CN113429459B

CN113429459B - 一种抗血小板多肽及其药物组合物与其应用

Info

Publication number: CN113429459B
Application number: CN202110664286.3A
Authority: CN
Inventors: 叶雨佳; 孟照辉; 刘辉; 李龙君; 罗少恒; 刘含; 朱泓羲
Original assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113429459A

Abstract

本发明公开一种抗血小板聚集的多肽A12，属于医药生物技术领域。本发明多肽A12为由12个氨基酸组成，具有SEQ ID NO:1的多肽的序列，分子量为1310.44，序列Lys‑Asp‑Ala‑Val‑Ala‑Phe‑Thr‑Cys‑Glu‑Pro‑Glu‑Thr。该多肽不限定于抑制凝血酶诱导的血小板聚集，可用于探索其与其它血小板激活剂(胶原、花生四烯酸、ADP、肾上腺素、瑞斯托霉素等)对血小板的作用及相关功能的影响，还可以用于监测现有的抗血小板治疗。

Description

一种抗血小板多肽及其药物组合物与其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种多肽，具体涉及一种抗血小板聚集的多肽A12，及其制备方法，以及以其为活性成分所组成的药物组合物，及其在制备抗血小板药物中的应用。

背景技术

心脑血管疾病血栓事件的发生率、死亡率、致残率及复发率均逐年曾高，不仅给患者带来沉重的经济负担，还对其生理和心理造成一定损害，导致患者的生活质量下降。血小板的活化为血栓形成的中心环节，因此抗血小板的治疗在心血管疾病的管理中十分重要。目前，临床上抗血小板药物仍然存在出血风险，疗效个体差异及药物抵抗等不足。因此，寻求更安全有效、靶向作用更强的抗血小板药物是抗血小板研究亟待解决的重点。

血小板膜受体PAR1是凝血酶与血小板相互作用至血小板活化及血栓形成的重要调节蛋白。PAR-1的N 端的蛋白水解后可以暴露出胞外凝血酶结合位点，与凝血酶结合，从而诱发凝血反应。抑制凝血酶介导的血小板活化是抗血小板药物研发的一个重要靶点。例如，PAR1竞争性拮抗剂沃拉帕沙在美国被批准为急性冠脉综合征患者的的辅助抗血小板药物，也是心肌梗死或外周动脉疾病患者血管事件的二级预防药物。但是临床试验表明，沃拉帕沙在抑制血小板聚集的同时也会增加患者脑出血的风险。

目前，现有技术中未见有抗血小板聚集的多肽A12及其活性作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗血小板聚集的多肽A12及其制备方法和以其为活性成分的药物组合物及其在制药中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种抗血小板聚集的多肽A12，其由Lys-Asp-Ala-Val-Ala-Phe-Thr-Cys-Glu-Pro-Glu-Thr所示的12个氨基酸序列所组成，具有序列表中SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列，分子量为1310.44。

本发明同时提供了所述的抗血小板聚集的多肽A12在制备对血小板聚集有抑制作用的制剂中的应用。

以及，所述的抗血小板聚集的多肽A12在制备抗血小板聚集的药物中的应用。

以及，所述的抗血小板聚集的多肽A12在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。

根据所述的多肽A12在制备抗血小板聚集或治疗心血管疾病的药物中的应用，其中所述的多肽A12能通过凝血酶诱导人血小板聚集和对凝血酶诱导的血小板血块回缩的显著抑制作用达到抗血小板聚集作用。

根据所述的多肽A12在制备抗血小板聚集或治疗心血管疾病的药物中的应用，其中所述的多肽A12在1mM能明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。

根据所述的多肽A12在制备抗血小板聚集或治疗心血管疾病的药物中的应用，其中所述的多肽A12能明显抑制凝血酶诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。

本发明另外还提供了一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的抗血小板聚集的多肽A12和药学上可接受的载体。

本发明所涉及的多肽A12由12个氨基酸组成，分子量为1310.44，序列Lys-Asp-Ala-Val-Ala-Phe-Thr-Cys-Glu-Pro-Glu-Thr。实验显示，A12显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集及血块回缩。因此，A12可用于抗血小板药物的研发。A12也可与药学上可接受的一种或多种载体组成的组合物制备，用于抗血小板抗血栓药物制备。

本发明多肽A12用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99%，优选为0.5-90%的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射（静注、肌注）和口服两种形式给药。

与现有技术相比，本发明优益性在于：

1、本发明新发明了多肽A12，并发掘了其新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

2、本发明的产品多肽A12价廉、未见毒副作用，制备工艺简单，并可做成口服剂型、注射剂型、片剂等，使用方便。

3、本发明的产品多肽A12能明显抑制凝血酶诱导的血块回缩。能有效地抑制血小板聚集作用，能有效地作为抗血小板药物使用。

4、本发明的产品多肽A12可明显抑制凝血酶

诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。能有效地抑制血小板聚集作用，能有效地作为抗血小板药物使用。

附图说明

图1为本发明所提供的多肽的高效液相色谱纯化图：峰值C即为纯化后的A12。

图2为图1峰值C(多肽A12)的二级质谱鉴定图。

图3为多肽A12对凝血酶诱导的血小板聚集的影响的曲线图；

图4为多肽A12对凝血酶诱导的血小板聚集的影响的柱状图；

图5为多肽A12对凝血酶诱导的血小板血块回缩的影响。

具体实施方式

下面结合附图以及具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明。但并不以此来限定本发明。

实施例1

按照文献报道的方法（La Face DM, Couture C, Anderson K, et al.Differential T cell signaling induced by antagonist peptide-MHC complexes andthe associated phenotypic responses. J Immunol. 1997 Mar 1;158 (5):2057–2064.），使用固相多肽合成的方法合成多肽A12。合成的多肽经过高效液相色谱（HPLC）纯化，浓度达≥95%（附图1）。随后通过质谱（MS）进行氨基酸序列和分子量的确定，明确合成的多肽为A12（附图2）。

A12体外抑制凝血酶诱导的人血小板聚集。

（1）实验人血小板来源健康志愿者签署献血知情同意书并给与一定的营养补助。采集静脉全血，经昆明市血液中心分离出单采血小板，于昆明医科大学附一院血液科收集单采血小板。

（2）具体实施方式如下：

步骤一，采用DMSO溶解并调整A12浓度为400mM和200mM。

步骤二，洗涤血小板。取1mL 25℃恒温震荡储存的人单采血小板于1.5mL离心管中，加入终浓度为5mM的EDTA及0.1U/mL的Apyrase(生理盐水配制，防止离心过程中血小板聚集)，400g室温下离心10分钟；离心后的人单采血小板弃上清，在细胞沉淀中加入1mLTyrode’s Buffer B(137mM NaCl,27mM KCl,1mM MgCl₂，0.42mM NaH₂PO₄,5.5mM Glucose,5.55mM HEPES,0.25％ Bovine Serum Albumin, pH 6.5)，5mM EDTA，0.1U/mL Apyrase轻吹匀，400g室温下再次离心10分钟；用Tyrode’s Buffer A(137mMNaCl,27mM KCl,1mMMgCl₂,0.42mM NaH₂PO₄，5.5mM Glucose,5.55mM HEPES，0.25％ Bovine Serum Albumin，pH7.4)重悬离心后的血小板，将血小板计数调整为150-250×10⁹/L。70rpm，25℃震荡储存，洗涤后的血小板在1小时内使用。

步骤三，吸取400μL洗涤血小板重悬液37℃下预热5min。在实验组中加入终浓度为0.5mM和1mM的A12，阳性对照组(Vehicle)中加入等体积的DMSO，于37℃孵育20min。打开血小板聚集仪，按要求设置好参数，在孵育好的洗涤血小板中放入磁力棒，将带有磁力搅拌棒的血小板反应杯插入机器的检测孔中，将其置于血小板聚集仪测试区调零后加入凝血酶，在37℃、1200rpm条件下观察A12对激活剂引起的血小板聚集的影响，共观察5-10min。根据血小板聚集仪记录的血小板聚集曲线绘制相应的条状图和柱状图。实验数据用GraphPadPrism 8.0软件进行统计学分析。利用Student’s t-test统计学方法进行组与组之间的比较。P<0.05则认为差异具有统计学意义。

如说明书附图3所示：人洗涤血小板在37℃下与不同浓度A12或DMSO孵育20分钟，加入凝血酶(0.05U/mL)活化血小板，使用血小板聚集仪，描绘并记录血小板聚集曲线。横坐标为聚集曲线描绘的时间，纵坐标为血小板聚集仪描绘的血小板实时聚集率。图3中呈现的是聚集实验中具有代表性的血小板聚集率曲线。聚集实验开始时，血小板聚集率为0％，随即加入凝血酶，在实验进行到第30秒左右时阳性对照组(Vehicle)实验组的血小板开始聚集。在聚集实验进行到第10分钟左右时，Vehicle组聚集率达峰值约为80％，0.5mM A12实验组聚集率达峰值约为50％，1mM A12实验组聚集率约为2％。说明书附图4所示：Vehicle和不同浓度的A12(0.5mM，1mM)组的血小板聚集峰值的比较的柱状图。Vehicle和不同浓度的A12(0.5mM，1mM)每组重复实验六次，血小板聚集峰值以均数±标准误表示，图中*代表差异有统计学意义，其中*,****分别代表与Vehicle组比较p≤0.05，p≤0.0001。由图3及图4可知：A12可明显抑制凝血酶诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。

实施例2

A12抑制血小板血块回缩。

（1）实验人血小板来源同实施例1。

（2）具体实施方式如下：

富血小板血浆用Tyrode’s Buffer A稀释并定量为500×10⁹/L，取200μL富血小板血浆置入硅化的透明玻璃管，37℃下孵20分钟。使用DMSO溶解A12，调整浓度为200mM。实验分组为：阳性对照组(Thrombin 0.2U/mL)，阴性对照组(Control)和A12实验组。在实验组中加入终浓度为1mM的A12，在阳性对照组，阴性对照组中加入和实验组等体积的DMSO，37℃孵育20分钟。孵育后在阳性对照组和A12实验管中加入终浓度为0.2U/mL凝血酶，混匀后静置于37℃，每10分钟拍照一次。观察每个实验组与对照组血块回缩的速度及血块的大小差异。以上检测组每组均重复3次。

如说明书附图5所示：在实验监测的70分钟内，Control组血小板悬液在没有凝血酶刺激的情况下，并没有产生血块及血块回缩现象。阳性对照组(Thrombin 0.2U/mL)中，血小板悬液凝固为血块，并在实验进行的第30分钟开始回缩，在60分钟时回缩到最小。1mMA12的实验组中，实验进行的第50分钟血小板血块开始回缩，直到70分钟时血块无明显缩小。图5为重复实验中具有代表性的图片，3次实验得到类似的实验结果。因此，1mM A12可明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。

实施例3

取多肽A12，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4

取多肽A12，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例5

取多肽A12，按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例6

取多肽A12，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7

取多肽A12，按常规口服液制法制成口服液。

实施例8

取多肽A12，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例9

取多肽A12，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

本发明的序列表

发明名称：一种抗血小板多肽及其药物组合物与其应用

<110> 昆明医科大学第一附属医院

<120> 一种抗血小板多肽及其药物组合物与其应用

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 多肽A12

<400> 1

Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr

1 5 10

Claims

1.一种抗血小板聚集的多肽A12，其由Lys-Asp-Ala-Val-Ala-Phe-Thr-Cys-Glu-Pro-Glu-Thr所示的12个氨基酸序列所组成，具有序列表中SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列，分子量为1310.44。

2.权利要求1所述的抗血小板聚集的多肽A12在制备对血小板聚集有抑制作用的制剂中的应用。

3.权利要求1所述的抗血小板聚集的多肽A12在制备抗血小板聚集的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的多肽A12在制备抗血小板聚集的药物中的应用，其特征在于：所述的多肽A12在1mM能明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。

5.药物组合物，其特征在于其中含有治疗有效量的权利要求1所述的抗血小板聚集的多肽A12和药学上可接受的载体。