Cys (4-CH&sub3;OBzl)), t-Butyloxycarbonyl-L- phenylalanin (Boc-Phe), t-butyloxycarbonyl-L-asparagin (Boc-Asn), t-butyloxycarbonyl-L-glutamin (Boc-Gln), t- butyloxycarbonyl-L-prolin (Boc-Pro), t-butyloxycarbonyl- O-benzyl-L-threonin (Boc-Thr (Bzl)), t-butyloxycarbonyl- O-benzyl-L-serin (Boc-Ser (Bzl)), t-butyloxycarbonyl-O-2- brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin (Boc-Tyr (BrBzl)), t- butyloxycarbonyl-glycin (Boc-Gly), t-butyloxycarbonyl-L- isoleucin (Boc-Ile) und t-butyloxycarbonyl-L-leucin (Boc- Leu).
Das entstandene Harz (1 g), an das ein geschütztes Peptid gebunden ist, wird in ein Gefäß eingebracht, um es mit Fluorwasserstoff umzusetzen. Anisol (0,5 ml) wird zugegeben, damit es in das Harz eindringt. Dann wird 10 ml Fluorwasserstoff zugegeben und bei 0ºC eine Stunde inkubiert. Anschließend wird das restliche Fluorwasserstoff unmittelbar abdestilliert. Es wird Essigsäure (1 %) in den Rückstand eingebracht, um ein Polypeptid zu extrahieren. Die so erhaltene Lösung wird mit Ether gewaschen und dann lyophilisiert, um hierdurch ein Rohpolypeptid zu erhalten.

(2) Crosslinking und Reinigung der synthetisierten Peptide

Nach dem Verfahren von J. Ryan (J. Biol. Chem., 264, 20283-20287, (1989)) werden Disulfidbrücken in der intramolekularen Struktur von jedem der drei in Beispiel 2-(1) synthetisierten Peptide ausgebildet. Die erhaltenen Peptide werden gereinigt. Die synthetisierten Peptide werden z.B. mit HPLC gereinigt. Die gereinigten Peptide werden einer Aminosäureanalyse unterworfen, um die Richtigkeit der durchgeführten Synthesen zu bestätigen. Die Peptide werden dann getrennt in einer 0,18 mM K&sub3;Fe(CN)&sub6; Lösung mit 8 M Harnstoff gelöst, so daß die Endkonzentration jedes Peptids 100 µg/ml hat. Die so erhaltenen Peptidlösungen werden bei Raumtemperatur 12 Tage gerührt, um hierdurch die Peptide zu vernetzen. Die Vernetzung der Peptide wird mit HPLC bestätigt. Es wird Trifluoressigsäure (40 %) in jede der Reaktionsmischungen eingebracht, in denen eine Vernetzung erfolgte, so daß jede Mischung einen pH-Wert von 2,5 hat. Die so erhaltenen Mischungen werden jeweils unter Verwendung einer Waters Bondapak Säule (1,9 x 30 cm) gereinigt und bei Unterdruck getrocknet, so daß man 30 mg von jedem der gewünschten synthetischen Peptide erhält. Die HPLC Analyse zeigte, daß jedes der entstandenen synthetischen Peptide eine Reinheit von mindestens 99 % aufweist und die Aminosäuresequenz der erhaltenen drei Peptidarten zu denen aus dem Beispiel 2-(1) identisch sind.

(3) Bestimmung der Aktivität der synthetischen Peptide zum Inhibieren der Bindung von Thrombin zu Thrombomodulin

Die Aktivität jedes der synthetischen Peptide zum Inhibieren der Bindung von Thrombin zu Thrombomodulin wird durch das folgende Verfahren bestimmt. Das in Beispiel 1-(4)-(b) gereinigte D123Asp wird mit 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH-Wert 9,2) verdünnt, so daß D123Asp eine Endkonzentration von 1,5 µg/ml hat. Zur Durchführung von ELISA wird 100 µl des Verdünnungsmittels auf jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit ebenen Boden verteilt. Man läßt die Platte drei Stunden und wascht dann jede Vertiefung mit 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH-Wert 9,2). Es wird 150 µl 50 mM Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 7,5), der 0,1 M NaCl und 1 % BSA enthält, auf jeder Vertiefung verteilt. Man läßt die Platte zwei Stunden, so daß in jeder Vertiefung eine Blockierung erfolgt. Jede Vertiefung der Platte wird mit einer Lösung versetzt, die durch Umsetzung von Thrombin (0 bis 0,4 µg/µl), das mit einer Waschlösung verdünnt wurde {50 mM Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 7,5) mit 0,5 % BSA und 0,05 % Tween-20}, mit verschiedenen Konzentrationen synthetischer Peptidlösungen bei 37ºC in 30 Minuten erhalten wurde. Eine Umsetzung erfolgt bei Raumtemperatur 1 Stunde lang. Die Platte wird wieder mit der vorstehend genannten Waschlösung gewaschen. In jede Vertiefung der Platte wird 100 µl 50 mM Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 8,0) mit 0,1 M NaCl eingebracht, in dem 200 µM H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (Kabi Virum, Schweden, Verzeichnis Nr. S2238) gelöst worden war, um hierdurch pNA (Paranitroanilin) freizusetzen. Nach einigen Stunden wird die Extinktion von freigesetzten pNA bei einer Wellenlänge von 410 nm gemessen. Zur Bestimmung der Inhibierungskonstante (Ki) jedes synthetischen Peptids wird 100/v, wobei v die Thrombinaktivität (in %) zu der Zeit darstellt, zu der ein Peptid mit einer vorgegebenen Konzentration eingebracht wird, vorausgesetzt, daß die Thrombinaktivität in Abwesenheit eines Peptids 100 % ist, in rechteckigen Koordinaten gegen die Konzentration des Peptids aufgezeichnet. Hierdurch erhält man eine Kurve (Dixon plot). Die Inhibierungskonstante (Ki) wird definiert als der Schnittpunkt der aufgetragenen Linie mit der Abszisse. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Beispiel 3

(Herstellung eines neuen Polypeptids, das die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt)

(1) Herstellung des Plasmids pSV2TMM3

Das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene rekombinante Plasmid M13TMD7 wird nach dem Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese im wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) teilmutiert, mit der Ausnahme, daß der Mutator TMm3 die folgende Nucleotidsequenz hat:
5'-GAAGCACGGTTCGGGGAACCCCAGG-3' (25 mer), die mit einen Bereich auf den Plasmid M13TMD7 hybridisiert, das die folgende, wie in Fig.10 gezeigte Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC GAC CCG TGC TTC AGA hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekonbinante Plasmid M13TMM3 zu erhalten, in das ein DNA-Fragment insertiert ist, das mit TMM3 bezeichnet ist. Das DNA- Fragment TMM3 besitzt eine Nucleotidsequenz mit einem Initiatorcodon (ATG) und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Peptid codiert, das Aminosäuren bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest weg, der dem Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 367 bis 480 umfaßt, indem in der Sequenz von Fig. 55 Asp 367 durch Glu ersetzt ist. Fig. 10 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD7, mit dem der Mutator TMm3 hybridisiert wird und in dem Asp durch Glu ersetzt ist.
Weiterhin wird das erhaltene Plasmid M13TMM3 DNA mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut, so daß man ein TMM3 DNA-Fragment von etwa 580 bp erhält. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von etwa 580 bp werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verknüpft, so daß man das Plasmid pSV2TMM3 erhält.

(2) Transfektion der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMM3 in die Zellinie Cos-1

Die Transfektion der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMM3 in die Zellinie Cos-1G erfolgt nach dem in Beispiel 1- (2) beschriebenen Verfahren. Beispielsweise werden in eine Kultur der Zellinie Cos-1 jeweils Suspensionen der Plasmide pSV2TMD7 und pSV2TMM3 zugegeben. Die erhaltenen Gemische werden jeweils 90 mal der Elektroporation unterworfen, so daß die Zellinie Cos-1 mit jedem der Plasmide transfiziert wird. Die erhaltenen Suspensionen werden kultiviert, um hierdurch 90 ml von jeder Kultur zu erhalten.

(3) Reinigung und quantitative Bestimmung von Polypeptiden, hergestellt mit der Zellinie Cos-1, die mit den Plasmiden pSV2TMD7 und pSV2TMM3 transfiziert wurde.

90 nl jeder der in Beispiel 3-(2) erhaltenen Kulturen wird auf eine Q-Sepharosesäule aufgetragen, die mit 5mm Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 5mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen und mit 5 mM Phosphat- Puffer (pH-Wert 7,4), der 1,0 M NaCl enthält, eluiert. Das so erhaltene Eluat wird dialysiert, um es zu entsalzen. Das Dialysat wird auf eine DIP-Thrombin-Säule aufgetragen, die mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert wird, um eine aktive Fraktion darauf zu absorbieren. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, der bei der vorstehenden Absorption und Äquilibrierung verwendet wurde. Sie wird mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 1,0 M NaCl enthält, eluiert, so daß man eine aktive Fraktion erhält. Die erhaltene aktive Fraktion wird wieder auf die DIP- Thrombin-Säule aufgetragen, die mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert wurde. Es wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, der bei der Absorption und Äquilibrierung verwendet wurde, und mit 20 mM Phoshat-Puffer (pH-Wert7,4) eluiert, der 1,0 M NaCl enthält, so daß man eine aktive Fraktion erhält.
Anschließend wird die erhaltene aktive Fraktion gegen 5 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) dialysiert, bei den die Calciumionen mit Chelex 100 (hergestellt und vertrieben von Bio Rad Co., Ltd., U.S.A., Verzeichnis Nr. 143-2832) entfernt worden waren. Dann wurde mit Centricon (Amicon Co., Ltd., Verzeichnis Nr. 4205) konzentriert, so daß man ein gereinigtes Polypeptid erhält. Das gereinigte Polypeptid wird gemäß den in Beispiel 1-(4)-(d) beschrieben ELISA quantitativ bestimmt. Von jeder der Kulturen aus Beispiel 3-(2) erhält man 50 µg Polypeptid. Das Polypeptid, das man aus der Kultur der mit pSV2TMD7 transfizierten Zellinie Cos-1 reinigt, wird mit E456 Asp bezeichnet. Das Polypeptid, das man aus der Kultur der mit pSV2TMM3 transfizierten Zellinie Cos-1 reinigte, wird mit E456 Glu bezeichnet.

(4) Bestimmung der Aktivität der Polypeptide E456 Asp und E456 Glu zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C

Die Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C der in Beispiel 3-(3) beschriebenen Polypeptide wird nach dem in Beispiel 1-(3) beschriebenen Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in den Fig. 11 und 12 gezeigt. Fig. 11 zeigt, daß E456 Asp eine hohe Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C besitzt und ihren höchsten Wert bei einer Calciumionenkonzentration von 0,4 bis 0,5 mM hat. Andererseits wird bei der Aktivierung von GDPC keine derartige spezifische Abhängigkeit von der Calciumionenkonzentration beobachtet. Insgesamt wird eine niedrige Aktivität zur Förderung der Aktivierung von GDPC gemessen. Fig. 12 zeigt, daß die Aktivität von E456 Glu zu der von E456 Asp ähnlich ist. Bei der Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C hat E456 Glu jedoch eine 1,3 mal höhere Aktivität als die von E456 Asp.

Beispiel 4

(1) Herstellung des Plasmids pSV2TMM4

Durch das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese werden in wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) drei weitere Nucleotide in das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene Plasmid M13TMD7 insertiert, mit der Ausnahme, daß der Mutator TMm4 die folgende Nucleotidsequenz besitzt:
5' GAAGCACGGGTCGTCGGGGAACCCCAGG-3' (28 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13TMD7 hybridisiert, das die folgende, wie in Fig. 13 gezeigte Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC GAC CCG TGC TTC AGA hat, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekombinante Plasmid M13TMM4 zu erhalten, in das ein mit TNM4 bezeichnetes DNA-Fragment insertiert ist. Das DNA- Fragment TMM4 hat eine Nucleotidsequenz mit dem Initiatorcodon (ATG) und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest aus, der dem Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 367 bis 480 umfaßt. Dabei ist in die Stelle vor der Asp 367 der Sequenz von Fig. 55 eine andere Asp insertiert. Fig. 13 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD7, mit dem der Mutator TMm4 hybridisiert ist und in dem drei weitere Nucleotide insertiert sind.
Weiterhin wird das erhaltenen Plasmid M13TMM4 mit den Restriktionsenzynen HindIII und BamHI vollständig verdaut, so daß man ein TMM4 DNA-Fragment von etwa 580 bp erhält. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte TMM4 DNAFragment von etwa 580 bp werden unter Verwendung von T4- DNA-Ligase miteinander verknüpft, um hierdurch das Plasmid pSV2TMM4 zu erhalten.

(2) Herstellung des Plasmids pSV2TMMS

Durch das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese werden im wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) sechs weitere Nucleotide in das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene Plasmid M13TMD7 insertiert, mit der Ausnahme, daß der Mutator TMm5 die folgende Nucleotidsequenz besitzt:
5' GAAGCACGGGTCGTCGTCGGGGAACCCCAGG-3' (31 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13TMD7 hybridisiert, das die, wie in Fig. 14 gezeigte folgende Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC GAC CCG TGC TTC AGA besitzt, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekombinante Plasmid M13TMMS zu erhalten, in das ein DNA- Fragment insertiert ist, das mit TMMS bezeichnet wird. Das DNA-Fragment TMM3 hat eine Nucleotidsequenz mit dem Initiatorcodon (ATG) und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest aus, der dem Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 367 bis 480 umfaßt. Darin sind im Abschnitt vor Asp 367 der Sequenz von Fig. 55 zwei Asp insertiert. Fig. 14 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD7, mit den der Mutaror TMmS hybridisiert ist und in dem sechs weitere Nucleotide insertiert sind.
Weiterhin wird das erhaltene Plasmid M13TMM5 mit den Restriktionsenzynen HindIII und BamHI vollständig verdaut. Ein TMM5-DNA-Fragment von etwa 580 bp wird isoliert. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte TMM5-DNA- Fragment von etwa 580 bp werden unter Verwendung der T4- DNA-Ligase miteinander verknüpft, um hierdurch das Plasmid pSV2TMM5 zu erhalten.

(3) Herstellung des Plasmids pSV2TMM6

Durch das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese werden im wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) drei weitere Nucleotide in das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene Plasmid M13TMD7 insertiert, mit der Ausnahme, daß der Mutator TMm6 die folgende Nucleotidsequenz besitzt:
5'- GAAGCACGGGTCTTCGGGGAACCCCAGG-3' (28 mer), die mit einen Abschnitt auf dem Plasmid M13TMD7 hybridisiert, das die folgende, wie in Fig. 15 gezeigte Abschnittsequenz GGC CTG GGG TTC CCC GAC CCG TGC TTC AGA besitzt, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekombinante Plasmid M13TMM6 zu erhalten, in das ein mit TMM6 bezeichnetes DNA-Fragment insertiert ist. Das DNAFragment TMM6 besitzt eine Nucleotidsequenz, mit einem Initiatorcodon (ATG) und, downstream davon, eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest aus, der den Initiatorcodon entspricht, und die Aminosäurereste 367 bis 480 umfaßt. Darin ist in der Stelle vor der Asp 367 der Sequenz von Fig. 55 eine andere Glu insertiert. Fig. 15 beschreibt das rekombinante Plasmid M13TMD7, mit dem der Mutator TMm6 hybridisiert ist und in das drei weitere Nucleotide insertiert sind.
Weiterhin wird das erhaltene Plasmid M13TMM6 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut, so daß man ein TNM4 DNA-Fragment von etwa 580 bp erhält. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC Nr. 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte TNM4-DNA- Fragment von etwa 580 bp werden unter Verwendung von T4- DNA-Ligase miteinander verknüpft, um hierdurch das Plasmid pSV2TMM6 zu erhalten.

(4) Transfektion der Plasmide pSV2TMD7, pSV2TMM3, pSV2TMM4, pSV2TMM5 und pSV2TMM6 in die Zellinie Cos-1

Die Transfektion jedes der vorstehend erhaltenen Plasmide in die Zellinie Cos-1 erfolgt gemäß des in Beispiel 1-(2) beschriebenen Verfahrens. Beispielsweise wird die Kultur der Zellinie Cos-1 jeweils mit den Suspensionen der Plasmide pSV2TMD7, pSV2TMM3, pSV2TMM4, pSV2TMM5 und pSV2TMM6 Cos-1 versetzt. Die entstandenen Gemische werden jeweils 90 mal einer Elektroporation unterworfen, so daß die Zellinie Cos-1 mit jeden der Plasmide transfiziert wird. Die entstandenen Gemische werden kultiviert, um hierdurch 900 ml jeder Kultur zu erhalten.

(5) Reinigung und quantitative Bestimmung der Polypeptide, hergestellt durch die Zellinie Cos-1, die mit den Plasmiden pSV2TMD7, pSV2TMM3, pSV2TNM4, pSV2TMM5 und pSV2TMM6 transfiziert sind

Es werden 900 ml jeder der in Beispiel 4-(4) erhaltenen Kultur gemäß des in Beispiel 3-(3) beschriebenen Verfahrens gereinigt. Die Extinktion daraus wird jeweils gemessen. Der Wert des molekularen Extinktionskoeffizienten bei allgemeinen Proteinen, der 10,0 (E1%1cm . 280 nm = 10,0) beträgt, wird auf jedes der gereinigten Polypeptide angewandt. Auf der Grundlage dieses Koeffizienten werden die Mengen der gereinigten Polypeptide jeweils aus der Extinktion daraus berechnet. Es waren etwa 50 µg enthalten.
Weiterhin werden die gereinigten Polypeptide jeweils einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Dabei wird ein Acrylamid-Konzentrationsgradient von 15 bis 25 % verwendet. Ein Anfärben mit CBB erfolgt, so daß man die gefärbten Bänder beobachtet. Man fand für jedes der gereinigten Polypeptide nur eine Bande.
Das Polypeptid, das aus der Kultur der mit pSV2TMD7 transfizierten Zellinie Cos-1 gereinigt wurde, wird mit E456 Asp bezeichnet. Das Polypeptid, das aus der Kultur der mit pSV2TMM3 transfizierten Zellinie Cos-1 gereingt wurde, wird mit E456 Glu bezeichnet. Das Polypeptid, das aus der Kultur der mit pSV2TMM4 transfizierten Zellinie Cos-1 gereingt wurde, wird mit E456Asp2 bezeichnet. Das Polypeptid, das aus der Kultur der mit pSV2TMM5 transfizierten Zellinie Cos-1 gereingt wurde, wird mit E456Asp3 bezeichnet. Das Polypeptid, das aus der Kultur der mit pSV2TMM6 transfizierten Zellinie Cos-1 gereingt wurde, wird mit E456GluAsp bezeichnet.

(6) Bestimmung der Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C

Bei den in Beispiel 4-(5) gereinigten und mengenmäßig bestimmten Polypeptiden wird die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C nach folgendem Verfahren bestimmt.
Es wird ein 0,02 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,5), der 0,1 M NaCl, 0,5 mM CaCl&sub2; und 10 mg/ml BSA enthält, mit 50 µg/ml Protein C, 5 nM Thrombin und 5nM von jedem der gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptide versetzt und bei 37 ºC umgesetzt. Jede Reaktionsmischung wird mit 300 µg/ml Antithrombin III (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A.) und mit 5 mM EDTA versetzt, um die Reaktion zu beenden. Dann wird die bei der Reaktion gebildete Menge an aktiviertem Protein C durch das in Beispiel 1-(3) beschriebene Verfahren bestimmt. Dabei wird ein synthetisches Substrat verwendet.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 16 bis 20 gezeigt. Wird kein erfindungsgemäßes Polypeptid zugegeben, so beobachtet man keine Bildung von aktiviertem Protein C (gestrichelte Linie). Andererseits erhöhtsich bei der Zugabe eines der Polypeptide die Menge an gebildetem Protein C im Lauf der Reaktionsdauer (durchgezogene Linie).

(7) (Messung der Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation)

Durch Messen der Blutgerinnungszeit wird die Aktivität jedes der erfindungsgemäßen Polypeptide zum Inhibieren der Thrombin-katalysierten Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, um somit die Blutkoagulation zu inhibieren, bestimmt. Dabei wird ein Blutgerinnungsmesser KC-10A (hergestellt und vertrieben von Heinrich Amelung A.G., Deutschland) verwendet. Beispielsweise wird ein 0,05 M Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 7,5), der 5 mM CaCl&sub2; und 0,1 M NaCl enthält, mit 3,0 µg Fibrinogen (Fraktion I, hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A.) versetzt. In das entstandene Gemisch wird 0 bis 50 nM jedes der gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptide eingebracht. Anschließend wird 10 nM Thrombin in einer solchen Menge in das Gemisch zugegeben, daß die Gesamtmenge der Mischung 0,4 ml hat. Dann wird die Koagulationsdauer des Gemisches gemessen.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 21 bis 25 gezeigt. Es zeigte sich, daß die Blutgerinnungszeit zunimmt, je größer die Menge jedes der zugegebenen gereinigten Polypeptide ist, bezogen auf die Menge an Thrombin.

(8) (Messen der Aktivität zum Inhibieren der Plättchenaggregation)

Die Aktivität jedes der erfindungsgemäßen Polypeptide zum Inhibieren der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation wird gemessen, indem eine Vorrichtung zum Messen der Plättchenaggregation HEMA TRACER IV (hergestellt und vertrieben von NIKO Bioscience, Inc., Japan) verwendet wird. Die Messung erfolgt nach der beiliegenden Anweisung. Wird 40 µl einer 20 NIH Einheit/ml Thrombinlösung (hergestellt und vertrieben von SIGMA Chemical Co., U.S.A., T 6759) in 180 µl einer Plättchenlösung mit Plättchenreichem Plasma (PRP) (3 x 10&sup5; Zellen/µl) eingebracht und inkubiert, so aggregieren die Plättchen. Wird im Gegensatz dazu ein gereinigtes erfindungsgemäßes Polypeptide in molarer Menge eingebracht, die gleich oder größer ist als die des zugegebenen Thronbins und beläßt es vor der Zugabe von 20 µl Thrombin (40 NIH Einheit/ml) zu einer Plättchenlösung bei 37ºC zwei Minuten lang, so erfolgt auch nach der Inkubation keine Plättchenaggregation. Die Plättchenaggregation wird auf der Grundlage der Durchlässigkeit bestimmt. Dabei wird die Durchlässigkeit einer Lösung von plättchenarnen Plasma (PPP) als 100 % gesetzt. Das Verhältnis der Plättchenaggregation wird gegen die Inkubationszeit aufgetragen (0 min: die Zeit, bei der Thrombin oder ein Thrombingemisch und eines der Polypeptide in die PRP-Lösung eingebracht werden). Die Ergebnisse sind in den Fig. 26 bis 30 gezeigt. Es zeigte sich, daß die Plättchenaggregation inhibiert wird, wenn eines der erfindungsgemäßen Polypeptide eingebracht wird.

Beispiel 5

(Expression von E456 Glu unter Verwendung von Prothrombin als Leader-Peptid)

(1) Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM3

Nach dem in Fig. 31 gezeigten Verfahren wird das Plasmid pSV2PTTMM3 hergestellt, um ein Gen, das E456 Glu codiert, zu exprimieren. Dabei wird Prothrombin als Leader-Peptid verwendet.

(a) Herstellung des PTTM-Linkers

Ein PTTM-Linker mit einer in Fig. 31 gezeigten Nucleotidsequenz wird hergestellt, um ein Gen zu exprimieren, das mit einem Prothrombin als Leader-Peptid unter der Steuerung eines SV40 Promotors E456 Glu codiert. Das Herstellungsverfahrenist nachstehend eingehend beschrieben.
Es werden zuerst vier einzelne Oligonucleotide mit den nachstehenden Nucleotidsequenzen jeweils nach dem herkömmlichen Verfahren synthetisiert, wobei eine Vorrichtung zur DNA-Synthese 380A (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems, U.S.A.) verwendet wird:
(1) 5'-AGCTTAGCTGACACACTATGGCGCACGTCCGAGGCTTGC AGCTGCCTGGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGT-3',
(2) 5'-AGCCTTGTGCACAGCCAGCATGTGTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACG GTCGCTGCTCGAGCGGGTCCGGCGACCCGTGGAA-3'
(3) 5'-GTGCACAAGGCTACACAGGGCAGCCAGGGCCAGGCAGCCAGGCAGCT GCAAGCCTCGGACGTGCGCCATAGTGTGTCAGCTA-3'
(4) 5'-TTCCACGGGTCGCCGGACCCGCTCGAGCAGCGACCGTGCTTGCTGAG GAGCCAGGAACACATGCTGGCT-3'
Anschließend wird das 5'-Ende jedes der Oilgonucleotide (2) und (3) mit der T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Das phosphorylierte Oligonucleotid (2) wird dann mit dem Oligonucleotid (1) vermischt. Das phosphorylierte Oligonucleotid (3) wird mit dem Oligonucleotid (4) vermischt. Anschließend erfolgt Renaturierung, so daß man einen PTTM-Linker erhält.

(b) Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM3

Das in Beispiel 1-(1)-(a) hergestellte Plasmid M13TMD3 wird mit den Restriktionsenzymen AvaII und EcoRI vollständig verdaut, so daß man ein AvaII-EcoRI DNA- Fragment von etwa 520 bp erhält, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die E456 Asp codiert. Das DNA- Fragment wird isoliert und gereinigt. Das gereinigte DNA- Fragment wird mit Mung Bean Nuclease (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd, Japan, 2420A) behandelt, um beide Enden des Fragments abzustumpfen. Das entstandene Fragment wird mit BamHI verdaut, um hierdurch ein Fragment von etwa 520 bp zu erhalten. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor, das vorstehend genannte DNA-Fragment von etwa 520 bp und der in Beispiel 5-(1)-(a) hergestellte PTTM-Linker werden verknüpft, wobei T4-DNA-Ligase verwendet wird, um hierdurch das Plasmid pSV2PTTMM3 zu erhalten.

(2) Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM6

Gemäß des in Fig. 32 gezeigten Verfahrens wird das Plasmid pSV2PTTNM6 hergestellt, um ein Gen zu exprimieren, das unter Verwendung von Prothrombin als Leader-Peptid E456GluAsp codiert.

(a) Herstellung des PTTM2-Linkers

Ein PTTM2-Linker mit einer in Fig. 32 gezeigten Nucleotidsequenz wird hergestellt, um ein Gen zu exprimieren, das mit Prothrombin als Leader-Peptid unter der Steuerung des SV40 Promotors E456GluAsp codiert. Das Herstellungsverfahren ist nachstehend eingehend beschrieben.
Es werden zuerst vier Oligonucleotide mit den jeweiligen folgenden Nucleotidsequenzen unter Verwendung einer Vorrichtung zur DNA-Synthese 380A (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems, U.S.A.) jeweils nach dem herkömmlichen Verfahren hergestellt:
(1) 5'-AGCTTAGCTGACACACTATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCT GGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGT-3'
(2) 5'-AGCCTTGTGCACAGCCAGCATGTGTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACG GTCGCTGCTCGAGCGGGTCCGGCGACCCGTGGAAGAC-3'
(3) 5'-GTGCACAAGGCTACACAGGGCAGCCAGGGCCAGGCAGCCAGGCAGCT GCAAGCCTCGGACGTGCGCCATAGTGTGTCAGCTA-3'
(4) 5'-GTCTTCCACGGGTCGCCGGACCCGCTCGAGCAGCGACCGTGCTTGCT GAGGAGCCAGGAACACATGCTGGCT-3'
Anschließend wird das 5'-Ende jedes der Oligonucleotide (2) und (3) mit der T4- Polynucleotidkinase phosphoryliert. Das phosphorylierte Oligonucleotid (2) wird dann mit dem Oligonucleotid (1) vermischt. Das phosphorylierte Oligonucleotid (3) wird mit dem Oligonucleotid (4) vermischt. Dann erfolgt Renaturierung, so daß man einen PTTM-Linker erhält.

(b) Herstellung des Plasmids pSV2PTTMM6

Das in Beispiel 1-(1)-(a) hergestellte Plasmid M13TMD3 wird mit den Restriktionsenzymen AvaII und EcoRI vollständig verdaut, so daß man ein AvaII-EcoRI DNA- Fragment von etwa 520 bp erhält, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die E456Asp codiert. Das DNA- Fragment wird isoliert und gereinigt. Das gereinigte DNA- Fragment wird mit Mung Bean Nuclease (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd, Japan) behandelt, um beide Enden des Fragments abzustupfen. Das entstandene Fragment wird mit BamII verdaut, um hierdurch ein Fragment von etwa 520 bp zu erhalten. Andererseits wird das Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor, das vorstehend genannte DNA-Fragment von etwa 520 bp und der in Beispiel 5-(2)-(a) hergestellte PTTM2-Linker werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase verknüpft, um hierdurch das Plasmid pSV2PTTMM6 zu erhalten.

(3) Transfektion der Plasmide pSV2PTTMM3 und pSV2PTTMM6 in die Zellinie CHO

Das Plasmid pSV2PTTMM3 wird nach dem in Beispiel 1- (4)-(b) beschriebenen Verfahren in die Zellinie CHO transfiziert. Nach etwa einem Monat treten Kolonien der transformierten Zelle auf. Jede erhaltene Zelle wird sukzessiv in Medien kultiviert, die Methotrexat in Konzentrationen von 20 nM bzw. 200 nM enthalten, um hierdurch eine Zellinie (PTTM) zu bilden, mit der sehr gut ein Polypeptid hergestellt werden kann, das die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt. Diese Zellinie wird in DMEM kultiviert, das mit Prolin, DFCS und Vitamin K&sub1; (Aquamephyton, hergestellt und vertrieben-von Merck Sharp und Dohome Co., Ltd.) in Konzentrationen von 150 µg/ml, 10 % bzw. 5 µg/ml ergänzt wurde. Die entstandenen Zellen werden im wesentlichen in der gleichen wie vorstehend genannten DMEM kultiviert, mit der Ausnahme, daß die Konzentration von DFCS auf 1 % vermindert wird, um hierdurch 1 Liter Kultur zu erhalten.
Die Transfektion des Plasmids pSV2PTTMM6 in die Zellinie CHO und das anschließende Kultivieren der erhaltenen transfizierten Zellen erfolgen im wesentlichen wie vorstehend beschrieben, um hierdurch eine Zellinie (PTTM2) zu erhalten, die geeignet ist zur Herstellung eines Polypeptids, das die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt.

(4) Reinigung und quantitative Bestimmung der Polypeptide

Es wird 1 Liter jeder Kultur der PTTM und PTTM2 Zellen von Beispiel 5-(3) nach dem in Beispiel 3-(3) beschriebenen Verfahren gereinigt. Die Extinktion jedes der gereinigten Polypeptide wird gemessen. Der Wert des molekularen Extinktionskoeffizienten für allgemeine Proteinen, der 10,0(E1%1cm=280nm=10,0) beträgt, wird auf jedes der gereinigten Polypeptide angewandt. Auf der Grundlage dieses Koeffizienten wird die Menge jedes der gereinigten Polypeptide aus der Extinktion berechnet. Es war etwa 50 µg enthalten.
Die gereinigten Polypeptide werden jeweils unter Verwendung eines Acrylamid-Konzentrationsgradienten mit 5 bis 10 % einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophotese unterworfen. Es wird mit CBB angefärbt, um gefärbte Banden zu beobachten. Es wurde bei jedem der Polypeptide nur eine Bande gefunden.
Das Polypeptid, das aus der Kultur von PTTM Zellen gereinigt wurde, die mit pSV2PTTMM3 transfiziert wurden, wird mit E456Gla bezeichnet. Das andere Polypeptid, das aus der Kultur von PTTM2 Zellen gereinigte wurde, die mit pSV2PTTMM6 transfiziert wurden, wird mit E456GlaAsp bezeichnet.

(5) Bestimmung der Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C

Bei dem in Beispiel 3-(3) gereinigten Polypeptid E456Glu wird der Betrag des molekularen Extinktionskoeffizienten für allgemeine Proteinen, der 10,0 (E1%cm=280nm=10,0) beträgt, auf das Polypeptide angewandt. Auf der Grundlage dieses Koeffizienten wird die Menge des Polypeptides aus der Extinktion daraus berechnet. Weiterhin werden bei diesem Polypeptid E456Glu und bei den in Beispiel 5-(4) gereinigten und mengenmäßig bestimmten Polypeptiden E456Gla bzw. E456GlaAsp die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C nach dem Verfahren von Beispiel 4-(6) bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmung für die Polypeptide E456Gla und E456Glu sind in den Fig. 33 und 34 gezeigt. Die Ergebnisse der Bestimmung für das Polypeptid E456GlaAsp ist in der Fig. 35 gezeigt. Wird kein erfindungsgemäßes Polypeptid zugegeben, wird keine Bildung von aktiviertem Protein C beobachtet (gestrichelte Linie). Wird im Gegensatz dazu jedes der erfindungsgemäßen Polypeptide E456Gla, E456GlaAsp und E456Glu zugegeben, steigt die Menge an gebildeten Protein C im Laufe der Zeit (durchgezogenee Linie). 30 Minuten nach der Zugabe des Polypeptids ist die Menge an Protein C, das in Gegenwart von E456Gla aktiviert wurde, 20 % größer als die von Protein C, die in Gegenwart von E456Glu aktiviert wurde. 30 Minuten nach der Zugabe des Polypeptids ist die Menge an Protein C, das in Gegenwart von E456GlaAsp aktiviert wurde, 80 % größer als die von Protein C, die in Gegenwart von E456Glu aktiviert wurde.

(6) Bestätigung der gamma-Carboxyglutaminsäure

(a) Bestimmung einer N-terminalen Aminosäuresequenz

Die Polypeptide E456Gla und E456GlaAsp, die bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt wurden, werden jeweils wie folgt analysiert.
Jedes der Polypeptide E456Gla und E456GlaAsp wird bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gegen eine 0,1 % (v/v) wäßrige Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung dialysiert, so daß man eine Probe zur Analyse der Aminosäuresequenz erhält. Bei der Verwendung eines Aminosäuresequenzierers (Modell 470A, hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., USA) wird mit Erfolg der Edmon Abbau vorgenommen, wobei man nach den Verfahren von R.M.Hewick et al. (J.Biol.Chem., 256, 7990, 1981) am N-Terminus beginnt. Die freigesetzte Aminosäure Phenylthiohydantoin wird unter Verwendung einer Vorrichtung zur Hochleistungs-Flüssigchromatographie (SP 8100, hergestellt und vetrieben von Spectra Physics, USA) und einer ZORVAX ODS Säule (hergestellt und vetrieben von E.I. du Pont de Nemours and Company, USA), analysiert, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Als Ergebnis zeigte sich, daß das Polypeptid E456Gla folgende Aminosäuresequenz besitzt: Pro-Val-X-Pro-X-Phe-Arg-Ala- Es zeigte sich, daß das Polypeptid E456GlaAsp folgende Aminosäuresequenz besitzt:
Pro-Val-X-Asp-Pro-X-Phe-Arg-Ala--
Bei den vorstehenden Aminosäuresequenzen bedeutet X, daß keine Aminosäure nachgewießen wurde.

(b) Bestätigung der gamma-Carboxyglutaminsäure

Jedes der Polypeptide E456Gla und E456GlaAsp, die beim vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt wurden, wird nach dem Verfahren von M.J.Jorgensen et al. (J.Biol.Chem., 262, 14, 6729-6734, 1987) wie folgt einer Aminosäureanalyse unterworfen.
Es wird jedes der gereinigten Polypeptide in 2M Kaliumhydroxyd bei 110ºC 22 Stunden lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird unter Verwendung eines Aminosäureanalysierers (Modell 119L, hergestellt und vetrieben von Beckman City Hope Medical Institute, USA), die mit einer Datenverarbeitung (Modell 126, hergestellt und vetrieben von Beckman City Hope Medical Institute, USA) ausgestattet ist, einer Aminosäureanalyse unterworfen, um hierdurch die gamma-Carboxyglutaminsäure zu bestätigen.

(7) Messen der Aktivität zum Inhibieren der Blutkoagulation

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zum Inhibieren der Thrombin-katalysierten Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, um so im wesentlichen die Blutkoagulation zu inhibieren, wird nach dem Verfahren von Beispiel 4-(7) gemessen. Die Ergebnisse für das Polypeptid E456Gla und für das Polypeptid E456GlaAsp sind in der Fig. 36 bzw. 37 gezeigt. Daraus ist ersichtlich, daß die Blutgerinnungszeit mit der Menge an zugegebenen gereinigten Polypeptid, bezogen auf die Thrombinmenge, zunimmt.

(8) Bestätigung der Aktivität zum Inhibieren der Plättchenaggregation

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zur wesentlichen Inhibierung der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation wird nach dem Verfahren von Beispiel 4-(8) gemessen. Die Ergebnisse für das Polypeptid E456Gla und für das Polypeptid E456GlaAsp sind in Fig. 38 bzw. 39 gezeigt. Daraus ist ersichtlich, daß bei Zugabe jedes der erfindungsgemäßen Polypeptide die Plättchenaggregation inhibiert wird.

Beispiel 6

Expression der Polypeptide E456Asp und E456Glu in Acremonium chrysogenum

(1) Herstellung des Plasmids pMTMD7

Das Plasmid pMTMD7 wird nach den in Fig. 40 und 41 gezeigten Schritten hergestellt, um ein Gen zu exprimieren, das unter der Steuerung des PGK Promoters, der vom Acremonium chrysogenum stammt, das Polypeptid E456Asp kodiert.

(a) Herstellung eines PGTM-Linkers

Es wird ein PGTM-Linker hergestellt, der eine in Fig. 40 gezeigte Nucleotidsequenz besitzt, um den Abschnitt des Initiatorkodons des Gens, das das Polypeptid E456Asp kodiert, mit dem Abschnitt des Initiatorkodons vom PGK-Gen, das vom Acremonium chrysogenum stammt, zu verknüpfen.
Das Verfahren ist nachstehend eingehender beschrieben.
Zwei Oligonucleotide mit folgenden Nucleotidsequenzen:
(1) 5'-CGCGTCGATTCACAGTCAAAATGCTTGGGGTCCTG-3' und
(2) 5'-CGACCAGGACCCCAAGCATTTTGACTGTGAATCGA-3'
werden unter Verwendung einer automatischen Vorrichtung zur DNA Synthese (Modell 380-A, hergestellt und vertrieben von Applied Biosystem Co., Ltd) durch das herkömmliche Verfahren hergestellt. Die erhaltenen zwei Oligonucleotide werden vermengt und renaturiert, um hierdurch einen PGTM-Linker zu erhalten.

(b) Herstellung des Plasmids pUMPGTMD7

Das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene Plasmid M13TMD7 wird in einen Wirt transfiziert, der keine Methylierungsaktivität besitzt. Aus dem entstandenen Transfornanten wird ein doppelsträngiges Plasmid DNA hergestellt. Dann wird es mit den Restriktionsenzymen AvaII und XbaI vollständig verdaut, so daß man ein gereinigtes AvaII-XbaI Fragment von etwa 540 bp erhält, das eine Nucleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid E456Asp kodiert. Das Fragment besitzt dabei einen Abschnitt vom N-Terminus, der den deletierten Bereich kodiert. Andererseits wird das UM20 (hergestellt und vertrieben von International Biotechnologies, Inc., USA, Verzeichnis Nr. 33700) mit den Restriktionsenzymen MluII und XbaI verdaut, so daß man ein gereinigtes MluII-XbaI Fragment von etwa 7,3 kp erhält. Diese zwei Fragmente und der vorstehend erhaltene PGTM-Linker werden miteinander verbunden, so daß man das Plasmid pUMPGTMD7 erhält.

(c) Herstellung des Plasmids pPGTMD7

Das beim vorstehenden Verfahren erhaltene Plasmid pUMPGTMD7 wird mit den Restriktionsenzymen MluI und PvuII vollständig verdaut, so daß man ein gereinigtes MluI- PvuII Fragment von etwa 510 bp mit einem Gen erhält, das das Polypeptid E456Asp und einen Abschnitt vom nichtkodierenden PGK5' Bereich kodiert. Andererseits wird das nach dem Verfahren von Matsude et al. (Japanische Patentanmeldung 2-219032, siehe nachstehend beschriebene Vergleichsbeispiele) erhaltene Plasmid pPGACY2, das einen PGK Promotor und einen PGK Terminator enthält, die beide vom Acremonium chrysogenum stammen, mit den Restriktionsenzymen MluI-NruI verdaut, so daß man ein gereinigtes DNA-Fragment von etwa 4,8 kb erhält. Diese DNA-Fragmente werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, so daß man das Plasmid pPGTMD7 erhält.

(d) Herstellung des Plasmids pMTMD7

Das vorstehend hergestellte Plasmid pPGTMD7 mit einer Expressionseinheit für das Polypeptid E456Asp (nachstehend als "E456Asp Expressionseinheit" bezeichnet), das den PGK Promotor, der vom Acremonium chrysogenum stammt, das Gen, das das Polypeptid E456Asp kodiert und den vom Acremonium chrysogenum stammenden PGK Terminator umfaßt, wird mit dem Restriktionsenzyn Sfil verdaut, so daß man ein DNA-Fragment von 2,6 kb mit der E456Asp Expressionseinheit erhält. Andererseits wird das nach dem Verfahren von Matsude et al. (Japanische Patentanmeldung 2-219032, siehe nachstehend beschriebenes Vergleichsbeispiel) erhaltene Plasmid pBSFAHY 83 mit dem Restriktionsenzym SfiI verdaut. Dann wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Die vorstehend erhaltenen Fragmente werden mit einer T4-DNA-Ligase unter Bedingungen miteinander verbunden, so daß die Konzentration des Fragments mit der E456Asp Expressionseinheit höher ist als die des anderen Fragments. Die so erhaltene verknüpfte Plasmid-DNA wird in die Bakterienzelle E. coli HB101 eingesetzt, um hierdurch einen Transformanten zu erhalten. Der Transformant wird auf auf eine L-Nährlösung im Agarmedium mit Ampicillin (100 µg/ml) gebracht. Man züchtet bei 37ºC über Nacht, um hierdurch Kolonien auszubilden. 10 Kolonien werden willkürlich ausgewählt. Man erhält von jeder von ihnen eine rekombinante Cosmid-DNA. Die erhaltene rekombinante Cosmid-DNA wird mit dem Restriktionsenzym BstEII verdaut und einer Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, um hierdurch eine rekombinante Cosmid-DNA auszuwählen, in die eine große Zahl an E456Asp Expressionseinheiten pro Vektormolekül insertiert ist. Die ausgewählte rekombinante Cosmid-DNA wird wie pMTMD7 verdaut, das in einer großen Menge hergestellt wird. Man nimmt an, daß aus der Analyse der vorstehend erhaltenen Ergebnisse mindestens 5 Kopien der E456Asp Expressionseinheit im entstandenen pMTMD7 enthalten sind.

(2) Herstellung des Plasmids pMTMM3

Im wesentlichen wird das gleiche, wie in Beispiel 6-(1) beschriebene Verfahren nach den in den Fig. 42 und 43 angegebenen Verfahren wiederholt, um hierdurch das Plasmid pMTMM3 zur Expression eines Gens zu erhalten, das unter der Steuerung eines von Acremonium chrysogenum stammenden PGK Promotors das Polypeptid E456Glu kodiert. (a) Das in Beispiel 3-(1) erhaltene Plasmid M13TMM3 wird zuerst mit den Restriktionsenzymen AvaII und XbaI vollständig verdaut, so daß man ein gereinigtes AvaII- XbaI Fragment von etwa 540 bp mit einer Nucleotidsequenz erhält, die das Polypeptid E456Glu kodiert, dessen Gen einen Abschnitt vom N-Terminus besitzt, der den deletierten Bereich kodiert. Andererseits wird UM20 (hergestellt und vertrieben von International Biotechnologies, Inc., USA, Verzeichnis Nr. 33700) mit den Restriktionsenzymen MluII und XbaI verdaut&sub1; so daß man ein gereinigtes MluII-XbaI Fragment von etwa 7,3 kp erhält. Diese zwei Fragmente und der vorstehend erhaltene PGTM-Linker werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, so daß man das Plasmid pUMPGTMM3 erhält.

(b) Herstellung des Plasmids pPGTMM3

Das in Beispiel 6-(2)-(a) erhaltene Plasmid pUMPGTMD7 wird mit den Restriktionsenzymen MluI und PvuII vollständig verdaut, so daß man ein gereinigtes MluI- PvuII Fragment von etwa 510 bp mit einem Gen, das das Polypeptid E456Glu kodiert und einen Abschnitt vom nichtkodierenden PGK5' Bereich erhält. Andererseits wird das nach dem Verfahren von Matsude et al. (Japanische Patentanmeldung 2-219032, siehe nachstehend beschriebene Vergleichsbeispiele) erhaltene Plasmid pPGACY2, das einen Acremonium chrysogenum PGK-Promotor und einen PGK- Terminator enthält, mit den Restriktionsenzymen MluI-NruI verdaut, so daß man ein gereinigtes DNA-Fragment von etwa 4,8 kb erhält. Diese DNA-Fragmente werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, so daß man das Plasmid pPGTMD3 erhält.

(c) Herstellung des Plasmids pMTMD3

Das vorstehend hergestellte Plasmid pPGTMD3 mit einer Expressionseinheit für das Polypeptid E456Glu (nachstehend als "E6Glu Expressionseinheit" bezeichnet), das den vom Acrenonium chrysogenum stammenden PGK Promotor, das Gen, das das Polypeptid E456Glu kodiert und den vom Acremonium chrysogenum stammenden PGK Terminator umfaßt, wird mit dem Restriktionsenzym SfiI verdaut, so daß man ein DNA- Fragment von 2,6 kb mit der E456Glu Expressionseinheit erhält. Andererseits wird das nach den Verfahren von Matsude et al. (Japanische Patentanmeldung 2-219032, siehe nachstehend beschriebenes Vergleichsbeispiel) erhaltene Plasmid pBSFAHYB3 mit dem Restriktionsenzym SfiI verdaut. Dann wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Die vorstehend erhaltenen Fragmente werden mit der T4-DNA-Ligase unter Bedingungen miteinander verbunden, so daß die Konzentration des Fragments mit der E456Glu Expressionseinheit höher ist als die des anderen Fragments. Die so erhaltene verknüpfte Plasmid-DNA wird in die Bakterienzelle E. coli HB101 eingesetzt, um hierdurch einen Transformanten zu erhalten. Der Transformant wird auf auf eine L-Nährlösung im Agarmedium mit Ampicillin (100 µg/ml) gebracht. Man züchtet bei 37ºC über Nacht, um hierdurch Kolonien auszubilden. 10 Kolonien werden willkürlich ausgewählt. Man erhält von jeder Kolonie eine rekombinante Cosmid-DNA. Die erhaltene rekombinante Cosmid-DNA wird mit den Restriktionsenzym BstEII verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um hierdurch eine rekombinante Cosmid-DNA auszuwählen, in die eine große Zahl an E456Glu Expressionseinheiten pro Vektormolekül eingesetzt ist. die ausgewählte rekombinante Cosmid-DNA wird wie pMTMD3 verdaut, das in einer großen Menge hergestellt wird Aus der Analyse der vorstehend erhaltenen Ergebnisse nimmt man an, daß mindestens 5 Kopien der E456Glu Expressionseinheit im entstandenen pMTMD3 enthalten sind.

(3) Einsetzen der Plasmide pMTMD7 und pMTMD3 in Acremonium chrysogenum

(a) Herstellung des Protoplasten

Die Kulturmedien zur Herstellung des Protoplasten besitzen folgende Zusammensetzung:
CM Kulturmedium: Medium aus 20 g Sucrose, 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat 7H&sub2;O, 0,01 g Eisen(II)Sulfat 7H&sub2;O, 3 g Natriumnitrat, 4 g Hefeextrakt und 10 g Pepton, gelöst in 1 Liter destilliertem Wasser; CM festes Medium: CM Kulturmedium mit 1,5 % Agar ergänzt; GAG Kulturmedium: Medium aus 40 g Glycerol, 4 g Asparagin, 0,1 g Calciumchlorid, 0,1 g Natriumchlorid, 25 ml Spurenmetall-Lösung (enthält 4 g Magnesiumsulfat 7H&sub2;O, 0,4 g Eisen(II)Sulphat 7H&sub2;O, 0,16 g Mangansulfat 7H&sub2;O, 0,4 g Zinksulfat 7H&sub2;O und 0,04 g wasserfreies Kupfersulfat, gelöst in 1 Liter destilliertem Wasser) und 30 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert7,0), gelöst in 1 Liter destilliertem Wasser; und
P-Puffer: 0,6 M Kaliumchlorid, 0,01 M Magnesiumchlorid und 0,025 M Calciumchlorid.
Ein Mycel von Acremonium chrysogenum (ATCC Nr. 11550), das bei 30ºC 5 Tage lang auf einem festen CM-Medium gezüchtet wurde, wird in 50 ml CM-Medium inokuliert und bei 30ºC 3 Tage lang auf einem Rüttler (250 UPM) kultiviert. Anschließend wird 1 ml der entstandenen Kultur in 50 ml GAG Kulturmedium inokuliert und bei 30ºC 20 Stunden lang kultiviert. Es werden 50 ml der so erhaltenen Kultur bei 3500 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um hierdurch das Mycel abzutrennen. Das Mycel wird mit einer 0,9 %igen NaCl Lösung gewaschen und in 20 ml McIlvain Puffer (0,1 M Zitronensäure, 0,2 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,3), der 0,01 M Dithiothreitol enthält, suspendiert. Die Suspension wird bei 30ºC 1 Stunde lang leicht gerüttelt. Die Kultur wird dann bei 3200 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um hierdurch das Mycel abzutrennen. Das Mycel wird mit P-Puffer gewaschen, in 10 ml P-Puffer mit Novozym (hergestellt und vertrieben von Novo Industry, Dänemark) bei einer Konzentration von 10 mg/ml suspendiert und bei 30ºC 1 Stunde leicht gerüttelt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird bei 800 UPM 30 Sekunden zentrifugiert, um hierdurch einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wird mit einem Filterpapier (Toyo Filter Paper 5A) filtriert, um hierdurch das Mycel vom Protoplasten abzutrennen. Das Filtrat wird dann bei 300 UPM 5 Minuten zentrifugiert, so daß der Protoplast abgetrennt wird. Der Protoplast wird einmal mit P-Puffer gewaschen und in P-Puffer suspendiert, so daß die Konzentration des Protoplasten 3 x 10&sup8;/ml hat.

(b) Transformation des Protoplasten mit pMTMD7 und pMTMD3 und Kultivieren davon

Zu 0,1 ml der in Beispiel 6-(3)-(a) erhaltenen Protoplastensuspension wird zuerst 10 µl einer Lösung, die 5 µg jedes der Plasmide pMTMD7 und pMTMD3 enthält, und dann 0,05 ml PEG Lösung eingebracht. Dann wird leicht gerührt. Man stellt das entstandene Gemisch 25 Minuten auf Eis. Dann werden 1 ml PEG Lösung mit 25 % Polyethylenglycol (etwa 4000), 0,01 Tris-Puffer (pH-Wert 8,0), 0,05 M Calciumchlorid und 0,6 M Kaliumchlorid zugegeben. Man läßt das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Die so erhaltene transformierte Protoplasten- Suspension wird in Portionen von je 0,2 ml auf eine glatte mit 25 ml Protoplasten-Regenerationsmedium (es ist das BRM Medium, beschrieben in Isogai et al.: Agric. Biol. Chem. 1987, 51, 2321-2329) gestrichen. Dann wird bei 15ºC 20 Stunden inkubiert. Dann wird 5 ml BRM Medium mit 4,5 mg Hygromycin B, gehalten bei 50ºC, auf die vorstehende Platte aufgebracht. Anschließend wird bei 28ºC 14 Tage inkubiert. Als Ergebnis treten 70 Stämme des Transformanten auf (nachfolgend als "HYB Transformanten" bezeichnet), die gegenüber Hygromycin B resistent gemacht wurden.

(c) Messung der Aktivität eines Überstands der transformierten Kultur zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C

Es werden jeweils drei Stämme, isoliert aus jedem der vorstehenden HYB Transformanten, die unter Verwendung der Plasmide pMTMD7 und pMTMM3 hergestellt wurden, in 30 ml CM Medium inokuliert. Dann wird unter Rütteln (220 UPM) bei 30ºC 3 Tage kultiviert. Es wird 1 ml jeder der entstandenen Kulturen bei 1500 UPM 5 Minuten zentrifugiert, so daß man einen Überstand erhält. Der Überstand wird aufgenommen und die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C nach dem Verfahren in Beispiel 1-(3) gemessen.
Sämtliche der so erhaltenen Stämme weisen eine Aktivität auf. Andererseits zeigt Acremonium chrysegnum (ATCC Nr. 11550), das nicht transformiert worden war, keine Aktivität. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

(4) Reinigung der Polypeptide E456Asp und E456Glu

Jeder der beim vorherstehenden Verfahren erhaltenen Stämme D71 und M31 wird in 500 ml CM Kulturmedium inokuliert. Dann wird unter Rütteln (220 UPM) bei 30ºC 5 Tage kultiviert. Die entstandene Kultur wird zentrifugiert, so daß 500 ml Überstand gewonnen wird. Das erfindungsgenäße Polypeptid aus dem gewonnenen Überstand wird nach dem Verfahren in Beispiel 3-(3) gereinigt. Der molekulare Extinktionskoeffizient für allgemeine Proteine, der 10,0 (E1%1cm.280 nm=10,0) beträgt, wird beim erfindungsgemäßen Polypeptid angewandt. Auf der Basis dieses Koeffizienten wird die Menge an gereinigtem Polypeptid aus der Extinktion davon gemessen. Man erhielt etwa 50 µg. Das gereinigte Polypeptid wird unter Verwendung eines Acrylamid-Konzentrationsgradienten von 5 bis 10 % einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Es wird mit CBB angefärbt. Als Ergebnis beobachtet man zwei Bande bei 24K und 22K.

(5) Bestätigung der Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C

Bei jedem der durch das vorstehende Verfahren gereinigten Polypeptide E456Asp und E456Glu wird die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C nach dem Verfahren von Beispiel 4-(6) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 44 und 45 gezeigt. Wird kein erfindungsgenäßes Polypeptid zugegeben, so bildet sich kein aktiviertes Protein C (gestrichelte Linie). Wird andererseits irgendeins der Polypeptide E456Asp und E456Glu zugegeben, nimmt die Menge an aktivierten Protein C im Lauf der Zeit zu (durchgezogene Linie).

(6) Messen der Aktivität zur Inhibierung der Blutkoagulation

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Inhibierung der Thrombin-katalysierten Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin, so daß hierdurch im wesentlichen die Blutkoagulation inhibiert wird, wird nach dem Verfahren von Beispiel 4-(7) gemessen. Die Ergebnisse für das Polypeptid E456Asp und für das Polypeptid E456Glu sind in den Fig. 46 bzw. 47 gezeigt. Es zeigt sich, daß die Blutgerinnungszeit umso länger ist, je größer die Menge an zugegebenem gereinigten Polypeptid ist, bezogen auf die Menge Thrombin.

(7) Bestätigung der Aktivität zur Inhibierung der Plättchenaggregation

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zur wesentlichen Inhibierung der Thrombin-katalysierten Plättchenaggregation wird nach dem Verfahren von Beispiel 4-(8) gemessen. Die Ergebnisse für das Polypeptid E456Asp und für das Polypeptid E456Glu sind in den Fig. 48 bzw. 49 gezeigt. Es zeigte sich, daß bei Zugabe von jeden der erfindungsgemäßen Polypeptide die Plättchenaggregation inhibiert wird. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3

Beispiel 7

(Kulturbildung von D71-Stamm)

Der in Beispiel 6 erhaltene D71-Stamm wird in jeweils 30 ml MM-Medium und 30 ml CM-Medium inokuliert. Getrennt davon wird D71 in den gleichen Medien inokuliert, von denen jedes 50 µg/ml Antipain (Protease-Inhibitor, hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A., Verzeichnis Nr. A6271) enthält. Die inokulierten Medien werden bei 30ºC zwei Tage kultiviert, während sie bei 220 UPM gerüttelt werden. Es wird 1 ml aus jeder entstandenen Kultur bei 15 000 UPM 5 Minuten zentrifugiert, um hierdurch einen Überstand zu gewinnen. Der Überstand wird hinsichtlich der Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C in der gleichen Weise wie im Schritt (3) von Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, ist die Aktivität der Kulturen mit Antipain mindestens 3 bis 4 mal höher als diejenige der Kulturen ohne Antipain.

Beispiel 8

(Reinigung des Polypeptid, hergestellt durch den D71-Stamm)

(1) Kultivieren des D71-Stamms

Der in Beispiel 6 erhaltene D71 Stamm wird in 100 ml CM-Medium inokuliert und bei 30ºC 5 Tage kultiviert, während bei 220 UPM gerüttelt wurde. Dann wurde bei 5000 UPM 20 Minuten zentrifugiert, um hierdurch Zellen anzusammeln. Die Zellen werden in 1 Liter MM-Medium mit 50 µg/ml Antipain (hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A., Verzeichnis Nr. A6271) inokuliert und bei 28ºC 4 Tage kultiviert. Es wird 1 Liter Überstand der erhaltenen Kultur mit einem Filter einer Porengröße von 0,22 um filtriert.

(2) Reinigung der DIP-Thrombinsäule

Die bei vorstehenden Schritt (1) erhaltene Kultur wird auf einer Q-Sepharose-Säule absorbiert, die mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) äquilibriert wurde. Dann wurde mit 5mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen und anschließend mit 5 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) mit 0,3 M NaCl eluiert. Die erhaltene Fraktion wird dialysiert, um sie zu entsalzen.
Es wird DIP-Thrombin (Diisopropylphosphorthrombin), das gemäß des Verfahrens nach N. L. Esmon et al. (J. Biol. Chem., 257, 859 (1982)) hergestellt wurde, an Agarose gebunden, das mit Cyanbromid gemäß des Verfahrens nach P. Cuatrecasas (J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970)) behandelt wurde, um hierdurch DIP-Thrombin-Agarose herzustellen. Die DIP-Thrombin-Agarose wird auf eine Säule aufgetragen, um eine DIP-Thrombin-Agarose-Säule (nachstehend als "DIP-Thrombin-Säule" bezeichnet) herzustellen. Die Säule wird mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert. Die vorstehend genannte Fraktion wird dann auf die Säule aufgetragen, um hierdurch die aktive Fraktion auf der Säule zu adsorbieren. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen wie er zur Äquilibrierung verwendet wird. Dann wird mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 1,0 M NaCl enthält, eluiert, um hierdurch die aktiven Fraktionen zu gewinnen. Die aktiven Fraktionen werden dialysiert, um sie zu entsalzen. Das so erhaltene Dialysat wird weiter auf eine DIP-Thrombin-Säule aufgetragen, die mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,2 M NaCl enthält, äquilibriert wurde, um hierdurch die aktiven Fraktionen auf der Säule zu adsorbieren. Die Säule wird dann mit dem gleichen Puffer gewaschen wie er zur Aquilibrierung verwendet wird. Die Elution erfolgt mit 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 1,0 M NaCl enthält, um hierdurch gereinigte aktive Fraktionen zu gewinnen. Das gereinigte Produkt wird bei der Extinktion von 280 nm gemessen. Der Wert des molekularen Extinktionskoeffizienten für allgemeine Proteine, der 10,0 (E1%1cm 280 nm = 10,0) beträgt, wird bei dem gereinigten Produkt angewandt. Auf der Basis dieses Koeffizienten wird die Menge des gereinigten Produkts aus der Extinktion der Fraktionen berechnet, die das gereinigte Produkt enthalten. Es ergab sich etwa 1 mg.
Bei dem so erhaltenen gereinigten Polypeptid 20 (E456Asp) wird die Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C in der gleichen Weise wie im Schritt (3) von Beispiel 1 gemessen. Als Ergebnis zeigte sich, wie in Fig. 50 dargestellt, daß man bei Abwesenheit des erfindungsgenäßen Polypeptids keine Bildung des aktivierten Proteins C beobachtet (wie durch die gestrichelte Linie in Fig. 50 angegeben). Ist dagegen das erfindungsgemäße Polypeptid (E456Asp) anwesend, nimmt die Menge an entstandenen Protein C im Laufe der Reaktionsdauer zu.
Weiterhin wird das gereinigte Produkt unter Verwendung einer SDS-PAG-Platte 15/25 1010 (hergestellt und vertrieben von Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Japan) und eines Gelgradienten von 15 bis 25 % einer SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Das Gel wird mit CBB (Coomassie Brilliant Blue) angefärbt, um angefärbte Bänder zu beobachten. Es wurden zwei Bänder gefunden, wie in Fig. 53 (Linie 1) dargestellt, wobei eine Linie ein Molekulargewicht von 24 k und die andere ein Molekulargewicht von 22 k bedeutete.

(3) Herstellung einer Anti-TM-(Thrombomodulin) monoklonalen Antikörpersäule

(a) Herstellung von Anti-TM-monoklonalem Antikörper

Die Herstellung von Anti-TM-monoklonalem Antikörper erfolgt gemäß des Verfahrens nach Maruyana et al. (J. Biol. Chem., 260, 15432 (1985)). Eine Balb/c Maus wird mehrmals immunisiert, wobei man als Antigen ein gereinigtes TM (Thrombomodulin) verwendet, das aus der Plazenta hergestellt wird. Die Milzzellen werden dann der Maus entnommen und mit Maus-Myelonzellen einer geeigneten Zellinie einer Zellfusion unterworfen. Dabei wird ein Zellfusionspromotor, z.B. Polyethylenglycol, verwendet. Beispiele für Maus-Myelomzellen, die zur Zellfusion verwendet werden können, umfassen eine P3-X63-Ag8-U1 Zelle (P3-U1) (siehe Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)). Die verschmolzenen Zellen werden mit einem geeigneten Selektionsmedium ausgewählt, z.B. HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin), um hierbei Hybridomzellen aufzufinden. Der Überstand der Kultur wird dann aufgenommen und mit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) hinsichtlich eines Antikörpers gegen TM durchmustert, wobei TM als ein Festphasenantigen verwendet wird. Hybridomzellen, die einen Antikörper gegen TM bilden, werden durch ein geeignetes Verfahren, z.B. eine Grenzwertverdünnung, kloniert. Als Ergebnis erhält man 2 Anti-TMmonoklonale Antikörper, die als Anti- TM-monoklonale Antikörper 1 und 2 bezeichnet werden.

(b) Bestimmung des Epitops des monoklonalen Antikörpers.

Die Bindung der Anti-TM-monoklonalen Antikörper 1 und 2 an Thrombin wird wie folgt gemessen. Das unter (b) von Schritt (4) aus Beispiel 1 gereinigte TM wird mit 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH-Wert 9,2) verdünnt, um eine Konzentration von 2,5 µg/ml zu erhalten. Zur Durchführung von ELISA wird es auf eine flache Mikrotitterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 50 µl/Vertiefung aufgetragen. Man beläßt es drei Stunden. Die Vertiefungen-werden dann mit 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer (pH-Wert 9,2) gewaschen. PBS mit 1 % BSA wird in die Vertiefungen in einer Menge von 100 µl/Vertiefung eingebracht. Dann wird über Nacht bei 4ºC blockiert. Anschließend werden die Kulturüberstände, die jeweils die Anti-TM monoklonalen Antikörper 1 und 2 enthalten, in die Vertiefungen in einer Menge von 50 µl/Vertiefung eingebracht und bei 25ºC 2 Stunden umgesetzt. Dann wird Thrombin, das mit PBS auf eine Konzentration von 1µg/ml verdünnt wurde, in die Vertiefungen in einer Menge von 50 µl/Vertiefung eingebracht und bei 25ºC 30 Minuten umgesetzt. Anschließend wird mit PBS gewaschen. Dann wird H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (hergestellt und vertrieben von Kabi Virum, Schweden, Verzeichnis Nr S2238), das in PBS bei einer Konzentration von 0,3 mg/ml gelöst wurde, in die Vertiefungen in einer Menge von 100 µl/Vertiefung eingebracht und bei 37ºC 1 Stunde umgesetzt. Dann wird das freie pNA (Para-nitroanilin) bei einer Meßwellenlänge von 410 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Wird ein Kulturmedium ohne monoklonalen Antikörper eingebracht, so bindet Thrombin an E456Asp und spaltet S2238 ab, wenn es mit E456Asp verbunden ist, um hierdurch pNA zu bilden. Der Anti-monoklonale Antikörper 1 inhibiert die Bindung von Thrombin an TM, so daß sich hierdurch weniger pNA auszubildet. Andererseits inhibiert der Anti-TM monoklonale Antikörper 2 nicht die Bindung von Thrombin an TM, so daß die Bildung von pNA auch dann nicht vermindert ist, wenn kein Antikörper zugegeben wird. So zeigte sich, daß der Anti-TM monoklonale Antikörper 1 die Bindungsstelle von TM an Thrombin erkennt, und der Anti-TM monoklonale Antikörper 2 einen Abschnitt von TM erkennt, bei dem es sich nicht um die Bindungstelle davon an Thrombin handelt.
Die Wirkung der Anti-TM monoklonalen Antikörper 1 und 2 auf die Aktivität von TM zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C werden witerhin wie folgt untersucht. Es wird 100 µl aus jedem Kulturüberstand, der die Anti-TM-monoklonalen Antikörper 1 bzw. 2 enthält, jeweils mit 100 µl TM (30 u/ml), das unter (b) von Schritt (4) aus Beispiel 1 gereinigt wurde, vermengt und bei 4ºC 14 Stunden umgesetzt. Die Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C wird dann in der gleichen Weise wie in Schritt (3) von Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Anti-TM monoklonalen Antikörper 1 und 2 inhibieren durch TM die Förderung der Thrombin- katalysierten Aktivierung von Protein C. Dies zeigt, daß die Anti-TM monoklonalen Antikörper 1 und 2 eine aktive Stelle vom TM erkennen, die bei der Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C beteiligt ist. Die aktive Stelle vom TM, die bei der Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C beteiligt ist, umfaßt zwei wesentliche Stellen, d.h. eine Bindungsstelle zu Protein C und eine Bindungsstelle zu Thrombin. Es zeigte sich somit, daß der Anti-TM monoklonale Antikörper 1 die Bindungsstelle vom TM an Thrombin erkennt und der Anti-TM monoklonale Antikörper 2 eine andere aktive Stelle vom TM erkennt, die wahrscheinlich die Bindungsstelle an Protein C ist.

(c) Herstellung einer monoklonalen Antikörpersäule

Die zwei monoklonalen Antikörper aus dem Bauchwasser, erhalten durch Multiplizieren von Hybridomzellen in den abdominalen Hohlräumen eines Hybridom-histokompatiblen Tieres, z.B. eine nackte Maus, werden bei einem herkömmlichen Abtrennung- und Reinigungsverfahren gereinigt, z.B. Aussalzen, Ionenaustausch, Chromatographie und Protein A- Säulenchronatographie. Die so gereinigten Anti-TM monoklonalen Antikörper werden jeweils mit CNBr- aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chenicals AB, Schweden, Verzeichnis Nr. 52-1153-00-AI) nach einem von Pharmacia Fine Chemicals AB (Affinity Chromatograph Principles & Methods) veröffentlichten Handbuch verbunden, um hierdurch monoklonale Antikörpersäulen zu erhalten. Die so erhaltenen Säulen werden mit Anti-TM monoklonale Antikörper-Säule 1 bzw. 2 bezeichnet.

(4) Reinigen mit der Anti-TM monoklonalen Antikörpersäule 1

Die in Beispiel 8-(1) erhaltene Kultur wird auf eine Q-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit einem 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 5mm Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,15 M NaCl enthält, gewaschen und mit 5mm Phosphat- Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,3 M NaCl enthält, eluiert. Das Eluat wird mit Natriumchlorid versetzt, so daß die Konzentration von Natriumchlorid 0,5 M hat. Das Gemisch wird dann auf die in Beispiel 8-(3) hergestellte Anti-TM monoklonale Antikörper-Säule 1 aufgetragen und mit einem 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) mit 0,5 M NaCl äquilibriert. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen wie er zur Äquilibrierung der Säule verwendet wird. Dann wird mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH-Wert 2,5), der 0,5 M NaCl enthält, eluiert. Der molare Extinktionskoeffizient bei allgemeinen Proteinen von 10,0 (E1%1cm . 280 nm = 10,0) wird beim gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptid angewandt. Bezogen auf diesen Koeffizienten wird die Menge an Polypeptid aus der Extinktion davon berechnet. Man erhielt etwa 1 mg. Die Aktivität des durch das vorstehende Verfahren gereinigten Polypeptids E456Asp zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C wird gemäß des Verfahrens von Beispiel 1-(3) gemessen. Wie in Fig. 51 gezeigt, bildete sich kein aktiviertes Proteins C (getrichelte Linie), wenn kein erfindungsgemäßes Polypeptid E456Asp zugegeben wird. Andererseits erhöht sich die Menge des aktivierten Proteins C im Laufe der Reaktionsdauer (durchgezogene Linie), wenn das erfindungsgemäße Polypeptid E456Asp zugegeben wird.
Das gereinigte Polypeptid wird weiterhin unter Verwendung eines Acryl amid-Konzentrationsgradienten von 15 bis 25 % (hergestellt und vertrieben von Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., SDS-PAG Platte 15/25 1010) einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Es wird mit CBB (Coomassie Brilliant Blue) angefärbt. Die zwei beobachteten Banden entsprechen einem Molekulargewicht von 24 k bzw. einem Molekulargewicht von 22 k. Dies ist in Fig 53 (Linie 2) gezeigt.

(5) Reinigen mit der Anti-TM monoklonalen Antikörpersäule 2

Die in Beispiel 8-(1) erhaltene Kultur wird auf eine Q-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit einem 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4) äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 5 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,15 mM NaCl enthält, gewaschen und mit 5mm Phosphat- Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,3 M NaCl enthält, eluiert. Das Eluat wird mit Natriumchlorid versetzt, so daß die Konzentration von Natriumchlorid 0,5 M hat. Das Gemisch wird dann auf die Anti-TM monoklonale Antikörper-Säule 2 aufgetragen, die in Beispiel 8-(3) hergestellt ist, und mit einem 20 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,4), der 0,5 M NaCl enthält, äquilibriert. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen wie er zur Equilibrierung der Säule verwendet wird. Es wird mit 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH-Wert 4,0) gewaschen, der 0,5 M NaCl enthält. Dann wird das Eluat mittels Dialyse entsalzen. Der molekulare Extinktionskoeffizient für allgemeine Proteine, der 10,0 (E1%1cm.280 nm=10,0) beträgt, wird auf das erfindungsgemäße Polypeptid angewandt. Auf der Basis dieses Koeffizienten wird die Menge an Polypeptid aus der Extinktion davon berechnet. Es ergab sich etwa 1 mg. Die Aktivität des nach dem vorstehenden Verfahren gereinigten Polypeptids E456Asp zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C wird nach dem Verfahren in Beispiel 1-(3) gemessen. Wird, wie in Fig. 52 gezeigt, kein erfindungegemäßes Polypeptid E456Asp zugegeben, so bildet sich kein aktiviertes Protein C (gestrichelte Linie). Wird hingegen das erfindungegemäße Polypeptid E456Asp zugegeben, nimmt die Menge an aktiviertem Protein C im Laufe der Reaktionsdauer zu (durchgezogene Linie).
Das gereinigte Polypeptid wird weiterhin unter Verwendung eines Acrylamid Konzentrationsgradienten von 15 bis 25 % (hergestellt und vertrieben von Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., SDS-PAD Platte 15/25 1010) einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Es wird mit CBB (Coomassie brilliant blue) angefärbt. Es werden zwei Bande beobachtet, die einem Molekulargewicht von 24 k bzw. einem Molekulargewicht von 22 k entsprechen. Dies ist in Fig. 53 (Linie 3) gezeigt.

(6) Bestätigung der N-terminalen Aminosäuresequenz

Es werden 2 µg jedes gereinigten Polypeptids E456Asp aus den Beispielen 8-(2), -(4) und -(5) gegen Wasser dialysiert, um eine Probe zur Aminosäuresequenzanalyse herzustellen. Dann erfolgt unter Verwendung einer Vorrichtung zur Analyse der Aminosäuresequenz (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., USA, Model 470A) ein Edman Abbau vom N-Terminus nach dem Verfahren von R.M. Hewick et al. (J.Biol.Chem., 256, 7990, 1981). Die freigesetzte Aminosäure Phenylthiohydantoin wird unter Verwendung von HPLC (hergestellt und vertrieben von Spectra Physics, USA, SP 8100) und einer Zorvax ODS Säule (hergestellt von E.I. du Pont de Nemours and Company) analysiert. Eine N-terminale Aminosäuresequenz wird definiert. Das Ergebnis ist, daß alle Polypeptide folgende Aminosäuresequenz besitzen:
Asp-Pro-X-Phe-Arg-Ala-Asn-X-Glu-Tyr-Gln-X-Gln-Pro- Leu-X-Gln-Thr-Ser-Tyr (X ist ein nicht gekennzeichneter Aminosäurerest).

(1) Herstellung des Plasmids pSV2TMD9

Das in Beispiel 1-(1)-(b) erhaltene rekombinante Plasmid M13TMD7 wird nach dem Verfahren der ortsspezifischen Muttagenese in wesentlichen wie in Beispiel 1-(1)-(a) einer Deletion von 114 unterworfen, mit der Ausnahme, daß der Deletor TMd9 die folgende Nucleotidsequenz besitz:
5'-CGGAGGCCGCTCAGATGTCCGTGCA-3' (25 mer), die mit einem Abschnitt auf dem Plasmid M13TMD7 hybridisiert, das die folgende, in Fig. 54 gezeigte Abschnittsequenz TTC ATC TGC ACG GAC ATC TGAGCGGCCT CCGTCCAG besitzt, wird an Stelle des Deletors TMd3 verwendet, um hierdurch das rekombinante Plasmid M13TMD9 zu erhalten, in das ein als TMD9 bezeichnetes DNA-Fragment insertiertt ist. Dieses DNA-Fragment TMD9 besitzt eine Nucleotidsequenz, die das Initiatorkodon ATG und downstream davon eine Nucleotidsequenz umfaßt, die ein Peptid kodiert, das die Aminosäurereste bis zur Stelle 18 vom Aminosäurerest aus, der dem Initiatorkodon entspricht und die Aminosäurereste 367 bis 442 der Sequenz von Fig. 55 umfaßt. Fig. 54 stellt das rekombinante Plasmid M13TMD7 dar, mit dem der Deletor TMd9 hybridisiert wird und von dem der DNA Bereich, der dem DNA-Fragment TMD7 entspricht, zum Teil deletiert wird. Weiterhin wird das rekombinante Plasmid M13TMD9 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI vollständig verdaut, so daß man einen Vektor erhält. Dieser Vektor und das vorstehend genannte DNA-Fragment von 580 bp werden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, so daß man das Plasmid pSV2TMD9 erhält.

(2) Transfektion von pSV2TMD1, pSV2TMD7 und pSV2TMD9 in die Zellinie COS-1

Die Transfektion des in Beispiel 1-(4)-(a) hergestellten Plasmids pSV2TMD1, des in Beispiel 1-(1)-(b) hergestellten Plasmids pSV2TMD7 und des in Beispiel 9-(1) hergestellten Plasmids pSV2TMD9 in die COS-1 Zellen erfolgt nach dem Verfahren von Beispiel 1-(2). Die Elektropolation erfolgt 30 mal für jedes der Plasmide, um hierdurch etwa 300 ml Kultur zu erhalten.
(3) Reinigen und quantitative Bestimmung der Polypeptide Es werden 300 ml der in Beispiel 9-(1) erhaltenen Kultur nach dem Verfahren von Beispiel 3-(3) gereinigt. Die quantitative Analyse mit aufeinanderfolgender ELISA unter Verwendung des Kaninchen-anti-Mensch-Thrombomodulin Antikörpers, hergestellt in Beispiel 1-(4)-(c), und des Anti-Mensch-monoklonalem Antikörpers 1, hergestellt in Beispiel 8-(3), ergibt 30 µg gereinigtes Polypeptid. Das Polypeptid, gereinigt aus der Kultur von COS-1 Zellen, die durch Transfektion von pSV2TMD1 erhalten wurden, wird mit D123Asp bezeichnet; das Polypeptid, gereinigt aus der Kultur von COS-1 Zellen, die durch Transfektion von PSV2TMD7 erhalten wurden, wird mit E456Asp bezeichnet; und das Polypeptid, gereinigt aus der Kultur von COS-1 Zellen, die durch Transfektion von pSV2TMD9 erhalten wurden, wird mit E54 bezeichnet.

(4) Messen der Aktivität zur Förderung der Thrombinkatalysierten Aktivierung von Protein C

Bei dem in Beispiel 9-(3) gereinigten Polypeptid wird die Aktivität zur Förderung der Aktivierung von Protein C nach folgendem Verfahren gemessen. Es werden 10 µl Peptidlösung (10 nM), 10 µl Thrombin (15 nM), 10 µl Protein C (3,2 µM), 10 µl 10 x Assay-Puffer [0,5 M Tris HCl (pH-Wert7,5) mit 1 % BSA, 1M NaCl und 20 mM CaCl&sub2;] und 60 µl destilliertes Wasser vermengt. Das Gemisch wird bei 37ºC eine Stunde umgesetzt. Es werden Antithrombin III bzw. Hepalin bei Endkonzentrationen von 100 nM zugegeben, um hierdurch die Reaktion zu beenden. Um die Konzentration von aktiviertem Protein C zu messen, wird die Konzentration von AMC (7-Amino-7-methyl-coumarin), das aus einem 200 µl Substrat aus Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA in einem Puffer mit 0,05 M Tris HCl (pH-Wert 8,0) und 0,1 M CsCl freigesetzt wurde, bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm und einer Meßwellenlänge von 440 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt Tabelle 4 Tabelle 5 Tabelle 6 Tabelle 7

Vergleichsbeispiele

In den Vergleichsbeispielen sind folgende Abkürzungen verwendet:
Maniatis Laboratory Manual: T.Maniatis et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
N-3 Nährmedium: Medium aus 40 g Malz-Einweichflüssigkeit, 20 g Bete, 2 g Ammoniumacetat und 40 g Salzsäure Hydrolysat aus Stärke, in 1 Liter Wasser gelöst.
Hauptmedium: Medium mit 30 g Bete, 40 g entfettete Sojabohne, 5 g Ammoniumacetat, 7 g Ammoniumsulfat 8 g Calciumsulfat, 15 g Calciumcarbonat, 60 g Salzsäure Hydrolysat aus Stärke und 41,5 g Methyloleat, enthalten in 1 Liter Wasser.
CMG-Medium: Medium aus 20 g Glukose, 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,01 g Eisen(II)Sulfat (Heptahydrat), 3 g Natriumnitrat, 4 g Hefeextrakt und 10 g Pepton, gelöst in 1 Liter Wasser.
CM-Medium: Medium aus 20 g Sucrose, 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,01 g Eisen(II)Sulfat (Heptahydrat), 3 g Natriumnitrat, 4 g Hefeextrakt und 10 g Pepton, gelöst in 1 Liter Wasser.
CM-Festmedium: CM-Medium mit 1,5 % Agar.
GAG-Medium: Medium aus 40 g Glycerol, 4 g Asparagin, 0,1 g Calciumchlorid, 0,1 g Natriumchlorid, 25 ml Lösung mit geringen Mengen an Metallen [4 g Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,4 g Eisen(II)Sulfat (Heptahydrat), 0,16 g Mangansulfat (Tetrahydrat), 0,4 g Zinksulfat (Heptahydrat) und 0,04 g wasserfreies Kupfersulfat, gelöst in 1 Liter Wasser] und 30 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH-Wert7,0), enthalten in Wasser.
P-Puffer: Puffer mit 0,6 M Kaliumchlorid, 0,01 M Magnesiumchlorid und 0,025 M Calciumchlorid.
PEG-Lösung: Lösung mit 25 % Polyethylenglycol (Molekulargewicht: etwa 4000), 0,01 M Tris HCl (pH-Wert 8,0), 0,05 M Calciumchlorid und 0,6 M Kaliumchlorid.

Vergleichsbeispiel 1

Vergleichsbeispiel 1-(1)

Herstellung von pPGACY2

Gemäß des in Fig. 56 gezeigten Verfahrens wird das Plasmid pPGACY2 zur Expression des Cephalosporin C Acylase Gens aus dem SE-83 Stamm (hinterlegt am Fermentation Research Institute, Japan, unter der Hinterlegungsnummer 7649), unter der Steuerung des PGK Promotors, der vom Acremonium chrysogenum stammt, hergestellt.

(i) Herstellung des ACY-Linkers

Der ACY-Linker wird mit einer in Fig. 56 gezeigten Nucleotidsequenz wie folgt hergestellt, damit das Initiatorkodon des Cephalosporin C Acylase Gens genau mit der Stelle des Initiatorkodons vom Acremoniun chrysogenum aufeinandertrifft.
Zuerst werden unter Verwendung einer automatischen Vorrichtung zur DNA-Synthese (hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems Inc., USA, DNA Synthesiser Modell 380-A) nach dem herkömmlichen Verfahren vier Oligonucleotide mit folgenden Sequenzen hergestellt:
1) CGCGTCGATTCACAGTCAAAATGACGAT
2) GGCGGCCAAGACCGATCGCGAGGCCCTGCA
3) GCCGCCATCGTCATTTTGACTGTGAATCGA und
3) GGGCCTCGCGATCGGTCTTG.
Dann wird das 5'-Ende jedes der vorstehend genannten Oligonucleotide 2) und 3) mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und mit den Oligonucleotiden 1) und 4) zur Renaturierung vermengt. Dann wird mit T4-DNA-Ligase verbunden, um hierdurch den ACY-Linker zu erhalten, der die Teilaminosäuresequenz, gezeigt in Fig. 56, kodiert.

(ii) Herstellung von pPGACY2

Zuerst wird pAMK3 mit SmaI verdaut, um es hierdurch zu linearisieren. Der BamHI-Linker wird an die linearisierte pAMK3 mit der T4-DNA-Ligase gebunden und zugleich mit PstI und BamHI verdaut, um ein gereinigtes PstI-BamHI- Fragment (2,3 kb) zu erhalten, das das Cephalosporin C Acylase Gen vom SE-83 Stamm enthält, dem ein Teil des N- terminalen Kodierbereichs fehlt. Das pGKCS' wird andererseits mit MluI und BglII verdaut. Ein DNA-Fragment von etwa 4,8 kb wird isoliert und gereinigt.
Dann werden diese zwei Fragmente und der bei vorstehenden Schritt (i) erhaltene ACY-Linker mit T4-DNA- Ligase verknüpft, um hierdurch pPGACY2 zu erhalten. Das Herstellungsverfahren des Plasmids pAMK3, das in diesem Vergleichsbeispiel 1 die Cephalosporin-C-Acylase, das vom SE-83 stammt, versorgt, ist in der Japanischen Patentoffenlegungsschrift 61-152286 und im Journal of Bacteriology (Matsuda et al., 169, 5815-5820, 1987) beschrieben. Das Plasmid pGKCS4, das den PGK-Promotor und den PGK-Terminator, der vom Acremonium chrysogenum stammt, versorgt, besitzt eine Struktur, wobei die Fragmente mit dem PGK-Promotor und den PGK-Terminator, der von Acremonium chrysogenum stammt, durch eine einzige Restriktionsenzymstelle so verbunden werden, daß sie exprimieren können. Das Herstellungsverfahren davon ist im Vergleichsbeispiel 2-(2) nachstehend beschrieben.
Im Vergleichsbeispiel 1-(1) wird ein DNA-Fragments, das bei der Verdauung mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, mit 1 % Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Die Isolierung des DNA-Fragments aus dem Agarosegel und die Reinigung des isolierten DNA-Fragments erfolgen mit GENE CLEAN (hergestellt und vertrieben von Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) gemäß der beiliegenden Beschreibung. Weiterhin erfolgen alle grundlegenden Durchführungen, einschließlich der Ligation von DNA- Fragmenten, der Transformation von E. coli unter Verwendung des Plasmids, das aus der vorstehenden Reaktion hergestellt wurde, und der Herstellung und Analyse des Plasmids aus den erhaltenen Transformanten nach den Verfahren, wie es im Maniatis Laboratory Journal beschrieben ist.

Vergleichsbeispiel 1-(2)

Transformation von Acremonium chrysogenum mit pPGACY2

Man erhält einen Transformant aus Acremonium chrysogenum (neues Acremonium chrysogenum mit der Aktivität zur Herstellung von Cephalosporin C Acylase), indem man pPGACY2 und pACTHYB3 zugleich transfiziert. Beispielsweise ist das im Vergleichsbeispiel 1-(2) eingesetzte pACTHYB3 ein Transformationsvektor für Acremonium chrysogenum, das eine Hygromycin B Phosphotransferase Expressionseinheit besitzt (eine Expressionseinheit, in der der Promotor und der Terminator eines Actingens, das von Acremonium chrysogenum stammt, und ein Hygronycin B Phosphotransferase Gen, das von Bakterien stammt, die miteinander so verbunden sind, daß sie exprimieren können), die in Acremonium chrysogenum arbeiten kann. Das Herstellungsverfahren davon ist im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben

(i) Herstellung von Protoplasten

Ein Mycel vom Acremonium chrysogenum IS-5, das auf dem CM-Festmedium bei 30ºC fünf Tage lang kultiviert wurde, wird auf 50 ml CM-Medium inokuliert und dann auf einem Rotationsrührer (250 UPM) bei 30ºC drei Tage inkubiert. Es wird 1 ml der entstandenen Zellsuspension auf 50 ml GAG Medium innokuliert und bei 30 ºC 20 Stunden inkubiert. Es wird 50 ml der so erhaltenen Kultur 10 Minuten bei 3500 UPM zentrifugiert, so daß sich das Mycel abtrennt. Das abgetrennte Mycel wird mit einer 0,9 %igen NaCl Lösung gewaschen und in 20 ml Mcilvaene-Puffer (mit 0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,3) mit 0,01 M Dithiothreitol suspendiert. Dann wird bei 30ºC 1 Stunde leicht gerüttelt. Anschließend wird das Mycel bei 3200 UPM 10 Minuten lang abzentrifugiert. Das Präzipitat wird mit P-Puffer gewaschen und in 10 ml P- Puffer mit Novozyme (hergestellt und vertrieben von Novo Industry, Dänemark) bei einer Konzentration von 10 mg/ml suspendiert. Dann wird bei 30ºC eine Stunde leicht gerüttelt. Das entstandene Gemisch wird bei 800 UPM 30 Sekunden zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird durch ein Filterpapier (Toyo Filter Paper SA) filtriert, um hierdurch ein Protoplast vom Mycel abzutrennen. Das Filtrat wird dann bei 3000 UPM 5 Minuten zentrifugiert, um den Protoplasten abzutrennen. Das Präzipitat wird einmal mit P-Puffer gewaschen und bei einer Protoplastkonzentration von 3 x 10&sup8; Zellen/ml in P-Puffer suspendiert.

(ii) Transformation des Protoplasten mit pPGACY2 und pACTHY83

Zu 0,1 ml der im Referenzbeispiel 1-(1) erhaltenen Protoplastsuspension werden 10 µl einer Lösung mit 5 µg pPGACY2 und 5 µg pACTHY83 und dann 0,05 ml PEG Lösung zugegeben. Dann wird leicht gerüttelt. Man stellt das erhaltene Gemisch 25 Minuten auf Eis. Es wird 1 ml der wie vorstehend verwendeten PEG Lösung zugegeben. Man läßt das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die so erhaltene Transformant-Protoplastsuspension wird portionsweise auf eine Platte mit 25 ml Protoplmast- Regenerationsmedium (dies ist das von Isogai et al. in Argic.Biol.Chem., 51, 2321-2329, 1987 beschriebene BRM Medium) in einer Menge von 0,2 ml aufgestrichen. Dann wird bei 15ºC 20 Stunden inkubiert. Dann wird 5 ml BRM Medium mit 4,5 mg Hygromycin B, gehalten bei 50ºC, auf die vorstehende Platte aufgetragen. Dann wird bei 28ºC 14 Tage inkubiert. Es treten 70 Transformantenstämme auf, die gegenüber Hygromycin B (nachstehend einfach als "HYB Transformanten" bezeichnet) resistent gemacht wurden.

Vergleichsbeispiel 1-(3)

Das pBSFAHY83 wird gemäß dem in den Fig. 57 und 58 gezeigten Verfahren hergestellt. Jeder Schritt des Verfahrens ist nachfolgend beschrieben.

(i) Herstellung vom pSFI-2 (Fig. 57)

Zuerst wird pUC18 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) mit EcoRI verdaut. Das erzeugte kohäsive Ende wird mit einer DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) in ein abgestumpftes Ende und in viert Deoxynucleotidtriphosphate übergeführt. Dann wird das vorstehende Fragment unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase an einen SF-Linker gebunden (nach dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung zur DNA- Synthese als zwei Einzelstrang-DNAs hergestellt), der folgende Sequenz besitzt:
5'TGGCCGAGGCGGCCAGATCTCCATGG3'
3'ACCGGCTCCGCCGGTCTAGAGGTACC5', um hierdurch pSFI-1 zu erhalten.
Die Nucleotidsequenz einer mehrfachen Klonierungsstelle von pSFI-1 wird nach dem herkömmlichen Verfahren bestimmt. Die Sequenz des vorstehend genannten SF-Linkers und die Insertionsrichtung des Linkers im pSFI-1 sind in Fig. 57 gezeigt. Der vorstehend genannte Linker wird in die HincII Stelle des so erhaltenen pSFI-1 in der in Fig. 57 gezeigten Orientierung insertiert, um hierdurch pSFI-2 zu erhalten. Die Bestätigung der Insertionsrichtung erfolgt wie bei pSFI-1. Wie in Fig. 57 gezeigt, besitzt pSFI-2 eine Struktur, die zwischen den SfiI Stellen eine große Zahl an Klonierungsstellen hat. Somit ist pSFI-2 ein Vektor, der zur Herstellung eines Fragments geeignet ist, das nur in einer Richtung verknüpft werden kann.

(ii) Herstellung vom pBSFAHY83 (Fig. 58)

Der Vektor pLAFR1 (ATCC 37167), der für einen breiten Bereich gramnegativer Bakterienwirte ein Cosmid ist, wird mit BglII verdaut. Dann wird das 1,6 kb Fragment mit einer Cos-Stelle abgetrennt und gereinigt. Dieses Fragment wird mit T4-DNA-Ligase an pSFI-1 geknüpft, das mit BglII verdaut und einer alkalischen Phosphatasebehandlung (siehe vorstehenden Schritt (i)) unterworfen wurde, um hierdurch pBSF1 zu erhalten. Anschließend wird pACTHY83 mit HindIII und SacI verdaut. Dann wird ein Fragment eines HYB-Expressionsvektors von 3,5 kb abgetrennt und gereinigt (siehe Vergleichsbeispiel 1-(2)). Das entstandene Fragment wird in pBSF1 an einer Stelle zwischen HindIII und SacI insertiert, um hierdurch pBSFAHY83 zu erhalten. Der so erhaltene Vektor pBSFAHY83 ist ein Cosmid, der SfiI Fragmente klonieren kann, die hergestellt werden unter Verwendung von vorstehendem pSFI-2, das so angeordnet ist, daß eine große Zahl von SfiI Fragmenten in der gleichen Orientierung verbunden werden und der das verbundene Fragment in Acremonium chrysogenum einbringen kann. Das im vorliegenden Schritt eingesetzte Herstellungssverfahren von pBGKM5 ist im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben. Beim vorhergehenden Schritt erfolgen die grundlegenden Durchführungen, einschließlich der Trennung und Reinigung eines DNA- Fragments, das durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, der Ligation von DNA-Fragmenten, der Transformation von E. coli mit einem Plasmid, das durch die Reaktion hergestellt wurde, der Herstellung eines Plasmids aus dem erhaltenen Transformanten und der Analyse des gereingten Plasmids gemäß des im Vergleichsbeispiel 1-(1) und im Laboratory Manual von Maniatis beschriebenen Verfahrens.

Vergleichsbeispiel 2-(1)

[Isolierung vom Acremonium chrysogenum Phosphoglycerat- Kinase (PGK)-Gen]

(i) Herstellung der Genbibliothek von Acremonium chrysogenum

Die Gesamt-DNA des Acremonium chrysogenum IS-5- Stamms (hinterlegt am Fermentation Research Institute, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-11232) wird gemäß des bei Johnstone et al bei Aspergillus nidulans (siehe L. L Johnstone et al, EMBO J., 4, 1307-1311, 1985) eingesetzten Verfahrens extrahiert. Es werden etwa 60 µg der Gesamt-DNA mit dem Restriktionsenzym MboI teilverdaut. Dann wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Andererseits werden 10 ug des λ-Vektors EMBL3 (hergestellt und vertrieben von Progema Co., U.S.A.) vollständig mit BamHI und EcoRI verdaut und mit Isopropanol-gefällt, um hierdurch das kurze Linkerfragment EcoRI-BamHI zu entfernen. Dann wird etwa 1 µg des vorstehend erhaltenen teilverdauten DNA- Fragments mit etwa 2 µg des Vektors, der einen BamHI- Terminus besitzt, unter Verwendung der T4-Ligase einer Ligationsreaktion unterworfen. Dann wird es in ein λ- Phagenteilchen verpackt. Die so erhaltene rekombinante Phagensuspension wird auf eine geeignete Konzentration verdünnt und zur Infektion von Escherichia coli NM539 (hergestellt und vertrieben von Promega Co.,USA) verwendet, so daß Plaques hergestellt werden. Die Zahl der gebildeten Plaques wird gezählt. Als Ergebnis zeigt sich, daß die Phagensuspension 3x10&sup5; Teilchen der rekombinanten Phage enthält. Diese Phagensuspension wird als eine Genbibliothek von Acremonium chrysogenum bei 4ºC gelagert. Bei dem vorstehenden Verfahren erfolgt die Herstellung der Donor-DNA und des Vektors und die Ligation dazwischen durch das von Frischauf et al (J. Mol. Biol., 170, 827-842, 1983) beschriebene Verfahren. Weiterhin wird die DNA in den λ-Phagenpartikel verpackt, indem man ein Verpackungsextrakt (hergestellt und vertrieben von Promega Co., USA) gemäß der dazu beiligenden Beschreibung verwendet.

(ii) Herstellung der Sonde

Die Gesamt-DNA der Saccharomyces cerevisiae wird mit HindIII verdaut und in die HindIII-Stelle von PBR327 (ATCC 37516) insertiert, um hierdurch eine Genbibliothek zu erhalten. Die Genbibloithek wird mit dem synthetischen Oligonucleotid der Sequenz: 5'-CAGATCATCAAGAAGTAATTATCT- 3' durchmustert, das auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des Saccharomyces PGK-Gens, beschrieben von Hitzeman et al (siehe Nucleic Acids Res., 10, 7791- 7808, 1982), hergestellt wurde, um hierdurch des Plasmid pYPGK1 zu erhalten, das ein HindIII-Fragment von 2,9 kb mit dem vollständigen PGK-Gen enthält, das vom Saccharomyces cerevisiae stammt. Es wer-den 20 µg Plasmid pYPGK1 mit HindIII und EcoRI verdaut und einer Gelelektrophorese mit 1% Agarose unterworfen. Dann wird das 2,9 kb Fragment gemäß des im Maniatis Laboratory Manual auf den Seiten 164 - 165 beschriebenen Verfahrens aufgenommen und gereingt. Es werden etwa 200 ng des so erhaltenen Fragments mit [α-³²P] Deoxycytidinetriphosphat (dCTP) (50 µCi) gekennzeichnet, indem man einen Nick- Translationssatz (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gemäß der dazu beigelegten Beschreibung verwendet. Nach 10 minütigen Erhitzen der Reaktionsmischung bei 70ºC wird das gekennzeichnete Fragment durch eine Nick-Kolonne (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) gereingt, um hierdurch eine Sonde zu erhalten, die eine Radioaktivität von etwa 10&sup7; cpm (diese Sonde wird nachstehend mit "YP-Sonde" bezeichnet) hat.

(iii) Screening durch Hybridisierung

E. coli NM539 wird mit einer Probe der Phagensuspension (Genbibliothek) infiziert, die in vorstehenden Schritt (i) erhalten wurde Das infizierte Bakterium NM539 wird auf vier Platten kultiviert, so daß sich insgesamt 2x10&sup4; Plaques ausbilden. Diese Plaques werden gemäß des Verfahrens nach Benton et al (siehe Benton et al., Science, 196, 180-182, 1977) auf einen Nitrocellulosefilter übertragen. Dann wird mit Alkali denaturiert und neutralisiert, um hierdurch die DNA zu befestigen. Diese Plaques werden dann mit der YP-Sonde hybridisiert, die bei vorstehenden Schritt (ii) erhalten wurde. Die Hybridisierung erfolgt bei 42ºC 16 Stunden lang in einer Lösung mit 30 % Formamid, 5 x Denhardt's Reagenz, 5 x SSPE, 0,1 % SDS und einer YP-Sonde mit einer Endkonzentration von 5 x 10&sup5; cpm/ml. Der Filter wird dann zweimal bei Raumtemperatur 10 Minuten lang in einer 6 x SSC-Lösung gewaschen, die 0,1 % SDS enthält. Dann wird bei 42ºC 30 Minuten lang in einer 1 x SSC-Lösung gewaschen, die 0,1 % SDS enthält. Dann erfolgt unter Verwendung eines Verstärkungsmusters bei -80ºC 16 Stunden lang eine Autoradiographie. Als Ergebnis werden sieben positive Flecken gefunden. Der Phage wird den Agarbereichen entnommen, die vier dieser positiven Flecken entsprechen und wie vorstehend beschrieben einer Plaque-Hybridisierung unterworfen, um hierdurch vier reine positive Phagenklone zu erhalten. Diese Klone werden mit λ-PGK1, λ-PGK2, λ-PGK3 bzw. λ-PGK4 bezeichnet.

(iv) Subklonierung des PGK-Gens und Ortsbestimmung

Die DNA wird aus den vier Phagenklonen, die bei vorstehenden Schritt (iii) erhaltenen werden, durch ein Verfahren extrahiert, das durch Grossberger (siehe Nucleic Acids Research, 15, 6773) beschrieben wurde. Die λ-DNA wird dann mit BamHI verdaut und der Agarosegel- Elektrophorese unterworfen. Dann erfolgt Southern- Hybridisierung, wobei eine YP-Sonde (hinsichtlich des Verfahrens siehe Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517, 1975) verwendet wird. Bei dem vorstehenden Verfahren erfolgt die Hybridisierung und das Waschen des Filters in gleicher Weise wie in Schritt (iii). Als Ergebnis zeigte sich, daß nur das BamHI-Fragment von etwa 5,5 kb, das in allen Klonen vorhanden ist, mit der vorstehend genannten YP-Sonde hybridisiert ist. Das Fragment wird dem Agarosegel entnommen und unter Verwendung von Gen Clean (hergestellt und vertrieben von Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) genäß der Beschreibung dazu gereinigt. Andererseits wird pUC18 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), das als Vektor verwendet wird, mit BamHI verdaut. Dann wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das vorstehende Fragment und der Vektor werden dann mit T4-Ligase miteinander verknüft und gemäß des im Maniatis Laboratory Journal auf den Seiten 252-253 beschriebenen Verfahrens in E. coli JM105 eingebracht. Der entstandene Transformant wird auf einer L-Nährlösung im Agarmedium mit Ampicillin (Amp) (100 µg/ml) und 5-Bromo-4-chlor-β-galactosid (X-Gal) (0,004 %) kultiviert, um hierdurch weiße Kolonien zu erhalten. Daraus werden 6 Kolonien ausgewählt. Die Plasmid-DNA wird durch ein rasches Isolationsverfahren im kleinen Maßstab (beschrieben auf Seite 368-369 im Maniatis Laboratory Journal) extrahiert. Die so erhaltenen Plasmid-DNAs werden durch Verdauung mit BamHI analysiert. Als Ergebnis zeigte sich, daß das gewünschte Fragment in die Plasmid-DNAs von 5 der 6 Klonen insertiert wurde Die Plasmid-DNAs werden weiterhin durch die Southern-Hybridisierung in der gleichen, wie vorstehend beschrieben Weise analysiert. Es bestätigte sich, daß das in den Klonen insertierte Fragment das gewünschte Fragment ist. Eins der so erhaltenen Plasmide wird mit "pPGK5" bezeichnet.
Das Plasmid pPGK5 wird mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und dann einer Agarosegel- Elektrophorese unterworfen, so daß man hierdurch die Restriktionskarte des 5,5 kb insertierten Fragments, gezeigt in Fig. 59, erhält. Anschließend erfolgt Southern-Hybridisierung zwischen jedem der Fragmente, die durch Verdauung von PGK5 mit verschiedenen Restriktionsenzynen erhalten wurden, und der YP-Sonde, um die Stelle des Bereichs zu bestimmen, der PGK codiert. Als Ergebnis zeigte sich, daß das PstI-StuI-Fragment von etwa 0,7 kb mindestens einen Abschnitt des Bereichs enthält, der PGK codiert.

(v) Bestimmung der Nucleotidsequenz des PGK-Gens

Das PstI-StuI-Fragment von etwa 0,7 kb, das einen Abschnitt des Codierbereichs des PGK-Gens enthält, wird in die SmaI-Psti-Stelle jedes M13mp18 und M13mp19 subkloniert. Ein Abschnitt der Nucleotidsequenz davon wird durch das Verfahren nach Sanger et al (Sanger, F., Science, 214, 1981) bestimmt. Die bestimmte Nucleotidsequenz wird dann mit der Nucleotidsequenz des bereits bekannten PGK-Gens verglichen, um hierdurch die Orientierung des Gens und den Abschnitt des durch diesen Bereich codierten PGK-Proteins zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz wird weiterhin upstream und downstream von diesem Bereich bestimmt. Hierdurch wird die Nucleotidsequenz von 3306 bp bestimmt, die sich über den gesamten Bereich erstreckt. Dieser ist durch eine durchgezogene Linie in Fig. 59 angegeben. Die Bestimmung der vorstehend genannten Nucleotidsequenz erfolgt durch die Verwendung eines Sequenzsatzes (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gemäß der dem Satz beiliegenden Beschreibung. Die vollständig bestimmte Nucleatidsequenz und das davon stammende Translationsprodukt sind in Fig. 61 gezeigt.
Diese Nucleotidsequenz wird mit einem Computer analysiert, wobei eine Software zum Verarbeiten der genetischen Informationen (hergestellt und vertrieben von SDC Software Kaihatsu Kabushiki Kaisha, Japan) verwendet wird. Als Ergebnis finden sich die folgenden Angaben [Punkte (1)-(3)]. Es bestätigt sich, daß das bei vorstehenden Verfahren isolierte Gen ein echtes PGK-Gen ist:
(1) Das PKG-Gen von Acremonium chrysogenum codiert ein Protein, das aus 418 Aminosäureresten besteht und das ein Molekulargewicht von 44300 Dalton besitzt.
(2) Der Codierungsbereich dieses PKG-Gens wird durch 2 Introns auf 145 bp bzw. 64 bp geteilt. Die Stellen dieser Introns sind die gleichen wie diejenigen der Introns im PGK-Gen von Aspergillus nidulans, das ein filamentöser Pilz ist, obwohl die Länge der Introns davon verschieden ist.
(3) Die Primärstruktur des Proteins, das von der Nucleotidsequenz dieses PGK-Gens abgeleitet ist, ist denjenigen der PGK-Gene vom Menschen, Saccharomyces cerevisiae bzw. Aspergillus nidulans sehr ähnlich und dazu zu 68 %, 70 % bzw. 75 % homolog.
Das BglII(1)-KpnI-Fragment [Nucleotidsequenzbestimmter Bereich (A) in Fig. 59] mit so bestimmter Struktur erstreckt sich über einen Bereich bis zu 1251 bp, der sich upstream vom Initiatorcodon (ATG) des PGK- Gens befindet. Man nimmt somit an, daß der gewünschte PGK-Promotor auf diesem Fragment liegt. Diese Annahme wird durch die folgenden Vergleichsbeispiele 2-(2) und (3) gestützt.

Vergleichsbeispiel 2-(2) [Herstellung von pPKGM5]

Das Plasmid pGKM5 wird nach den in Fig. 63 dargestellten Schritten hergestellt, so daß das Bakterium, das vom Neomycin-Phosphotransferase-Gen (nachstehend als "KmR-Gen" bezeichnet) stammt, exprimiert wird. Dabei steuert ein PGK-Promotor, der vom Acremonium chrysogenum stammt. Jeder Schritt wird wie folgt dargestellt.

(i) Herstellung vom pGKBL

Das bei vorstehenden Vergleichsbeispiel 2-(1)-(iv) erhaltene Plasmid pPGKS wird mit BglII verdaut. Ein 3,6 kb Fragment mit dem PGK-Gen wird isoliert und gereinigt. Das Fragment wird in die BamHI-Stelle von pUC18 eingesetzt, das bei vorstehenden Vergleichsbeispiel 2(1)-(iv) hergestellt wurde, um hierdurch das pGKBL zu erhalten. Zugleich wird auch ein anderes Plasmid erhalten, in das das gleiche, vorstehend genannte Fragment in umgekehrter Orientierung relativ zur Orientierung von pGKBL insertiert ist. Das Plasmid wird mit pGKBL' bezeichnet.

(ii) Herstellung von pGKCS

Das bei vorstehenden Schritt (i) erhaltene Plasmid pGKBL wird mit MluI und XhoI verdaut. Ein 4,8 kb Fragment wird isoliert und gereinigt. Das Fragment wird an einen synthetischen Linker geknüpft, der durch folgende Formel dargestellt ist, so daß man hierdurch pGKCS erhält:
5'-CGCGTCGATTCACAGTCAAAAGATC-3'
3'-AGCTAAGTGTCAGTTTTCTAGAGCT-5'
Weiterhin erfolgt im wesentlichen die gleiche, wie vorstehend genannte Durchführung, mit der Ausnahme, daß pGKBL' an Stelle von pGKBL verwendet wird, so daß hierdurch pGKCS' hergestellt wird. pGKCS und pGKCS' sind Plasmide einer Struktur, so daß die Fragmente mit dem PGK-Promotor und den Terminator, die vom Acremonium chrysogenum stammen, mit einzigen Restriktionsstellen (BglII und XhoI) so verknüpft werden, daß sie exprimieren können. Diese Plasmide sind als Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Vektoren geeignet, um verschiedene fremde Gene in Acremonium chrysogenum zu exprinieren. Der vorstehend genannte Linker wird als zwei Einzelstränge synthetisiert, wobei ein Modell 380-A zur DNA-Synthese, hergestellt und vertrieben von Applied Biosystems, gemäß des herkömmlichen Verfahrens verwendet wird.

(iii) Herstellung des Plasmids pPGKM5

Das Plasmid pEX002 wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und BglII verdaut, so daß man ein Fragment von etwa 1,5 kb mit den KmR-Gen erhält. Das erhaltene Fragment wird gereinigt. Das resultierende Fragment wird gemäß der in Fig. 63 dargestellten Orientierung an das Plasmid pGKCS geknüpft, das mit BglII verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde, um hierdurch das Plasmid pPGKMS zu erhalten. Das vorstehend verwendete Plasmid pEX002 ist ein Expressionsvektor für E. coli, das den lac-UV5-Promotor und ein KmR-Gen besitzt, das vom Transposon 5 (Tu5) stammt. Das Verfahren zur Herstellung davon ist in der Japanischen Patentoffenlegungsschrift 63-74488 offenbart.
Im Vergleichsbeispiel 2-(2) werden die mit den Restriktionsenzynen verdauten DNA-Fragmente mit Gelelektrophorese mit 1 % Agarose isoliert. Die Fragmente werden vom Agarosegel mit Gene Clean (hergestellt und vertrieben von Funakoshi Pharmaceutical Co,, Ltd., Japan) gemäß der beiliegenden Anweisungen aufgenommen. Grundlegende Durchführungen, einschließlich der Ligation eines Plasmids an ein DNA-Fragment, der Transformation von E. coli und der Herstellung und Analyse des durch Subklonierung hergestellten Plasmids erfolgen gemäß des im Maniatis Laboratory Journal beschriebenen Verfahrens. Vergleichsbeispiel 2-(3) (Transformation von Acremonium chrysogenum mit Plasmid pPGKM5)

(i) Herstellung des Protoplast

Mycellien (entsprechend etwa 1 cm²) von Acremonium chrysogenum IS-5, gezüchtet bei 30ºC 5 Tage lang auf dem CM-Festmedium, werden in 50 ml CM-Kulturmedium inokuliert und auf einem Rotationsrüttler (250 upm) bei 30ºC drei Tage inkubiert. Es wird 1 ml der entstandenen Kultur in 50 ml GAG-Kulturmedium inokuliert und auf dem Rotationsrüttler (250 upm) bei 30ºC 20 Stunden inkübiert. Es wird 50 ml erhaltene Kultur bei 3500 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um hierdurch die Mycellien als Präzipitat zu sammeln. Die gesammelten Mycellien werden mit einer 0,9 %igen NaCl-Lösung gewaschen und in 20 ml Mcilvaene- Puffer (mit 0,1 M Zitronensäüre und 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,3), der 0,01 M Dithiothreitol enthält, gewaschen. Dann wird bei 30ºC 1 Stunde leicht gerüttelt. Die Suspension wird dann bei 3200 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um hierdurch die Mycellien als Präzipitat zu sammeln. Die erhaltenen Mycellien werden mit P-Puffer gewaschen und in 10 ml P-Puffer mit Novozym (hergestellt und vertrieben von NOVO Industry, Dänemark) bei einer Konzentration von 10 mg/ml suspendiert. Dann wird bei 30ºC 1 Stunde leicht gerüttelt. Das so erhaltene Gemisch wird bei 800 UPM 30 Sekunden zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird durch ein Filterpapier (Toyo Filter Papier 5A) filtriert, um hierdurch die Mycellien vom Protoplast abzutrennen. Das Filtrat wird bei 3000 UPM 5 Minuten zentrifugiert, um den Protoplast abzutrennen. Der erhaltene Protoplast wird einmal mit P-Puffer gewaschen und in P-Puffer bei einer Protoplast- Konzentration von 3x10&sup8;/ml suspendiert.

(ii) Transformation des Protoplast mit dem Plasmid pPGKM5

Es wird 0,1 ml der bei vorstehenden Schritt (i) erhaltenen Protoplastsuspension mit 10 µl einer Lösung mit 5 µg Plasmid pPGKM5 und dann mit 0,05 ml PEG-Lösung versetzt. Dann wird leicht gerührt. Man beläßt das entstandene Gemisch 25 Minuten auf Eis. Dann wird hierzu 1 ml PEG-Lösung eingebracht. Man beläßt das Gemisch weiterhin 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die so erhaltene transformierte Protoplastsuspension wird portionsweise auf eine Platte mit 25 ml Protoplast-Regenerationsmedium (dies ist das bei Isogai et al: Argic. Biol. Chem.1987, 51, 2321-2329 beschriebene BRM-Medium) in einer Menge von 0,2 ml aufgestrichen. Dann werden 5 ml BRM-Medium, das 3 mg G418 enthält und das bei 50ºC gehalten wird auf die vorstehende Platte aufgetragen. Die erhaltene Platte wird bei 28ºC 10 bis 20 Tage inkubiert. Dann werden die G418resistenten transformierten Zellinien ausgewählt. Das vorstehende Verfahren wird mehrmals wiederholt, um hierdurch 50 bis 150 G418-resistente transformierte Zellinien pro 5,5 µg Plasmid pPGKM5 zu erhalten. Im Gegensatz dazu werden nur 0 bis 2 G418-resistente transformierte Zellinien erhalten, wenn der gleiche wie vorstehend genannte Test erfolgt, bei dem das Plasmid pEX002 steuert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das XbaI-BglII-Fragment, das im Plasmid pPGKM5 enthalten ist, den Promotor vom Acremonium chrysogenum PGK-Gen enthält. Die Nucleotidsequenz des XbaI-BglII-Fragments ist nachstehend gezeigt:
Durch Southern-Hybridisierung, bei dem als eine Sonde das PstI-Fragments (etwa 900 bp) vom Plasmid pEX002, das den größten Teil des codierten Bereichs von KmR-Gen enthält, verwendet wird, bestätigt sich, daß das bei der Transfektion verwendete Plasmid pPGKM5 genau in das Chromosom der vorstehend erhaltenen G418-resistenten transformierten Zellinien insertiert ist.

Vergleichsbeispiel 2-(4) (Klonierung des Actin-Gens)

(i) Durchmustern von Klonen mit dem Actin-Gen durch Hybridisierung

Unter Verwendung des ³²P-markierten 400 bp HinfI- Fragments (hergestellt und vertrieben von WAKO PURE CHEMICAL Industries, Ltd., Japan), das das dritte Exon von Mensch-β-Actin-Gen als Sonde (nachstehend als ACTSonde bezeichnet) enthält, wird die im Vergleichsbeispiel 2-(1)-(i) hergestellte Acremonium chrysogenum Genbibliothek unter den gleichen Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 2-(3) durchmustert, um hierbei 4 Phagen zu erhalten, die mit der Sonde hybridisiert sind.

(ii) Subklonieren des Actin-Gens und Bestimmung der Stelle davon

Das Actin-Gens wird subkloniert. Beispielsweise wird die DNA von einem der in Schritt (i) erhaltenen Phagenklonen extrahiert. Sie wird mit λ-ACT5 bezeichnet. Die erhaltene λ-ACTS-DNA wird mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Dann erfolgt Southern-Hybridisierung, wobei die vorstehend genannte ACT-Sonde verwendet wird. Als Ergebnis zeigte sich, daß ein XhoI-Fragment von etwa 5,4 kb und zwei SalI-Fragmente von etwa 1,3 kb und etwa 1,5 kb mit der ACT-Sonde hybridisiert sind. Diebe drei Fragmente (XhoI-Fragment von etwa 5,4 kb, SalI-Fragment von etwa 1,5 kb und SalI-Fragment von etwa 1,3 kb) werden jeweils in die SalI-Stelle des pUC18-Plasmids eingesetzt, so daß hierdurch- die Plasmide pACT5X, pACT5SS und pACT5SL erhalten werden. Anschließend werden jeweils die Teilrestriktionskarten dieser Plasmid hergestellt. Durch deren Überlagerung wird eine Teilrestriktionskarte des DNA-Fragments von etwa 6 kb hergestellt, das das Actin- Gen enthalten soll. Dies ist in Fig. 60 gezeigt.
Die Southern-Hybridisierung erfolgt im wesentlichen unter den gleichen Bedingungen wie im Vergleichsbeispiel 2-(1)-(iv), mit der Ausnahme, daß die ACT-Sonde verwendet wird.

(iii) Bestimmung und Analyse der Nucleotidsequenz vom Actin-Gen

Die Ergebnisse von Schritt (ii) weisen darauf hin, daß das SmaI-XhoI-Fragment von etwa 0,7 kb mindestens einen Abschnitt des Codierungsbereichs für Actin enthält, der dem dritten Exon vorn menschlichen β-Actin entspricht. Demzufolge wird zuerst die Nucleotidsequenz dieses Abschnitts bestimmt. Durch Vergleich der Nucleotidsequenz mit den bekannten Actin-Gen erfolgen die Annahmen hinsichtlich der Orientierung der Nucleotidsequenz, der Gegenwart oder Abwesenheit eines Introns und der Kennzeichnung des Abschnitts vom Actin-Protein, das durch diesen Bereich codiert wird. Anschließend erfolgt die Endbestimmung der Nucleotidsequenz von 3748 bp, die sich vollständig über den Bereich (B) erstreckt, wie in Fig. 60 durch die untere Linie gezeigt, indem eine Nucleotid- Sequenzbestimmung vom Bereich weg upstream und downstream durchgeführt wird. Die vollständig bestimmte Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz eines angenommenen Translationsprodukts werden in Fig. 62 gezeigt. Die erhaltene Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz werden mit denjenigen verglichen, die beim Actin-Gens bekannt sind. Als Ergebnis erhält man folgende Befunde. Es bestätigt sich, daß das bei den vorstehend genannten Schritten isolierte Gen das authentische Actin-Gen ist.
1) Das Actin-Gen, das aus Acremonium chrysogenum isolierte wurde, codiert die Aminosäuresequenz eines Proteins mit einem Molekulargewicht von 41 800 Daltons, das 375 Aminosäurereste umfaßt. Die Zahl der Aminosäurereste ist identisch zu der des Actins, bei dem es sich nicht um Actin (alpha-Typ) von vertebralen Skelettmuskels handelt.
(2) Die aus der Nucleotidsequenz, in Fig. 62 gezeigt, angenommenen Aminosäuresequenz ist zu der des bekannten Actins ziemlich ähnlich. Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Act ins ist mit der des Actins vom Saccharomyces cerevisiae- zu 92 % homolog und mit der des bekannten menschlichen Actins vom Gamma-Typ zu 90 % homolog. Das isolierte NsiI-SalI-Fragment (Fig. 60) mit der wie vorstehend beschriebenen Struktur umfaßt das Actin-Gen-Initiatorcodon und upstream davon in Richtung des 5'-Endes 1293 bp Nucleotide. Es wird somit angenommen, daß der gewünschte Actin-Promotor auf dem Fragment liegt. Die folgenden Vergleichsbeispiele 2-(5) und 2-(6) unterstützen die vorstehenden Annahmen.

Vergleichsbeispiel 2-(5) (Herstellung des Plasmids pACTHY83)

Das Plasmid pACTHY83 wird gemäß der in Fig. 64 gezeigten Schritte hergestellt, um das Hygromycin-B- Phosphotransferse-Gen (nachstehend als "HYBR-Gen" bezeichnet), das von Bakterien stammt zu exprimieren Dabei steuert der Actin-Promotor, der vom Acremonium chrysogenum stammt. Jeder der Schritte wird nachstehend beschrieben.

(i) Herstellung vom Plasmid pACTΔNP

Das im Vergleichsbeispiel 2-(4)-(ii) erhaltene Plasmid pACT5X wird zugleich mit den Restriktionsenzymen NsiI und PstI verdaut, so daß man ein DNA-Fragment von etwa 5,3 kb erhält. Das so erhaltene DNA-Fragment von etwa 5,3 kb wird unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit sich selbst zyklisiert, um das Plasmid pACTΔNP herzustellen.

(ii) Herstellung der Plasmide pACTB1, pACTB2 und pACTB3

Das in Schritt (i) erhaltene Plasmid pACTΔNP wird mit dem Restriktionsenzym NcoI verdaut, so daß sich kohäsive Enden ausbilden. Die kohäsiven Enden werden mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment (nachstehend als "DNA- pol." bezeichnet) und mit vier Deoxyribonucleotiddetriphosphaten (Deoxyadenosyntriphosphat, Deoxyguanosyntriphosphat, Deoxycytidintriphosphat und Thymidintriphosphat, nachstehend als "4dNTPS" bezeichnet) behandelt, um hierdurch die Enden abzustumpfen. Der BamHI-Linker (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) mit phosphoryliertem 5'-Ende und der folgenden Nucleotidsequenz:
5' CCCGGATCCGGG 3'
3' GGGCCTAGGCCC 5' wird dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an die vorstehend genannten abgestumpften Enden geknüpft. Dann wird vollständig mit BamHI verdaut. Das so erhaltene verdaute Gemisch wird einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um hierdurch ein DNA-Fragment von etwa 4 kb zu erhalten. Das entstandene Fragment wird gereinigt. Das gereinigte Fragment von etwa 4 kb wird unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit sich selbst zyklisiert, um hierdurch das Plasmid pACTB1 zu erhalten. Die Plasmide pACTB2 und pACTB3 werden im wesentlichen in der gleichen Weise hergestellt, wobei zwei andere BamHI-Linker verwendet werden, die vom vorstehend genannten Linker in der Nucleotidsequenz und in der Zahl der Nucleotide verschieden sind.
Diese anderen BamHI-Linker werden auch von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan hergestellt und vertrieben. Sie besitzen folgende Nucleotidsequenzen:
5' CCGGATCCGG 3' 5' CGGATCCG 3'
3' GGCCTAGGCC 5' , 3' GCCTAGGC 5'

(iii) Herstellung der Plasmide pACTCS1, pACTCS2 und pACTCS3

Das im Vergleichsbeispiel 2-(4)-(ii) erhaltene Plasmid pACTSS wird mit BamHI verdaut. Beide Enden der entstandenen DNA werden unter Verwendung von DNA-pol. und 4dNTPS abgestumpft. Die DNA mit abgestumpften Enden wird unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit sich selbst cyclisiert, um hierdurch das Plasmid pACTSSΔBam mit deletierter BamHI-Stelle zu erhalten. Dieses Plasmid wird mit ScaI und EcoRI verdaut. Ein Fragment von etwa 0,9 kb, das den Actin-Gen-Terminator enthalten soll, wird abgetrennt und gereinigt. Dieses Fragment wird in pACTBI zwischen den SmaI- und EcoRI-Stellen insertiert, um hierdurch pACTCS1 zu erhalten. Das vorstehend genannte Fragment von etwa 0,9 kb wird in pACTB2 und pACTB3 zwischen den SmaI- und EcoRI-Stellen insertiert, um hierdurch pACTCS2 bzw. pACTCS3 zu erhalten. Die so erhaltenen drei Plasmide haben jeweils eine Struktur, so daß ein Fragment mit dem Acremonium chrysogenum Actin- Promotor durch die einzige Restriktionsstelle BamHI (direkt downstream vom Actin-Initiatorcodon ATG angeordnet) so mit einem Fragment, das den Acremonium chrysogenum Actin-Terminator enthält, verbunden ist, um exprimieren zu können. Diese Plasmide sind geeignete Ausgangsmaterialien zur Herstellung eines Vektors, mit dem verschiedene gewünschte Gene in Acremonium chrysogenum exprimiert werden, um ein Fusionsprotein herzustellen. Verwendet man eins dieser drei Plasmide, kann jedes der gewünschten Gene in einem Actin-Gen- Leserahmen verknüpft werden.

(iv) Herstellung des Plasmids pACTHY83

Das Plasmid pLG83 (erhalten von Professor Julian Davies vom Pasteur Läboratory) wird mit BamHI verdaut. Ein Fragment von etwa 1,3 kb, das das HYBR-Gen enthält, wird abgetrennt und gereinigt. Dieses Fragment wird in der in Fig. 64 gezeigten Orientierung an pACTCS1 geknüpft, das mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, um hierdurch das Plasmid pACTHY83 zu erhalten. Das vorstehend genannte Plasmid pLG83 ist ein Vektor mit dem HYBR-Gen für Hefe. Die Eigenschaften daraus sind in der veröffentlichten Literatur (siehe Critz et al., Gene, 25, 179-188 (1983)) beschrieben. Die grundlegenden Durchführungen von Vergleichsbeispiel 2-(5), z. B. die Abtrennung und Reinigung der verdauten Restriktionsfragmente, die Verknüpfung jedes Fragments an ein Plasmid, die Transformation von E. coli und die Herstellung und Analyse der Plasmide aus der Subklonierung sind im wesentlichen mit denjenigen identisch, die im Vergleichsbeispiel 2-(2) durchgeführt werden.

Claims

1. Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel:

worin X

(a) einen Aminosäurerest aus der durch Glu und Gla gebildeten Gruppe oder

(b) einen Peptidrest von 2 bis 20 Aminosäureresten aus der durch Asp, Glu und Gla gebildeten Gruppe bedeutet, wobei Gla einen gamma-Carboxyglutaminsäurerest bedeutet.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Glu ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Gla ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Asp-Asp ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Asp-Asp-Asp ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Glu-Asp ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei X Gla-Asp ist.

8. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel

9. DNA mit einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.

10. Rekombinantes DNA-Molekül mit einem replizierbaren Expressionsvektor und einer DNA gemäß Anspruch 9, die in den Expressionsvektor eingesetzt ist.

11. Transformant, der einen Mikroorganismus oder eine kultivierte Tierzellinie enthält, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 10 tranformiert sind.

12. Transformant nach Anspruch 11, wobei der Mikroorganismus ein filamentöser Pilz ist.

13. Transformant nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus Acremonium chrysogenum ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem man:

(a) einen Transformanten mit einem Gehalt an einem Mikroorganismus oder einer kultivierten Tierzellinie vorsieht, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 10 tranformiert sind;

(b) den Transformanten kultiviert und ein Polypeptid bilden läßt; und

(c) das Polypeptid vom kultivierten Transformanten isoliert.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Mikroorganismus ein filamentöser Pilz ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus Acremonium chrysogenum ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einer wirksamen Menge eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und an mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Polypeptid eine Aktivität zum Inhibieren einer Blutcoagulation und einer Plättenaggregation durch Thrombin und/oder eine Aktivität zur Förderung der Thrombin-katalysierten Aktivierung von Protein C besitzt.