CN110724678B - 中介蝮蛇毒纤溶酶及其制备方法和应用 - Google Patents

中介蝮蛇毒纤溶酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种中介蝮蛇毒纤溶酶，其基因为Gisp6，具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；其制备方法由中介蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法、纯度鉴定以及质谱分析、中介蝮蛇毒纤溶酶Gisp6基因的克隆三个步骤组成；中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞建立稳定表达细胞株中的用途，中介蝮蛇毒纤溶酶在溶解血栓药物中的用途。由于采取了最佳的盐浓度，减少了组分与填料的非特异性吸附；采用了最佳pH值，使得峰之间不重叠，排除了杂质、提高了产物的纯度。

Description

中介蝮蛇毒纤溶酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于酶技术领域，具体涉及到中介蝮蛇毒纤溶酶。
背景技术
血栓是血液成分在血管内皮细胞表面受损、胶原纤维暴露处形成的血凝块，血栓的主要成分是沉积的血小板和不溶性纤维蛋白凝胶及红细胞。血栓通常被分成六类，混合性血栓包括血栓头(血小板+少量纤维蛋白)、血栓体(血小板小梁+纤维蛋白网+红细胞)和血栓尾(纤维蛋白网络+红细胞)，透明血栓(微血栓)主要由纤维蛋白构成。在人体的血液循环系统中，存在两个相互拮抗又相互依存的生理作用系统，即凝血系统和抗凝血系统，即纤维蛋白溶解系统，简称纤溶系统，两者在体内处于动态平衡中。
纤溶系统的主要功能是清除沉积在血管壁上血栓内的纤维蛋白凝胶块，使血栓溶解，保持血管再通和血流正常。人体内的纤溶系统主要包括4种成分：纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活剂抑制剂。血栓性疾病是一类常见的心脑血管疾病，随着我国人民生活水平的提高和老龄化时代的到来，血栓性疾病现已成为我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病之一，溶栓治疗毫无疑问是最为有效的疗法，寻找新型高效溶栓药物是天然药物研究的一个热点。
溶栓药物的发展经历了第一代尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂，第二代溶栓药、重组型t-PA(rt-PA，第三代溶栓药。从自然界寻找溶栓药物也是一个重要方向，先后发现的溶栓药物有蚓激酶、纳豆激酶、水蛭素等。从蛇毒中分离得到的纤溶酶有两大类型，即金属蛋白酶型(SVMP)纤溶酶和丝氨酸蛋白酶型(SVSP)纤溶酶。自1991年起，已在蝰科蛇毒中发现了多个具有纤溶酶活性的金属蛋白酶(水解纤维蛋白的α-链)。例如，来自铜头蝮的Fibrolase(商品名Alfimeprase)、东部菱斑响尾蛇蛇毒的Atroxas、原矛头蝮(Protobothrops tokarensis)的金属蛋白酶PT-H2等，其作用不受血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF等影响，且其纤溶酶活性依赖于金属离子。
蝰科中的蝮亚科蛇毒中含有丰富的丝氨酸蛋白酶类纤溶酶，其酶活性中心有标志性氨基酸残基-丝氨酸，发挥作用时不依赖金属离子。虽然这类纤溶酶氨基酸序列不同，分子量、等电点等有差异，却有相似的纤维蛋白水解活性。最为有名的是来自烙铁头蛇毒的纤溶酶，以及来自白眉蝮(即乌苏里蝮)蛇毒的纤溶酶现已被做成纤溶酶注射液，临床使用效果良好。
中介蝮(Gloydius intermedius)为蝰科(Viperidae)蝮亚科亚洲蝮属毒蛇，广泛分布于我国西北及华北地区。由于中介蝮蛇毒中纤溶酶的含量很低，运用柱层析分离技术纯化获得的纤溶酶纯度不高，含有的杂质会引起副作用。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种中介蝮蛇毒纤溶酶。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种中介蝮蛇纤溶酶的制备方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为中介蝮蛇纤溶酶提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：中介蝮蛇毒纤溶酶，它的基因为Gisp6，具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶的制备方法由下述步骤组成：
(1)中介蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法
1)凝胶过滤层析分离
取中介蝮粗毒冻干粉溶解在50mM的醋酸铵缓冲液中，配制成50mg/mL的样品溶液，以Sephacry1-200HR为填料，以含0.10～0.25M NaCl、pH为7.3的30～60mM醋酸铵为缓冲液，上凝胶过滤层析柱，按常规方法，做凝胶过滤，收集具有纤溶酶活性的初组分P3。
2)阴离子交换层析分离
以pH为8.2的45～55mM醋酸铵为起始缓冲液，含0.8～1.2M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap DEAE FF 16/10阴离子交换柱分离纤溶酶活性的初组分P3，得具有纤溶酶活性的二级组分P3-3。
3)阳离子交换层析分离
以pH为5.6的45～55mM醋酸铵为起始缓冲液，含1M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap CM FF 16/10阳离子交换柱分离阴离子交换层析分离纤溶酶活性的二级组分P3-3，得具有纤溶酶活性的精提组分P3-3-2，即中介蝮蛇毒纤溶酶。
4)中介蝮蛇毒纤溶酶活性测定
对中介蝮蛇毒纤溶酶活性的检测按照常规酶学方法进行，所用底物为纤溶酶特异性人工多肽V7127，溶剂为pH8.0的100mM Tris-盐酸缓冲液，反应条件为37℃避光反应20min，用酶标仪按操作步骤测定吸光值的波长为405nm。
(2)纯度鉴定以及质谱分析
取精提组分P3-3-2组分做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确定纯度，切取蛋白条带，做MALDI-TOF/TOF鉴定，得肽段序列信息。
(3)中介蝮蛇毒纤溶酶Gisp6基因的克隆方法
1)以中介蝮毒腺为原料，用分子生物学常规方法提取总RNA。
2)以Oligo dT为引物，反转录成cDNA，获得模板。
3)按照中介蝮蛇毒纤溶酶的肽段序列提供的信息，设计一对Gisp6兼并引物，序列如下：
上游引物：5'-GCTATG[T/G][G/T]GCTGATCA[A/G]AGTG[C/T]TAG[C/T]-3'
下游引物：5'-GTTTTCA[T/C/A][T/G]G[A/G]GGGCA[G/A][T/G][T/C][G/C][G/A]CATC-3'
合成上述引物。
4)按照常规分子克隆的方法建立PCR体系，其中用上述序列对应的引物、所制备的cDNA为模板，以高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得长度为780bp的产物，反应条件：98℃、20s预变性；98℃变性15秒，52℃退火35秒，72℃延伸1.5分钟，共运行30个循环。
5)扩增结束后，取跑2％琼脂糖凝胶电泳，回收长度为780bp的Gisp6基因DNA片段，与pEASY-Blunt Zero T载体连接，连接体系转化感受态细胞，涂氨苄抗性平板及挑取克隆培养，提取质粒，用M13F和M13R引物做常规PCR筛选阳性克隆；获得的阳性克隆用M13F或M13R引物测序，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因Gisp6如SEQ ID NO.1所示的全长核苷酸序列，用BioEdit软件推导出的中介蝮蛇毒纤溶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法步骤(1)中的步骤1)为：以Sephacry1-200HR为填料，最佳以含0.18M NaCl、pH为7.3的45mM醋酸铵为缓冲液，做凝胶过滤层析得具有纤溶酶活性的初组分P3。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞建立稳定表达细胞株中的用途，其使用方法如下：
(1)重组表达载体的构建
将中介蝮蛇毒纤溶酶基因插入到表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，得到重组表达质粒。
(2)转染宿主细胞
以HEK293细胞为宿主细胞，在聚乙烯亚胺介导下，将重组表达质粒转入HEK293细胞，实现瞬时表达。
(3)G418抗生素筛选
以浓度600～1050μg/mL的G418抗生素筛选，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞；
上述的G418抗生素购于美国Calbiochem公司。
(4)中介蝮蛇毒纤溶酶表达检测
收集上述中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞进行，裂解制样，以6×His单抗做western blot检测中介蝮蛇毒纤溶酶的表达。
(5)工程细胞的亚克隆
将整合有中介蝮蛇毒纤溶酶基因的HEK293细胞进行亚克隆，获得稳定表达该蛇毒纤溶酶的工程细胞，命名为HEK293-Gisp6。
上述的步骤(3)为：最佳以浓度800μg/mL的G418抗生素筛选，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶在溶解血栓药物中的用途。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶在溶解血栓药物中的用途，它是由下述原料及其配比按常规制剂方法制备成1000mL注射剂：
中介蝮蛇毒纤溶酶 6.5mg
注射用水加至 1000mL。
本发明以中介蝮蛇毒为材料，依次采用凝胶过滤层析、阴离子交换层析、阳离子交换技术，分离得到中介蝮蛇毒纤溶酶，由于采取了最佳的盐浓度，减少了组分与填料的非特异性吸附；采用了最佳pH值，使得峰之间不重叠，排除了杂质、提高了产物的纯度。
用中介蝮的毒腺为材料，提取了总RNA后反转录制备出cDNA，以中介蝮蛇毒纤溶酶质谱鉴定提供的肽段信息为基础，设计了引物，采用RT-PCR技术克隆了该纤溶酶的基因，得其基因的全序列。
本发明以pcDNA3.1(+)为表达载体，以HEK293细胞系为宿主细胞，实现在HEK293细胞中稳定表达中介蝮蛇毒纤溶酶Gisp6的方法，为将该基因工程产品开发为临床药物奠定了基础。
附图说明
图1是用阳离子交换层析分离P3-3组分的过程图。
图2阳离子交换层析分离P3-3组分所得组分的纤溶酶活性检测。
图3是中介蝮蛇毒纤溶酶的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图4是中介蝮蛇毒纤溶酶A带的MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定图。
图5是中介蝮蛇毒纤溶酶B带的MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定图。
图6是中介蝮蛇毒纤溶酶基因Gisp6的PCR扩增产物电泳图。
图7是pcDNA3.1/Gisp6阳性克隆的PCR鉴定电泳图。
图8是pcDNA3.1-Gisp6重组质粒正向测序图。
图9是重组质粒转染HEK293细胞后G418筛选15天的光学显微镜观察图。
图10是Western blot检测HEK293-Gisp6细胞内表达的中介蝮蛇毒纤溶酶。
图11是HEK293/Gisp6细胞亚克隆产生7个细胞株Gisp6表达的Western blot检测图。
图12是7个HEK 293/Gisp6工程细胞株上清的纤溶酶活性测定图。
图13是七种HEK 293/Gisp6工程细胞上清的溶栓作用测定。
图14是中介蝮蛇毒纤溶酶与注射用纤溶酶纤溶活力比较图。
图15是中介蝮蛇毒纤溶酶水解纤维蛋白原的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。
图16是中介蝮蛇毒纤溶酶和巴曲酶水解纤维蛋白原的活性比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶，其基因为Gisp6，具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述的中介蝮蛇毒纤溶酶的制备方法由下述步骤组成：
(1)中介蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法
1)凝胶过滤层析分离
取中介蝮粗毒冻干粉溶解在50mM的醋酸铵缓冲液中，配制成50mg/mL的样品溶液，以Sephacry1-200HR为填料，以含0.10～0.25M NaCl、pH为7.3的30～60mM醋酸铵为缓冲液，上凝胶过滤层析柱，按常规方法，做凝胶过滤，设置流速为0.45mL/min，共出现6个峰组分，收集具有纤溶酶活性的初组分P3。
2)阴离子交换层析分离
以pH为8.2的50mM醋酸铵为起始缓冲液，以含1M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap DEAE FF 16/10阴离子交换柱分离P3组分，得具有纤溶酶活性的二级组分P3-3。
3)阳离子交换层析分离
以pH为5.6的50mM醋酸铵为起始缓冲液，以含1M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap CM FF 16/10阳离子交换柱分离阴离子交换层析分离纤溶酶活性的二级组分P3-3组分，得具有纤溶酶活性的精提组分P3-3-2，即中介蝮蛇毒纤溶酶；过程曲线见图1，其中P3-3-1为穿透峰，P3-3-2和P3-3-3为洗脱峰。
4)中介蝮蛇毒纤溶酶活性测定
对步骤3)分离精提组分P3-3-2的活性检测由下述步骤组成：
纤溶酶活性检测：以V7127为底物做发色底物法检测
V7127溶液配制：称取40mg的V7127固体(美国Sigma公司产品)溶解于1ml的二甲基亚砜中，4℃避光保存。临用前，用活性测定缓冲液20倍稀释即为工作液。按照常规方法配制pH8.0的100mM Tris-HCl缓冲液，作为纤溶酶活性测定缓冲液。
①先向96孔板中加入100μL活性测定缓冲液。
②反应体系建立：实验组：向反应体系中加入10μL(1μg/μL)第三步分离后浓缩除盐的三个组分P3-3-1、P3-3-2、P3-3-3；加10μg粗毒为阳性对照组，加等体积缓冲液代替P3-3-2的为阴性对照，每个样品平行做三个复孔。
③在避光条件下，加20μL的V7127底物工作液，并用Tris-HCl缓冲液将反应体系补到200μL。
④37℃避光孵育20min，加30％冰醋酸50μL终止反应，在酶标仪(美国Biotek公司)上测量405nm波长下吸光值，计算平均值，吸光值反映了酶活力的大小，结果见图2。其中，P3-3-1～P3-3-3
为阳离子交换层析分离P3-3得到的3个组分，阴性对照Negative为缓冲液，阳性对照crude venom为粗蛇毒。由图2可见，第三步分离的P3-3-2组分为中介蝮蛇毒纤溶酶。
(2)纯度鉴定以及质谱分析
取精提组分P3-3-2做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确定纯度，结果见图3，其中M为蛋白分子量Marker，泳道1为中介蝮蛇毒纤溶酶P3-3-2蛋白。切取目标条带A和B，送上海中科新生命生物科技有限公司采用AB SCIEX的串联质谱仪5800做MALDI-TOF/TOF鉴定。中介蝮蛇毒纤溶酶A带的MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定m/z谱见图4，中介蝮蛇毒纤溶酶B带的MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定m/z谱见图5，A带和B带鉴定出的肽段序列见表1。
表1 A带和B带鉴定出的肽段序列
A带 B带
R.FLALLYSDK.F R.FLALLYSDK.F
K.FQCGGTLINEEWVLTAAHCDMR.N K.FQCGGTLINEEWVLTAAHCDMR.N
R.YDDEQR.R R.YDDEQR.R
K.KKYFCLSSR.N K.KKYFCLSSR.N
K.KYFCLSSR.N K.YFCLSSR.N
R.NYNQWDKDIMLIR.L R.NYNQWDKDIMLIR.L
R.NSAHIAPLSLPSNPPSVGSVCR.V R.NSAHIAPLSLPSNPPSVGSVCR.V
R.AAYPELPVTRR.T R.AAYPELPVTRR.T
R.TLCAGILEGGK.D R.TLCAGILEGGK.D
GNMRIYLGMHNLK
R.NYNQWDK.D
K.DIMLIRLNRPVR.N
R.LNRPVR.N
R.VMGWGTITSPQETLPDVPHCANINILDYEVCR.A
VIGGDECNINEHR.F
K.SSELVIGGDECNINEHR.F
MVLIKVLVNLLILQLSYAQK.S
从上表可以看出，A和B带共同的肽段有9条，在A条带中发现了带信号肽的肽段，其序列分别为：MVLIKVLVNLLILQLSYAQK，K.SSELVIGGDECNINEHR.F，表明A条带是该蛋白在翻
译完成后，未经过信号肽切除的完整形式，而B条带是没有信号肽的成熟蛋白部分。
(3)中介蝮蛇毒纤溶酶的基因克隆方法
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶基因的克隆方法由下述步骤组成：
1)以中介蝮毒腺为原料，用分子生物学常规方法提取总RNA
实验前，所有用品都经过RNA酶灭活处理，所用焦碳酸二乙酯(DEPC)为美国Promega公司产品，RNA提取试剂盒
Figure BDA0002241240190000061
Mini Kit为德国Qiagen公司产品。
取中介蝮毒腺0.25g，在无RNA酶的研钵中边研磨边加入液氮，直至成为粉末。按照Qiagen公司的产品使用说明，用试剂盒提取RNA，用30μL无RNA酶的水溶解RNA，在Nanodrop核酸定量仪上测定所提取RNA的浓度，取4μL RNA溶液跑1％的琼脂糖凝胶电泳，观察其完整性。
2)以Oligo dT为引物，反转录成cDNA，获得模板
用cDNA合成试剂盒(瑞士Roche公司)进行，反应体系20μL，其构成为：1ng的RNA模板，反转录引物Oligo dT 1μL，加水至11μL，65℃变性10分钟；冰上冷却后依次加入5x反应缓冲液4μL、RNase抑制剂2μL、10mM 4xdNTP 2μL、逆转录酶1μL。体系混匀后离心5秒，进入42℃、60分钟反转录，70℃加热5分钟使酶灭火，得到cDNA，-20℃冰箱保存备用。
3)按照中介蝮蛇毒纤溶酶质谱结果提供的的上游肽段序列信息MVLIKVLVNLLILQLSYAQK，先做tBlastn得到20个相似度最高的序列，获得开放阅读框相关的保守序列，用Primer Premier5软件设计一对兼并引物，引物序列如下：
上游引物：5'-GCTATGGTGCT[T/G]ATC AAA GTG[C/T]TAG[C/T]-3'
下游引物：5'-GTTTTCA[T/C/A][T/G]G[A/G]GGGCA[G/A][T/G][T/C][G/C][G/A]CATC-3'
委托西安擎科生物技术有限公司合成上述引物。
4)克隆操作所用的高保真HS DNA聚合酶购自日本TakaRa公司，按照其说明书、采用PCR技术克隆中介蝮蛇毒纤溶酶的基因，反应体系50μL，构成如下：5×反应缓冲液10μL，10mM 4xdNTP为4μL，上游引物、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，去离子水32μL，以高保真DNA聚合酶1μL进行PCR扩增，得长度为780bp的产物。
反应条件：98℃、20s预变性；98℃变性15秒，52℃退火35秒，72℃延伸1.5分钟，共运行30个循环。
5)扩增结束后，取跑2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图6，图中Gisp6为中介蝮蛇毒纤溶酶基因的PCR扩增产物，M为DL2000 DNA marker。由图6可见，在Gisp6泳道的780bp的位置有明显条带，表明扩增成功。回收长度为780bp的Gisp6基因DNA片段，与pEASY-Blunt ZeroT载体连接，连接体系转化感受态细胞，涂氨苄抗性平板及挑取克隆培养，提取质粒，用M13F和M13R引物做常规PCR筛选阳性克隆；获得的阳性克隆用M13F或M13R引物测序，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因Gisp6如SEQ ID NO.1所示的全长核苷酸序列。用BioEdit软件推导出的中介蝮蛇毒纤溶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。和串联质谱仪所鉴定的9条肽段序完全吻合，表明所克隆的基因正是中介蝮蛇毒纤溶酶的基因。
实施例2
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶，它的其基因为Gisp6，具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶的制备方法由下述步骤组成：
1)凝胶过滤层析分离
取中介蝮粗毒冻干粉溶解在50mM的醋酸铵缓冲液中，配制成50mg/mL的样品溶液，以Sephacry1-200HR为填料，以含0.10M NaCl、pH为7.3的30mM醋酸铵为缓冲液，上凝胶过滤层析柱，按常规方法，做凝胶过滤，设置流速为0.45mL/min，共出现6个峰组分，收集具有纤溶酶活性的初组分P3。
2)阴离子交换层析分离
以pH为8.2的45mM醋酸铵为起始缓冲液，以含0.8M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap DEAE FF 16/10阴离子交换柱分离溶酶活性的初组分P3，得具有纤溶酶活性的二级组分P3-3。
3)阳离子交换层析分离
以pH为5.6的45mM醋酸铵为起始缓冲液，以含1M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap CM FF 16/10阳离子交换柱分离阴离子交换层析分离纤溶酶活性的二级组分P3-3，得具有纤溶酶活性的精提组分P3-3-2，即中介蝮蛇毒纤溶酶。
其它步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶，它的其基因为Gisp6，具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本实施例的中介蝮蛇毒纤溶酶的制备方法由下述步骤组成：
1)凝胶过滤层析分离
取中介蝮粗毒冻干粉溶解在50mM的醋酸铵缓冲液中，配制成50mg/mL的样品溶液，以Sephacry1-200HR为填料，以含0.25M NaCl、pH为7.3的60mM醋酸铵为缓冲液，上凝胶过滤层析柱，按常规方法，做凝胶过滤，设置流速为0.45mL/min，共出现6个峰组分，收集具有纤溶酶活性的初组分P3。
2)阴离子交换层析分离以pH为8.2的55mM醋酸铵为起始缓冲液，以含1.2M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap DEAE FF 16/10阴离子交换柱分离有纤溶酶活性的初组分P3，得具有纤溶酶活性的二级组分P3-3。
3)阳离子交换层析分离
以pH为5.6的55mM醋酸铵为起始缓冲液，含1M NaCl的起始缓冲液为洗脱缓冲液，过HiTrap CM FF 16/10阳离子交换柱分离阴离子交换层析分离纤溶酶活性的二级组分P3-3，得具有纤溶酶活性的精提组分P3-3-2，即中介蝮蛇毒纤溶酶。
其它步骤与实施例1相同。
实施例4
以上实施例1～3的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞表达中的用途。其使用方法如下：
(1)重组表达载体的构建
将中介蝮蛇毒纤溶酶基因Gisp6插入到表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，构建重组表达载体的步骤如下：
1)根据所克隆的中介蝮Gisp6的基因序列(SEQID NO.1)设计了一对引物，分别在上游引物的5'端加入酶切位点BamHⅠ(下划线)、KozaK序列和保护碱基，下游引物中引入酶切位点EcoRⅠ(下划线)，为便于对所表达目标蛋白的Western blot检测，在下游引物末端终止密码子前引入6×His标签序列，引物的序列如下：
Gisp6F：5'-CAGTGGATCCACCATGGTGCTGATCAGAGTGTTAGT-3'
Gisp6R：5'-CGTAGAATTCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCTGAGGGCAGGTCGCATCTGTATTTC-3'
委托西安擎科生物技术有限公司合成上述引物。
2)以中介蝮Gisp6的基因序列为模板，用Gisp6F和Gisp6R为引物进行PCR扩增，扩增体系为50μL，体系构成：5×Buffer 10μL，质粒模板pEasy-T/Gisp6为1μL，Gisp6F、Gisp6R引物各1μL，4×dNTP Mix 5μL，超纯水31μL，高保真HS DNA聚合酶1μL。PCR反应参数如下：98℃预变性35s；然后按照98℃、15s，56℃、45s、72℃、50s的参数运行30个循环；在72℃下延伸10min。
3)PCR产物回收
PCR扩增产物走1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，使用QIAquick PCR PurificationKit(德国Qiagen公司产品)回收目的条带。
4)将目的片段和载体pcDNA3.1做BamHI+EcoRI双酶切(日本Takara公司产品)，用QIAquick PCR Purification Kit回收载体及目的片段，再将回收产物进行连接、转化、涂氨苄抗性平板。
5)随机挑取7个克隆培养，提取质粒，以Gisp6F+Gisp6R为引物做PCR鉴定。重组质粒筛选结果见图7，图中M为DL2000 DNA marker，泳道1～7为随机挑取的7个重组克隆质粒，3号和6号为阳性克隆。6号克隆重组质粒测序结果见图8，所用引物为T7 promoter primer，序列与预期完全相符，表明重组质粒构建成功，正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-Gisp6。
(2)转染宿主细胞
1)质粒提取：按照无内毒素质粒大提试剂盒(美国Promega公司产品)的操作说明，提取pcDNA3.1-Gisp6质粒和pcDNA3.1质粒，完毕后用NanoDropTMOne微量快速核酸定量仪(美国Thermo Scientific公司)计测定质粒浓度后，低温冰箱保存备用。
2)在T25瓶中(美国Corning公司)，用DMEM+10％胎牛血清(分别为美国GIBCO公司和HyClone公司产品)培养基培养HEK293细胞至对数生长期，用胰蛋白酶消化(美国Invitrogen公司产品)，细胞分别计数后按照1x105细胞/孔种植到24孔板(美国Corning公司)，待细胞生长至70％汇合时做转染。
3)配制PEI-DNA混合物
以pcDNA3.1-Gisp6为实验质粒、pcDNA3.1为阴性对照质粒。
A液配制
实验组A1：取1μg的pcDNA3.1-Gisp6质粒，加入到100μL的DMEM中，混匀。
对照组A2：取1μg的pcDNA3.1质粒，加入到100μL的DMEM中，混匀。
B液配制
取线性聚乙烯亚胺(PEI)(美国PolySciences公司)10μL，加入到200μL的DMEM中，混匀。
分别向A1和A2中加入100μL的B液，吹打混匀后室温静置25min，得到PEI-DNA混合物。
4)用Hanks液清洗细胞两次，将两组PEI-质粒DNA混合物200μL分别滴加到HEK293细胞上，轻轻摇匀。
5)转染4h，给HEK293细胞添加含30％FBS的DMEM完全培养基。
6)次日，消化两组转染的细胞，分别转移至T25培养瓶中。
(3)G418抗生素筛选
以浓度850μg/mL的G418抗生素筛选(美国Calbiochem公司产品)，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞，G418抗生素筛选15天的光镜观察见图9(200×拍照)，其中A为pcDNA3.1-Gisp6质粒转染组，B为pcDNA3.1空质粒转染组(阴性对照1)，C为未转染质粒的HEK293细胞(阴性对照2)。
(4)中介蝮蛇毒纤溶酶表达检测
收集上述中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞，裂解制样，以6×His单抗(一抗6×His Mouse McAb，美国Proteintech公司产品；HRP-山羊抗小鼠二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品)做Western blot，检测细胞内的中介蝮蛇毒纤溶酶的表达，结果见图10，图中M为蛋白分子量Marker，泳道1为HEK293-Gisp6细胞上清，泳道2为阴性对照1(HEK293-pcDNA3.1)细胞上清。由图10可见，位置在35kDa附近，有明显阳性条带，表明中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293细胞中有表达。
(5)工程细胞的亚克隆
1)中介蝮蛇毒纤溶酶的表达检测
将整合有中介蝮蛇毒纤溶酶基因的HEK293细胞进行亚克隆，获得稳定表达该蛇毒纤溶酶的工程细胞共7株：1-6C6，2-6C12，3-6D7，4-6D11，5-6E6，6-6F6，7-6H。以6×His单抗做Western blot检测7株工程细胞中的中介蝮蛇毒纤溶酶表达情况，结果见图11。图中M为低分子量蛋白Marker，6C6、6C12、6D7、6D11、6E6、6F6及6H9为筛选获得的7个HEK293/Gisp6亚克隆工程细胞的上清，3.1为阴性对照1(HEK293-pcDNA3.1)细胞的上清。由图11可见，中介蝮蛇毒纤溶酶在7个细胞株中的表达水平不同，以6E6亚克隆细胞株中的中介蝮蛇毒纤溶酶的表达水平最高。
2)纤溶酶活性测定
收集7株工程细胞的上清，以V7127为底物，测定纤溶酶活性，结果见图12，图中Positive为蛇毒阳性对照，negative为阴性对照1(HEK293-pcDNA3.1)细胞上清，6C6～6H9为筛选获得的7个HEK293/Gisp6亚克隆工程细胞上清。由图12可见，亚克隆获得的7株工程细胞中，6E6细胞株上清中的中介蝮蛇毒纤溶酶的活性最高，6D11次之。
3)表达产物的溶栓活性测定
收集上述获得的7株工程细胞的上清，采用纤维平板法测定溶栓活性，结果见图13，图中V为蛇毒阳性对照，N为阴性对照1(HEK293-pcDNA3.1)细胞上清，1～7孔分别为1-6C6、2-6C12、3-6D7、4-6D11、5-6E6、6-6F6、7-6H9七个工程细胞的上清。由图13可见，亚克隆获得的7株工程细胞中，6E6细胞株上清所在的第5孔出现了明显的透明圈，所表达的中介蝮蛇毒纤溶酶具有水解血栓的活性，其它亚克隆细胞株的上清未显示纤溶酶活性。
将亚克隆获得的能稳定表达中介蝮蛇毒纤溶酶基因的HEK293细胞株6E6命名为HEK293-Gisp6。
实施例5
以上实施例1～3的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞表达中的用途。其使用方法如下：
(1)重组表达载体的构建
该步骤与实施例4相同。
(2)转染宿主细胞
该步骤与实施例4相同。
(3)G418抗生素筛选
以浓度600μg/mL的G418抗生素筛选(G418抗生素购于美国Calbiochem公司)，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞，G418抗生素筛选15天的光镜观察见图6(200X拍照)，其中A为pcDNA3.1-Gisp6质粒转染组，B为pcDNA3.1空质粒转染组(阴性对照1)，C为未转染质粒的HEK293细胞(阴性对照2)。
其它步骤与实施例4相同。获得稳定表达该蛇毒纤溶酶的工程细胞，命名为HEK293-Gisp6。
实施例6
以上实施例1～3的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞表达中的用途。其使用方法如下：
(1)重组表达载体的构建
该步骤与实施例4相同。
(2)转染宿主细胞
该步骤与实施例4相同。
(3)G418抗生素筛选
以浓度1050μg/mL的G418抗生素筛选(G418抗生素购于美国Calbiochem公司)，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞，G418抗生素筛选15天的光镜观察见图6(200X拍照)，其中A为pcDNA3.1-Gisp6质粒转染组，B为pcDNA3.1空质粒转染组(阴性对照1)，C为未转染质粒的HEK293细胞(阴性对照2)。
其它步骤与实施例4相同。获得稳定表达该蛇毒纤溶酶的工程细胞，命名为HEK293-Gisp6。
实施例7
以上实施例1～3的中介蝮蛇毒纤溶酶在溶解血栓药物中的用途。
以制备1000mL注射液为例，所用原料及其配比按常规制剂方法制备成注射剂：
中介蝮蛇毒纤溶酶 6.5mg
注射用水加至 1000mL。
按注射液的常规制备方法制备成注射液，每安瓿1mL，每mL含中介蝮蛇毒纤溶酶6.5μg，静脉点滴，用于溶解血栓，每天2支，用于预防血栓，每天1支，。
为了验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验室研究实验，各种实验情况如下：
1、中介蝮蛇毒纤溶酶的溶解血栓活性对比实验
比较了中介蝮蛇毒纤溶酶与注射用纤溶酶的活力差异，注射用纤溶酶为北京赛生药业股份有限公司产品，产品批号201411136，用纤维蛋白平板法检测溶解血栓活性如下：
(1)取4mL 50℃预热溶解的0.9％琼脂糖溶液置于50mL离心管内，冷却至40℃，与4mL 0.3％牛纤维蛋白原(美国Sigma公司产品)溶液混合，摇匀，加入100微升凝血酶(10U)，混匀后倒入6cm无菌培养皿中，37℃室温凝固，置于4℃过夜,即为纤维蛋白平板。
(2)在纤维蛋白平板上打直径4mm小孔，每孔加样品10微升(相当于1μg蛋白)，以中介蝮粗毒和生理盐水分别作为阳性和阴性对照。用封口膜封闭培养皿，置于37℃恒温培养箱中保温24h，让纤溶酶水解人工血栓，实验结果见图14。在图14中，I为注射用纤溶酶，N为生理盐水，P3-3-1、P3-3-2、P3-3-3为阳离子交换层析分离P3-3得到的3个组分。
纤溶酶活性计算公式：相对纤溶酶活性单位＝(透明圈的直径-圆孔的直径)mm/圆孔的直径mm
(3)由图14可见，中介蝮蛇毒纤溶酶水解人工纤维蛋白血栓，出现了明显的透明圈，表明该纤溶酶具有良好的溶解血栓活性。
依据上述公式计算，得出中介蝮蛇毒纤溶酶的相对活性为2.472±0.133U/微克，注射用纤溶酶的活性为0.8±0.012U/微克，中介蝮蛇毒纤溶酶水解血栓的活性为注射用纤溶酶的3.09倍。注射用纤溶酶的实际活性为5U/微克，中介蝮蛇毒纤溶酶的实际活性约为15U/微克。
2、中介蝮蛇毒纤溶酶的降纤作用对比实验
(1)中介蝮蛇毒纤溶酶对纤维蛋白原的水解活性
通过体外对牛纤维蛋白原的水解活性，可以推测纤溶酶的降纤作用。所用牛纤维蛋白原购自美国Sigma公司，用去离子水配制成浓度为5μg/μL的溶液，测定缓冲液为pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液。
具体步骤如下：
1)取1.5mL Eppendorf管7支，每孔加入2.5μL的纤维蛋白原溶液。
2)向各孔中加入5μL的P3-3-2组份(相当于1.0μg)，用Tris-HCl补齐体积至100μL，37℃水浴保温。
3)分别在保温的不同时间点0min、5min、15min、30min、60min、120min、240min取出样品，加2倍体积丙酮过夜沉淀，次日12000rpm离心15min，获得沉淀蛋白。
4)做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：分离胶浓度12％，方法同上，结果见图15。在图15中，M为蛋白分子量Marker，泳道1～7依次为中介蝮蛇毒纤溶酶水解纤维蛋白原的不同时间点0、5、15、30、60、120、240min的产物，α、β和γ分别为纤维蛋白原的三个亚基链。由图15可见，孵育15min以后，可以观察到中介蝮蛇毒纤溶酶对纤维蛋白原β链的水解作用，随着时间的延长，β链所在的条带越来越淡，到120min时，β链几乎全部被水解掉，中介蝮蛇毒纤溶酶不水解纤维蛋白原的α链和γ链。
(2)中介蝮蛇毒纤溶酶与巴曲酶的对比实验
巴曲酶为临床上常见的降解纤维蛋白原药物，用于治疗/降低血栓患者的高凝倾向。所用巴曲酶注射液为北京托毕西药业有限公司产品，规格为5μg/支，产品批号20150116。
实验比较了中介蝮蛇毒纤溶酶与巴曲酶对纤维蛋白原水解活性差异，酶的用量均为1μg，方法同上，实验结果见图16。图中M为蛋白分子量Marker，ctrl为纤维蛋白原对照组，左半边的G1～G3泳道为中介蝮蛇毒纤溶酶水解纤维蛋白原在15min,、30min、60min三个时间点的产物；右半边的B1～B3泳道为巴曲酶水解纤维蛋白原在的15min,、30min,、60min三个时间点的产物；α、β和γ分别为纤维蛋白原的三条链。从图16可见，中介蝮蛇毒纤溶酶水解纤维蛋白原的活性优于巴曲酶注射液。
3、中介蝮蛇毒纤溶酶对小鼠的抗凝作用
(1)采用玻片法测定了中介蝮蛇毒纤溶酶对小鼠凝血时间的影响，步骤为：
1)选取体重18-22g的Balb/C小鼠20只(购自西安交通大学实验动物中心)，雌雄各半，分为4组：生理盐水阴性对照组、25μg/kg组、50μg/kg组、100μg/kg组，每组5只。
2)腹腔注射给药3h后眼球取血，滴于37℃预热的载玻片上，血滴直径5mm，记时。
3)用4号注射器针头每隔15s秒血滴边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起。从血液滴至载玻片起至挑起血丝止即为凝血时间，结果见表2。
表2中介蝮蛇毒纤溶酶对小鼠凝血时间的影响
Figure BDA0002241240190000141
方差分析结果表明，25μg/kg组、50μg/kg组、100μg/kg均可以明显延长小鼠的体外凝血时间，各剂量组与生理盐水对照组均有显著性差异(P<0.05)，说明中介蝮蛇毒纤溶酶具有良好的抗凝效果。与生理盐水组数据相比，25μg/kg组延长凝血时间1.48倍，50μg/kg组延长凝血时间1.94倍，100μg/kg组延长凝血时间2.44倍。
(2)中介蝮蛇毒纤溶酶对小鼠的出血活性测定
剂量和实验3的(1)的完全相同，所不同的是，在出血活性测定中，中介蝮蛇毒纤溶酶的注射部位是背部皮下，24h后处死小鼠，剥离背部注射部位的皮肤，观察皮下有无出血斑形成。结果显示，25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg三个剂量组均没有在小鼠注射部位皮下引起出血现象，说明中介蝮蛇毒纤溶酶不具有出血活性，对小鼠使用是安全的。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 中介蝮蛇毒纤溶酶及其制备方法和应用
<140> 2019110007692
<141> 2019-10-21
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 中介蝮(Gloydius intermedius)
<400> 1
atggtgctga tcagagtgtt agtaaacctt ctgatactac agctttctta cgcacaaaag 60
tcttctgaat tggtcattgg aggtgatgaa tgtaacataa atgaacatcg tttccttgca 120
ctcctgtact ctgacaagtt tcaatgcggt gggactttga tcaacgaaga atgggtgctc 180
accgctgcac actgcgacat gagaaatatg tacatatacc ttggtgtgca taacgtaagt 240
gtacgatatg atgatgagca gagaagatac ccaaagaaga agtacttttg cctcagtagc 300
agaaactata accaatggga caaggatatc atgttgatca ggttgaacag acctgttagg 360
aacagtgcac acatcgcgcc tctcagcttg ccttccaacc ctcccagtgt gggctcagtt 420
tgccgtgtta tgggatgggg cacaatcaca tctcctcaag agactttgcc cgatgtccct 480
cactgtgcta acattaacat acttgattat gaggtgtgtc gagcagctta cccagagttg 540
ccagtgacaa ggagaacatt gtgtgcaggt atcctggaag gaggcaaaga ttcatgtaac 600
ggtgactctg ggggacccct catctgtaat ggacaattcc agggcattac atattggggg 660
gccgatactt gtgcccaacc gcatgagcct ggcctctaca ccaaggtctt cgattatact 720
gactggatcc agagcattat ttcaggaaat acagatgcga cctgccctca gtga 774
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 中介蝮(Gloydius intermedius)
<400> 2
Met Val Leu Ile Arg Val Leu Val Asn Leu Leu Ile Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Gln Lys Ser Ser Glu Leu Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn
20 25 30
Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Ala Leu Leu Tyr Ser Asp Lys Phe Gln
35 40 45
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Glu Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His
50 55 60
Cys Asp Met Arg Asn Met Tyr Ile Tyr Leu Gly Val His Asn Val Ser
65 70 75 80
Val Arg Tyr Asp Asp Glu Gln Arg Arg Tyr Pro Lys Lys Lys Tyr Phe
85 90 95
Cys Leu Ser Ser Arg Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu
100 105 110
Ile Arg Leu Asn Arg Pro Val Arg Asn Ser Ala His Ile Ala Pro Leu
115 120 125
Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Val Met
130 135 140
Gly Trp Gly Thr Ile Thr Ser Pro Gln Glu Thr Leu Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
His Cys Ala Asn Ile Asn Ile Leu Asp Tyr Glu Val Cys Arg Ala Ala
165 170 175
Tyr Pro Glu Leu Pro Val Thr Arg Arg Thr Leu Cys Ala Gly Ile Leu
180 185 190
Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile
195 200 205
Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Thr Tyr Trp Gly Ala Asp Thr Cys
210 215 220
Ala Gln Pro His Glu Pro Gly Leu Tyr Thr Lys Val Phe Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Asp Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ser Gly Asn Thr Asp Ala Thr Cys Pro
245 250 255
Gln
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtggatcc accatggtgc tgatcagagt gttagt 36
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtagaattc tcagtgatgg tgatggtgat gctgagggca ggtcgcatct gtatttc 57

Claims (5)

1.一种中介蝮蛇毒纤溶酶，其特征在于：它的基因为Gisp6，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞建立稳定表达细胞株中的用途，其使用方法如下：
（1）重组表达载体的构建
将中介蝮蛇毒纤溶酶基因插入到表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，得到重组表达质粒；
（2）转染宿主细胞
以HEK293细胞为宿主细胞，在聚乙烯亚胺介导下，将重组表达质粒转入HEK293细胞，实现瞬时表达；
（3）G418抗生素筛选
以浓度600～1050 μg/mL的G418抗生素筛选，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞；
上述的G418抗生素购于美国Calbiochem公司；
（4）中介蝮蛇毒纤溶酶表达检测
收集上述中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞进行，裂解制样，以6×His单抗做western blot检测中介蝮蛇毒纤溶酶的表达；
（5）工程细胞的亚克隆
将整合有中介蝮蛇毒纤溶酶基因的HEK293细胞进行亚克隆，获得稳定表达该蛇毒纤溶酶的工程细胞，命名为HEK293-Gisp6。
3.根据权利要求2所述的中介蝮蛇毒纤溶酶在HEK293T细胞表达中的用途，其特征在于所述的步骤（3）为：以浓度800 μg/mL的G418抗生素筛选，得中介蝮蛇毒纤溶酶基因整合型HEK293细胞。
4.权利要求1的中介蝮蛇毒纤溶酶在制备治疗脑血管静脉血栓病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的中介蝮蛇毒纤溶酶在制备治疗脑血管静脉血栓病药物中的应用，其特征在于它是由下述原料及其配比按常规制剂方法制备成1000mL注射剂：
中介蝮蛇毒纤溶酶 6.5mg
注射用水加至 1000mL。
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中介蝮蛇毒纤溶酶基因真核表达载体的构建及其功能的研究;刘玉芬 等;《中国生物工程杂志》;20121231;第32卷(第10期);摘要，第2页左栏第3段至右栏第4段 *

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