JPH068317B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

新規ポリペプチド

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JPH068317B2
JPH068317B2 JP62326384A JP32638487A JPH068317B2 JP H068317 B2 JPH068317 B2 JP H068317B2 JP 62326384 A JP62326384 A JP 62326384A JP 32638487 A JP32638487 A JP 32638487A JP H068317 B2 JPH068317 B2 JP H068317B2
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宏昌 宮地
盛幸 佐藤
正実 岡部
真 森本
菁莪 伊藤
基生 山崎
義春 横尾
和夫 山口
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下hG-CSFと略
記する）ポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ
酸で置換されるか、および／または一部のアミノ酸が欠
失したアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドの内、特
に第１番目のアミノ酸残基がアラニン（Ala）に、第３
番目のアミノ酸残基がスレオニン（Thr）に、第４番目
のアミノ酸残基がチロシン（Tyr）に、第５番目のアミ
ノ酸残基がアルギニン（Arg）に、および第17番目のア
ミノ酸残基がセリン（Ser）にすべて置換されたポリペ
プチド（以下ND28と略称する）、並びに該ND28をコード
するＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを含む細菌
を用いるND28の製造法に関する。
産業上の利用分野 ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）は、造血
幹細胞を増殖・分化させ種々の血球を形成させる際に必
須なポリペプチドの１種で、主として顆粒球、なかでも
好中球の増加を促進する効果をもつ。好中球は生体の感
染防御において重要な役割を担っているが寿命が短く、
前駆細胞の恒常的な増殖・分化によって常に補給されて
いなければならない。近年広く行われている増殖性腫瘍
に対する治療は、同時に好中球前駆細胞の増殖を阻止す
るため、担癌患者の感染防御機能を低下させるという重
篤副作用をもつ。ｈＧ−ＣＳＦは、好中球の増加を促進
することにより、この副作用を軽減し、他方、感染症を
予防・治療する効果をもつものと期待される。さらに、
ｈＧ−ＣＳＦには、白血病細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏに
おいて分化させる活性があり、白血病に対する治療薬と
なる可能性もあるものとみられる。本発明のｈＧ−ＣＳ
Ｆポリペプチド誘導体は、既知のｈＧ−ＣＳＦよりすぐ
れたｈＧ−ＣＳＦ活性を有しており、医薬品としての利
用が期待される。
従来の技術 近年急速に発展してきた組換えＤＮＡ技術により、血球
の増殖・分化に係わるタンパク質性の因子の遺伝子が次
々と単離されてきた。それらの因子は、微生物や動物細
胞を利用して遺伝子工学の手法で生産されている。
ｈＧ−ＣＳＦは、長田らがヒト扁平上皮癌細胞株ＣＨＵ
−IIよりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を決定し、Ｃ
ＯＳ細胞での発現を報告している〔長田ら：ネイチャー
（Nature）３１９，415(1986)〕。また、スーザ（Souz
a）らはヒト膀胱癌細胞株5637よりｃＤＮＡを単離して
その塩基配列を決定し、大腸菌での発現を報告している
〔スーザら：サイエンス（Science）２３２，61(198
6)〕。
上記２つのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の
アミノ酸配列と本発明者が正常人末梢血マクロファージ
より単離したｃＤＮＡによってコードされるタンパク質
のアミノ酸配列（第１表）とは一致している。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、比活性が高く、血中での安定性の高い
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を安価に大量に製造す
る手段を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、第１表に示されたｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮ
Ａを改変し、改変したｃＤＮＡを組み込んだプラスミド
を担う大腸菌を培養することにより、またプロテアーゼ
を用いるポリペプチドの限定分解により比活性の高いｈ
Ｇ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を製造できることを見出
し、本発明を完成するに至った。
発明の具体的説明 本発明によれば、新規なｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導
体、及び該ポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組
み込んだ組み換え体プラスミドを含む細菌を用いる新規
なｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体の製造法が提供され
る。
本発明のhG-CSFポリペプチド誘導体は、hG-CSFポリペプ
チドの内、第１番目のアミノ酸残基がアラニン（Ala）
に、第３番目のアミノ酸残基がスレオニン（Thr）に、
第４番目のアミノ酸残基がチロシン（Tyr）に、第５番
目のアミノ酸残基がアルギニン（Arg）に、および第17
番目のアミノ酸残基がセリン（Ser）にすべて置換され
たポリペプチド（以下ND28と略称する）である。
本発明の組換え体プラスミドは、上記ｈＧ−ＣＳＦポリ
ペプチド誘導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発現
機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれたものであ
る。
第１表に示されるｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡとし
ては、ｈＧ−ＣＳＦをコードするメッセンジャーＲＮＡ
から組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ
（hG-CSFcDNA）または染色体ＤＮＡから得られるｈＧ−
ＣＳＦをコードするＤＮＡなどが利用できる。
ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしては、ｈＧ−ＣＳＦをコード
しているものであればいかなるものも用いることができ
るが、具体的にはｐＣＳＦ１−２を用いることができ
る。ｐＣＳＦ１−２は、本発明者によって製造されたも
のであり、その製造法は参考例１に記載されている。
ｐＣＳＦ１−２中のｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡは、Ｍ１３フ
ァージを用いたディデオキシ・シークエンス（dideoxy
sequence）法〔ジェイ・メシング（J.Messing）ら：ジ
ーン（Gene）１９，269(1982)〕により決定された第１
表に示す塩基配列を有している。
宿主微生物としては、本願のプラスミドを発現できるも
のであればいずれの微生物でもよく、例えば細菌、好ま
しくは大腸菌が用いられる。
ｐＣＳＦ１−２は第１図に示した制限酵素地図を有する
プラスミドで、それを含む大腸菌はEscherichia coli E
CSF1-2（FEMR BP-1220）として昭和６１年１１月２７日
付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託
されている。
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体をコードするＤＮＡを
組み込むプラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡが発現
できるものならいかなるプラスミドでも使うことができ
る。
好ましくは、適当なプロモーター、例えば、trp系、
ａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入するこ
とができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下ＳＤ配
列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な距
離、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用い
ることができる。
具体的に好適なプラスミドとしては、ｐＫＹＰ10（特開
昭58-110600）、ｐＬＳＡ１（参考例３）、ｐＧＥＬ１
〔関根ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、ＵＳＡ８２，4306(1985)〕、ｐＫＹＰ２６（特開
昭62-48699）、ｐＢＲ３２２〔ボリバー（Bolivar）
ら：ジーン（Gene）２，95(1977)〕などがあげられる。
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびその誘導体をコードす
るＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用
いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合する一般的組換えＤＡＮ技法を用いて行うことができ
る。結合に際しては、制限酵素を用いて消化したＤＮＡ
断片の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を
用いる埋め込み反応、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる
埋め込み反応または削り込み反応を利用して加工する方
法やＤＮＡリンカーを用いる方法によっても行うことが
できる。
ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡとしてｐＣＳＦ１−２を、該ＤＮ
Ａを組み込むためのプラスミドとしてｐＧＥＬ１，ｐＫ
ＹＰ10，ｐＫＹＰ26，ｐＢＲ322，ｐＬＳＡ１を用い、
また必要な場合には、化学合成したＤＮＡリンカーや部
位特異的変異を用いて、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導
体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド
を造成する例を以下に述べる。
第１図に示したようにしてｐＣＳＦ１−２〔約4.5キロ
ベース（以下ｋｂと略記する）〕をApaIとBamHIで切断
し、低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）〔エ
ル・ウィスランダー（L.Wieslander）：アナリティカル
・バイオケミストリイ（Analytical Biochemistry）９
８，305(1979)〕にて約1.5kbのＤＮＡ断片を精製する。
次いで、ｐＬＳＡ１をＢａｎIIIとＢａｍＨＩで切断し
た後、ＬＧＴ法にて約2.8kbのＤＮＡ断片を精製する。
このようにして得られた両ＤＮＡ断片と、第１図に示し
た合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合しｐＣｆ
ＴＡ１を得る。
次いで、第２図に示したようにして、pCfTA1をＢａｍＨ
Ｉで切断後、クレノー断片で処理することにより突出末
端を平滑末端に変換し、さらにＥｃｏＲＩで切断後、約
2.5kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。別にｐ
ＣｆＴＡ１をＥｃｏＲＩとＤｒａＩで切断後、約1.0kb
のＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。このようにし
て得たＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、
ｐＣｆＴＢ２０を得る。
さらに、第３図のように、ｐＣＳＦ１−２をＡｐａＩと
ＢａｍＨＩで切断後、約1.5kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。また、ｐＧＥＬ１をＨｉｎｄIII、Ｂ
ａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断後、約1.7kbのＤＮＡ断
片をＬＧＴ法により精製する。一方、ｐＫＹＰ１０をＰ
ｓｔＩとＢａｎIIIで切断後、約1.1kbのＤＮＡ断片をＬ
ＧＴ法により精製する。これら３つのＤＮＡ断片と第３
図に示した合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
し、pCfTL23，pCfTL38，pCfTL35，pCfTL41を得、また、
これら３つのＤＮＡ断片と第４図に示した合成ＤＮＡを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、pCfTM14，pCfTM17，
pCfTM113を得る。
さらに、第５図に示すように、ｐＣｆＴＡ１をＢａｎII
IとＳｔｕＩで切断後、hG−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約1.3
kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。また、ｐＫ
ＹＰ26をＢａｍＨＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ・
クレノー断片で処理することにより突出末端を平滑末端
に変換し、さらにＰｓｔＩで切断後、ＬＧＴ法にて約1.
8kbのＤＮＡ断片を精製する。一方、ｐＧＥＬ１をＢａ
ｎIIIとＰｓｔＩで切断後、約1.0kbのＤＮＡ断片をＬＧ
Ｔ法により精製する。こうして得られた３つのDNA断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合することにより、ｐＣｆＷ
Ｄ１を得る。
さらに、第６図に示すように、ｐＣｆＴＬ38をＨｉｎｄ
IIIとＢｇｌIIで切断後約2.6kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。また、ｐＣｆＴＬ38をＨｉｎｄIIIと
ＤｐｎＩで切断後、約３００bpのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。一方、ｐＣｆＴＢ２０をＡｖａＩで切
断後、クレノー断片で処理することにより突出末端を削
り、さらにBgl IIで切断後、約４８０bpのＤＮＡ断片を
ＬＧＴ法により精製する。こうして得た３つのＤＮＡ断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合することによりｐＣｆＴ
95Ｋ19を得る。さらに、同じく第６図に示すようにし
て、ｐＣｆＴ95Ｋ19をＢａｎIIIとＢｇｌＩで切断後約
1.0kbのＤＮＡ断片を、またＢｇｌＩのみで切断後約1.8
kbのＤＮＡ断片を、ＬＧＴ法により精製する。一方、pC
fT95Ｋ19をＢｇｌＩとＳａｕ３Ａで切断後、約３５０bp
のＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして得ら
れる３つのＤＮＡ断片と、第６図中段に示した合成ＤＮ
ＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＣｆＡＡ１を得
る。さらに、同じく第６図に示すようにして、ｐＣｆＡ
Ａ１をＸｈｏＩとBglＩで切断後、約3.0kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。このＤＮＡ断片と上記pCfT
95Ｋ19のＢｇｌＩ−Ｓａｕ３Ａ断片（約３５０bp）およ
び第６図下段に示す合成ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合し、ｐＣｆＡＢ５およびｐＣｆＡＢ１４を得る。さ
らに、第７図に示すように、pCfAB5をＡｖａＩとＢｇｌ
IIで切断後、約2.8kbのDNA断片をＬＧＴ法により精製す
る。また、pCfWD1をＢｇｌIIとＡｖａＩで切断後、約1.
3kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こうして
得られた両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、
ｐＣｆＢＡ８を得る。また、ｐＣｆＡＢ14をＡｖａＩと
ＢａｌIIで切断後ＬＧＴ法により精製される約2.8kbの
ＤＮＡ断片と、前記pCfWD1のＢｇｌII、ＡｖａＩ断片約
1.3kbとをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ｐＣｆＢＡ32
を得る。さらに、同じく第７図に示すように、ｐＣｆＢ
Ａ８をBan III、ＢｇｌII、ＸｈｏＩで切断後、約1.4kb
と約2.7kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。こ
うして得られる２つのＤＮＡ断片と第７図に示した合成
ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＣ
ｆＢＢ101、ｐＣｆＢＣ52、ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＤ2
8、ｐＣｆＢＤ56、ｐＣｆＢＣ42Ｂ１、ｐＣｆＢＣ45、
ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、ｐＣｆＢＣ93、ｐＣｆＢ
Ｃ95、ｐＣｆＢＣ97、ｐＣｆＢＤ82を得る。第８図に示
すように、ｐＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断後、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで突出末端を削り、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いてＢｇｌIIリンカーを挿入し、さらにＥｃｏＲＩ
とＢｇｌIIで切断後、約3.6kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。
一方、上記で得られるpCfBB101、pCfBC52、pCfBC59、pC
fBD28、pCfVBD56をＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで切断後、約
1.8kbのＤＮＡ断片を各々ＬＧＴ法により精製する。こ
うして得られる約3.6kbと約1.8kbのＤＮＡ断片を各々Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで結合することにより、各々、pCfCB1
01、pCfCC52、pCfCC59、pCfCD28、pCfCD56を得る。
他方、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎIII、ＢｇｌII、ＸｈｏＩ
で切断後、約1.4kbと約2.7kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法に
より精製する。こうして得られる２つの断片と第１４図
に示した合成ＤＮＡリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合させ、pCfTNS7およびｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓを得る。
加えて、第15図に示すようにｐＣｆＴＮＳ７をＰｖｕ
Ｉ、ＸｈｏＩで切断後、約１kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法
により精製する。またｐＣｆＢＡ32をＰｖｕＩ、Ｘｈｏ
Ｉで切断後、約３kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製
する。こうして得られる２つの断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼで結合させ、ｐＣｆＴＮ205を得る。同様に、ｐＣｆ
ＴＡＡｒｇ４ＳをPvuI、ＸｈｏＩで切断後、ＬＧＴ法で
精製して得られる約１kbの断片と、前記ｐＣｆＢＡ32を
ＰｖｕＩ、ＸｈｏＩで切断して得られる約３kbのＤＮＡ
断片とをＴ４DNAリガーゼで結合させｐＣｆＴＡＡrg４
を得る。また、ｐＣｆＢＡ８をＢａｎIII、Bgl II、Ｈ
ｉｎｄIIIで切断後、約1.4kbと約2.7kbのＤＮＡ断片を
ＬＧＴ法により精製する。こうして得られる２つの断片
と第１６図に示した合成ＤＮＡリンカーをT4DNAリガー
ゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ301、ｐＣｆＴＮＳ401を得
る。さらに第１２図に示すようにｐＣｆＢＡ８をＸｈｏ
Ｉで切断後、クレノー断片で処理することにより突出末
端を平滑末端に変換し、さらにＰｖｕＩで切断後、約３
kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。別に、ＡＴ
ＧベクターｐＴｒＳ20（参考例４）をＳａｃＩで切断
後、クレノー断片で処理して突出末端を平滑末端に変換
し、さらにＰｖｕＩで切断後、LGT法により約１kbのＤ
ＮＡ断片を精製する。こうして得られる２つの断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼで結合させ、ｐＣｆＴＮＳ５０１を得
る。
部位特異的変異を用いる例としては、第１７図に示すよ
うに、ｐＣｆＢＤ28をＢａｎIIIとＰｓｔＩで切断後、
約２１０bpのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。ま
た、Ｍ１３ファージベクターのＭ13ｍｐ１９ＲＦＤＮＡ
をＡｃｃＩとＰｓｔＩで切断後、約7.24kbのＤＮＡ断片
をＬＧＴ法により精製する。こうして得られる２つのＤ
ＮＡ断片をT4DNAリガーゼにより結合し、ＰＴ１９BD２
８Ｎを得る。ついで、このｐｔ１９ＢＤ２８Ｎを大腸菌
ＪＭ１０５にトランスフェクションし、得られたファー
ジより一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎを得る。同じく第１７
図に示すようにして、Ｍ13ｍｐ１９ＲＦＤＮＡをＨｉｎ
ｄIIIとＥｃｏＲＩで切断後、約7.2kbのＤＮＡ切断をＬ
ＧＴ法により精製する。この約7.2kbのＤＮＡ断片と上
記で得られた一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎを混合し、変性
処理の後再びアニールさせることによりギャップト・デ
ュプレックスDNAを生成させ、ＬＧＴ法によりこれを精
製する。ついでこのギャップト・デュプレックスＤＮＡ
に第１７図に示した合成ＤＮＡをアニールさせた後、ク
レノー断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより環状化する。こ
の環状化ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株にトランスフェク
ションし、部位特異的変異が導入されたｐｔ１９ＢＤ２
８ＮＡ１７，ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７を得る。さらに
同じく第17図に示すようにしてｐｔ19ＢＤ２８ＮＡ１
７，ｐｔ１９ＢＤ２７ＮＴ１７をAvaIとＸｈｏＩで切断
後、約１１０bpのＤＮＡ断片を各々ＬＧＴ法により精製
する。一方、ｐＣｆＢＤ２８をＸｈｏＩとＢｇｌIIで切
断後、約2.74kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製す
る。また、ｐＣｆＢＤ２８をＢｇｌIIとＡｖａＩで切断
後、約1.29kbのＤＮＡ断片をＬＧＴ法により精製する。
こうして得られる約110bp，約2.74kb，約1.29kbのＤＮ
Ａ断片を各々Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合することによ
り、各々ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７，ｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７
を得る。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常0.1〜20μｇの
ＤＮＡを２〜２００mM（好ましくは１０〜40mM）のＴｒ
ｉｓ−ＨＣ（pH6.0〜9.5好ましくはpH7.0〜8.0）、０
〜２００mMのＮａＣ、２〜２０mM（好ましくは５〜10
mM）のＭｇＣ2を含む反応液中で、制限酵素0.1〜１０
０単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単
位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素
により異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反
応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱す
ることによるが、フェノールまたはジエチルピロカーボ
ネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も用
いることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片あるいはギャッ
プト・デュプレックスＤＮＡの精製は、ＬＧＴ法やポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・エム・マキサム
（A.M.Maxam）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.），USA７４，560(1977)〕などによって行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００mM（好ましくは１
０〜４０mM）のＴｒｉｓ−ＨＣ（pH6.1〜9.5、好まし
くはpH7.0〜8.0）、２〜20mM（好ましくは５〜10mM）の
ＭｇＣ2、0.1〜１０mM（好ましくは0.5〜2.0mM）のＡ
ＴＰ、１〜５０mM（好ましくは５〜１０mM）のジチオス
レイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ0.3
〜１０単位を用い、１〜37℃（好ましくは３〜２０℃）
で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０時間）行
う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔エス・エヌ・コー
エン（S.N.Cohen）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）USA６９，2110(1972)〕によって、大腸菌
に導入する。
結合反応によって生じた組み換え体Ｍ１３ファージＲＦ
ＤＮＡは、必要により公知のトランスフェクション法
〔口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素２９，294(1984)〕
によって、大腸菌ＪＭ１０５株〔ジェイ・メシング（J.
Messing）ら：ジーン（Gene）３３，103(1985)〕に導入
する。
組換え体プラスミドＤＮＡおよび組み換え体Ｍ１３ファ
ージＲＦＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、バ
ーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（H.
C.Birnboim）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ
（Nucleic Acids Res.）７，1513(1979)〕などを用いて
行う。
組み換え体Ｍ１３ファージからの一本鎖ＤＮＡの単離は
公知の方法〔口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素２９，29
4(1984)〕に従って行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基
配列を決定する必要があるときはＭ１３ファージを用い
たディデオキシ・シークエンス（dideoxy sequence）法
〔ジェイ・メシング（J.Messing）ら：ジーン（Gene）
１９，269(1982)〕によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
本発明のｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体は以下のとお
りに製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐＣｆＢＤ28）を用いて
大腸菌Ｋ−１２ＨＢ１０１を形質転換させ、アンピシリ
ン耐性（Ａｐr以下同じ）のコロニーの中からプラスミ
ド（例えばｐＣｆＢＤ28）を有する大腸菌を選びだす。
プラスミド（例えばｐＣｆＢＤ２８）を有する大腸菌を
培地に培養することにより培養物中にｈＧ−ＣＳＦポリ
ペプチド誘導体を生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにｈＧ−
ＣＳＦポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合
成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど
が、窒素源としては、ＮＨ4Ｃ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バク
トトリプトン、コーン・スティープ・リカーなどが、そ
の他の栄養源としてはＫ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ＮａＣ
、ＭｇＳＯ4、ビタミンＢ1、ＭｇＣ2などが使用で
きる。
培養はpH5.5〜8.5、温度１８〜４０℃で通気攪拌培養に
より行われる。培養５〜９０時間で培養菌体中にｈＧ−
ＣＳＦポリペプチド誘導体が蓄積するので、培養物から
菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、遠心し
て菌体残渣を得る。この菌体残渣からマーストンらの方
法〔F.A.O.Marstonら：BIO/TECHNOLOGY２，800(1984)〕
によりｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体を抽出・精製・
可溶化・再生し、該誘導体でマウス骨髄細胞を処理し、
軟寒天中に形成されるコロニー数を指標としたアッセイ
法によりｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体の定量を行
う。
本発明におけるＧ−ＣＳＦ活性の測定は以下のように行
う。８〜１２週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（静岡実験動
物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出
し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したα−Minimu
m Essential Medium（Flow Laboratories,以下α−ＭＥ
Ｍ培地と略す）に懸濁する。この細胞（約５×１０
7個）懸濁液1.5mlを、ナイロン・ウール（Nylon wool）
（和光純薬、Nylon Fiber 146-04231）をつめたカラム
(0.3g)に浸漬し、５％ＣＯ2インキュベーター内にて３
７℃９０分間反応させる。次いで予め37℃に加温したα
−ＭＥＭ培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・
ウール非吸着性の骨髄細胞を得る。この細胞をα−ＭＥ
Ｍ培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整する。
次いで、岡部らの方法〔Okabe T.et al.,Cancer Resear
ch４４、4503-4506(1986)〕に準じて骨髄造血幹細胞コ
ロニー形成能を測定する。すなわち、α−ＭＥＭ 0.2m
l、ＦＢＳ 0.4mlおよび２段階稀釈した各サンプル0.2m
lの混液に、上記の方法で調整した骨髄細胞（２×１０6
個／ml）の0.2mlを混和する。これに４２℃に保温した
0.6％寒天（Difco,Agar purified # 0560-01）溶液を等
量(1.0ml)混和し、その0.5mlを２４穴マルチディッシュ
（Nunc社製、#143982）に播種する（５×１０4個／dis
h,ｎ＝３）。５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃７
日間培養し、40個以上の細胞からなるコロニーの数を顕
微鏡（Olympus社製、X40）で計数する。コロニー計数
後、注意深くスライドグラス上にとり出し、アセトン・
ホルマリン混液で３０秒間固定後、Kubotaらの方法〔Ku
bota K.,et al.,Exp.Hematology.８，339-344(1980)〕
でエステラーゼ２重染色を施し、各コロニーの同定を行
う。
各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下の様に算出する。スタンダード
として用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロニー形成の最
大値の1/2値を与える活性を50単位と定義し、これに各
サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性に換算するた
め、20を乗じて力価（単位）とする。比活性は、単位蛋
白質（mg）当りの力価（単位／mg）で表示する。
ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端側のアミノ酸が欠失
したｈＧ−ＣＳＦポリペプチド誘導体は酵素的分解方法
により製造することもできる。
該誘導体は天然のｈＧ−ＣＳＦを原料物質として用い酵
素分解により製造することもできるが、天然のｈＧ−Ｃ
ＳＦは酵素（プロテアーゼ）に対する反応性が低いの
で、プロテアーゼに対して反応性の高められた改変ｈＧ
−ＣＳＦを用いた方が高活性を有する誘導体を収率よく
製造することができる。
原料物質としては、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端
側アミノ酸が第２表のように置換した改変ｈＧ−ＣＳＦ
(a)、(b)、(c)および(d)が好適に用いられる。(a)、
(b)、(c)および(d)は、対応する塩基配列を有するプラ
スミドｐＣｆＢＣ５９（ＮＣ59）、ｐＣｆＢＤ２８（Ｎ
Ｄ28）、ｐＣｆＢＣ95（ＮＣ95）およびｐＣｆＴＡＡｒ
ｇ４Ｓ（Ａｒｇ４Ｓ）をそれぞれ保有する菌株を培養し
公知の方法で精製単離することにより得ることができ
る。
酵素としては、セリンプロテアーゼ、チオールプロテア
ーゼなどのエンドプロテアーゼが好適に用いられる。具
体的には、例えば、ズブチリシンＡ、ズブチリシンＢＰ
Ｎ′、ズブチリシンカールスバーグ、ズブチリシンノ
ボ、プロティナーゼＫ、ナガーゼ、サーモライシン、エ
ンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、トリプシン、α−キモ
トリプシンなどがあげられる。酵素は、原料物質の１mg
に対して3.4×１０-6〜8.5×１０-3単位の割合で用い
る。
酵素反応は、原料物質をトリス塩酸緩衝液あるいはリン
酸緩衝液などの水性溶液に溶かし、酵素を加えて、１０
〜３７℃で３０分間〜３日間行う。
本発明における総蛋白質量、蛋白質量は以下に記載する
方法によって測定する。
総蛋白質量の測定はエム・エム・ブラッドフォードの方
法〔M.M.Bradford：アナリティカル・バイオケミストリ
ィ（Anal.Biochem.）７２，248(1976)〕により行う。
蛋白質量はレムリの方法〔U.K.Laemmli：ネイチャー（N
ature）２２７，680(1970)〕によりSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った後、クロマトスキャナー
（ＣＳ−９３０ 島津製作所）で測定する。
酵素切断後に得られるペプチドのＮ末端アミノ酸配列は
自動アミノ酸配列測定機“ガスーフェーズ・プロテイン
・シークエンサー・モデル４７０Ａ”（アプライド・バ
イオシステムズ社製）とスペクトラ・フィジクス（Spec
tra-Physics）社製高速液体クロマトグラフィーの組み
合せによって測定する。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１． ｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣｆＴＡ１の造成（第１
図参照）： 参考例１により得られたｐＣＳＦ１−２ＤＮＡ２μｇを
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、６ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１００
ｍＭ ＮａＣｌを含む全量20μの溶液（以下“Ｙ−１
００緩衝液”と略す）に溶かし、制限酵素ＡｐａＩ〔ベ
ーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社
製〕とBamＨＩ（宝酒造社製、以下制限酵素については
特記しない限りすべて宝酒造社製）それぞれ１０単位を
加え、３７℃で４時間反応を行った。この反応液からＬ
ＧＴ法により1.5kbのＤＮＡ断片0.4μｇを精製、回収し
た。
別に参考例３の方法で調整したプラスミドｐＬＳＡ１２
μｇをＹ−１００緩衝液２０μに溶かし、制限酵素Ｂ
ａｎIII（東洋紡績社製）とＢａｍＨＩそれぞれ１０単
位を加え、３７℃で４時間反応を行った。この反応液か
らＬＧＴ法により2.8kbのＤＮＡ断片0.8μｇを精製、回
収した。
一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドのＮ末端１番目か
ら５番目までのアミノ酸〔スレオニン1（ＡＣＡまたは
ＡＣＴ）、プロリン2（ＣＣＡまたはＣＣＴ）、ロイシ
ン3（ＣＴＡ）、グリシン4（ＧＧＣ）、プロリン5（Ｃ
ＣＣ）〕をコードするコドンと発現に必要な開始コドン
（ＡＴＧ）を付与する必要があること、また、トリプト
ファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）の下流のＳＤ−配列と
ＡＴＧとの距離を、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにす
る必要があることなどの理由から、下記のＤＮＡリンカ
ーを合成した。
まず一本鎖ＤＮＡ、26merと20merを通常のトリエステル
法〔アール・クレア（R.Crea）ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、ＵＳＡ７５，5765(1978)〕
により合成した。26mer、20merのそれぞれ２μｇを50mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５ｍＭジチオスレイトール、0.1ｍＭ ＥＤＴＡおよび
１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を“Ｔ４
キナーゼ緩衝液”と略記する）４０μに溶かし、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ30単位（宝酒造社製：以下同
じ）を加えて、３７℃６０分間リン酸化反応を行った。
上記で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ
断片（1.5kb）0.4μｇとｐＬＳＡ１由来のＢａｎIII−
ＢａｍＨＩ断片（2.8kb）0.2μｇとを２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH7.6）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、10mMジチ
オスレイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以
下この緩衝液を“Ｔ４リガーゼ緩衝液”と略記する）25
μに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを0.1
μｇ加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製：以下同じ）６単位を加え、４℃１８時間
結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株〔ボリバー（Bolivar）ら：ジーン（Gene）
２，75(1977)〕をコーエンらの方法〔エス・エヌ・コー
エン（S.N.Cohen）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）ＵＳＡ，６９，2110(1972)〕（以下大腸
菌の形質転換にはこの方法を用いる）により形質転換
し、Ａｐrのコロニーを得た。このコロニーの培養菌体
から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.Bi
rnboim）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucl
eic Acids Res.）７，1513(1979)〕（以下プラスミドＤ
ＮＡの分離はこの方法を用いる）に従ってプラスミドＤ
ＮＡを回収した。得られたプラスミドの構造は、Ｂａｎ
III、ＲｓａＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII、ＢｇｌIIで切
断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。このプ
ラスミドをｐＣｆＴＡ１とよぶ。ｐＣｆＴＡ１のＢａｎ
III、ＨｉｎｄIII付近の塩基配列は下記のとおりである
ことを、Ｍ１３ファージを用いたディデオキシ・シーク
エンス法で確認した。
実施例２． ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの３′−非翻訳領域の１部を欠失
したプラスミドｐＣｆＴＢ２０の造成（第２図参照）： 実施例１で得られたｈＧ−ＣＳＦ発現プラスミドｐＣｆ
ＴＡ１（4.3kb）２μｇをＹ−１００緩衝液２０μに
溶かし、制限酵素ＢａｍＨＩ ４単位を加えて３７℃４
時間消化反応を行った。フェノール−クロロホルム等量
混合液による抽出（以下フェノール−クロロホルム抽出
と略記する）の後、エタノール沈澱により、ＤＮＡ断片
1.8μｇを回収した。このＤＮＡ断片を50mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH7.8）、７ｍＭ ＭｇＣｌ2および６ｍＭメ
ルカプトエタノールを含む緩衝液（以下この緩衝液を
“クレノー緩衝液”と略記する）20μに溶かし、ｄＡ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１ｍＭ
になるように加え、さらに４単位のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片（宝酒造社製：以下同じ）を加えて、
室温で１時間反応させ、突出末端を平滑末端に変換し
た。フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
により、ＤＮＡ断片1.6μｇを回収した。該ＤＮＡ断片
をＹ−１００緩衝液２０μに溶かし、１０単位のＥｃ
ｏＲＩを加え、３７℃４時間切断反応を行った。この反
応液からＬＧＴ法により2.5kbのＤＮＡ断片（ＢａｍＨ
Ｉ（Blunt）−ＥｃｏＲＩ断片）１μｇを得た。
別に、ｐＣｆＴＡ１２μｇを２０μのＹ−100緩衝液
に溶かし、１０単位のＥｃｏＲＩを加え、37℃４時間切
断反応を行った後、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭとなるよ
うにＮａＣｌを添加し、１０単位のＤｒａＩを加え、３
７℃４時間切断反応を行った。アガロースゲル電気泳動
にて完全な分解を確認した後、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを
含む1.0kbのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＤｒａＩ断片）
0.2μｇを、ＬＧＴ法により精製、回収した。
上記で得たＢａｍＨＩ（Blunt）−ＥｃｏＲＩ断片（2.5
kb）0.2μｇとＥｃｏＲＩ−ＣｒａＩ断片（1.0kb）0.2
μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２５μに溶かし、この混合
液にＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃１８時間結
合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体よりプラスミドＤＮＡを回収し
た。得られたプラスミドの構造は、ＨｉｎｄIII、Ｐｓ
ｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。このプラスミドをｐＣｆＴＢ２０と呼ぶ。
実施例３． ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端アミノ酸を置換したポリペプチド
をコードするプラスミドｐＣｆＴＬ２３，ｐＣｆＴＬ３
８，ｐＣｆＴＬ３５，ｐＣｆＴＬ41の造成（第３図参
照）： 参考例１の方法によって得たｐＣＳＦ１−２（4.5kb）
３μｇを６０μＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素
ＡｐａＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）と制限酵素
ＢａｍＨＩそれぞれ８単位ずつを加え、３７℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｈＧ
−ＣＳＦ遺伝子の大部分を含む約1.5kbのDNA断片（Ａｐ
ａＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.4μｇを得た。
一方、ｐＧＥＬ１〔関根ら：プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）USA８２，4306(1985)〕（E.coli
ＩＧＥＬ１ ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９の培養物から常法
により採取）（3.4kb）２μｇをＹ−１００緩衝液４０
μに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３７℃で３時間切
断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、リポ
プロテイン由来ターミネーターを含む約1.7kbのＤＮＡ
断片（ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.5μｇを得た。
別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
整したｐＫＹＰ１０ ３μｇをＹ−１００緩衝液６０μ
に溶かし、制限酵素 ＢａｎIII（東洋紡績社製）と
制限酵素ＰｓｔＩをそれぞれ６単位ずつ加え３７℃で３
時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
トリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約1.1k
bのＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片）約0.5μｇ
を得た。
一方、成熟hG−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸であるＴｈｒ
をＳｅｒ，Ｃｙｓ，ＡｒｇまたはＧｌｙのうちのいずれ
かに置換し、発現に必要な開始コドン（ＡＴＧ）を付与
する必要があること、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列と
ＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにす
る必要があることなどの理由から、下記のＤＮＡリンカ
ーを合成した。
（ＮはＧ，Ａ，ＴまたはＣのいずれかの塩基である） まず、一本鎖ＤＮＡ、２６−merと２０−merを通常のト
リエステル法により合成した。２６−merおよび２０−m
erの各々２０ピコモルを４０μのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）６単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を
行った。
次に上記で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約1.5kb）0.3μｇとｐＧＥＬ１由来のＰｓｔ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約1.7kb）0.2μｇおよび発現ベク
ターｐＫＹＰ10のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約1.1kb）
0.2μｇを全量３０μのＴ４リガーゼ緩衝液に溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル加
えた。この混合液にさらに６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を加えて４℃，１８時間結合反応を行った。
組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−1070）〔カメロン
（Cameron）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Aca
d.Sci.），USA ７２，3416(1975)〕を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを公知の方法に従って分離・精製した。該プラス
ミドＤＮＡの構造はＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｎIII
で切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認
した。これらのプラスミドを第３図に示したとおりｐＣ
ｆＴＬ23，ｐＣｆＴＬ38，ｐＣｆＴＬ35，ｐＣｆＴＬ４
１とよぶ。上記プラスミド中のｈＧ−ＣＳＦ誘導体遺伝
子のＮ末端付近の配列はそれぞれ、 であることをＭ１３ファージを用いたデイデオキシ・シ
ークエンス法により確認した。
ｐＣｆＴＬ23によりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体
（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｇｌｙ1〕とよぶ）は、成
熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のＴｈｒがＧｌｙに置換してい
ることが確認された。同様に、ｐＣｆＴＬ３８によりコ
ードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体（本誘導体をｈＧ−ＣＳ
Ｆ〔Ｓｅｒ1〕とよぶ）はＳｅｒに、ｐＣｆＴＬ３５に
よりコードされるhG−ＣＳＦ誘導体（本誘導体をhG−Ｃ
ＳＦ〔Ｃｙｓ1〕とよぶ）はＣｙｓに、ｐＣｆＴＬ41に
よりコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体（本誘導体をｈＧ
−ＣＳＦ〔Ａｒｇ1〕とよぶ）はＡｒｇにそれぞれＮ末
端のアミノ酸が置換していることが確認された。
実施例４． ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端および３番目のアミノ酸を置換し
たポリペプチドをコードするプラスミドｐＣｆＴＭ14，
ｐＣｆＴＭ17およびｐＣｆＴＭ113の造成（第４図参
照）： 参考例１の方法によって得たｐＣＳＦ１−２（4.5kb）
３μｇをＹ−１００緩衝液６０μに溶かし、ＡｐａＩ
とＢａｍＨＩをそれぞれ８単位ずつ加え、３７℃で３時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりｈ
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の大部分を含む約1.5kbのＤＮＡ断片
（ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.4μｇを得た。
一方、ｐＧＥＬ１（3.4kb）２μｇをＹ−100緩衝液４０
μに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３７℃で３時間切
断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、リポ
プロテイン由来ターミネーターを含む約1.7kbのＤＮＡ
断片（PstI−ＢａｍＨＩ断片）約0.5μｇを得た。
別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰ１０ ３μｇをＹ−１００緩衝液60μ
に溶かし、制限酵素ＢａｎIIIとＰｓｔＩそれぞれ６単
位ずつを加え３７℃で３時間切断反応を行った。この反
応液からＬＧＴ法によりPtrpを含む約1.1kbのＤＮＡ断
片（ＢａｎIII−PstI断片）約0.5μｇを得た。
一方、成熟ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸であるＴｈ
ｒをＳｅｒに、３番目のアミノ酸であるＬｅｕをＧｌ
ｙ，Ｓｅｒ，ＣｙｓまたはＡｒｇのうちいずれかに置換
し、発現に必要な開始コドン（ATG）を付与する必要が
あること、またＰｔｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの
距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な長さにする必要があ
ることなどの理由から、下記のＤＮＡリンカーを合成し
た。
（ＮはＧ，Ａ，ＴまたはＣのいずれかの塩基である） まず、一本鎖ＤＮＡ、２６−merと２０−merを通常のト
リエステル法により合成した。２６−merおよび２０−m
erの各々２０ピコモルを４０μのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ６単位を加え
て、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＣＳＦ１−２由来のＡｐａＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（約1.5kb）0.3μｇとｐＧＥＬ１由来のＰｓｔ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約1.7kb）0.2μｇおよび発現ベク
ターｐＫＹＰ10のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約1.1kb）
0.2μｇを３０μのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、こ
の混合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル加えた。
この混合液にさらに６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
て４℃，１８時間結合反応を行った。
組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｃ
６００ＳＦ８（FERM BP-1070）株をコーエンらの方法に
より形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。この形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法に従って分離・
精製した。該プラスミドＤＮＡの構造はPstI，EcoRI，
ＢａｎIIIで切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により確認した。これらのプラスミドを第４図に示し
たとおり、ｐＣｆＴＭ１４，ｐＣｆＴＭ１７，ｐＣｆＴ
Ｍ１１３とよぶ。上記プラスミド中のhG−ＣＳＦ誘導体
遺伝子のＮ末端付近の配列はそれぞれ、 であることをＭ１３ファージを用いたデイデオキシ・シ
ークエンス法により確認した。
ｐＣｆＴＭ１４によりコードされる誘導体（本誘導体を
ｈＧ−ＣＳＦ〔Ｓｅｒ1，Ｃｙｓ3〕とよぶ）は、成熟hG
−ＣＳＦのＮ末端のＴｈｒがSerに、３番目のアミノ酸
であるＬｅｕがＣｙｓに置換していることが確認され
た。同様にｐＣｆＴＭ１７によりコードされる誘導体
（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｓｅｒ1，Ａｒｇ3〕とよ
ぶ）は、Ｎ末端のＴｈｒがＳｅｒに、３番目のＬｅｕが
Ａｒｇに、ｐＣｆＴＭ１１３によりコードされる誘導体
（本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｓｅｒ1，Ｓｅｒ3〕とよ
ぶ）は、Ｎ末端のＴｈｒがＳｅｒに、３番目のＬｅｕが
Ｓｅｒに置換していることが確認された。
実施例５． (1)組換え体プラスミドｐＣｆＷＤ１の造成（第５図参
照）： 実施例１の方法で得たｐＣｆＴＡ１ ５μｇを50μの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素StuI10単位と、制限
酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）10単位を加えて、３７
℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によ
りhG−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約1.3kbのＤＮＡ断片（Ｂ
ａｎIII−ＳｔｕＩ断片）約0.5μｇを得た。別に、参考
例２の方法で製造したｐＫＹＰ２６ ３μｇを50μの
Ｙ−１００緩衝液に溶かし、ＢａｍＨＩ ６単位を加え
て、３０℃で１時間消化反応を行った。
これに10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），１mM Ｅ
ＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、激しく攪拌し
た後、低速遠心分離法（3,300rpm，１０分間，以下同条
件）により水層を集めた。等量のクロロホルムを加え、
激しく攪拌した後低速遠心分離法により水層を集めた。
１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、2.5倍容のエ
タノールを加え、−２０℃，１時間静置した。冷却遠心
分離法（４℃，11,000rpm 10分間）で沈殿を集めた。こ
の沈殿を３０μのクレノー緩衝液に溶かし、ｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰをそれぞれ１００μ
Ｍになるように加え、ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー
断片を２単位加え１７℃で１５分間反応を行った。６８
℃で10分間処理してＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断
片を失活させた後、ＮａＣを１００mMとなるように加
え、制限酵素PstIを５単位加え３７℃で１時間消化反応
を行った。反応液からＬＧＴ法によりｐｐターミネー
ターを含む約1.8kbのＤＮＡ断片〔ＢａｍＨＩ（Blunt）
−ＰｓｔＩ断片〕約0.6μｇを得た。これとは別に、ｐ
ＧＥＬ１ ４μｇを４０μのＹ−１００緩衝液に溶か
し、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社製）１０単位とＰ
ｓｔＩ １０単位を加え３７℃で１時間消化反応を行
い、反応液から、ＬＧＴ法でトリプトファン系プロモー
ターを含む約１kbのＤＮＡ断片（ＢａｎIII−PstI断
片）を0.4μｇ得た。
上記で得たｐＣｆＴＡ１由来のＢａｎIII−ＳｔｕＩ断
片（約1.3kb）約0.2μｇ，ｐＫＹＰ２６由来のＢａｍＨ
Ｉ（Blunt）−ＰｓｔＩ 断片（約1.8kb）約0.1μｇ，
ｐＧＥＬ１由来のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約１ｋ
ｂ）約0.1μｇを３０μのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，
18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第５図に
示したｐＣｆＷＤ１を得た。
(2)ｐＣｆＴ９５Ｋ１９の造成（第６図参照）： 実施例３の方法で得たｐＣｆＴＬ３８５μｇを50μの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢｇ
IIを１０単位ずつ加え、37℃で１時間消化反応を行っ
た。反応液からＬＧＴ法によりトリプトファン・プロモ
ーターを含む約2.6kbのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−Ｂｇ
II断片）約0.7μｇを得た。別にｐＣｆＴＬ38，１０
０μｇを1.5mlのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIを80単位ずつ加え、３７℃で
６時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりhG
−ＣＳＦｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を回収し、ＥＬＵＴ
ＩＰTM−ｄ（Schleicher&Schuell社製）で精製した。こ
のＤＮＡ断片を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.
5），７ｍＭ ＭｇＣ2，１５０ｍＭ ＮａＣ，６ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール（以下、“Ｙ−１５０緩
衝液”と略記する）を含む全量90μの溶液に溶かし、
制限酵素ＤｐｎＩ（Boehringer Mannheim社製）３単位
を加え37℃で15分間消化反応を行った。反応液からポリ
アクリルアミド電気泳動法で、hG−ＣＳＦｃＤＮＡを含
む約３００bpのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＤｐｎＩ断
片）約１μｇを得た。
別に実施例２の方法で得たｐＣｆＴＢ２０ 10μｇを１
００μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ａｖａ
Ｉ10単位を加え、３７℃で１時間消化反応を行った。フ
ェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿でＤ
ＮＡを回収し、３０μのクレノー緩衝液に溶かし、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を２単位加え、17℃
で３０分間反応を行った。６８℃で１０分間処理しＤＮ
ＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を失活させ、ＮａＣ
を１００ｍＭになるように加え制限酵素ＢｇII１０単
位を加え37℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法でＰＰターミネーター部分を含む約４８０bpの
ＤＮＡ断片〔ＡｖａＩ（Blunt）−ＢｇII〕約0.3μｇ
を得た。
上記で得た、ｐＣｆＴＬ３８由来のＨｉｎｄIII−Ｂｇ
II断片（約2.6kb）約0.1μｇ，ｐＣｆＴＬ３８由来の
ＨｉｎｄIII−ＤｐｎＩ断片（約３００ｂｐ）約0.2μ
ｇ，ｐＣｆＴＢ20由来のＡｖａＩ（Blunt）−ＢｇII
断片（約480ｂｐ）約0.15μｇを３０μのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液に溶かし、４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。該反応液を
用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロ
ニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの方法
によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に示したｐＣ
ｆＴ９５Ｋ１９を得た。
(3)ｐＣｆＡＡ１の造成（第６図参照）： 前項で得たｐＣｆＴ９５Ｋ１９５μｇを５０μのＹ−
100緩衝液に溶かし、制限酵素Ban III（東洋紡績社製）
７単位とＢｇＩ（日本ジーン社製）２単位を加え、３
７℃で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法に
よりトリプトファン・プロモーター部分を含む約１ｋｂ
のＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＢｇＩ断片）約0.6μｇ
と、ｐｐターミネーター部分を含む約1.8ｋｂのＤＮ
Ａ断片（ＢｇＩ−ＢｇＩ断片）約１μｇを得た。
これとは別に１５μｇのｐＣｆＴ９５Ｋ１９を１５０μ
のＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢｇＩ（日
本ジーン社製）６単位とＳａｕ３Ａ １０単位を加え３
７℃で１時間消化反応を行った。反応液からポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ部
分を含む約350bpのＤＮＡ断片（ＢｇＩ−Ｓａｕ３Ａ
断片）約0.3μｇを得た。
これとは別に、下記のDNAリンカーを合成した。
まず、一本鎖ＤＮＡ、３９−merと４１−merを通常のト
リエステル法により合成した。３９−merおよび41-mer
の各々２０ピコモルを全量40μのＴ４キナーゼ緩衝液
に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）６単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を
行った。
次に上記で得たｐＣｆＴ９５Ｋ１９由来のＢａｎIII−
ＢｇＩ断片（約１ｋｂ）0.1μｇ，ＢｇＩ−Ｂｇ
Ｉ断片（約1.8ｋｂ）0.05μｇ，ＢｇＩ−Ｓａｕ３Ａ
断片（約３５０bp）0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝
液２５μに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカー
を約２ピコモル加えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単
位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に
示したｐＣｆＡＡ１を得た。前記デイデオキシ・シーク
エンス法でｐＣｆＡＡ１のＤＮＡリンカー部分の塩基配
列を決定したところ、４番目のアミノ酸であるＬｅｕを
コードするコドンの３番目の塩基はＡであることが判明
した。このｐＣｆＡＡ１ではｈＧ−ＣＳＦの10番目のＰ
ｒｏから２３番目のＬｙｓまでの14アミノ酸をコードす
るＤＮＡ部分が欠失している。また、ｈＧ−ＣＳＦの６
番目のＡｌａがＡｓｎに変化する変異が導入されてお
り、新たにＸｈｏＩサイトが生じる。
(4)ｐＣｆＡＢ５の造成（第６図参照）： 前項で得たｐＣｆＡＡ１３μｇを３０μのＹ−100緩
衝液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩを５単位加え、３７℃
で１時間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動法
でＸｈｏＩ切断が完全に行われていることを確認したの
ち、制限酵素ＢｇＩ（日本ジーン社製）を１単位加
え、37℃で25分間部分消化反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法によりトリプトファン・プロモーター部分および
ｐｐターミネーター部分を含む約３kbのＤＮＡ断片
（ＸｈｏＩ−ＢｇＩ断片）約１μｇを得た。これとは
別に、下記のＤＮＡリンカーを合成した。
（ＮはＧ，Ａ，ＴまたはＣ） このリンカーＤＮＡはｐＣｆＡＡ１のｈＧ−ＣＳＦｃＤ
ＮＡで欠失していたｈＧ−ＣＳＦの１０番目のＰｒｏか
ら２３番目のＬｙｓまでの１４アミノ酸をコードするＤ
ＮＡ部分を含んでいる。
まず、一本鎖ＤＮＡ、２７−merと２５−mer（２種）と
２３−merを通常のトリエステル法により合成した。た
がいに相補的な２７−merと２５−merおよび２５−mer
と２３−merのＤＮＡ20ピコモルずつを各々全量40μ
のＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造社製）６単位を加えて、37℃で６０分
間リン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＣｆＡＡ１由来のＸｈｏＩ−ＢｇＩ
断片（約３kb）0.1μｇ、前項で得たｐＣｆＴ９５Ｋ19
由来のＢｇＩ−Ｓａｕ３Ａ断片（約３５０bp）0.1μ
ｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液30μに溶かし、この混
合液に上記ＤＮＡリンカーを２ピコモルずつ加えた。さ
らにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第６図に
示したｐＣｆＡＢ５とｐＣｆＡＢ１４を得た。前記デイ
デオキシ・シークエンス法でｐＣｆＡＢ５とｐＣｆＡＢ
１４のＤＮＡリンカー部分の塩基配列を決定したとこ
ろ、１７番目のアミノ酸をコードするコドンの１番目の
塩基はｐＣｆＡＢ５ではＡであり、ｐＣｆＡＢ１４では
Ｔであって各々Ｓｅｒのコドン（ＡＧＣ）およびＣｙｓ
のコドン（ＴＧＣ）であり成熟型ｈＧ−ＣＳＦの１７番
目のＣｙｓが、ｐＣｆＡＢ５ではＳｅｒに置換し、ｐＣ
ｆＡＢ14では置換していないことが判明した。
実施例６． (1)ｐＣｆＢＡ８およびｐＣｆＢＡ３２の造成（第７図
参照）： 前項で得たｐＣｆＡＢ５、３μｇを４０μのＹ−100
緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩ５単位とＢｇII５
単位を加え３７℃で１時間消化反応を行った。反応液か
らＬＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部分と
ｐｐターミネーター部分を含む約2.8ｋｂのＤＮＡ断
片（ＡｖａＩ−ＢｇII断片）を約１μｇ得た。
これとは別に、第１項で得たｐＣｆＷＤ１ ６μｇを50
μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢｇIIを
５単位加え、３７℃で１時間消化反応を行った。アガロ
ースゲル電気泳動法でＢｇII切断が完全に行われてい
ることを確認した後に、制限酵素ＡｖａＩを３単位加
え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分を含む約
1.3ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇII−ＡｖａＩ断片）を0.4
μｇ得た。
次に上記で得たｐＣｆＡＢ５由来のＡｖａＩ−ＢｇII
断片（約2.8kb）の0.1μｇとｐＣｆＷＤ１由来のＢｇ
II−ＡｖａＩ断片（約1.3kb）0.3μｇをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液２５μに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え、４℃１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第７図に
示したｐＣｆＢＡ８を得た。
ｐＣｆＢＡ８のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ
酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目のＡｌａがＡｓ
ｎに、１７番目のＣｙｓがＳｅｒに置換している。以
後、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＡ８〕と呼ぶ。
他方前項で得たｐＣｆＡＢ１４、３μｇを40μのＹ−
100緩衝液に溶かし、制限酵素ＡｖａＩ５単位とＢｇI
I５単位を加え３７℃で１時間消化反応を行った。反応
液からＬＧＴ法により、トリプトファンプロモーター部
分とｐｐターミネーター部分を含む約2.8ｋｂのＤＮ
Ａ断片（ＡｖａＩ−ＢｇII断片）を約１μｇ得た。
これとは別に、第１項で得たｐＣｆＷＤ１ ６μｇを５
０μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢｇII
を５単位加え、３７℃で１時間消化反応を行った。アガ
ロースゲル電気泳動法でＢｇII切断が完全に行われて
いることを確認した後に、制限酵素ＡｖａＩを３単位加
え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液からＬ
ＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分を含む約
1.3ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇII−ＡｖａＩ断片）を0.4
μｇ得た。
次に上記で得たｐＣｆＡＢ14由来のＡｖａＩ−ＢｇII
断片（約2.8kb）の0.1μｇとｐＣｆＷＤ１由来のＢｇ
II−ＡｖａＩ断片（約1.3kb）0.3μｇをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液２５μに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え、４℃１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第７図に
示したｐＣｆＢＡ３２を得た。
ｐＣｆＢＡ３２のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミ
ノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの６番目のＡｌａがＡ
ｓｎに置換している。
(2)ｐＣｆＢＢ１０１の造成： 前項で得たｐＣｆＢＡ８、６μｇを５０μのＹ−１０
０緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎIII（東洋紡績社
製）１０単位、ＢｇII８単位、ＸｈｏＩ８単位を加
え、37℃１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法
によりhG−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約1.4kbのＤＮＡ断片
（ＸｈｏＩ−ＢｇII断片）約0.6μｇとトリプトファ
ンプロモーター部分を含む約2.7ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ
ａｎIII−ＢｇII断片）約0.8μｇを得た。
これとは別に、下記のＤＮＡリンカーを合成した。
まず一本鎖ＤＮＡ、３１−merと３３−merを通常のトリ
エステル法により合成した。31−ｍｅｒおよび３３−ｍ
ｅｒの各々２μｇを全量40μのＴ４キナーゼ緩衝液に
溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒
造社製）を加えて、３７℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。
次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII−ＢｇI
I断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ８
由来のＸｈｏＩ−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）0.1μ
をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、この
混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加えた。さ
らにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
第７図に示したｐＣｆＢＢ１０１を得た。ｐＣｆＢＢ１
０１のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列
は、成熟型hG−ＣＳＦの１番目のＴｈｒがＡｌａに、３
番目のＬｅｕがＴｈｒに、４番目のＧｌｙがＡｒｇに、
５番目のＰｒｏがＳｅｒに、１７番目のＣｙｓがＳｅｒ
に置換されている。以後、本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Ｎ
Ｂ１０１〕と呼ぶ。
(3)ｐＣｆＢＣ４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ
５２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢＣ７
７、ｐＣｆＢＣ９３、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７
の造成（第８図参照）： まず、下記のＤＮＡリンカーを合成した。
この合成ＤＮＡリンカーは、３ケ所の塩基がＧ，Ａ，
Ｔ，Ｃのうちのいずれかであり、１ケ所の塩基がＧかＡ
（31−ｍｅｒの場合）、あるいはＣかＴ（３３−ｍｅｒ
の場合）のいずれかであり、合計１２８種類のＤＮＡリ
ンカーの混合物として得られる。その結果、このＤＮＡ
リンカーのコードするｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸
配列としてはＭｅｔの次のアミノ酸としては16種類、Ｐ
ｒｏの次のアミノ酸としては８種類の可能性があり全体
として１２８種類のアミノ酸配列が可能であるようにデ
ザインされている。
まず一本鎖ＤＮＡ、31−ｍｅｒと33−ｍｅｒを通常のト
リエステル法により合成した。３１−ｍｅｒおよび３３
−ｍｅｒの各々２μｇを全量４０μのＴ４キナーゼ緩
衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製）３０単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反
応を行った。
次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII−Ｂ
ｇII断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢ
Ａ８由来のＸｈｏＩ−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）
0.1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加
えた。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で
18時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐＣｆＢＣ42Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ５２、
ｐＣｆＢＣ59、ｐＣｆＢＣ76、ｐＣｆＢＣ77、ｐＣｆＢ
Ｃ93、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７を得た。前記デ
イデオキシ・シークエンス法でＤＮＡリンカー部分の塩
基配列を決定したところ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末端
側の塩基配列は下記の通りであることが判明した。
これらのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体
は、それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。
ｐＣｆＢＣ４２Ｂ１、ｐＣｆＢＣ４５、ｐＣｆＢＣ５
２、ｐＣｆＢＣ５９、ｐＣｆＢＣ７６、ｐＣｆＢＣ77、
ｐＣｆＢＣ93、ｐＣｆＢＣ９５、ｐＣｆＢＣ９７にコー
ドされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、それぞれhG−ＣＳ
Ｆ〔ＮＣ42Ｂ１〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ45〕、ｈＧ−Ｃ
ＳＦ〔ＮＣ52〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ59〕、ｈＧ−ＣＳ
Ｆ〔ＮＣ76〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ77〕、ｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＣ93〕、ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＣ95〕およびｈＧ−ＣＳ
Ｆ〔ＮＣ97〕と呼ぶ。
(4)ｐＣｆＢＤ28、ｐＣｆＢＤ56、ｐＣｆＢＤ82の造
成： まず、下記のＤＮＡリンカーを合成した。
このＤＮＡリンカーは、４ケ所の塩基がＧ，Ａ，Ｔ，Ｃ
のうちのいづれかであり、合計２５６種類のＤＮＡリン
カーの混合物として得られる。その結果、このＤＮＡリ
ンカーのコードするhG−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸配列
としては４ケ所に４種類のアミノ酸の可能性があり、全
体として２５６種類のアミノ酸配列が可能であるように
デザインされている。
まず一本鎖ＤＮＡ、３１−ｍｅｒと33−ｍｅｒを通常の
トリエステル法により合成した。３１−ｍｅｒおよび３
３−ｍｅｒの各々２μｇを全量40μのＴ４キナーゼ緩
衝液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位
（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反
応を行った。
次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のBan III−Ｂｇ
II断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ
８由来のＸｈｏＩ−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）0.1
μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、こ
の混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加えた。
さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時
間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐＣｆ
ＢＤ２８，ｐＣｆＢＤ５６，ｐＣｆＢＤ８２を得た。前
記デイデオキシ・シークエンス法でＤＮＡリンカー部分
の塩基配列を決定したところ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ
末端側の塩基配列は下記の通りであることが判明した。
これらのプラスミドがコードするhG−ＣＳＦ誘導体は、
それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べて次のようにアミノ
酸残基が置換されている。
ｐＣｆＢＤ28，ｐＣｆＢＤ56，ｐＣｆＢＤ82にコードさ
れるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、それぞれｈＧ−ＣＳＦ
〔ＮＤ２８〕、hG−ＣＳＦ〔ＮＤ５６〕およびｈＧ−Ｃ
ＳＦ〔ＮＤ82〕と呼ぶ。ｐＣｆＢＤ５６を含む大腸菌菌
株はEscherichia coli ECfBD56（FERM BP-1221）とし
て、ｐＣｆＢＤ２８を含む大腸菌菌株はEscherichia co
li ＥＣｆＢＤ２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７９）とし
て微工研にそれぞれ寄託してある。
(5)ｐＣｆＴＮＳ７の造成（第１４図）： 下記のＤＮＡリンカーを合成した。
このＤＮＡリンカーのコードするhG−ＣＳＦのＮ末端の
アミノ酸配列としては、１番目のThrから４番目のGlyま
での４アミノ酸が欠失したアミノ酸配列となるようにデ
ザインされている。
まず一本鎖ＤＮＡ、18-merと20-merを通常のトリエステ
ル法により合成した。18-merおよび20-merの各々２μｇ
を全量４０μのＴ４キナーゼ緩衝液にとかし、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加え
て、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に実施例６で得たｐＣｆＢＡ８由来のBan III−Ｂｇ
II断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ
８由来のＸｈｏＩ−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ）0.1μｇ
をＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液25μに溶かし、この混合
液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加えた。さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間結合
反応を行った。
得られた組換えプラスミドの混合物を用いて大腸菌ＨＢ
１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。この
コロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐＣｆＴ
ＮＳ７を得た。ｐＣｆＴＮＳ７にコードされるｈＧ−Ｃ
ＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ〔Δ１−４Ｓ〕と呼
ぶ。
(6)ｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓの造成（第１４図）： 下記のＤＮＡリンカーを合成した。
このＤＮＡリンカーは、２カ所の塩基がＡかＧのいづれ
かであり、合計４種類のＤＮＡリンカーの混合物として
得られる。その結果、このＤＮＡリンカーのコードする
ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端のアミノ酸配列としては、４番目
のアミノ酸が４種類可能であるようにデザインされてい
る。
まず一本鎖ＤＮＡ、31-merと33-merを通常のトリエステ
ル法により合成した。31-merおよび33-merの各々２μｇ
を全量４０μのＴ４キナーゼ緩衝液にとかし、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加え
て、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に第(1)項で得たｐＣｆＢＡ８由来のBan III−Ｂｇ
II断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ８
由来のＸｈｏＩ−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）0.1μ
ｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、この
混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加えた。さ
らにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドを回収し、ｐＣｆ
ＴＡＡｒｇ４Ｓを得た。前記デイデオキシ・シークエン
ス法でＤＮＡリンカー部分の塩基配列を決定したとこ
ろ、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体のＮ末端側の塩基配列は下記の
通りであることが判明した。
ｐＣｆＴＡＡｒｇ４ＳによりコードされるｈＧ−ＣＳＦ
誘導体を以後ｈＧ−ＣＳＦ〔Arg4,Ser17〕と呼ぶ。
(7)ｐＣｆＴＮ２０５の造成（第１５図）： 第５項で得たｐＣｆＴＮＳ７、３μｇを40μのＫ−１
５０緩衝液（Ｙ−１００緩衝液の１００ｍＭ ＮａＣ
を１５０ｍＭ ＫＣｌにおきかえたもの）に溶し、制限
酵素ＰｖｕＩ ５単位とＸｈｏＩ ５単位を加え３７℃
で１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法によ
り、トリプトファンプロモーター部分を含む約1.0kbの
ＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ−ＸｈｏＩ断片）を約0.5μｇ得
た。
これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ３２３μｇを40
μのＫ−１５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＰｖｕＩ
５単位とＸｈｏＩ ５単位を加え、３７℃で１時間消化
反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡの大部分を含む約3.0kbのＤＮＡ断片（Ｘｈ
ｏＩ−ＰｖｕＩ断片）を２μｇ得た。
次に上記で得たｐＣｆＴＮＳ７由来のPvuI−ＸｈｏＩ断
片（約1.0kb）の0.1μｇとｐＣｆＢＡ32由来のＸｈｏＩ
−ＰｖｕＩ断片（約3.0ｋｂ）0.3μｇをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液２５μに溶かし、３単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え、４℃１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第15図に
示したｐＣｆＴＮ２０５を得た。
ｐＣｆＴＮ２０５のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体のア
ミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの１〜４番目のアミ
ノ酸が欠失している。以後本誘導体をｈＧ−ＣＳＦ〔Δ
１−４〕と呼ぶ。
(8)ｐＣｆＴＡＡｒｇ４の造成（第１５図）： 第６項で得たｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ、３μｇを４０μ
のＫ−１５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＰｖｕＩ ５単
位とＸｈｏＩ ５単位を加え37℃で１時間消化反応を行
った。反応液からLGT法により、トリプトファンプロモ
ーター部分を含む約1.0kbのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ−Ｘ
ｈｏＩ断片）を約0.5μｇ得た。
これとは別に、第１項で得たｐＣｆＢＡ３２３μｇを40
μのＫ−１５０緩衝液に溶かし、制限酵素ＰｖｕＩ
５単位とＸｈｏＩ ５単位を加え、３７℃で１時間消化
反応を行った。反応液からＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡの大部分を含む約3.0ｋｂのＤＮＡ断片（Ｘ
ｈｏＩ−ＰｖｕＩ断片）を２μｇ得た。
次に上記で得たｐＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ由来のＰｖｕＩ−
ＸｈｏＩ断片（約1.0ｋｂ）の0.1μｇとｐＣｆＢＡ３２
由来のＸｈｏＩ−ＰｖｕＩ断片（約3.0kb）0.3μｇをＴ
４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、３単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃，１８時間結合反応を行
った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第15図に
示したｐＣｆＴＡＡｒｇ４を得た。
ｐＣｆＴＡＡｒｇ４のコードするhG−ＣＳＦ誘導体のア
ミノ酸配列は、成熟型ｈＧ−ＣＳＦの４番目のＧｌｙが
Ａｒｇに置換している。以後本誘導体をＧ−ＣＳＦ〔Ａ
ｒｇ４〕と呼ぶ。
(9)ｐＣｆＴＮＳ３０１の造成（第１６図）： 第１項で得たｐＣｆＢＡ８、６μｇを５０μのＹ−10
0緩衝液に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII１０単位、Ｂｇ
II８単位を加え、３７℃１時間消化反応を行った。反
応液からＬＧＴ法によりｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む約
1.4ｋｂのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＢｇII断片）約
0.6μｇを得た。
次に下記のＤＮＡリンカーを合成した。
このＤＮＡリンカーのコードするhG−ＣＳＦのＮ末端の
アミノ酸配列としては、１番目のＴｈｒから11番目のＧ
ｌｎまでの１１アミノ酸が欠失したアミノ酸配列となる
ようにデザインされている。まず一本鎖ＤＮＡ、27-mer
と29-merを通常のトリエステル法により合成した。27-m
erおよび29-merの各々２μｇを全量４０μのＴ４キナ
ーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３
０単位（宝酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン
酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII−ＢｇI
I断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ８
由来のＨｉｎｄIII−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）0.
1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、
この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約２ピコモル加え
た。さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で18
時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐＣｆＴＮＳ301を得た。ｐＣｆＴＮＳ３０１にコード
されるhG−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ〔Δ１−
11Ｓ〕と呼ぶ。
(10)ｐＣｆＴＮＳ４０１の造成（第１６図）： 下記のＤＮＡリンカーを合成した。
このＤＮＡリンカーのコードするhG−ＣＳＦのＮ末端の
アミノ酸配列としては、１番目のThrから７番目のＳｅ
ｒまでの７アミノ酸が欠失したアミノ酸配列となるよう
にデザインされている。
まず一本鎖ＤＮＡ、39-merと41-merを通常のトリエステ
ル法により合成した。39-merおよび41-merの各々２μｇ
を全量４０μのＴ４キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加え
て、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＢａｎIII−ＢｇI
I断片（約2.7ｋｂ断片）0.1μｇ、同じくｐＣｆＢＡ８
由来のＨｉｎｄIII−ＢｇII断片（約1.4ｋｂ断片）0.
1μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、
この混合液に上記DNAリンカー約２ピコモルを加えた。
さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位を加え、４℃で１８時
間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し、
ｐＣｆＴＮＳ401を得た。ｐＣｆＴＮＳ４０１にコード
されるhG−ＣＳＦ誘導体を以後、ｈＧ−ＣＳＦ〔Δ１−
７Ｓ〕と呼ぶ。
(11)ｐＣｆＴＮＳ５０１の造成（第１２図）： 第１項で得られたｐＣｆＢＡ８、６μｇを４０μのＹ
−100緩衝液に溶かし、制限酵素XhoI１０単位を加え、
３７℃１時間消化反応を行った。フェノール−クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱でＤＮＡを回収し、３０
μのクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼＩ
・クレノー断片を２単位加え、１７℃で３０分間反応を
行った。６８℃で10分間処理しＤＮＡポリメラーゼＩ・
クレノー断片を失活させ、ＫＣを１５０mMになるよう
に加え制限酵素ＰｖｕＩを８単位加え３７℃で１時間消
化反応を行った。反応液からＬＧＴ法でｈＧ−ＣＳＦｃ
ＤＮＡを含む約３kbのＤＮＡ断片〔ＸｈｏＩ（Ｂｌｕｎ
ｔ）−ＰｖｕＩ〕約２μｇを得た。
別に、参考例４の方法によって得たＡＴＧベクターｐＴ
ｒＳ２０（3.8ｋｂ）５μｇを50μのＹ−０緩衝液
（Ｙ−１００緩衝液より１００mMＮａＣを除いたも
の）に溶かし、１６単位の制限酵素ＳａｃＩを加え、３
７℃で３時間切断反応を行った。フェノール−クロロホ
ルム抽出の後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、
30μのクレノー緩衝液に溶かし、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を２単位加え、１７℃で３０分間反応
を行った。６８℃で１０分間処理しＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ・クレノー断片を失活させ、ＫＣを１５０mMになる
ように加え、制限酵素ＰｖｕＩを８単位加え37℃で１時
間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法でPtrpを含む
約１kbのＤＮＡ断片〔ＳａｃＩ（Blunt）−ＰｖｕＩ〕
約0.5μｇを得た。
次に上記で得たｐＣｆＢＡ８由来のＸｈｏＩ（Blunt）
−ＰｖｕＩ断片（約３ｋｂ）0.1μｇとｐＴｒＳ20由来
のＳａｃＩ（Blunt）−ＰｖｕＩ断片（約１ｋｂ）0.2μ
ｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２５μに溶かし、３単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃１８時間結合反応
を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイ
ムらの方法によりプラスミドＤＮＡを回収し、第12図に
示したｐＣｆＴＮＳ５０１を得た。
ｐＣｆＴＮＳ501のコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導体は、
成熟型ｈＧ−ＣＳＦのＮ末端６番目までのアミノ酸が欠
失し、１７番目のＣｙｓがＳｅｒに置換している。ｐＣ
ｆＴＮＳ５０１にコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以
後、ｈＧ−ＣＳＦ〔Δ１−６Ｓ〕と呼ぶ。
実施例７． (1)ｐＣｆＣＢ101，ｐＣｆＣＣ52，ｐＣｆＣＣ59，Ｃｆ
ＣＤ28，ｐＣｆＣＤ56の造成（第８図）： まず、ｐＢＲ３２２〔ボリバー（Bolivar）ら：ジーン
（Gene）２，95(1977)〕３μｇを40μのＹ−１００緩
衝液に溶かし、制限酵素ＰｓｔＩを５単位加え、３７℃
１時間消化反応を行った。フェノール−クロロホルム抽
出およびエタノール沈殿でＤＮＡを回収し、３３ｍＭト
リス−酢酸（pH7.9）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、およ
び0.4ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
を含む溶液（以下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と略
記する）２０μに溶かし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）１単位を加え、３７℃、３０分反応を行
った。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール
沈殿でＤＮＡを回収し、２０μのＴ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液に溶かした。これにＢｇIIリンカーＤＮＡ（宝
酒造社製：ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）を
約８ピコモル加え、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを６単位
加え、４℃１８時間結合反応を行った。フェノール−ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈殿でＤＮＡを回収
し、４０μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを１０単位、ＢｇIIを８単位加え、３７℃で
１時間消化反応を行った。反応液からＬＧＴ法でテトラ
サイクリン耐性遺伝子部分を含む約3.6kbのＤＮＡ断片
（EcoRI−ＢｇII断片）約0.9μｇを得た。
これとは別に、実施例６−(2)で得たｐＣｆＢＢ１０
１、実施例６−(3)で得たｐＣｆＢＣ５２あるいはｐＣ
ｆＢＣ５９、実施例６−(4)で得たｐＣｆＢＤ２８ある
いはｐＣｆＢＤ５６をそれぞれ３μｇ別々に10倍濃度の
Ｙ−１００緩衝液にとかし、制限酵素ＥｃｏＲＩを５単
位、ＢｇIIを６単位加え、３７℃で１時間消化反応を
行った。反応液からＬＧＴ法で、hG−ＣＳＦｃＤＮＡ部
分を含む約1.8kbのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｇII
断片）をそれぞれ約0.4μｇ得た。
上記で得た、ｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ−ＢｇII
断片（約3.6kb）約0.05μｇを２０μのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液にとかしたものを５本調製した。これに上
記で得たｐＣｆＢＢ１０１あるいはｐＣｆＢＣ５２ある
いはｐＣｆＢＣ５９あるいはｐＣｆＢＤ２８あるいはｐ
ＣｆＢＤ５６由来のＥｃｏＲＩ−ＢｇII断片（約1.8k
b断片）約0.1μｇずつを別々に加え、さらにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを４単位加え、４℃１８時間結合反応を行っ
た。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換し、ＴｃRのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し第
８図に示したｐＣｆＣＢ101，ｐＣｆＣＣ52，ｐＣｆＣ
Ｃ59，ｐＣｆＣＤ５２，ｐＣｆＣＤ５６を得た。これら
のプラスミドにコードされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミ
ノ酸配列はそれぞれｐＣｆＢＢ101，ｐＣｆＢＣ５２，
ｐＣｆＢＣ59，ｐＣｆＢＤ28，ｐＣｆＢＤ５６にコード
されるｈＧ−ＣＳＦ誘導体のアミノ酸配列と同じであ
る。
実施例８．ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の生産および精製： 実施例３，４，６および７で得た組換え体プラスミドpC
fTL23，pCfTL35，pCfTL38，pCfTL41，pCfTM14，pCfTM1
7，pCfTM113，pCfBB101，pCfBC42B1，pCfBC45，pCfBC5
2，pCfBC59，pCfBC76，pCfBC77，pCfBC93，pCfBC95，pC
fBC97，pCfBD28，pCfBD56，pCfBD82，pCfTNS7，pCfAArg
4S，pCfTNS301，pCfTNS401，pCfTNS501，pCfBD28A17，p
CfBD28T17をもつ大腸菌W3110ｓｔｒＡ株（それぞれECfT
L23，ECfTL35，ECfTL38，ECfTL41，ECfTM14，ECfTM17，
ECfTM113，ECfBB101，ECfBC42B1，ECfBC45，ECfBC52，E
CfBC59，ECfBC76，ECfBC77，ECfBC93，ECfBC95，ECfBC9
7，ECfBD28，ECfBD56，ECfBD82，ECfTNS7，ECfTAArg4
S，ECfTNS301，ECfTNS401，ECfTNS501，ECfBD28A17，EC
fBD28T17と呼ぶ）をＬＧ培地〔バクトトリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣ５ｇ、グルコース１ｇを
水１に溶かし、ＮａＯＨにてpHを7.0とする。〕で３
７℃、１８時間培養し、この培養液５mlを２５μｇ／ml
のトリプトファンと50μｇ／mlのアンピシリンを含むＭ
ＣＧ培地〔Na2HPO40.6％、ＫＨ2ＰＯ40.3％、ＮａＣ
0.5％、カザミノ酸0.5％、ＭｇＳＯ4１ｍＭ、ビタミン
Ｂ1４μｇ／ml、pH7.2〕１００mlに接種し、30℃で４〜
８時間培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−
インドールアクリル酸（３β−indoleacrylicacid,以下
ＩＡＡと略す）を１０μｇ／ml加え、さらに２〜１２時
間培養を続けた。培養液を8,000rpm、１０分間遠心して
集菌し、30ｍＭ ＮａＣ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH7.5）緩衝液で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液3
0mlに懸濁し、０℃で超音波破砕（BRANSON SONIC POWER
COMPANY社SONIFIER CELL DISRUPTOR200、OUTPUT CONTR
OL2、10分間処理）した。これを9,000rpm、３０分間遠
心して菌体残渣を得た。この菌体残渣からマーストンら
の方法〔F.A.O.Marstonら：BIO/TECHNOLOGY２，８００
(1984)〕によりｈＧ−ＣＳＦ誘導体を抽出・精製・可溶
化・再生した。蛋白量の測定は、日本バイオ・ラッド・
ラボラトリーズ社プロティン・アッセイキット（スタン
ダードアッセイ法）〔M.M.Bradford：Anal.Biochem.,７
２，248(1976)〕により行った。Ｇ−ＣＳＦ活性の測定
は以下のように行った。８〜１２週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄
マウス（静岡実験動物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞
を無菌的にとり出し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を10％添加
したα−Minimum Essential Medium(Flow Laboratorie
s,以下α−ＭＥＭ培地と略す）に懸濁した。この細胞
（約５×１０7個）懸濁液1.5mlを、ナイロン・ウール
（Nylon wool）（和光純薬、Nylon Fiber 146-04231）
をつめたカラム（0.3ｇ）に浸漬し、５％ＣＯ2インキュ
ベーター内にて37℃９０分間反応させた。次いで予め３
７℃に加温したα−ＭＥＭ培地をカラムに流し、溶出し
てくるナイロン・ウール非吸着性の骨髄細胞を得た。こ
の細胞をα−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整
した。
次いで、岡部らの方法〔Okabe T.et al.,Cancer Resear
ch４４，4503-4506(1986)〕に準じて骨髄造血幹細胞コ
ロニー形成能を測定した。すなわち、α−ＭＥＭ 0.2m
l、ＦＢＳ 0.4mlおよび２段階稀釈した各サンプル0.2m
lの混液に、上記の方法で調製した骨髄細胞（２×１０6
個／ml）の0.2mlを混和した。これに４２℃に保温した
0.6％寒天（Difco,Agar purified#0560-01）溶液を等量
（1.0ml）混和し、その0.5mlを２４穴マルチディッシュ
（Nunc社製、#143982）に播種した（５×１０4個／dis
h，ｎ＝３）。５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃７
日間培養し、40個以上の細胞からなるコロニーの数を顕
微鏡（Olympus社製、X40）で計数した。コロニー計数
後、注意深くスライドグラス上にとり出し、アセトン・
ホルマリン混液で３０秒間固定後、Kubotaらの方法〔Ku
bota K.,et al.,Exp.Hematology.８，339-344(1980)〕
でエステラーゼ２重染色を施し、各コロニーの同定を行
った。
各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下の様に算出した。スタンダード
として用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロニー形成の最
大値の1/2値を与える活性を50単位と定義し、これに各
サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性に換算するた
め、20を乗じて力価（単位）とした。比活性は、単位蛋
白質（mg）当りの力価（単位／mg）で表示した。
インタクトのＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ誘導体の力価
を第３表に示す。
実施例９．ヒト骨髄細胞に対するｈＧ−ＣＳＦ誘導体の
活性測定 ２０〜３０才の健常人の腸骨より骨髄液をとりだし、こ
れに等量のα−ＭＥＭ培地を加え混和した。フィコール
−パーク（Ficoll-Paque）液（ファルマシア・ファイン
・ケミカル社、比重1.077）３mlの上に上記骨髄液４ml
を重層し、４００×ｇ、30分間遠心分離し、中間層にく
る細胞を分離した。細胞をＰＢＳ（ＮａＣ８ｇ，ＫＣ
0.2ｇ，Ｎａ2ＨＰＯ41.15ｇおよびＫＨ2ＰＯ40.2ｇを
水に溶かして１としたもの）で２回洗浄後、１０％ウ
シ胎児血清（FBS）を添加したα−ＭＥＭ培地に懸濁
し、２×１０6/ml以下の細胞濃度に調整した。プラスチ
ック・ディッシュ〔ファルコン(Falcon)3003〕に10ml播
種し、５％ＣＯ2インキュベーターにて37℃90分間培養
し、プラスチック・ディッシュに非付着性の細胞を回収
した。細胞をα−ＭＥＭ培地で一回洗浄し、所定の濃度
に調整して以下のヒト骨髄幹細胞増殖促進活性およびコ
ロニー形成試験に供した。すなわち、９６穴平型マイク
ロプレート（NUNC,167008）の各ウエルに１０％ＦＢＳ
添加α−ＭＥＭ培地を１００μ注入し、次いで実施例
８の方法で得たｈＧ−ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦ誘導体
の各サンプル１００μを第一列に添加した。よく混和
した液１００μを第二列目に移し２倍稀釈とし、以下
１２列まで同様に２段階稀釈した（ｎ＝３）。陰性対照
として、α−ＭＥＭ培地だけの群を設けた。
次に、各ウエルに上述のごとく調製した骨髄細胞懸濁液
１００μ（有核細胞数、５×１０4個）を播種し、５
％ＣＯ2インキュベーターにて、37℃、３日間培養し
た。最後の１８〜２０時間に６−3Ｈ−チミジン〔アマ
ーシャム日本（Amersham Japan），CodeTRK61，107mci/
mg）１０μを添加して培養した。セル・ハーベスター
（Cell harvester）（ラボサイエンス社）にて各細胞を
ガラスフィルター上に回収し乾燥後、細胞にとり込まれ
た放射能を液体シンチレーションカウンター〔パッカー
ド社（Packard），Tricarb 3320)〕で計測した。
一方、ヒト骨髄造血幹細胞コロニー形成試験および各コ
ロニーの同定は実施例８の方法に従って行った。
各サンプルの力価は、コロニー形成試験において、１個
のコロニーを形成しうる活性を１単位と定義した。すな
わち、２段階稀釈に於ける計数結果の直線性を与える投
与量応答直線（Dose-responsecurve）よりHalf Max値
（最大取り込み値の1/2の値）を求め、各サンプルの力
価を算出した。
比活性は単位蛋白質（mg）当りの力価（unit/mg）で表
示した。
インタクトのｈＧ−ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦ誘導体の
力価を第４表に示す。
実施例１０．Ｎ末端第１〜７番目欠失、１７番セリンｈ
Ｇ−ＣＳＦ誘導体（以後Ｍ−７Ｓと略す）の製造： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＢＣ５９をも
つ大腸菌（ＥＣｆＢＣ５９）を実施例８に記したように
培養、精製して得た第２表の誘導体(a)（１３２μｇ／m
l）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ
ＮａＣ溶液（pH8.0）５０mlに対して、ズブチリンＢ
ＰＮ′（8.5単位／mg蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ
添加し、25℃40時間インキュベートした。10mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ（pH8.0）で３倍稀釈ののち、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）で充たされたDEAE−トヨパー
ル６５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×4.4cm）に１
０ml／時の流速で通塔した。次いで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH8.0）20mlを５ml／時の流速で通塔後、10m
M Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）の緩衝液系に直線勾配で
ＮａＣを０Ｍから0.4Ｍまで総容量５０mlかけて加
え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−７Ｓ誘導体はＮａＣ
濃度１００〜１５０ｍＭで溶出された（収量0.7mg、
収率１０％）。純度は９０％以上であった。
実施例１１． Ｍ−７Ｓの製造： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＢＣ59をもつ
大腸菌（ＥＣｆＢＣ５９）を実施例８に記したように培
養、精製して得た第２表の誘導体(b)（１３２μｇ／m
l）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ
ＮａＣ溶液（pH8.0）５０mlに対して、ズブチリンＢ
ＰＮ′（8.5単位／mg蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ
添加し、２５℃１４時間インキュベートした。10mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）で３倍稀釈したのち、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）で充たされたＤＥＡＥ
−トヨパール６５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×
4.4cm）に１０ml／時の流速で通塔した。次いで10ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）20mlを５ml／時の流速で通
塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）の緩衝液系に
直線勾配でＮａＣを０Ｍから0.4Ｍまで総容量５０ml
かけて加え、同流速で溶出を行った。Ｍ−７Ｓ誘導体は
ＮａＣ濃度１００〜１５０ｍＭで溶出された（収量4.
2mg、収率６３％）。純度は９０％以上であった。
実施例１２． Ｍ−７Ｓの製造： 実施例６で得た組換え体プラスミドｐＣｆＴＡＡｒｇ４
Ｓをもつ大腸菌（ＥＣｆＴＡＡｒｇ４Ｓ）を実施例８に
記したように培養、精製して得た第２表の誘導体(d)
（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.0）５０mlに対して
ズブチリシンＢＰＮ′（8.5単位／mg−蛋白質）（シグ
マ社製）を0.7μｇ添加し、２５℃４０時間インキュベ
ートした。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにした後、10mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣで充されたＺ
ｎキレート セファロース（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で通塔
した。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）
−0.5Ｍ ＮａＣ12mlを３ml／時の流速で通塔後、10m
M Ｔｒｉｓ−ＨＣ−0.5Ｍ ＮａＣの緩衝液を直線
勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量３０mlかけて、同流速
で溶出を行った。Ｍ−７Ｓ誘導体はpH7.0付近で溶出さ
れた（収量0.6mg、収率９％）。純度は９０％であっ
た。
実施例１３． Ｎ末端第１〜６番目欠失、１７番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘
導体（以後Ｍ−６Ｓと略す）の製造： 第２表の誘導体(a)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対して、ズブチリシンＢＰＮ′（8.5単位／
mg蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ添加し、25℃ ２
時間インキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH8.0）で３倍稀釈したのち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣ（pH8.0）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパール６
５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×4.4cm）に１０ml
／時の流速で通塔した。次いで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（pH8.0）２０mlを５ml／時の流速で通塔後、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）の緩衝液系に直線勾
配でＮａＣを０Ｍから0.4Ｍまで総容量50mlかけて加
え、同流速で溶出を行った。Ｍ−６Ｓ誘導体はＮａＣ
濃度１００〜１５０ｍＭで溶出された（収量2.6mg、収
率４０％）。純度は９０％以上であった。
実施例１４． Ｍ−６Ｓ製造： 第２表の誘導体(a)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対して、エポルザイム（4120単位／mg蛋白
質）（協和発酵工業社製）を0.7μｇ添加し、２５℃２
０時間インキュベートした。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにし
た後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ
ＮａＣで充たされたＺｎキレート セファロース（フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製）（1.7cm×2.6c
m）に６ml／時の流速で通塔した。次いで、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ １２ml
を３ml／時の流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ−
0.5Ｍ ＮａＣの緩衝液を直線勾配でpH8.0からpH6.0
まで総容量３０mlかけて同流速で溶出を行った。Ｍ−６
Ｓ誘導体はpH7.0付近で溶出された（収量2.5mg、収率３
８％）。純度は９０％以上であった。
実施例１５． Ｍ−６Ｓの製造： 第２表の誘導体(b)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対してズブチリシンアミロサッカリティカ
スを0.7μｇ添加し、２５℃，20時間インキュベートし
た。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにした後、10ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣで充たされたＺｎ
キレート セファロース（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で通塔
した。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）
−0.5Ｍ ＮａＣ １２mlを３ml／時の流速で通塔
後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ Ｎ
ａＣの緩衝液系に直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容
量３０mlかけて同流速で溶出を行なった。Ｍ−６Ｓ誘導
体はpH7.0付近で溶出された（収量2.5mg、収率３８
％）。純度は９０％以上であった。
実施例１６． Ｍ−６Ｓの製造： 第２表の誘導体(d)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対してズブチリシン・カールスバーグ（0.0
34単位／mg蛋白質）（ＮＯＶＯ社）を0.7μｇ添加し、
２５℃，２０時間インキュベートした。ＮａＣ濃度を
0.5Ｍにした後、10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−
0.5Ｍ ＮａＣで充たされたＺｎキレート セファロ
ース（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）（1.7c
m×2.6cm）に６ml／時の流速で通塔した。次いで、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ
１２mlを３ml／時の流速で通塔後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ−0.5Ｍ ＮａＣの緩衝液系に直線勾配でpH
8.0からpH6.0まで総容量３０mlかけて同流速で溶出を行
なった。Ｍ−６Ｓ誘導体はpH7.0付近で溶出された（収
量３mg、収率４５％）。純度は９０％以上であった。
実施例１７． Ｍ−６Ｓの製造： 第２表の誘導体(a)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対して、プロテイナーゼＫ（0.027単位／mg
−蛋白質）（シグマ社製）を0.7μｇ添加し、２５℃４
０時間インキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH8.0）で３倍稀釈ののち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣ（pH8.0）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパール６
５０Ｍ（東洋曹達工業社製）（1.7cm×4.4cm）に１０ml
／時の流速で通塔した。次いで１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
（pH8.0）２０mlを５ml／時の流速で通塔後、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）の緩衝液系に直線勾配
で０Ｍ ＮａＣから0.4Ｍ ＮａＣまで総容量５０m
lかけて加え、同流速で溶出を行なった。Ｍ−６Ｓ誘導
体はＮａＣ濃度１００〜１５０ｍＭで溶出された（収
量2.6mg、収率３９％）。純度は９０％以上であった。
実施例１８． Ｎ末端第１〜５番欠失、１７番セリンｈＧ−ＣＳＦ誘導
体（以後Ｍ−５Ｓと略す）の製造： 第２表の誘導体(b)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対して、トリプシン（267単位／mg−蛋白
質）（シグマ社製）を0.5μｇ添加し、２５℃，１０時
間インキュベートした。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにした
後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ
で充たされたＺｎキレート セファロース（ファルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６
ml／時の流速で通塔した。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ １２mlを３ml／
時の流速で通塔後、10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.
0）−0.5Ｍ ＮａＣの緩衝液系に直線勾配で０Ｍから
0.3Ｍまでのイミダゾールを総容量３０mlかけて加え、
同流速で溶出を行なった。Ｍ−５Ｓ誘導体は0.1Ｍイミ
ダゾールで溶出された（収量2.7mg、収率４１％）。純
度は９０％以上であった。
実施例１９． Ｍ−４Ｓの製造： 第２表の誘導体(d)（１３２μｇ／ml）を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対して、トリプシン267単位／mg−蛋白質
（シグマ社製）を５μｇ添加し、25℃２０時間インキュ
ベートした。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにした後、10mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣで充たされ
たZnキレート セファロース（ファルマシア・ファイン
・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６ml／時の流速で
通塔した。次いで、10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.
0）−0.5Ｍ ＮａＣ １２mlを３ml／時の流速で通塔
後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5ＭＮａＣ
の緩衝液系に直線勾配で０Ｍから0.3Ｍまでのイミダゾ
ールを総容量３０mlかけて加え、同流速で溶出を行なっ
た。Ｍ−４Ｓ誘導体は0.1Ｍイミダゾールで溶出された
（収量2.7mg、収率４１％）。純度は９０％以上であっ
た。
実施例２０． Ｍ−４Ｓの製造： 第２表の誘導体(d)（１３２μｇ／ml）を含む１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣ−１００ｍＭ ＮａＣ溶液（pH8.
0）５０mlに対してα−キモトリプシン２６７単位／mg
−蛋白質（シグマ社製）を５μｇ添加し、２５℃，２０
時間インキュベートした。ＮａＣ濃度を0.5Ｍにした
後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ
で充たされたＺｎキレート セファロース（ファルマ
シア・ファイン・ケミカル社製）（1.7cm×2.6cm）に６
ml／時の流速で通塔した。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH8.0）−0.5Ｍ ＮａＣ12mlを３ml／時の
流速で通塔後、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）−0.5
Ｍ ＮａＣの緩衝液系に直線勾配で０Ｍから0.3Ｍま
でのイミダゾールを総容量30mlかけて加え、同流速で溶
出を行なった。Ｍ−４Ｓ誘導体は0.1Ｍイミダゾールで
溶出された（収量2.3mg、収率３５％）。純度は９０％
以上であった。
実施例２１． 実施例１０−２０に認められたように、１７番目がセリ
ンに置換し、しかもＮ末端アミノ酸が、４個欠失（Ｍ−
４Ｓ）、５個欠失（Ｍ−５Ｓ）、６個欠失（Ｍ−６
Ｓ）、そして７個欠失（Ｍ−７Ｓ）されたｈＧ−ＣＳＦ
誘導体が得られる。一般に組換えＤＮＡ技術を用いる場
合、Ｎ末端にメチオニンが付加される。これが、組換え
型産物の１つの欠点である。しかし、本発明の酵素切断
法を用いれば、Ｎ末端にメチオニンが付加されずに製造
できるので有利である。
このように取得された誘導体のＧ−ＣＳＦ活性を測定し
比較した。結果を第５表に示す。
第５表の結果より、Ｎ末端側アミノ酸４〜７欠失体につ
いては、すべて、インタクトhG−ＣＳＦに比べ、in vit
roの評価において２〜４倍の高活性が見い出された。
したがって、本発明より製造できるＮ末端側アミノ酸欠
失体はＮ末端側にメチオニンが付加されず、しかもイン
タクトより２倍〜４倍高活性を有するものである。
Ｎ末端部の変異による加水分解酵素に対する切断反応性
（感受性）の獲得について以下の例で示す。
実験例１． インタクトのｈＧ−ＣＳＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳＦと
のズブチリシン・カールスバーグに対する反応性の比較 実施例16と同様にして、第２表の誘導体とインタクトの
ｈＧ−ＣＳＦをズブチリシン・カールスバーグ（NOVO
社）3.6〜10-4単位／mg−Ｇ−CSF存在下に１４時間、２
５℃でインキュベートしたところ、第２表の誘導体から
はＭ−６Ｓ誘導体が得られたが、インタクトｈＧ−ＣＳ
Ｆは未反応であった。さらに、酵素量１００倍（3.6×
１０-2単位／mg−Ｇ−ＣＳＦ）にしても、インタクトで
は、Ｍ−６Ｓの生成はなく全体的な分解反応が優先し
た。
実験例２． インタクトのｈＧ−ＣＳＦとＮ末端変異ｈＧ−ＣＳＦと
のトリプシンに対する反応性の比較 実施例19と同様にして、第２表の誘導体(a)とインタク
トｈＧ−ＣＳＦをトリプシン（シグマ社）0.22単位／mg
−Ｇ−ＣＳＦの存在下に20時間，25℃でインキュベート
したところ、第２表の誘導体(a)からはＭ−４Ｓ誘導体
が得られたが、インタクトｈＧ−ＣＳＦは未反応であっ
た。さらに、酵素量１００倍（２２単位／mg−Ｇ−ＣＳ
Ｆ）にしても、インタクトｈＧ−ＣＳＦではＭ−４Ｓの
生成はなく全体的な分解反応が優先した。
実験例３． ｈＧ−ＣＳＦ誘導体の熱安定性： 第６表に示した本発明の各種誘導体20μｇをリン酸緩衝
液−生理食塩水（ＰＢＳ）（pH7.2）または１０％牛胎
児血清（ＦＢＳ）添加α−ＭＥＭ培地１mlに溶解させ
た。５６℃でインキュベートし、経時的にサンプル採取
を行い、そのＣＳＦ活性を、マウス骨髄細胞を用いたコ
ロニー形成試験（前記岡部らの方法）で測定した。
各サンプルは４０ｎｇ／mlより２段階稀釈法で１０段階
の稀釈を行い、各段階の測定を行い、良好な用量反応
（Dose response）を与える任意の濃度での活性を加熱
前（０分）と比較することにより残存活性を求めた。
ＰＢＳ中または１０％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭ培地中での
残存活性（熱安定性に対応する）をそれぞれ第６表
（Ａ）および（Ｂ）に示す。
実施例２２． 部位特異的変異を用いたｐＣｆＢＤ２８Ａ１７，ｐＣｆ
ＢＤ２８Ｔ１７の造成（第１７図参照）： (a)鋳型一本鎖ＤＮＡ（一本鎖ｐｔ１９ＢＤ２８Ｎ）の
造成： 実施例６(4)の方法で得たｐＣｆＢＤ２８ ３μｇを５
０μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＢａｎII
I（東洋紡績社製）とＰｓｔＩをそれぞれ10単位ずつ加
え、３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法により、ｈＧ−ＣＳＦ誘導体（ＮＤ２８）のＮ
末部分をコードする約２１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ban II
I−ＰｓｔＩ断片）約0.1μｇを得た。
一方、Ｍ１３ファージベクターであるＭ１３ｍｐ１９Ｒ
ＦＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇを全量50μのＹ−50緩
衝液に溶かし、制限酵素ＡｃｃＩ（東洋紡績社製）を１
０単位加え、３７℃，２時間切断反応を行った。その
後、ＮａＣ濃度が１００ｍＭになるようにＮａＣを
添加し、制限酵素ＰｓｔＩを１０単位加え３７℃，２時
間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により約
7.24ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｃｃＩ−ＰｓｔＩ断片）約0.
8μｇを得た。
上記で得たＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約210ｂｐ）0.2
μｇと、ＡｃｃＩ−ＰｓｔＩ断片（約7.24ｋｂ）0.05μ
ｇをＴ４リガーゼ緩衝液50μに溶かし、この混合液に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ10単位を加え１２℃，１６時間結合
反応を行った。
次に、公知の方法に従い、上記反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０５株をトランスフェクションし、組換え体ファー
ジを得た。この組換え体ファージの感染した大腸菌ＪＭ
１０５株の培養菌体より、プラスミドＤＮＡ回収法に準
じて、組換え体Ｍ１３ファージＲＦＤＮＡを回収した。
このＲＦＤＮＡ（これをｐｔ１９ＢＤ２８Ｎと呼ぶ）の
構造は、ＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＡｖａＩ，ＸｈｏＩで
切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し
た。そこでこの組換え体ファージより、公知の方法に従
って一本鎖ｐｔ19ＢＤ２８Ｎを回収し鋳型とした。
(b)ギャップト・デュプレックスＤＮＡ（Gapped Duplex
ＤＮＡ）の造成： Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡ（宝酒造社製）３μｇを３０
μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄIIIをそれぞれ１０単位ずつ加え、３７℃で
２時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によ
り約7.2ｋｂのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断
片）約2.5μｇを得た。
このｍｐ１９ＲＦＤＮＡ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
I断片（約7.2ｋｂ）と前項で得た鋳型一本鎖ＤＮＡ，ｐ
ｔ１９ＢＤ２８Ｎ １μｇをクレノー緩衝液２７μに
溶かし、１００℃で６分間煮沸することによりＤＮＡを
変性させた。その後、６５℃で１０分間、３７℃で４０
分間，４℃で４０分間、氷中で１０分間放置し、アニー
ル反応を行い鋳型中のＧ−ＳＣＦ遺伝子部分だけが一本
鎖となったギャップト・デュプレックスＤＮＡを生成さ
せた。生成したギャップト・デュプレックスＤＮＡはＬ
ＧＴ法により回収した。
(c)突然変異誘発（ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７，ｐｔ１
９ＢＤ２８ＮＴ１７の造成）： 実施例６で得たｈＧ−ＣＳＦ誘導体〔ＮＤ28〕のＮ末端
から１７番目のアミノ酸であるＳｅｒをＡｌａに置換す
るために必要な一本鎖ＤＮＡ（これをＤ−１と呼ぶ）お
よび同ＳｅｒをＴｈｒに置換するために必要な一本鎖Ｄ
ＮＡ（これをＤ−２と呼ぶ）を通常のトリエステル法に
より合成した。Ｄ−１（３３−mer）およびＤ−２（３
３−mer）の塩基配列を下に示す。
Ｄ−１を用いた突然変異誘発によりＳｔｕＩサイトが、
Ｄ−２を用いた突然変異誘発によりＸｂａＩサイトが新
たに生じるようにデザインされているため、突然変異が
導入されたものをこれらの制限酵素による切断で確認す
ることができる。
Ｄ−１，Ｄ−２それぞれ１μｇを別個に５０μのＴ４
キナーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ３０単位を加えて３７℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。
次に、このリン酸化したＤ−１あるいはＤ−２の0.2μ
ｇと前項で得たギャップト・デュプレックスＤＮＡ0.1
μｇを6.5ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），８ｍＭ
ＭｇＣ2，１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１
００ｍＭ ＮａＣを含む緩衝液３４μに溶かし、６
５℃で６０分間、室温で３０分間放置し、Ｄ−１あるい
はＤ−２をギャップト・デュプレックスＤＮＡにアニー
ルさせた。
この溶液にｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを
それぞれ0.5ｍＭになるように加えた後、1.5単位のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ・クレノー断片と１０単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃，１６時間の伸長反応を行っ
た。
該反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０５をトランスフェクシ
ョンし、変異導入ファージを得た。変異導入ファージの
感染した大腸菌ＪＭ１０５よりＲＦＤＮＡを回収し、Ａ
ｖａＩ，ＸｈｏＩ，ＳｔｕＩ（Ｄ−１を用いた場合）あ
るいはXbaI（Ｄ−２を用いた場合）で切断後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により確認した。Ｄ−１により
変異を導入したＲＦＤＮＡをｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１
７，Ｄ−２により変異を導入したＲＦＤＮＡをｐｔ１９
ＢＤ２８ＮＴ１７と呼ぶ。ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７の
ＳｔｕＩサイト付近およびｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７の
ＸｂａＩサイト付近の塩基配列は下記のとおりであるこ
とを、Ｍ１３ファージを用いたデイデオキシ・シークエ
ンス法で確認した。
(d)ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７
の造成： 前項で得たｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７あるいはｐｔ１９
ＢＤ２８ＮＴ１７３μｇを５０μのＹ−１００緩衝液
に溶かし、制限酵素ＡｖａＩおよびＸｈｏＩをそれぞれ
１０単位加え３７℃で２時間切断反応を行った。反応液
からＬＧＴ法により、前項で導入した変異部位を含む約
１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＡｖａＩ−ＸｈｏＩ断片）を
0.05μｇ得た。
一方、実施例６の(4)で得たｐＣｆＢＤ２８ ２μｇを5
0μのＹ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＸｈｏＩ
とＢｇIIをそれぞれ１０単位ずつ加え３７℃で２時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、ト
リプトファンプロモーター部分を含む約2.74kbのＤＮＡ
断片（ＸｈｏＩ−ＢｇII断片）を約１μｇ得た。
また、ｐＣｆＢＤ２８２μｇを50μのＹ−100緩衝液
に溶かし、制限酵素ＢｇIIを10単位加え３７℃で２時
間切断反応を行った。アガロースゲル電気泳動でＢｇ
II切断が完全に行われていることを確認した後に、制限
酵素ＡｖａＩを５単位加え３７℃で１０分間部分切断反
応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、成熟型ｈ
Ｇ−ＣＳＦｃＤＮＡの大部分とｐｐターミネーター部
分を含む約1.29ｋｂのＤＮＡ断片（ＢｇII−ＡｖａＩ
断片）を0.4μｇ得た。
次に上記で得たｐＣｆＢＤ28由来のＸｈｏＩ−ＢｇII
断片（約2.74kb）0.1μｇおよびＢｇII−ＡｖａＩ断
片（約1.29kb）とｐｔ19ＢＤ２８ＮＡ１７あるいはｐｔ
１９ＢＤ２８ＮＴ17のＡｖａＩ−ＸｈｏＩ断片（約１１
０bp）0.02μｇをＴ４リガーゼ緩衝液６０μに溶か
し、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１２℃で16
時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ａ
ｐrのコロニーを得た。このコロニーの培養菌体よりプ
ラスミドＤＮＡを回収した。ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＡ１７
を用いて造成したプラスミドをｐＣｆＢＤ２８Ａ１７，
ｐｔ１９ＢＤ２８ＮＴ１７を用いて造成したプラスミド
をｐＣｆＢＤ28Ｔ１７と呼ぶ。ｐＣｆＢＤ２８Ａ17の構
造は、ＡｖａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｇII，ＳｔｕＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動により確認した。また、ｐ
ＣｆＢＤ２８Ｔ１７の構造はＡｖａＩ，ＸｈｏＩ，Ｂｇ
II，ＸｂａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
り確認した。
これら２つのプラスミドがコードするｈＧ−ＣＳＦ誘導
体は、それぞれ成熟型ｈＧ−ＣＳＦに比べて以下のよう
にアミノ酸残基が置換されている。
ｐＣｆＢＤ２８Ａ１７およびｐＣｆＢＤ２８Ｔ17にコー
ドされるｈＧ−ＣＳＦ誘導体を以後、それぞれｈＧ−Ｃ
ＳＦ〔ＮＤ２８Ａ１７〕，ｈＧ−ＣＳＦ〔ＮＤ２８Ｔ１
７〕と呼ぶ。
参考例１． ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＣＳＦ１−２
の単離 (1)正常人末梢血マクロファージからのポリ(A)ＲＮＡの
調製： 正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球をプラスチ
ックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄・除去する
ことにより、接着性の細胞であるマクロファージを単離
した。このマクロファージより、チオシアン酸グアニジ
ン−塩化リチウム法〔カサラ（Cathala）ら：ディーエ
ヌエイ（ＤＮＡ）２，329(1983)〕に従い、ポリ（Ａ）
を有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
正常人の末梢血４００mlをHitachi RPR10ローターにて
１８００rpm、２０分間遠心して血球を沈殿させ、これ
を５０mlリン酸緩衝食塩水〔ＮａＣ８ｇ／、ＫＣ
0.2ｇ／、無水Ｎａ2ＨＰＯ41.15ｇ／、ＫＨ2ＰＯ
40.2ｇ／（pH7.2）；以下ＰＢＳと略記する〕に懸濁
した。この懸濁液２５mlをリンパ球分離液〔ビオネティ
クス（BIONETICS）社製〕25mlに重層し、Hitachi RPR10
ローターにて1800rpm、３０分間遠心した。中間層の白
血球を分取し、等量のＰＢＳで洗浄（Hitachi RPR10ロ
ーターにて１５００rpm、１０分間）した後、５％の仔
牛胎児血清を含む２０mlのＲＰＭＩ1640培地（日水製薬
社製）に、懸濁し培養した。培養には組織培養用フラス
コ（コーニング社製）を用いた。37℃で1.5時間培養し
た後、培養上清を非接着性の細胞とともに除去した。新
たに20mlの同培地と大腸菌リポ多糖（LPS）を0.3mg／ml
となるように加え、さらに３７℃で４時間培養した。次
いで、培養液より1,100×ｇ、４℃、１０分間の遠心に
よって細胞を集め、８０mlのＰＢＳで洗浄した後、５Ｍ
チオシアン酸グアニジン、10ｍＭ ＥＤＴＡ、50mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH７）および８％（v/v）２−メルカ
プトエタノールからなる溶液１０ml中でボルテックス・
ミキサーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管に移
し４Ｍ ＬｉＣ溶液80mlを加えて攪拌した後、４℃、
２０時間静置した。Hitachi RPR10ローターにて9,000rp
m、90分間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。ＲＮ
Ａの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウムからなる溶
液５０mlに懸濁し、Hitachi RPR10ローターにて9,000rp
m、６０分間遠心後、再びＲＮＡを沈殿として回収し
た。
ＲＮＡの沈殿を0.1％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5）か
らなる溶液１０mlに溶解し、フェノール−クロロホルム
で抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られたＲ
ＮＡ約0.8mgを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）お
よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１mlに溶かした。65
℃，５分間インキュベートし、0.1mlの５Ｍ ＮａＣ
を加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セルロース・カラム
〔ビー・エル・バイオケミカル（Ｐ−Ｌ Biochemica
l）社製〕クロマトグラフィー（カラム体積0.5ml）にか
けた。吸着したポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを10ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5）および１ｍＭ ＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約３
０μｇを得た。
(2)ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入： オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol.Cell.Bio
l.），２，161(1982)〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれ
を組み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その
工程の概略を第９図に示す。
ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Be
rg）：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ
（Mol.Cell.Biol.），３，280(1983)〕４００μｇを10
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2
および10ｍＭ ＮａＣからなる溶液３００μに加
え、さらに５００単位のＫｐｎＩを加えて、37℃，６時
間反応させ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。
フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によ
りＤＮＡを回収した。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約２０
０μｇを４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH6.8），１ｍＭ ＣａＣ2および0.
1ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）か
らなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴ
Ｐを0.25ｍＭとなるよう加えた溶液２００μに加え、
さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加えて、３７℃、１１分間反応さ
せた。ここで、ｐＣＤＶ１のＫｐｎＩ切断部位の３′末
端にポリ（ｄＴ）鎖が約６７個付加された。該溶液から
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿によ
り、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ１ＤＮＡ約１０
０μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2，１００mM ＮａＣ
からなる緩衝液１５０μに加え、さらに３６０単位
のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。該反応
物をＬＧＴ法で処理後、約3.1ｋｂのＤＮＡ断片を回収
し、約60μｇのポリ（ｄＴ）鎖付加ｐＣＤＶ１を得た。
該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）およ
び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μに溶解し、
６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５０μの５
Ｍ ＮａＣを加えた。混合物をオリゴ（ｄＡ）セルロ
ースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグ
ラフィーにかけた。ポリ（ｄＴ）鎖長が充分なものはカ
ラムに吸着し、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH
8.0）および１mM ＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
リ（dT）鎖の付加したｐＣＤ１（以下ベクタープライマ
ーと略記する）２７μｇを得た。
次にリンカーＤＮＡの調製を行った。ｐＬ１〔オカヤマ
・アンド・バーグ（Okayama & Berg）：モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol.Cell.Biol.），
３，280(1983)〕約１４μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2および50ｍＭ Ｎａ
Ｃからなる緩衝液２００μに加え、さらに５０単位
のＰｓｔＩを加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬ１ＤＮ
Ａ中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、PstI
で切断したｐＬ１ＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮ
Ａ約13μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度0.25ｍＭのｄＧＴＰ
を含む溶液５０μに加え、さらにＴｄＴ（P-L Bioche
micals社製）５４単位を加えて３７℃13分間インキュベ
ートし、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位３′末端に（ｄＧ）
鎖を約14個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後
エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2
および６０ｍＭ ＮａＣからなる緩衝液１００μに
加え、さらに８０単位のＨｉｎｄIIIを加えて37℃３時
間インキュベートし、ｐＬ１ＤＮＡのＨｉｎｄIII部位
で切断した。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約0.5ｋｂのＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法
〔ドレツェン（Dretzen）ら：アナリティカル・バイオ
ケミストリィ（Anal.Biochem.），１１２，295(1981)〕
にて回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリンカーＤＮＡ（以
下単にリンカーＤＮＡと略記する）を得た。
上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約３μｇ、ベクタープ
ライマー約1.4μｇを50ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.
3），８ｍＭ ＭｇＣ2，30ｍＭ ＫＣ，0.3ｍＭ
ＤＴＴ，２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧ
ＴＰおよびｄＣＴＰ）および10単位のリボヌクレアーゼ
インヒビター（P-L Biochemicals社製）からなる溶液2
2.3μに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業
社製）を加え、４１℃９０分間インキュベートし、ｍＲ
ＮＡに相補的なＤＮＡを合成させた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを６６μＭ ｄＣＴＰおよび0.2
μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液20μに溶かし、１
４単位のＴｄＴ（P-L Biochemicals社製）を加えて３７
℃２分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３′末端に２０個
の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物をフェノール−クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈殿により（ｄＣ）鎖の付
加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを回収し
た。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.
5），６ｍＭ ＭｇＣ2および６０ｍＭ ＮａＣから
なる液４００μに溶かし、２０単位のＨｉｎｄIIIを
加え、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄIII部
位で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿して0.5ピコモルの（dC）鎖付加ｃ
ＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ0.
2ピコモルおよび前記のリンカーＤＮＡ0.4ピコモルを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），0.1Ｍ ＮａＣ
および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１００μに溶か
し、６５℃，４２℃，０℃でそれぞれ１０分，25分，３
０分間インキュベートした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH7.5），４mM ＭｇＣ2，１０ｍＭ（ＮＨ4)2Ｓ
Ｏ4，0.1Ｍ ＫＣおよび0.1ｍＭ β−ＮＡＤの組成
で、全量１０００μとなるよう反応液を調製した。該
反応液に25単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイング
ランド・バイオラブズ社製）を加え、11℃１８時間イン
キュベートした。該反応液を各40μＭのｄＮＴＰ，0.15
ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、10単位
の大腸菌ＤＮＡリガーゼ，２０単位の大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（P-L Biochemicals社製）および１０単位の
大腸菌リボヌクレアーゼＨ（P-L Biochemicals社製）を
加え、１２℃，２５℃で順次１時間ずつインキュベート
した。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状
化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置
換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミドが生
成した。
(3)ｈＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択： (2)で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ８株をスコット（Scott）らの方法〔重定勝
哉：細胞工学２，616(1983)〕に従い形質転換した。得
られた約9200個のコロニーをニトロセルロース・フィル
ター上に固定した。長田ら〔長田（Nagata）ら：ネイチ
ャー（Nature）３１９，415(1986)〕が単離したｈＧ−
ＣＳＦの成熱タンパク質のＮ末端９アミノ酸に相当する
27塩基の合成ＤＮＡ ５′−ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG−３′を32Ｐで標
識したプローブに６０℃で強く会合した１菌株を選んだ
〔グルンステイン・ホグネス（Grunstein-Hogness）の
方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA
７２，3961(1975)〕。この菌株がもつプラスミドｐＣＳ
Ｆ１−２が有するｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ13ファー
ジを用いたディデオキシ・シークエンス法により決定し
た（第１表）。その結果、ｐＣＳＦ１−２が有するｃＤ
ＮＡは、ｈＧ−ＣＳＦをコードしていることが判明し
た。
この菌株は、前記のようにEscherichia coliＥＣＳＦ１
−２〔ＦＥＲＭ ＢＰ−１２２０〕として、微工研に寄
託されている。
参考例２． プラスミドｐＫＹＰ２６の分離精製 ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌〔Escherichia coli IKYP26
(FERM BP-863)〕を５０μｇ／mlのアンピシリンを含む
Ｌ培地（１％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、１
％ＮａＣ，pH7.5）１０mlで３７℃、１８時間培養し
た。この培養液全量を５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ培地１に植菌し、３７℃で培養した。４時間後
に、クロラムフェニコールを１７０μｇ／mlとなるよう
に加え、さらに３７℃、１６時間培養した。遠心分離法
（5,000rpm１０分間）により集菌を行い、0.8％ＮａＣ
で菌体を洗浄した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH8.0）２０mlに懸濁し、氷冷した。１０mg/mlのリゾ
チームを８ml加え氷中に１０分間静置した後、0.5Ｍ
ＥＤＴＡを9.6ml加え、氷中に１０分間静置し、２％ト
リトン Ｘ−１００（和光純薬工業社製）を2.3ml加え
氷中にさらに１時間静置した。50,000×ｇで４℃、１時
間超遠心分離を行い、上清約４０mlを得た。次にこの上
清に３ＭＮａＯＨを加えpHを12.5として、室温で10分間
静かに攪拌した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5）を
加え、pHを8.5にもどし、さらに３分間攪拌した。この
時点で液の容量は約５５mlであった。１／９容の５Ｍ
ＮａＣを加えた後、フェノール抽出を行った。１／２
５０容の５mg/mlＲＮａｓｅ Ａ（シグマ社製）を加
え、３７℃、１時間ＲＮＡ分解反応を行った後、１／５
容の５Ｍ ＮａＣを加え、１／３容の３０％ＰＥＧ６
０００（半井化学薬品社製）を加え−２０℃に２時間静
置した。遠心分離法で沈殿を集め、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH7.5）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液
２mlに溶かし、ソジウム・ドデシル・サルフェイト（Ｓ
ＤＳ）を0.5％となるように加え、プロティナーゼＫ
（シグマ社製）を５０μｇ／mlとなるように加えて、３
７℃、１時間蛋白質分解反応を行った。フェノール抽出
を３回繰り返し行った後、クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収し、10mMＴｒｉｓ−ＨＣ
（pH7.5）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる液１mlに溶
かした。このようにしてｐＫＹＰ２６を８００μｇ得る
ことができた。ｐＫＹＰ26の構造は、ＥｃｏＲＩ，Ｋｐ
ｎＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇII，ＰｓｔＩで切断してアガ
ロースゲル電気泳動で確認した。
参考例３． 1)ヒトＬＴｃＤＮＡを運ぶプラスミドｐＬＴ１の単離： (1)ＬｕｋII細胞よりのポリ（Ａ）ＲＮＡの調製： ヒトリンパ芽球様細胞株ＬｕｋIIより、チオシアン酸グ
アニジン−塩化リチウム法〔カサラ（Cathala）ら：デ
ィーエヌエイ（ＤＮＡ）２，329(1983)〕に従い、ポリ
（Ａ）を有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
ヒトリンパ芽球様細胞株ＬｕｋII〔ベリッシュ・ワイ・
ルビン（Berish Y.Rubin）ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）USA８２，6637(1985)〕を、５％の
仔牛胎児血清と１ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）
を含む１のＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）
に、８×１０5／mlとなるように接種し、増殖させた。
培養にはスピンナー・カルチャー・ボトルを用いた。３
７℃で４８時間培養した後、遠心によって細胞を集め、
10ng/mlのフォルボール・ミリステート・アセテート
（ＰＭＡ；Phorbol myristate acetate）と５％の仔牛
胎児血清と１ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む、新しい１のＲ
ＰＭＩ１６４０培地に移し、さらに３７℃で４８時間培
養した。続いて、この細胞懸濁液の一部（２５０ml）か
ら1,100×ｇ，４℃，１０分間の遠心によって細胞を集
め、８０mlのリン酸塩バッファーで洗浄した後、５Ｍチ
オシアン酸グアニジン，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH７）および８％（V/V）２−メ
ルカプトエタノールからなる溶液１０ml中でボルテック
ス・ミキサーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管
に移し、４Ｍ ＬｉＣ溶液８０mlを加えて攪拌した
後、４℃，２０時間静置した。HitachiＲＰＲ１０ロー
ターにて9,000ｒｐｍ，９０分間遠心後、ＲＮＡを沈殿
として回収した。ＲＮＡの沈殿を４Ｍ尿素および２Ｍ塩
化リチウムからなる溶液５０mlに懸濁し、HitachiＲＰ
Ｒ１０ローターにて9,000rpm，６０分間遠心後、再びＲ
ＮＡを沈殿として回収した。ＲＮＡの沈殿を0.1％ラウ
リル硫酸ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣ（pH7.5）からなる溶液１０mlに溶解し、
フェノール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿に
より回収した。得られたＲＮＡ約2.5mgを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣ（pH8.0）および１ｍＭ ＥＤＴＡから
なる溶液１mlに溶かした。６５℃，５分間インキュベー
トし、0.1mlの５Ｍ ＮａＣを加えた。混合物をオリ
ゴ（ｄＴ）セルロース・カラム〔ピー・エル・バイオケ
ミカル（Ｐ−Ｌ Biochemical）社製〕クロマトグラフ
ィー（カラム体積0.5ml）にかけた。吸着したポリ
（Ａ）を有するｍＲＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH7.5）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出
し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１００μｇを得た。
(2)ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの挿入： オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）の方法〔モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジィ（Mol.Cell.Bio
l.），２，161(1982)〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれ
を組み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その
工程の概略を第９図に示す。
ｐＣＤＶ１〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Be
rg）：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ
（Mol.Cell.Biol.），３，280(1983)〕４００μｇを10
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2
および１０ｍＭ ＮａＣからなる溶液３００μに加
え、さらに５００単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃，６
時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断し
た。フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿
によりＤＮＡを回収した。ＫｐｎＩ切断した該ＤＮＡ約
２００μｇをＴｄＴ緩衝液にｄＴＴＰを0.25ｍＭとなる
よう加えた溶液２００μに加え、さらに81単位のＴｄ
Ｔ（P-L Biochemicals社製）を加えて、３７℃、１１分
間反応させた。ここで、ｐＣＤＶ１のＫｐｎＩ切断部位
の３′末端にポリ（ｄＴ）鎖が約６７個付加された。該
溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈
殿により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ１ＤＮＡ
約100μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ2，１００ｍＭ
ＮａＣからなる緩衝液１５０μに加え、さらに３６
０単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。
該反応物をＬＧＴ法で処理後、約3.1ｋｂのＤＮＡ断片
を回収し、約６０μｇのポリ（ｄＴ）鎖付加ｐＣＤＶ１
を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH8.
0）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００μに
溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷して50μ
の５Ｍ ＮａＣを加えた。混合物をオリゴ（ｄＡ）
セルロースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロ
マトグラフィーにかけた。ポリ（ｄＴ）鎖長が充分なも
のはカラムに吸着し、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（pH8.0）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶
出し、ポリ（ｄＴ）鎖の付加したｐＣＤＶ１（以下ベク
タープライマーと略記する）２７μｇを得た。
次にリンカーＤＮＡの調製を行った。
ｐＬ１〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama & Ber
g）：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ
（Mol.Cell.Biol.），３，280(1983)〕約１４μｇを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），６ｍＭ ＭｇＣ
2および50ｍＭ ＮａＣからなる緩衝液200μに加
え、さらに50単位のＰｓｔＩを加え、３７℃４時間反応
させ、ｐＬ１ＤＮＡ中のＰｓｔＩ部位で切断させた。該
反応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿を行い、ＰｓｔＩで切断したｐＬ１ＤＮＡ約１３μ
ｇを回収した。該ＤＮＡ約13μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃
度0.25ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液50μに加え、さらに
ＴｄＴ（P-L Biochemicals社製）５４単位を加えて３７
℃13分間インキュベートし、ｐＬ１のＰｓｔＩ切断部位
３′末端に（ｄＧ）鎖を約14個付加した。フェノール−
クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し
た。該DNAを10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），６ｍ
Ｍ ＭｇＣ2および６０ｍＭ ＮａＣからなる緩衝
液１００μに加え、さらに８０単位のＨｉｎｄIIIを
加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ１ＤＮＡの
ＨｉｎｄIII部位で切断した。該反応物をアガロースゲ
ル電気泳動にて分画し、約0.5kbのＤＮＡ断片をＤＥＡ
Ｅペーパー法〔ドレツェン（Dretzen）ら：アナリティ
カル・バイオケミストリィ（Anal.Biochem.），１１
２，295(1981)〕にて回収し、オリゴ（ｄＧ）鎖付きの
リンカーＤＮＡ（以下単にリンカーＤＮＡと略記する）
を得た。
上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクタープ
ライマー約1.4μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH
8.3），８ｍＭ ＭｇＣ2，３０ｍＭ ＫＣ，0.3ｍ
Ｍ ＤＴＴ，２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，
ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１０単位のリボヌクレ
アーゼインヒビター（P-L Biochemicals社製）からなる
溶液22.3μに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学
工業社製）を加え、４１℃９０分間インキュベートし、
ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成させた。該反応物をフ
ェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭ ｄＣＴＰおよび
0.2μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ緩衝液２０μに溶か
し、14単位のＴｄＴ（P-L Biochemicals社製）を加えて
３７℃２分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３′末端に２
０個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物をフェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により（ｄＣ）鎖
の付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを回収
した。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.
5），６ｍＭ ＭｇＣ2および60ｍＭ ＮａＣからな
る液４００μに溶かし、２０単位のＨｉｎｄIIIを加
え、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄIII部位
で切断した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿して0.5ピコモルの（ｄＣ）鎖付加
ｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ
0.2ピコモルおよび前記のリンカーＤＮＡ0.4ピコモルを
10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），0.1Ｍ ＮａＣお
よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１００μに溶か
し、６５℃，４２℃，０℃でそれぞれ１０分，２５分，
３０分間インキュベートした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（pH7.5），４ｍＭ ＭｇＣ2，１０ｍＭ（ＮＨ4)
2ＳＯ4，0.1Ｍ ＫＣおよび0.1mM β−ＮＡＤの組成
で、全量100μとなるよう反応液を調製した。該反応
液に２５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラ
ンド・バイオラブズ社製）を加え、１１℃１８時間イン
キュベートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ，0.
15ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、１０
単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ，２０単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（P-L Biochemicals社製）および１０単
位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（P-L Biochemicals社
製）を加え、１２℃，２５℃で順次１時間ずつインキュ
ベートした。上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
の環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮ
Ａに置換され、完全な二重鎖ＤＮＡの組換え体プラスミ
ドが生成した。
(3)ヒトＬＴｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの選択： (2)で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６００
ＳＦ８株〔カメロン（Cameron）：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA７２，3416(1975)〕をScot
tらの方法〔重定勝哉：細胞工学２，616(1983)〕に従い
形質転換した。得られた約30,000個のコロニーをニトロ
セルロース・フィルター上に固定した。ジェネンテク
（Genentech）社が単離したヒトＬＴｃＤＮＡ〔パトリ
ック・ダブリュー・グレイ（Patrick W.Gray）ら：ネイ
チャー（Nature）３１２，721(1984)〕の５′非翻訳領
域の一部の塩基配列と一致する１７塩基の合成ＤＮＡ
５′−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧ−３′を32
Ｐで標識したプローブに５２℃で強く会合した１菌株を
選んだ〔グルンステイン・ホグネス（Grunstein-Hognes
s）の方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA７２，3961(1975)〕。この菌株が持つプラスミ
ドｐＬＴ１のｃＤＮＡの全塩基配列を、Ｍ13ファージを
用いたディデオキシ・シークエンス法により決定した。
その結果、ｐＬＴ１のｃＤＮＡはヒトＬＴをコードして
いることが判明した。
2)組換え体プラスミドｐＬＡ１の造成： 前項の方法によって得たｐＬＴ１（4.7ｋｂ）５μｇを
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），７ｍＭ Ｍｇ
Ｃ2，６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む全量５
０μの溶液（以下“Ｙ−０緩衝液”と略記する）に溶
かし、制限酵素ＸｈｏII（ベーリンガーマンハイム社
製）１０単位を加えて、３７℃で２時間切断反応を行っ
た。次いで、ＮａＣを終濃度１５０ｍＭとなるように
加え、制限酵素ＮｓｉＩ（ニューイングランド・バイオ
ラブズ社製）１０単位を加え、３７℃でさらに３時間切
断反応を行った。反応液からＬＧＴ法によりヒトＬＴＤ
ＮＡの大部分を含む約７５０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｘｈｏ
II−ＮｓｉＩ断片）約0.3μｇを得た。
別に、ｐＬＴ１ ２０μｇを２００μのＹ−５０緩衝
液に溶かし、制限酵素ＨａｅIII４０単位を加えて、３
７℃で２時間切断反応を行った。
次いで、ＮａＣを終濃度１５０ｍＭとなるように加
え、ＮｓｉＩ４０単位を加え、３７℃でさらに３時間切
断反応を行った。反応液からポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により、ヒトＬＴのＮ末端部分を含む約５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＨａｅIII−ＮｓｉＩ断片）約４０ng
を得た。
一方、ｐＧＥＬ１（3.4ｋｂ）３μｇを全量３０μの
Ｙ−１００緩衝液に溶かし、制限酵素ＳｔｕＩと制限酵
素ＢｇIIそれぞれ６単位ずつを加え３７℃で３時間切
断反応を行った。
この反応液からＬＧＴ法によりＡｐr遺伝子を含む約2.3
ｋｂのＤＮＡ断片（ＳｔｕＩ−ＢｇII断片）約1.0μ
ｇを得た。
次に上記で得たｐＬＴ１由来のＸｈｏII−ＮｓｉＩ断片
（約７５０ｂｐ）0.2μｇおよびＨａｅIII−ＮｓｉＩ断
片（約５０ｂｐ）２０ngとｐＧＥＬ１由来のＳｔｕＩ−
ＢｇII断片（約2.3ｋｂ）0.6μｇを全量２０μＴ４
リガーゼ緩衝液に溶かし、この混合溶液にさらに２単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え４℃１８時
間反応を行った。
このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
Escherichia coli ＫＭ４３０株をコーエンらの方法に
より形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。この形質転
換株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法に従って分離精
製し、該プラスミドＤＮＡをＳｔｕＩ等の制限酵素で切
断することによりプラスミドの構造解析を行った。その
結果、目的のプラスミドが得られたことを確認した。こ
の組換え体プラスミドをｐＬＡ１と呼ぶ。
3)ＬＴ発現プラスミドｐＬＳＡ１の造成： 前項により得られたｐＬＡ１（3.1ｋｂ）をもつ大腸菌
ＫＭ４３０株を培養し、培養菌体から常法によりｐＬＡ
１ＤＮＡを調製した。得られたｐＬＡ１ＤＮＡ ３μｇ
をＹ−１００緩衝液３０μに溶かし、ＳｔｕＩとＢｇ
IIそれぞれ３単位ずつを加え３７℃で３時間切断反応
を行った。この反応液からＬＧＴ法によりヒトＬＴ遺伝
子の大部分を含む約７９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳｔｕＩ
−ＢｇII断片）約0.5μｇを得た。
別に、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰ１０ ３μｇをＹ−100緩衝液３０μ
に溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素ＰｓｔＩをそ
れぞれ６単位ずつを加え３７℃で３時間切断反応を行っ
た。この反応液からＬＧＴ法によりトリプトファンプロ
モーター（Ｐｔｒｐ）を含む約1.1ｋｂのＤＮＡ断片
（ＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片）約0.6μｇを得た。また、
ｐＧＥＬ１（3.4ｋｂ）２μｇをＹ−１００緩衝液２０
μに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩおよ
びＰｓｔＩそれぞれ４単位ずつを加え３７℃で３時間切
断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりリポプ
ロテイン由来ターミネーターを含む約1.7ｋｂのＤＮＡ
断片（ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）約0.7μｇを得た。
一方、成熟ヒトＬＴポリペプチドのＮ末端であるＬｅｕ
（ＣＴＡ）から、５番目のアミノ酸であるＧｌｙ（ＧＧ
Ｃ）の２番目の塩基（ＧＧ）までと、発現に必要な開始
コドン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰｔ
ｒｐの下流のＳＤ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂ
ｐの間の適当な長さにする必要があることなどの理由か
ら、下記のＤＮＡリンカーを合成した。
まず、一本鎖ＤＮＡ、27-merと25-merを通常のトリエス
テル法により合成した。27-merおよび25-merの各々２０
ピコモルを全量４０μのＴ４キナーゼ緩衝液に溶か
し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）６単
位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。
次に上記で得たｐＬＡ１由来のＳｔｕＩ−ＢｇII断片
（約７９０ｂｐ）0.3μｇと発現ベクターｐＫＹＰ１０
のＢａｎIII−ＰｓｔＩ断片（約1.1ｋｂ）0.4μｇおよ
びｐＧＥＬ１由来のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約1.7
ｋｂ）0.6μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２５μに溶か
し、この混合液に上記ＤＮＡリンカーを約１ピコモル加
えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ６単位
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。
組換え体プラスミドを含む反応混合物を用いて大腸菌Ｋ
Ｍ４３０株を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回収し
た。得られたプラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ，
ＢａｎIII，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄIII，ＢｇIIで切断
後、アガロースゲル電気泳動により確認した。このプラ
スミドをｐＬＳＡ１とよぶ。ｐＬＳＡ１のＢａｎIII，
ＨｉｎｄIII付近の塩基配列は下記のとおりであること
をマキサム・ギルバートの方法〔エイ・エム・マキサム
（A.M.Maxam）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA７４，560(1977)〕で確認した。
参考例４． ＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０の造成： 第１３図に示した手順に従い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コ
ドンの間の距離が１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後
にＳａｃＩサイトを有するＡＴＧベクターｐＴｒＳ２０
を造成した。
まず、特開昭５８−１１０６００号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰ１０ ３μｇをＹ−１００緩衝液３０μ
に溶かし、制限酵素ＢａｎIIIと制限酵素ＮｒｕＩ
（ニューイングランド・バイオラブズ社製）をそれぞれ
６単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行った。こ
の反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約3.8ｋｂ
のＤＮＡ断片（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）約0.5μｇを
得た。
一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するた
めに下記のＤＮＡリンカーをトリエステル法により合成
した。
19-merと17-merの合成ＤＮＡ（各々１０ピコモルずつ）
を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（pH7.5），１０ｍＭ
ＭｇＣ2，５ｍＭジチオスレイトール，0.1ｍＭ ＥＤ
ＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量２０μの溶液に
溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３単位（宝酒造
社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行っ
た。
次に上記で得たｐＫＹ１０由来のＢａｎIII−ＮｒｕＩ
断片（約3.8ｋｂ）0.1μｇと上記のＤＮＡリンカー約0.
5ピコモルをＴ４リガーゼ緩衝液２０μに溶かし、さ
らにＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株〔ボリバー（Boliver）ら：ジーン（Gene）
２，75(1977)〕を形質転換し、Ａｐrのコロニーを得
た。このコロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを回
収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｎIII、HindIII，ＳａｃＩ，ＮｒｕＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動により確認した。このプラ
スミドをpTrS20と名付けた（第１３図）。ｐＴｒＳ２０
のＢａｎIII，ＨｉｎｄIIIサイト付近の塩基配列は下記
のとおりであることをＭ13ファージを用いたディデオキ
シ・シークエンス法を用い確認した。
発明の効果 本発明によればＣＳＦ活性の高いポリペプチドを大量に
安価に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＣｆＴＡ１の造成工程を示す。 第２図はプラスミドｐＣｆＴＢ２０の造成工程を示す。 第３図はプラスミドｐＣｆＴＬ２３，３８，３５，４１
の造成工程を示す。 第４図はプラスミドｐＣｆＴＭ１４，１７，１１３の造
成工程を示す。 第５図はプラスミドｐＣｆＷＤ１の造成工程を示す。 第６図はプラスミドｐＣｆＴ９５Ｋ１９，ｐＣｆＡＡ１
およびｐＣｆＡＢ５の造成工程を示す。 第７図はプラスミドｐＣｆＢＡ８，ｐＣｆＢＢ１０１，
ｐＣｆＢＣ５２，５９，４２Ｂ１，４５，７６，７７，
９３，９５，９７およびｐＣｆＢＤ２８，５６，８２の
造成工程を示す。 第８図はプラスミドｐＣｆＣＢ１０１，ｐＣｆＣＣ５
２，５９，ｐＣｆＣＤ２８，５６の造成工程を示す。 第９図(1)および(2)は、オカヤマ・バーグ法によるｃＤ
ＮＡ合成と該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過
程の概略を示す。 第１０図はプラスミドｐＬＡ１の造成工程を示す。 第１１図はプラスミドｐＬＳＡ１の造成工程を示す。 第１２図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ５０１の造成工程を
示す。 第１３図はプラスミドｐＴｒＳ２０の造成工程を示す。 第１４図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ７およびｐＣｆＴＡ
Ａｒｇ４Ｓの造成工程を示す。 第１５図はプラスミドｐＣｆＴＮ２０５およびｐＣｆＴ
ＡＡｒｇ４の造成工程を示す。 第１６図はプラスミドｐＣｆＴＮＳ３０１およびｐＣｆ
ＴＮＳ４０１の造成工程を示す。 第１７図(1)および(2)はプラスミドｐＣｆＢＤ２８Ａ１
７，ｐＣｆＢＤ２８Ｔ１７の造成工程を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 森本 真 静岡県駿東郡長泉町下土狩203―５ (72)発明者 伊藤 菁莪 神奈川県相模原市相原字八幡西218―14 (72)発明者 山崎 基生 東京都町田市旭町３―６―６ (72)発明者 横尾 義春 神奈川県相模原市横山３―４―17 (72)発明者 山口 和夫 神奈川県相模原市磯部2121―８ (56)参考文献 特開 昭63−229（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500636（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト顆粒球コロニー刺激因子ポリペプチド
    のアミノ酸配列の内、第１番目のアミノ酸残基がアラニ
    ン（Ala）に、第３番目のアミノ酸残基がスレオニン（T
    hr）に、第４番目のアミノ酸残基がチロシン（Tyr）
    に、第５番目のアミノ酸残基がアルギニン（Arg）に、
    および第17番目のアミノ酸残基がセリン（Ser）にすべ
    て置換されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】ヒト顆粒球コロニー刺激因子ポリペプチド
    のアミノ酸配列の内、第１番目のアミノ酸残基がアラニ
    ン（Ala）に、第３番目のアミノ酸残基がスレオニン（T
    hr）に、第４番目のアミノ酸残基がチロシン（Tyr）
    に、第５番目のアミノ酸残基がアルギニン（Arg）に、
    および第17番目のアミノ酸残基がセリン（Ser）にすべ
    て置換されたポリペプチドをコードするＤＮＡがプラス
    ミドＤＮＡに組み込まれた組み換え体プラスミドを含む
    細菌を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成
    蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取すること
    を特徴とするポリペプチドの製造法。
  3. 【請求項３】該細菌がEschrichia coli ECfBD28(FERM B
    P-1479）である特許請求の範囲第２項記載の製造法。
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