CN101284877A - 重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的抗血栓的融合蛋白，它包括靶向的FXa识别序列和抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD－HV，本发明还公开了重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的抗血栓的融合蛋白制备方法和用途。本发明融合蛋白可防止各类血栓的形成及延伸，能够靶向性地抑制血栓的形成，具有抗凝血酶活性和血小板聚集活性双功能，副作用小，适用于预防和治疗各种静脉性和动脉性血栓性疾病，效果良好。

Description

重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种靶向性抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法。

背景技术

心脑血管系统疾病是一类危害人类健康的重要疾病，每年约有1700万人死于该疾病，因此多年来人们一直致力于研制有效的治疗血栓的药物。水蛭素是存在于医用水蛭唾液腺中的单链多肽，由65个氨基酸残基组成，分子量为7KD，是最有效的天然凝血酶抑制剂，可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病。与肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物相比，水蛭素用量小，疗效高，无毒性，有又无明显抗原性。同时水蛭素也存在一些问题，极大地影响了水蛭素的临床应用：①过量的水蛭素会容易引起非溶栓部位出血，发生明显的全身出血现象，并且水蛭素所致的全身出血没有良好的对抗药物；②水蛭素只有特异的抗凝血酶活性，功能单一，不能从多个途径阻断血栓的形成，仪能有效地防治静脉血栓，而不能防治动脉血栓。③传统方法从医用水蛭中提取获得天然水蛭素，产量很低，价格非常昂贵。

凝血因子FXa在凝血途径中处于关键和核心位置。FXa在游离状态下活性很低，但在血栓部位活性将显著提高，可特异地识别FXa识别序列Ile-Glu-Gly-Arg并将其全部切下。如果在水蛭素N端融合FXa识别序列，在非血栓部位，水蛭素N端被封闭而丧失其抗凝活性；在血栓部位，活化的FXa会将FXa识别序列特异地全部切下，释放出水蛭素抗凝活性，使水蛭素靶向性地在血栓部位体现出抗凝的功能而减少出血副作用。

糖蛋白(GP)II b2 IIIa是血小板膜上含量最丰富的一种蛋白质，其与血纤维蛋白原的结合被认为是血小板聚集的最终共同途径。在血小板被活化后，GP II b2IIIa能通过识别配体上的RGD序列(Arg-Gly-Asp)与血纤维蛋白原相结合。因此利用RGD肽竞争性的阻断它们的相互作用，从而抑制血小板的聚集就成为治疗血栓性疾病的一种有效手段。将RGD三肽序列引入水蛭素32～35位突变位点，能在保留水蛭素抗凝活性的同时，也增加了抗血小板聚集的活性(Zhang YG，Yue L，Song HY.Design of a Novel Plasminogen Activator Based on the Structure ofHirudin.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2006，38：531-536.)因此，将抗凝血酶药物和抗血小板聚集药物组合形成融合抗栓剂已成为抗血栓药物发展的新方向。

巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种高效的表达系统，和其它原核、真核表达系统相比，具有许多优点：具有强有力的醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源蛋白的表达，外源蛋白表达量高；毕赤酵母无内源型载体，外源目的基因需整合到宿主染色体上实现整合型表达，稳定性高；毕赤酵母可分泌表达外源蛋白，自身分泌的蛋白非常少，因此非常有利于目的蛋白的纯化；毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能；发酵工艺成熟，易放大，培养基不含蛋白，较廉价，便于工业化生产。

发明内容

本发明的目的，是提供一种重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白(FXa-RGD-HV)。它由抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV及其N端的FXa识别序列组成。

本发明的重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白包括两个主体部分，一个是在融合蛋白N端的FXa识别序列(Ile-Glu-Gly-Arg)，增加融合蛋白的靶向性而降低出血的副作用；另一个是含有64个氨基酸残基的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的双功能水蛭素变异体(命名为RGD-HV)(序列表SEQ ID NO：1)，其氨基酸序列是在天然水蛭素的32～35位突变位点引入RGD三肽序列所组成的，从而在抗凝血酶活性的基础上增加抗血小板聚集作用。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明在融合蛋白N端引入9×His-tag用于蛋白亲和层析，并在9×His-tag和融合蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，以便于去除亲和层析纯化后融合蛋白的9×His-tag。

本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列从N端依次为9×His-tag、EK酶切位点、FXa识别序列和RGD-HV(序列表SEQ ID NO：2)。

本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ IDNO：3)和携带该DNA序列的重组表达载体。

根据融合蛋白的氨基酸序列，参照毕赤酵母密码子偏好性，确定融合蛋白的编码基因序列。并且根据基因序列以及毕赤酵母表达载体pPIC9K上的多克隆位点的特征，在基因序列两端增加EcoRI和NotI酶切位点，以便于构建入表达载体，设计其基因序列。

本发明根据设计的基因序列，合成了六条引物，经三轮PCR拼接获得目的基因。将目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒。

为保证重组融合蛋白能形成正确的空间构像，所表达的重组融合蛋白最好是以可溶性形式存在。本发明的融合蛋白的重组表达载体为pPIC9K/FXa-RGD-HV质粒。

表达本发明融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，优选地，真核表达的宿主是毕赤酵母。

本发明的又一个目的，是提供制备一种重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法。电转化毕赤酵母GS115宿主菌，经G418筛选得到高表达的阳性克隆，鉴定为甲醇利用快型(Mut+)。在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的FXa-RGD-HV融合蛋白。

对于分泌表达的FXa-RGD-HV融合蛋白可以通过多种方法从菌液上清中进行提取、纯化，这些方法包括粗提、透析、超滤及液相层析等本领域常用的技术，其中液相层析又包括了离子交换、亲和、疏水等层析技术。本发明主要是用His-tag亲和层析柱进行纯化。

因此，制备本融合蛋白的方法，包括以下步骤：

1.FXa-RGD-HV基因的拼接克隆；

2.pPIC9K/FXa-RGD-HV表达质粒的构建；

3.FXa-RGD-HV融合蛋白的纯化。

本发明的融合蛋白可用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，这些疾病包括深层静脉血栓、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性或慢性血管内凝血、肝素引起的血小板减少症、血栓溶解后再栓塞等。此外还能防止肿瘤细胞的转移，配合化学治疗和放射治疗，可促进肿瘤中的血流量从而增强疗效；还有抑制凝血酶在急性脑出血时对脑组织的损伤作用；减轻凝血酶所致的脑组织水肿和离子含量的变化，阻断凝血酶对血脑屏障的破坏作用；抑制凝血酶介导的神经胞凋亡和刺激小胶质细胞活化、增生、分泌细胞因子等作用。还能够降低蛋白尿，改善肾功能，降低血脂，具有抗凝抗血栓形成、改变血液流变性、抗炎、抗增殖和抗纤维化等多种药理活性。

本发明的优点是：

水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂，能有效地防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，并抑制游离的和凝血块上的凝血酶，所以可防止各类血栓的形成及延伸。本发明在保证天然水蛭素抗凝血酶功能的基础上，将FXa(Ile-Glu-Gly-Arg)识别序列融合到水蛭素N端，使其在被切割前封闭水蛭素，被特异识别切割后释放水蛭素的抗凝功能，增加靶向性而降低出血的副作用；将RGD(Arg-Gly-Asp)三肽序列融合在水蛭素32-35突变位点，增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性而使其抗栓功能更全面。融合后的蛋白分子量增加很少，因此在理论上不会增加其免疫原性和毒性。因此，本发明融合蛋白能够靶向性地抑制血栓的形成，具有抗凝血酶活性和血小板聚集活性双功能，副作用小，适用于预防和治疗各种静脉性和动脉性血栓性疾病，效果良好。

附图说明

图1为FXa-RGD-HV基因的克隆；

图2为pPIC9K/FXa-RGD-HV重组质粒的构建；

图3为FXa-RGD-HV融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；

图4为FXa-RGD-HV融合蛋白的Western blot鉴定结果。

具体实施方式

材料：

1.Pyrobest TM DNA Polymerase PCR试剂盒(Takara公司产品，中国大连)

2.pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)

3.T4 DNA连接酶(Takara公司产品，中国大连)

4.EcoRI、NotI、SaII等内切酶(Takara公司产品，中国大连)

5.质粒载体pPIC9K(Invitrogen公司产品，美国)

6.质粒小量制备试剂盒(百泰克生物技术有限公司产品，中国北京)

7.DNA凝胶回收试剂盒(上海博亚公司产品，中国上海)

8.HiTrap^TM prepacked columns(Pharmacia公司产品，美国)

9.大肠杆菌JM109(Takara公司产品，中国大连)

10.酵母菌GS115(Invitrogen公司产品，美国)

11.BCA蛋白定量试剂盒(北京天泰生物公司产品，中国北京)

12.G418、氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)

13.天然水蛭素、纤维蛋白原、(Sigma公司产品，美国)

14.酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，美国)

15.LB培养基

酵母提取物            5g

胰蛋白胨              10g

NaCl                  10g

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。

16.YPD培养基

酵母提取物            2g

胰蛋白胨              4g

溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml浓度为100mg/ml的氨苄青霉素。

17.磷酸盐缓冲液

NaCl                  8g

KCl                   0.2g

Na₂HPO₄               1.44g

KH₂PO₄                0.24g

溶于水1000ml，并用HCl调节pH值至7.4，高压灭菌。

18.BMGY培养基

酵母提取物            2g

胰蛋白胨              4g

溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 10％甘油、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。

19.BMMY培养基

酵母提取物            2g

胰蛋白胨              4g

溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13.4％的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml 1mol/L磷酸盐缓冲液、20ml 5％甲醇、0.4ml0.02％生物素和0.2ml 100mg/ml的氨苄青霉素。

20.肠激酶(重庆科润生物医药公司产品，中国重庆)

21.FXa(Promega公司产品，美国)

实施例1：FXa-RGD-HV的克隆

根据FXa-RGD-HV融合蛋白序列和酵母密码子偏好性确定FXa-RGD-HV基因序列，设计六条引物，经过三轮PCR扩增得到FXa-RGD-HV基因片断。扩增所用的六条引物碱基序列如下：

Hv1：

5′-AAGGATCCGATGATGATGATAAGATTGAGGGTCGTGTTGTTTACACTGAT-3’

Hv2：

5′-ACCCTCGCAAAGGCAAAGGTTTTGACCAGACTCGGTGCAATCAGTGTAAACAAC-3’

Hv3：

5′-TGCCTTTGCGAGGGTTCCAACGTTTGCGGTCAAGGTAACAAGTGCATTCTTGGT-3’

Hv4：

5′-AACGCATTGGTTCTTATCACCACGACCAAGAATGCACTT-3’

Hv5：

5′-AAGAACCAATGCGTTACTGGTGAAGGTACTCCTAAGCCTCAATCTCATAACGATGGT G-3’

Hv6：

5′-TTGGATCCTTATTGAAGGTAATCCTCAGGAATTTCTTCGAAGTCACCATCGTTATGAG-3’

三轮PCR的反应体系均为50ul，其中含引物各50pmol，40nmol的dNTP，10×PCR反应缓冲液5ul，taq酶2U。PCR的反应条件为：第一阶段95℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环32次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约250bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体进行连接。连接产物通过电转化法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次日提取质粒DNA，用PCR鉴定，对于有250bp大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点中插入的DNA片段即是完整的FXa-RGD-HV，该重组质粒命名为pMD-FXa-RGD-HV。参见图1，经三轮PCR拼接后，1％的琼脂糖凝胶电泳显示，有一条与目的基因(269bp)大小基本相符的清晰条带。

实施例2：融合蛋白表达载体的构建及鉴定

参见图2，为了把融合蛋白基因连接入表达载体pPIC9K中，设计了两条引物A、B，在上游引物A上引入EcoRI酶切位点和9×His序列，在下游引物B上引入NotI酶切位点，并且分别加上保护碱基，这两条引物可以使目的基因定向插入到表达载体pPIC9K中。两条引物A、B如下：

A：

5′-CGGAATTCCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACGGATCCGATGATGATGATAA-3’

B：

5′-TTGCGGCCGCTTATTGAAGGTAATCCTCAG-3’

用引物A和引物B，以克隆载体为模板，PCR的扩增条件同上。扩增到5’端引入EcoRI酶切位点和9×His序列，3’端引入NotI酶切位点的目的基因，所获得PCR产物经琼脂糖电泳检测为270bp左右，纯化PCR产物。对目的基因和pPIC9K进行EcoRI和NotI双酶切，纯化回收片断后进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109。筛选出阳性克隆，提取质粒后送到上海英骏生物公司测序，测序结果表明在pPIC9K质粒的EcoRI和NotI位点之间插入有与序列信息表SEQ IDNO3碱基序列一致的DNA片段。该重组质粒命名为pPIC9K/FXa-RGD-HV。

对测序正确的pPIC9K/FXa-RGD-HV质粒进行限制性内切酶SalI线性化后，电穿孔转化毕赤酵母，如表达载体成功转化并整合到毕赤酵母中，转化子则可以在不含His的MDS平板上正常生长，否则就不能生长。经过His营养缺陷平板的初筛，获得了大量阳性转化子。在MDS平板上，3ug的质粒转化总共得到了250多个转化子。在不含组氨酸的MDS培养基上完成初筛后，选取MDS培养基上生长良好的菌落150个，接种到G418抗性平板上完成复筛。将所选菌落接种到G418抗性平板上的同时，接种到MD和MM平板对应的位置上完成表型Mut+鉴定。菌落PCR鉴定FXa-RGD-HV融合基因DNA片段的存在(方法同前)，结果选出在MD和MM平板上都能正常生长，并能在G418抗性平板上生长的抗G418、Mut+转化子5个。

将筛选出来的5个阳性转化子，分别进行诱导表达，收集上清液。各取1ml培养96h的上清液，超滤离心至50μl，用SDS-PAGE电泳检测这5个转化子的蛋白表达量，并做Western blot验证目的蛋白的表达。最终获得一个高表达的重组菌株。加甘油于-80℃冻存。根据凝血酶滴定法(“凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进”陈华友，刑自力，李媛媛，《生物技术》，2002，12：24-25)，测定此高表达重组菌株在各诱导时间点的单位抗凝活性，确定较合适的诱导时间为48小时，重组菌株摇瓶表达的上清液单位抗凝活性不小于280ATU/ml。

实施例3：工程酵母的培养及融合蛋白的表达与纯化

取-80℃保存的含有pPIC9K/FXa-RGD-HV的酵母工程菌种接种于YPD平板活化，挑取外观优良的单个菌落接种于BMGY培养基，28℃～30℃恒温摇床280rpm振荡培养16～18小时至OD600≈1，将所得的菌液置于1L三角瓶中，用双层灭菌纱布封口，300rpm，30℃震荡培养，每24h向培养基中添加无菌甲醇至终浓度为1.0％，48h后停止培养，离心菌液收集上清液。对摇瓶培养的菌液离心得到的上清液进行超滤离心，将100ml上清液浓缩为10ml，去除培养基成分，同时更换为亲和层析进样缓冲液。用AKTA层析仪和HiTrap^TM Chelating HP Columns(Pharmacia)对蛋白质进行亲和层析纯化，经二次重复上样，柱洗脱时出现一个蛋白洗脱峰，说明有带His-tag的蛋白被亲和层析纯化出来。对纯化产物进行SDS-PAGE电泳(如图3)，样品0为纯化上样前总蛋白，样品0’为纯化过柱后未亲和吸附的产物，样品1-4为依次洗脱的目的蛋白。纯化结果表明，依次洗脱的纯化产物中第3号产物的杂蛋白较少，有一条单一明亮的目的蛋白条带，纯化效果好。根据常用的BCA法，取纯化后的蛋白溶液，测定溶液中总蛋白的浓度为1.54mg/ml。

实施例4：重组FXa-RGD-HV融合蛋白的鉴定

融合蛋白的N端有9×His-tag，因此可以用Anti-His Antibody对目的蛋白进行Western Blot鉴定。分离纯化的重组FXa-RGD-HV融合蛋白经过SDS-PAGE电泳后，通过电转移将PAGE胶上的蛋白质转移至尼龙膜上。尼龙膜用高浓度蛋白质进行封闭，然后用His抗体进行结合反应，用洗液漂洗尼龙膜，加显色试剂进行显色。蛋白质印迹结果如图4所示，样品1为亲和层析纯化后产物，样品2为亲和层析纯化前的超滤产物，样品0为未诱导表达对照。结果表明，目的蛋白在甲醇诱导前无表达，甲醇诱导能使重组菌株表达外源蛋白，经超滤离心和亲和层析纯化后，在菌液上清中分离出单一的目的蛋白。

分别用蛋白酶EK和FXa切割鉴定融合蛋白。结果表明，目的蛋白可以分别被两种蛋白酶切割开，切开的片段基本符合预期，这说明目的蛋白可以进行下一步的活性实验，并还证明纯化出的蛋白为目的蛋白。

实施例5：重组FXa-RGD-HV融合蛋白的抗凝血酶活性测定

根据凝血酶滴定法方法(“凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进”陈华友，刑自力，李媛媛，《生物技术》，2002，12：24-25)，对待测蛋白的抗凝血酶活性进行测定，并计算抗凝血酶比活性。待测样品A为带有9×His-tag的FXa-RGD-HV融合蛋白；待测样品B为经EK完全切割后的FXa-RGD-HV，即是本发明中的目的融合蛋白；待测样品C为经FXa完全切割后的RGD-HV，即是模拟体内被靶向性切割活化的双功能水蛭素；待测样品D为标准水蛭素0.1mg/ml。测定结果如表1：

表1目的蛋白抗凝血酶活性测定结果

结果发现，N端带有9×His、EK识别序列和FXa识别序列的融合蛋白抗凝活性极低，说明水蛭素的N端如有较长氨基酸封闭会丧失绝大部分抗凝活性；去除9×His、EK识别序列后，融合蛋白的N端仍有FXa识别序列，不能完全封闭水蛭素的抗凝功能；经FXa完全切割后的融合蛋白释放出了水蛭素的抗凝活性，与天然水蛭素基本相同。表明纯化出的蛋白抗凝血酶活性较高，基本上达到天然水蛭素的抗凝效果。经过体外酶切融合蛋白并测定其抗凝活性，显示融合蛋白具有靶向型，能在一定程度上减小水蛭素出血的副作用。

实施例6：重组FXa-RGD-HV融合蛋白抗血小板聚集活性测定

采用比浊法测定抗血小板聚集活性。基本实验过程为：(1)健康成人男性静脉取血3ml，3.8％枸橼酸钠1:9抗凝，700rpm离心10min，分离富含血小板血浆(PRP)。4000rpm离心15min，分离贫血小板血浆(PPP)。用PPP稀释PRP，使血小板数量为25-30万个/ul.(2)取200ulPPP加入比色杯中，插入检测孔，调零。(3)取200ulPRP加入比色杯中，插入检测孔，加入37℃预热的ADP(200uM)5ul(终浓度5uM)。(4)观察5分钟聚集率变化，打印聚集曲线。以最大聚集率(PAG(M))为观察指标，此最大聚集率为空白对照，应大于50％(小于50％，应重新取血)。(5)取200ulPRP加入比色杯中，分别加入FXa-RGD-HV融合蛋白溶液5ul(浓度为0.04mg/ml；终浓度为0.001mg/ml)，室温放置15min，加入37℃预热的ADP(200uM)5ul(终浓度5uM)，测定最大血小板聚集率。血小板聚集抑制率(％)＝(对照血小板聚集％-重组蛋白血小板聚集％)/

对照血小板聚集％×100％。测定结果如表2：

表2目的蛋白抗血小板凝集活性测定结果

实验结果表明，以生理盐水为对照，重组FXa-RGD-HV融合蛋白浓度为0.001mg/ml时抗血小板聚集活性为20.7％，说明重组FXa-RGD-HV融合蛋白具有很好的抗血小板聚集功能。

结论：

由于凝血酶和血小板聚集诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要因素，因此，从实施例5和实施例6的结果可以表明，重组融合蛋白中的水蛭素成分能有效地防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，并抑制游离的和凝血块上的凝血酶，所以可防止各类血栓的形成及延伸，将FXa识别序列融合到水蛭素N端可以增强水蛭素的靶向性而减少出血副作用，将RGD三肽序列融合在水蛭素的合理部位可以增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性。可以用于预防和治疗各种静脉及动脉血栓疾病，效果良好。

本发明为采用重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集融合蛋白在临床上预防和治疗血栓性疾病提供了新的途径。

序列表

<110>重庆大学

<120>重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>192

<212>DNA

<213>氨基酸序列在天然水蛭素HV2的32～35位突变位点引入RGD三肽序列组成

<400>1

valvaltyrt hraspcysth rglusergly glnasnleuc ysleucysgl uglyserasn     60

valcysglyg lnglyasnly scysileleu glyargglya splysasngl ncysvalthr    120

glygluglyt hrprolyspr oglnserhis asnaspglya sppheglugl uileproglu    180

asptyrleug ln                                                        192

<210>2

<211>246

<212>DNA

<213>融合蛋白的氨基酸序列从N端依次为9×His-tag、EK酶切位点、FXa识别序列和RGD-HV

<400>2

hishishish ishishishi shishisasp aspaspaspl ysileglugl yargvalval     60

tyrthraspc ysthrgluse rglyglnasn leucysleuc ysgluglyse rasnvalcys    120

glyglnglya snlyscysil eleuglyarg glyasplysa snglncysva lthrglyglu    180

glythrprol ysproglnse rhisasnasp glyasppheg lugluilepr ogluasptyr    240

leugln                                                               246

<210>3

<211>269

<212>DNA

<213>融合蛋白的基因序列两端增加EcoRI和NotI酶切位点，以便于构建入表达载体

<400>3

gaattccacc accaccacca ccaccaccac cacggatccg atgatgatga taagattgag     60

ggtcgtgttg tttacactga ttgcaccgag tctggtcaaa acctttgcct ttgcgagggt    120

tccaacgttt gcggtcaagg taacaagtgc attcttggtc gtggtgataa gaaccaatgc    180

gttactggtg aaggtactcc taagcctcaa tctcataacg atggtgactt cgaagaaatt    240

cctgaggatt accttcaata agcggccgc                                      269

Claims (10)

1.一种重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于：由靶向的FXa识别序列和抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV组成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

2.根据权利要求1所述的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于：RGD-HV的氨基酸具有SEQ ID NO：1序列，RGD序列位于水蛭素32-35突变位点；FXa识别序列为人FXa凝血因子的识别序列。

3.根据权利要求1所述的重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于：FXa识别序列位于融合蛋白的N-末端，RGD-HV位于融合蛋白的C-末端。

4.根据权利要求1所述的重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白，其特征在于：所述重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的N端融合有一个9×His-tag。

5.根据权利要求4所述的重组靶向双功能水蛭素的融合蛋白，其特征在于：所述重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白与9×His-tag之间有一个肠激酶酶切位点。

6.编码权利要求1-5中重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的DNA序列，具有SEQ ID NO：3的DNA序列。

7.包含权利要求5所述的DNA序列的重组表达载体pPIC9K/FXa-RGD-HV。

8.制备重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法，包括用权利要求6重组表达载体转化毕赤酵母细胞，分离、纯化所述重组靶向双功能水蛭素的融合蛋白。

9.根据权利要求7所述的制备重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白的方法，其特征在于：表达系统的宿主为毕赤酵母GS115。

10.权利要求1所述的重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的的融合蛋白用于制备静脉和动脉血栓性疾病的药物的用途。

Images