JP4542705B2 - オーストラリア・ブラウン・スネーク,プソイドナジャ・テキスティリス・テキスティリスからのプラスミンインヒビター - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、抗線維素溶解剤、特に、反跳性血栓形成を引き起こす傾向が低い、新規プラスミンインヒビターに関する。本発明は、新規プラスミンインヒビターをコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列ならびにこれらのインヒビターおよびそれを含有する薬学的組成物を製造する方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
大手術関連の失血は、以前は、新鮮な凍結血漿、新鮮な全血および血小板濃縮物を含んでもよい、代償療法で補われてきた。近年、様々な血液伝播性ウイルス感染(B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスHIV)が認識され、手術中の失血を減少させる必要性が重要な優先事項となっている。さらに、現在では、信頼できる分析法がない、狂牛病(BSE)およびクロイツフェルト−ヤコブ病(CJD)関連作用物による感染性に関する不安が、National Blood Trasfusion Service内で発生している。
【0003】
プラスミノーゲン−プラスミン経路経由の非束縛線維素溶解活性は、出血の一助となり、アプロチニン等のプラスミンインヒビターは失血の軽減に役立つことが証明されている(Royston, 1990, Blood Coagul. Fibrinol. 1:53−69; Orchard et al, 1993, Br. J. Haemat. 85:596−599)。このことから、線維素血餅および凝固系成分のプラスミン媒介性消化は、この出血状態に貢献するものとして一番重要であろうことが示唆される(Orchard et al, 1993、前掲)。
【0004】
現在、心肺バイパス(CPB)術中のアプロチニン使用は普通である(Royston, 1990、前掲;Orchard et al, 1993、前掲)。特に、Orchard et al.(1993、前掲)は、ウシ由来のインヒビター・アプロチニン(医薬Trasylol(登録商標)中の有効物質として)が、プラスミン活性を中和することによりCPB患者における失血を減少させ、血小板活性に影響を及ぼさないことを証明した。この後者の発見は、他の研究者によって確認された(Ray and March, 1997, Thromb. Haemost. 78: 1021−1026)。
【0005】
アプロチニンは、十分に研究されたセリンプロテアーゼインヒビター、すなわち「セルピン」である。アプロチニンは、アミノ酸58個を含み、トリプシン、α−キモトリプシン、プラスミンならびに組織カリクレインおよび血漿カリクレインを阻害するように作用する(Fritz and Wunderer, 1983, Drug Res. 33:479−494; Gebhard et al, 1986 In “Proteinase Inhibitors”, Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publications BV pp 374−387)。アプロチニンは、トロンビンおよびプラスミノゲン活性化因子(tPAおよびuPA)とも反応することが確認されている(Willmott et al, 1995, Fibrinolysis 9:1−8)。
【0006】
アミノ酸配列の15位にリシンの代わりに他のアミノ酸を含む半合成的に生成されたアプロチニンの同族化合物は、アプロチニンのものとは独特の差がある作用プロフィールおよび作用特異性を有することが、最近の研究で証明された(米国特許第4,595,674号;Wenzel et al, 1985, In “Chemistry of Peptides and Proteins” Vol.3)。これらの半合成的アプロチニン同族化合物の幾つかは、たとえば、膵臓および白血球由来のエラスターゼに対する強い阻害作用を有する。15位にアルギニン、17位にアラニン、42位にセリンを含む他のアプロチニン同族化合物は、血漿カリクレインに対して、アプロチニンより明らかに大きい阻害作用を示すという特徴がある(WO 89/10374号参照)。
【0007】
アプロチニンと同じタイプのヒトプロテアーゼインヒビターが開示されている米国特許第5,576,294号(Norris et al)を参照することも可能である。特に、好中球エラスターゼ、カテプシンGおよび/またはプロテイナーゼ3を優先的に阻害するヒトクニッツ(Kunitz)型プロテアーゼインヒビターの変異型が開示されている。アプロチニンと比較して、これらの変異型は本質的に負の電荷を有し、患者に大量投与されたとき、腎障害のリスクが少ないと考えられる。対照的に、アプロチニンは、比較的高用量で投与されたとき、腎毒作用を有する(Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteinase; Glaser et al, In “Verhandlungen der Deutchen Gesellschaft Fuer Innere Medizin, 78. Kongress”, Bergmann, Muenchen, 1972, pp 1612−1614)。この腎毒性は、アプロチニンが本質的に正に強く帯電している(そのため、負に帯電した腎細管の表面に結合する)結果であると考えられる。
【0008】
アプロチニンを抗線維素溶解的に臨床使用すると血管手術中の失血が減少することは確かであるが、移植片閉塞および周手術心筋梗塞に現れる「反跳性血栓形成」の発生率が上昇するという証拠がある(Van der Meer et al, 1996, Thromb. Haemost, 75:1−3; Cosgrove et al, 1992, Annals Thorac. Surg. 54: 1031-1038; Samama et al, 1994, Thromb. Haemost. 71:663-669)。これらの知見と一致して、アプロチニンが、幾らか広い特異性およびプラスミンに対する緩徐な強束縛動的作用を有することが証明されている(Willmott et al, 1995、前掲)。したがって、反跳性血栓形成の高い発生率は、アプロチニンのプラスミンへの束縛結合および同時に生じる線維素溶解系の不可逆的中和の結果であろう。
【0009】
従来技術で説明した、アプロチニンと比較して反跳性血栓形成を引き起こす傾向が低い有効な抗線維素融解剤は最近までなかった。しかし、最近の研究で、Willmottら(1995、前掲)は、オーストラリアのコブラモドキPseudonaja textilis textilisの毒液から、反跳性血栓形成に関して有望な動的プロフィールを備えたプラスミンインヒビターを単離して特性決定した。この単離されたプラスミンインヒビター調製物(Textilinin(Txln)と呼ばれる)は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)およびクマシーブルー染色で評価したとき、単一の約7kDaのタンパク質からなることが判った。アプロチニンにより阻害される多くのセリンプロテアーゼ酵素と対照的に、Txlnは、プラスミンおよびトリプシンを阻害するにすぎなかった。一段階競合的可逆的機構に従うことも明らかにされている。対照的に、アプロチニンは、二段階可逆的機構に従う。酵素とバージンインヒビターが反応して最初に遊離した非共有結合型錯体を生成し、続いて、酵素およびインヒビターがほとんど未変化のままである、しっかり結合した安定な錯体を生成する(Laskowski and Kato, 1980, Annu. Rev. Biochem. 49:593−626; Travis and Salvesen, 1983, Annu. Rev. Biochem. 52; 655−709; Longstaff and Gaffney, 1991, Biochemistry 30: 979−986)。さらに、Txlnは、アプロチニン(解離速度定数、K2=1.64×10-5/秒/M、解離定数、Ki=5.3×10-11M、この後者の値は、先に報告された値Ki=2×10-10M(Longstaff and Gaffney, 1992, Fibrinolysis 3: 89−87))より速くプラスミンを結合し(解離速度定数、K1=3.85×10-5秒-1M-1)、親和性が低いKi(解離定数、Ki=1.4×10-8M)を有する。したがって、周手術出血および術後出血を管理する際に、Txln動的プロフィールは、アプロチニンよりも、反跳性血栓形成に関して臨床的に魅力的であることが示唆される。
【0010】
(発明の要約)
本願発明は、最初は本質的に同質であると考えられていたウィルモット(Willmott)ら(1995,上記)のプラスミンインヒビター調製物中の2つの異なったプラスミンインヒビターの予期せぬ発見から生じたものである。驚くべきことに、テキスティリニン1(Textilinin 1,Txln 1)及びテキスティリニン2(Textilinin 2,Txln 2)と称するこれらのプラスミンインヒビターは、SDS−PAGEによる評価によって約7kDaの分子量で共に移動し、ウィルモットらに用いられた、親となるプラスミンインヒビター調製物において(重量で)総タンパク質の約50%だけしか構成していない。これは、Txln 1及びTxln 2が各々、親となる調製物と比べて異なった速度論的プロファイルを有するという事実と合せて、親となる調製物がプラスミン阻害を妨げる可能性がある他の化合物を含有していることを示唆する。特に、Txln 1及びTxln 2が別個のアミノ酸配列、多少類似する速度論的プロファイル(Txln 1,k1=3.09×10-6秒-1M-1;Ki=3.5×10-9M及びTxln 2,k1=8.20×10-6秒-1M-1;Ki=2.0×10-9M)を有する一方、両方ともネズミモデルでの血液損失を阻害する。親となる対応物と同様に、Txln 1及びTxln 2はプラスミン及びトリプシンとのみ反応し、そのため、アプロチニンと比べて高い酵素特異性を有するものである。さらに、Txln 1,Txln 2及びアプロチニンのプラスミンに対する個々の速度論的プロファイルの比較によって、Txln 1及びTxln 2が、プラスミンを阻害することにおいてアプロチニンより10倍から100倍効果が小さいことが明らかである。これはまた、Txln 1及びTxln 2がアプロチニンより10倍から100倍速くプラスミンから解離することを見出すものである。それらのプラスミンに対する高い特異性、及び、低い阻害効果によって、アプロチニンに比べて、血液の流動性を制御する線維素分解系の酵素とインヒビターの微妙なバランスに一時的に影響を与えるという治療的な利点を有する可能性をもつ。
【0011】
本願発明者はまた、驚くべきことに、オーストラリア・ブラウン・スネーク(Australian brown snake)がTxln 1及びTxln 2をコードする転写物を発現するばかりでなく、テキスティリニン(Textilinin)3,4,5及び6(即ち、Txln 3,Txln 4,Txln 5及びTxln 6)と称する、さらに4つのプラスミンインヒビターをコードする転写物も発現することを見出した。これら後者の転写物は、Txln 1及びTxln 2をコードするものに比べて著しく低いレベルで発現されているようであるが、ヌクレオチドレベル及び推定されたアミノ酸レベルの両方において、Txln 1及びTxln 2に高い相同性を示す。
【0012】
即ち、本願発明の1つの面は、プラスミンの一段階の競合的インヒビターであることを特徴とするプラスミンインヒビターの本質的に純粋な調製物を提供することにある。
【0013】
好ましくは、当該一段階の競合的インヒビターが、プラスミンに対して1×10-8M-1から1×10-10M-1の範囲、より好ましくは5×10-8M-1から8×10-9M-1の範囲、最も好ましくは1×10-9M-1から5×10-9M-1の範囲の解離定数を有する。
【0014】
当該一段階の競合的インヒビターが、プラスミンに対して4×10-5秒-1M-1から5×10-7秒-1M-1の範囲、より好ましくは1×10-6秒-1M-1から1×10-7秒-1M-1の範囲、最も好ましくは2×10-6秒-1M-1から9×10-6秒-1M-1の範囲の解離速度定数を有していてもよい。
【0015】
適したものとしては、当該一段階の競合的インヒビターはポリペプチドからなる。好ましくは、ポリペプチドは以下のものからなる群から選ばれる。
(g)配列番号2,4,6,8,10及び12のいずれか1つの生物学的に活性なフラグメント;並びに
(h)いずれかの前記ポリペプチドの変異体または誘導体、もしくはそのフラグメント。
【0016】
好ましくは、当該変異体が一般式:KDZPZY”CZLBBZBGXCZXXXBXFA”YXBZZZZCBZFBYGGCXBNANNFXTXEECESTCAA(I)を有するものであって、
Xはいずれかのアミノ酸であり;
Y”は疎水性アミノ酸であり;
A”は芳香族アミノ酸またはヒスチジンであり;
ZはK,R,H,D,E,QまたはNであり;及び
Bは中性アミノ酸、もしくはP,A,G,S,T,VまたはLである。
好ましくは、3番目のZがHまたはRである。
適したものとしては、5番目のZがK,N,EまたはDである。
好ましくは、6番目のY”がFまたはLである。
8番目のZはEまたはKでもよい。
適したものとしては、10番目のBがPまたはLである。
好ましくは、11番目のBがPまたはAである。
12番目のZはEまたはDが好ましい。
適したものとしては、13番目のBがTまたはIである。
15番目のXはP,SまたはRでもよい。
17番目のZはK,N,E,DまたはRが適している。
好ましくは、18番目のXがD,G,AまたはVである。
適したものとして、19番目のXがF,N,KまたはRである。
20番目のXはT,P,FまたはIが好ましい。
21番目のBはG,VまたはPでもよい。
適したものとしては、22番目のXがA,SまたはRである。
好ましくは、24番目のA”がYまたはHである。
26番目のXはSまたはNが適している。
27番目のBはP,AまたはTが好ましい。
28番目のZはDまたはRでもよい。
適したものとしては、29番目のZがE,D,HまたはQである。
好ましくは、30番目のZがH,K,RまたはQである。
31番目のZはK,QまたはEでもよい。
33番目のBはLまたはIが好ましい。
34番目のZはEまたはKが適している。
適したものとして、36番目のBがLまたはIである。
好ましくは、41番目のXがE,GまたはKである。
42番目のBはCでもよいが、Gが好ましい。
適したものとしては、48番目のXがK,NまたはIである。
好ましくは、50番目のXがK,QまたはIである。
【0017】
ポリペプチドはリーダーペプチドを含んでいてもよい。適したものとしては、リーダーペプチドがアミノ酸配列:Met-Ser-Ser-Gly-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Gly-Leu-Leu-Thr-Leu-Trp-Glu-Val-Leu-Thr-Pro-Val-Ser-Ser[配列番号14]、またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはこれらの変異体または誘導体を含む。
【0018】
リーダーペプチドを含む例示的なポリペプチドは以下のものからなる群から選択されてもよい。
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
他の面として、本願発明は、第1に述べた面による、ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、もしくは当該フラグメントまたはポリペプチドの変異体または誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。適したものとしては、当該ポリヌクレオチドが以下のものからなる。
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
(7)ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号2,4,6,8,10及び12のいずれか1つの生物学的に活性なフラグメントをコードする、配列番号1,3,5,7,9及び11のいずれか1つのポリヌクレオチドフラグメント;並びに
【0032】
(8)前記配列のいずれかのポリヌクレオチド相同体。
【0033】
ポリヌクレオチドは、好ましくはリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。適したものとしては、ヌクレオチド配列:
またはその生物学的に活性なフラグメント、もしくはこれらのヌクレオチド相同体を含む。
【0034】
当該ヌクレオチド配列からなる例示的なポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択されてもよい。
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
もう1つの面として、本願発明は患者における血液損失を軽減するための医薬的組成物を提供し、当該組成物はポリペプチドまたはその生物学的フラグメント、またはこれらの変異体または誘導体(「治療剤」)及び医薬的に許容できる担体を含む。
【0043】
本願発明のもう一つの面によって、治療に有効な量の本願発明の治療剤を、医薬的に許容される担体と組合せて、治療が必要な患者に投与する段階からなる、血液損失を軽減する方法が提供される。
【0044】
さらにまた別の面において、本願発明は抗フィブリン抗体にコンジュゲートされた本願発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体または誘導体からなる抗腫瘍剤を併せ持つものである。
【0045】
(詳細な説明)
1.定義
特に記載がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において普通に熟練した人により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似したもしくは等価の方法および物質を本発明の実行または試験に使用してもよいが、好ましい方法および材料をについて説明する。本発明の場合、下記の用語を以下の通りに定義する。
【0046】
「生物学的に活性なフラグメント」は、フラグメントが親ポリペプチド活性を保持する実質的に全長の親ポリペプチドのフラグメントを意味する。たとえば、配列識別番号2、4、6、8、10および12によるポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントの場合、このポリペプチドフラグメントは、プラスミンに関して、親ポリペプチドの一段階競合阻害特性を保持しなければならない。
【0047】
本明細書で使用する用語「生物学的試料」は、未処理であってもよく、処理済みであってもよく、希釈もしくは濃縮されていてもよい、患者からの試料を指す。胎児細胞、および脳の尾状核および/または被殻領域由来の組織等を含む組織試料から生物学的試料を選択することが適当である。
【0048】
「対応する」は、(a)参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と実質的に同じであるか相補的であるヌクレオチドを有するか、またはペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド、あるいは(b)参照ペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドを意味する。
【0049】
「誘導体」は、たとえば、他の化学部分との共役または錯形成によって、あるいは当技術分野で理解されるであろう翻訳後修飾技術による修飾によって、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。用語「誘導体」は、機能的等価分子を提供する付加、または欠失を含む、親配列に対して行われた変更も、その範囲内に含む。
【0050】
「相同性」は、同じであるか、下表1に示す保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。GAP等の配列比較プログラムを使用して、相同性を決定することができる(Deveraux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12, 387−395)(参照により本明細書に援用する)。この方式で、アラインメントに空隙を挿入することにより(このような空隙は、たとえば、GAPに使用されている比較アルゴリズムによって決定される)、本明細書に列挙したものと類似した配列または実質的に異なる長さの配列を比較することが可能である。
【0051】
本明細書では、「ハイブリダイゼーション」は、DNA−DNAハイブリッドまたはDNA−RNAハイブリッドを生成するための、相補的ヌクレオチド配列の対合を示すために使用される。相補的塩基配列は、塩基対合規則と関連のある配列である。DNAでは、AはTと対合し、CはGと対合する。RNAでは、UはAと対合し、CはGと対合する。この点に関して、本明細書で使用する用語「適合する」および「適合しない」は、相補的核酸鎖における対合ヌクレオチドのハイブリダイゼーション潜在能力を指す。適合したヌクレオチドは、上述の古典的A−T塩基対およびG−C塩基対のように、効率よくハイブリダイズする。適合しない組み合わせは、効率よくハイブリダイズしない、ヌクレオチドの他の組み合わせである。
【0052】
「単離物」は、その天然の状態で、通常は随伴する成分を実質的にもしくは本質的に含まない物質を意味する。たとえば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、天然の状態でそれを挟む配列から除かれているポリヌクレオチド、たとえば、通常はフラグメントに隣接している配列から除去されたDNAフラグメントを指す。
【0053】
「から得られる」は、たとえば、核酸抽出物等の試料が、宿主の特定のソースから単離される、または誘導されることを意味する。たとえば、宿主から直接単離された組織から核酸抽出物を得ることが可能である。
【0054】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により連結された様々なヌクレオチド単位(デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはその関連した構造的変異型または合成類縁体)を含むポリマー(あるいはその関連した構造的変異型または合成類縁体)を指す。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」は、一般に、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が天然であるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語は、ペプチド核酸(PNA)、ホスホルアミデート類、ホスホロチオアート類、メチルホスホネート類、2−O−メチルリボ核酸等々を含むがその限りではない様々な類縁体を、その範囲内に含むことが理解されるであろう。分子の正確なサイズは、個々のアプリケーションによって様々であってもよい。オリゴヌクレオチドは、一般に、かなり短く、一般に、約10〜30ヌクレオチドであるものの、この用語は、任意の長さの分子を指すことができるが、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一般に、高分子オリゴヌクレオチドに使用される。
【0055】
「操作可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の転写が開始でき且つ終結できる方式で、転写および翻訳の調節核酸が、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドに関連して配置されることを意味する。
【0056】
用語「患者」は、ヒトまたは他の動物起源の患者を指し、本発明の方法を使用して検査もしくは治療することが望ましい個体を含む。しかし、「患者」は、症状が存在することを含意しないことが理解されるであろう。
【0057】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、mRNA、RNA、cRNA、cDNAまたはDNAを示す。この用語は、一般に、30ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドを指す。
【0058】
「薬学的に許容される担体」は、全身投与において安全に使用することが可能な、固体または液体の充填剤、希釈剤または封入材料を意味する。
【0059】
用語「ポリヌクレオチド相同体」は、一般に、実質的にストリンジェントな条件下で、参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【0060】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異型および合成類縁体を指すために、本明細書では互換的に使用される。したがって、これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、たとえば、対応する天然のアミノ酸の化学的類縁体、ならびに天然のアミノ酸ポリマー等に使用される。
【0061】
「プライマー」は、DNA鎖と対合するとき、適当な重合剤の存在下で、プライマー伸長生成物の合成を開始することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅効率を最高にするために、1本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。プライマーは、重合剤の存在下で、伸長生成物の合成をプライムできるほど十分に長くなければならない。プライマーの長さは、用途、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、およびプライマーのソースを含む、多くの因子によって異なる。たとえば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に15〜35またはそれより多いヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーは、たとえば約200ヌクレオチドから数千塩基対以上までの、高分子ポリヌクレオチドであってもよい。ハイブリダイズして合成開始部位の役割を果たすように設計されている鋳型で、配列に「実質的に相補的」であるようにプライマーを選択することができる。「実質的に相補的な」は、プライマーが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズできるほど、十分に相補的であることを意味する。プライマーは、ハイブリダイズするように設計された対象である鋳型と不適合な組み合せを含まないことが好ましいが、このことは必要不可欠ではない。たとえば、非相補的ヌクレオチドを、プライマーの5’末端につけることが可能であり、プライマー配列の残りは鋳型に相補的である。あるいは、プライマー配列が、ハイブリダイズできるほど鋳型の配列と十分な相補性を有し、その結果、プライマーの伸長生成物を合成するための鋳型を形成する限り、非相補的ヌクレオチドまたは非相補的ヌクレオチドの伸長部をプライマー内に散在させることができる。
【0062】
「プローブ」は、別の分子の特定の配列もしくは亜配列または他の部分に結合する分子を指す。特に記載がない限り、用語「プローブ」は、一般に、相補的塩基対合により別の核酸(しばしば「標的核酸」と呼ばれる)に結合するオリゴヌクレオチドプローブを指す。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブは、プローブとの完全な配列相補性を欠く標的細胞を結合することが可能である。プローブを、直接もしくは間接に標識することができる。
【0063】
本明細書で使用される用語「組換えポリヌクレオチド」は、核酸を、通常は自然界にない形に操作することによって、in vitroで生成されるポリヌクレオチドを指す。たとえば、組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターの形であってもよい。一般に、このような発現ベクターは、ヌクレオチド配列に操作可能に連結された転写および翻訳の調節核酸を含む。
【0064】
「組換えポリペプチド」は、組換え技術を使用して(すなわち、組換えポリヌクレオチドの発現により)、製作されるポリペプチドを意味する。
【0065】
2つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」などが挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも12モノマー単位の長さであるが、多くの場合、15〜18モノマー単位、しばしば少なくとも25モノマー単位の長さである。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似している配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、および(2)2つのポリヌクレオチド間、で異なる配列を含んでもよいため、2つ(以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、一般に、局所領域配列類似性を同定し、比較するための、「比較ウインドウ」に関して、2つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施される。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較される、一般に、12連続した残基の概念上のセグメントを指す。2つの配列の最適アラインメントでは、比較ウィンドウは、参照配列(付加もしくは欠失を含まない)と比較して、約20%以下の付加もしくは欠失(すなわち、空隙)を含んでもよい。比較ウインドウを整列化するための最適アラインメントは、コンピュータ化されたアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI, USAのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)の実行、または精査および選択された様々な方法のいずれかによって作成された最もすぐれたアラインメント(すなわち、結果として、比較ウィンドウに関して、最高のパーセンテージ相同性が得られる)によって実行される。
【0066】
「配列同一性」は、比較ウィンドウに関して、同じ(すなわち、個々のヌクレオチドベースもしくは個々のアミノ酸ベースで)配列を指す。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、2つの最適に整列した配列を比較し、適合した位置の数を出すために、同じ核酸塩基(たとえば、A、T、C、G、I)が両配列に現れる位置の数を決定し、適合した位置の数を比較ウインドウにおける位置総数(すなわち、ウインドウサイズ)で割り、配列類似性のパーセンテージを出すために、その結果に100を掛けることにより算出される。
【0067】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、ならびにある特定の有機溶媒の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、固定化ヌクレオチド配列と標識ポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度が高くなる。
【0068】
「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイズする温度およびイオン条件を指す。必要なストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存的であり、ハイブリダイゼーション中に存在する様々な成分にも左右される。一般に、明示されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列について、熱的融解温度(Tm)より約10〜20℃低くなるような、ストリンジェントな条件が選択される。Tmは、(明示されたイオン強度およびpHで)標的配列の50%が相補的プローブにハイブリダイズする温度である。
【0069】
本明細書で使用される用語「実質的に純粋」は、生来随伴する成分から分離された化合物、たとえば、ペプチドを表す。試料中の全物質の少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも75%、さらに好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも99%(容量基準、重量もしくは乾燥重量基準、またはモルパーセントもしくはモル分率で)が、関心のある化合物であるとき、一般に、化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適当な方法、たとえば、ペプチドの場合、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動法またはHPLC分析によっ測定することができる。生来関連した成分を本質的に含まないとき、その天然の状態で随伴する固有の汚染物質から分離されているとき、化合物、たとえばペプチドは、実質的に純粋である。
【0070】
用語「変異型」は、1つまたは複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置き換えられているポリペプチドを指す。ポリペプチドの活性の性質を変えずに、幾つかのアミノ酸を、概ね類似した特性を有する他のアミノ酸に変更できること(保存的置換)は、当技術分野で周知である。
【0071】
「ベクター」は、合成核酸配列を挿入またはクローニングすることが可能な核酸分子、好ましくは、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスから誘導されるDNA分子を意味する。ベクターは、1つまたは複数の制限部位を含み、標的細胞、標的組織、前駆細胞またはその組織を含む明示された宿主細胞で自律複製できる可能性があるか、クローニングされた配列が複製できるように、明示された宿主のゲノムと結合する可能性があることが好ましい。したがって、「発現ベクター」は、タンパク質の合成を指示することができる自律エレメントを意味する。このような発現ベクターは、当業者に周知である。このベクターは、適当な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子等の、選択マーカーも含んでもよい。このような耐性遺伝子の例は、当業者に周知である。
【0072】
本明細書で使用される、下線またはイタリック体を使用しない遺伝子の名称で示されるタンパク質生成物と違って、下線またはイタリック体を使用した遺伝子の名称は、遺伝子を示す。たとえば、「Txln 1」は、Txln遺伝子を意味し、「Txln 1」は、「Txln 1」遺伝子のタンパク質生成物を示す。
【0073】
本明細書を通して、「含む(“comprise”,“comprises”,“comprising”」は、明示した整数または整数群を包含するが、他の整数または整数群を排除しないとを意味すると理解される。
【0074】
2.本発明のプラスミンインヒビター
本発明は、プラスミンの一段階競合インヒビターであることを特徴とする、プラスミンインヒビターの実質的に純粋な調製物を提供する。好ましい実施形態において、この一段階競合インヒビターは、プラスミンに関する解離定数を有する。1×10-8M-1〜1×10-10M-1の範囲内、さらに好ましくは5×10-8M-1〜8×10-9M-1、最も好ましくは1×10-8M-1〜5×10-8M-1の範囲内の、プラスミンに関する解離定数を有する。一段階競合インヒビターは、好ましくは、4×10-5秒-1M-1〜5×10-7秒-1M-1、さらに好ましくは1×10-6秒-1M-1〜1×10-7秒-1M-1、最も好ましくは2×10-6秒-1M-1〜9×10-6秒-1M-1の範囲内の、プラスミンに関する解離速度定数を有する。
【0075】
2.1 テキスティリニン(Textilinin)ポリペプチド
プラスミンインヒビターは、テキスティリニンポリペプチドであることが好ましい。したがって、本発明は、配列識別番号2、4、6、8、10および12による単離されたポリペプチド、あるいは、それぞれ、その生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を提供する。配列識別番号2および配列識別番号4は、さらに十分に後述する通り、それぞれ、Pseudonaja textilis textilisから得られる、新規な約7kDaのテキスティリニン1(Txln 1)およびテキスティリニン2(Txln 2)ポリペプチドに相当する。配列識別番号6、8、10および12は、Pseudonaja textilis textilisから推定される相同のポリペプチドに相当する。
【0076】
1つの実施形態では、単離されたポリペプチドは、配列識別番号14による、リーダーペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体をを含んでもよい。これに関して、本発明は、配列識別番号16、18、20、22、24および26による、単離されたポリペプチドも提供する。
【0077】
2.2 テキスティリニンポリペプチドフラグメント
本発明では、本発明によるテキスティリニンポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを考える。この種の代表的なフラグメントとしては、配列識別番号2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24および26によるポリペプチドの、欠失突然変異体ならびに、たとえば、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、さらに好ましくは少なくとも30連続したアミノ酸の低分子ポリペプチドが挙げられる。
【0078】
2.3 テキスティリニンポリペプチド変異体
本発明の変異型ポリペプチドに関して、このような変異型は、親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドの、プラスミンの一段階競合阻害を保持すべきであることが理解されるであろう。表1に従って、親ポリペプチドにおける代表的な保存的置換を行うことが可能である。
【0079】
【表1】
【0080】
表1に示したものより保存性が低い置換を選択することにより、機能の実質的な変化がもたらされる。他の置き換えは、非保存的置換となり、これらの比較的小数が許容される。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化をもたらす可能性がある置換は、次のものである:(a)親水性残基(たとえば、SerまたはThr)を疎水性残基(たとえば、Ala、Leu、Ile、PheまたはVal)と取り換える、(b)システインまたはプロリンを任意の他の残基と取り換える、(c)陽電性側鎖を有する残基(たとえば、Arg、HisまたはLys)を陰電性残基(たとえば、GluまたはAsp)と取り換える、あるいは(d)嵩高い側鎖を有する残基(たとえば、PheまたはTrp)を小さい側鎖を有する残基(たとえば、Ala、Ser)または側鎖を持たない残基(たとえば、Gly)と取り換える。
【0081】
一般に、変異型は、たとえば、配列識別番号2、4、6、8、10および12に表示されている基本的配列と少なくとも75%相同な、さらにふさわしくは、少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%相同な領域を含む。代替実施態様では、変異型は、同じサイズの親アミノ酸配列(「比較ウインドウ」)に関して、あるいは、当技術分野で周知のコンピューター相同性プログラムによってアラインメントが実施される整列配列と比較するとき、少なくとも70%、さらにふさわしくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する領域を含む。何が適当な変異型を構成するかは、従来技術によって決定することが可能である。たとえば、トランスポゾン突然変異誘発を使用したランダム突然変異誘発、または位置指定突然変異誘発のいずれかを使用して、たとえば、配列識別番号2、4、6、8、10および12によるポリヌクレオチドをコードする核酸に突然変異させることができる。次いで、従来技術を使用して、結果として得られたDNAフラグメントを、E. coli等の適当な発現宿主にクローニングし、所望の活性を保持するクローンを検出する。上述の通り、所望の活性は、親ポリペプチドもしくは参照ポリペプチドの、プラスミンの一段階競合阻害を含む。ランダム突然変異技術を使用してクローンが誘導された場合、突然変異を検出するために、陽性クローンを配列決定しなければならないであろう。用語「変異型」は、天然の対立遺伝子の変異型も含む。
【0082】
好ましい実施形態では、変異型は、一般式:
KDZPZY”CZLBBZBGXCZXXXBXFA”YXBZZZZCBZFBYGGCXBNANNFXTXEECESTCAA(I)
を有し、ここで、
Xは、任意のアミノ酸であり
Y”は、疎水性アミノ酸であり、
A”は、芳香族アミノ酸またはヒスチジンであり、
Zは、K、R、H、D、E、QまたはNであり、
Bは、中性アミノ酸、またはP、A、G、S、T、VまたはLである。
【0083】
2.4 テキスティリニンポリペプチド誘導体
本発明の適当な誘導体を参照すると、このような誘導体は、たとえば、配列識別番号2、4、6、8、10および12、またはその変異型等の、本発明によるテキスティリニンポリペプチドに対するアミノ酸欠失および/または付加を含み、前述の誘導体は、プラスミンの一段階競合阻害を保持する。「アミノ酸」の付加は、ポリペプチド、そのフラグメントまたはこれらの変異型と、他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を含んでもよい。これに関して、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたは変異型を高分子ポリペプチドに組み込むことができ、このような高分子ポリペプチドが、上述のプラスミンの一段階競合阻害を保持することも予期される。
【0084】
本発明のテキスティリニンポリペプチド、そのフラグメントまたはこれらの変異型を、たとえば、もとの宿主から誘導されないさらなるタンパク質と融合させることが可能である。他方のタンパク質は、一例として、タンパク質の精製に役立つ。以下に詳述する通り、この点に関して、たとえば、ポリヒスチジンタグ、またはマルトース結合性タンパク質を使用することが可能である。あるいは、他方のタンパク質は、ポリペプチドもしくはそのフラグメントに対して有効な、抗原性応答もしくは免疫原性応答をもたらす可能性がある。他の可能な融合タンパク質は、免疫調節応答をもたらすものである。このようなタンパク質の個々の例としては、プロテインAまたはグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)などが挙げられる。
【0085】
本発明で考えられる他の誘導体としては、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成中の、側鎖への修飾、非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の組み込み、ならびに架橋剤および本発明のポリペプチド、フラグメントおよび変異型に立体配置的制約を加える他の方法の使用が挙げられるが、その限りではない。
【0086】
本発明で考えられる側鎖修飾の例としては、無水酢酸を用いたアシル化等によるアミノ基の修飾、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートを用いたアミド化、シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−5−ホスフェートを用いたリシンのピリドキシル化に続くNaBH4を用いた還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続くNaBH4を用いた還元、および2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化が挙げられる。
【0087】
O−アクリルイソウレア生成によるカルボジイミド活性化に続いて、例として、対応するアミドに誘導することにより、カルボキシル基を修飾することができる。
【0088】
2,3−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサール等の試薬と複素環縮合生成物を生成することにより、アルギニン残基のグアニジン基を修飾することができる。
【0089】
システイン酸への過ギ酸酸化、4−塩化水銀フェニルスルホン酸、4−塩化安息香酸水銀、2-塩化水銀−4−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀剤を使用した水銀誘導体の生成、および他のチオール化合物との混合ジスルフィドの生成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化、およびアリカリ性pHにてシアナートを用いたカルバモイル化等の方法によって、スルフヒドリル基を修飾することができる。
【0090】
たとえば、2−ヒドロキシ−5−ニトロ臭化ベンジルもしくはハロゲン化スルホニルを用いたインドール環のアルキル化またはN−ブロモスクシンイミドを用いた酸化によって、トリプトファン残基を修飾することができる。
【0091】
テトラニトロメタンでニトロ化することによりチロシン残基を修飾し、3−ニトロチロシン誘導体を生成することができる。
【0092】
ピロ炭酸ジエチルを用いたN−カルボエトキシル化またはヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化により、ヒスチジン残基のイミダゾール環を修飾することができる。
【0093】
ペプチド合成中に非天然のアミノ酸および誘導体を組み込む例としては、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−5−フェニルペンタン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルペンタン酸、t−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2−チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD−異性体の使用などが挙げられるが、その限りではない。本発明で考えられる非天然アミノ酸のリストを表2に示す。
【0094】
【表2】
【0095】
本発明は、たとえば、本発明のペプチドもしくはペプチド相同体の3D立体配置を安定化するために、(CH2)nスペーサー基(n=1〜6)を有するニ官能価イミドエステル、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル類等のホモニ官能価架橋剤、および通常はN−ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応部分およびマレイミド等の別の基特異的反応部分またはジチオ部分またはカルボジイミドを含むヘテロニ官能価試薬を使用した、架橋剤の使用も考える。さらに、たとえば、アミノ酸のCα原子とCβ原子との間に二重結合を導入することによって、CαおよびNα−メチルアミノ酸の組み込みによって、また共有結合を導入することにより環状ペプチドまたは類縁体を生成することによって、たとえば、ペプチドまたは類縁体の、2つの側鎖間のN末端とC末端との間、または側鎖とN末端またはC末端との間にアミドを生成することによって、ペプチドを立体配置的に束縛することができる。たとえば、以下のものを参照することができる:直交保護基としてトリメチルシリル(TMSE)エステルを使用した、TFA樹脂上でのペプチド環状化について説明しているMarlowe(1993, Biorganic & Medicinal Chemistry Letters 3:437-44、参照により本明細書に援用する)、オキシム生成による水溶液中での非保護ペプチドの環状化について説明しているPallin and Tam(1995, J. Chem. Soc. Comm. 2021−2022、参照により本明細書に援用する)、リシン側鎖固定による頭尾環状ペプチドの固相合成について開示しているAlgin et al (1994, Tetrahedron Letters 35: 9633−9636、参照により本明細書に援用する)、三次元固相法による頭尾環状ペプチドの生成について説明しているKates et al(1993, Tetrahedron Letters 34; 1549−1552、参照により本明細書に援用する)、N−保護基を損なわずに固定化ペプチドの活性化が実行され、その後の除去が環状化につながる、固定化されて活性化された中間体からの環状ペプチドの合成について説明しているTumelty et al(1994, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1067−1068、参照により本明細書に援用する)、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖を用いた、不溶性支持体に付着したペプチドの頭尾環状化について説明しているMcMurray et al(1994, Peptide Research 7: 195−206、参照により本明細書に援用する)、固体支持体によりペプチドを環状化する代替法について教示しているHruby et al(1994, Reactive Polymers 22:231−241、参照により本明細書に援用する)、およびシクロテトラペプチドおよびシクロペンタペプチドを合成する方法を開示しているSchmidt and Langer(1997, J. Peptide Res. 49:67−73 、参照により本明細書に援用する)。前述の方法を使用して、プラスミンに関して一段階競合阻害反応速度論に従う立体配置的に束縛されたペプチドを生成することができる。
【0096】
本発明は、テキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントのタンパク質分解的分解に対する抵抗性を改良したり、溶解特性を最適化したり、あるいはそれらを治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたテキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントも考える。
【0097】
本発明は、さらに、テキスティリニンポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントの化学的類縁体を含み、その類縁体は、前述のポリペプチドまたはフラグメントの機能的類縁体として機能する。これに関して、化学的類縁体は必ずしも前述のポリペプチドまたはフラグメントから誘導されるとは限らないが、ある一定の立体配置的類似性を共有することが可能である。あるいは、化学的類縁体は、前述のポリペプチドまたはフラグメントの、ある一定の物理的特性によく似るように特別に設計することが可能である。化学的類縁体は、化学的に合成することも可能であり、たとえば、自然産物スクリーニングにより検出されることもある。
【0098】
当業者に周知の適当な手順でテキスティリニンポリペプチドを調製することが可能である。たとえば、このようなポリペプチドは、
(a)テキスティリニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、たとえば、配列識別番号2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24または26、またはそれぞれその生物学的に活性なフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を含み、そのヌクレオチド配列が転写および翻訳の調節核酸に操作可能に連結されている、組換えポリヌクレオチドを調製するステップと、
(b)組換えポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入するステップと、
(c)前述の組換えポリヌクレオチドから組換えポリペプチドを発現させるために宿主細胞を培養するステップと、
(d)組換えポリペプチドを単離するステプと
を含む手順によって調製することが可能である。
【0099】
前述の組換えポリヌクレオチドは、単離された天然のテキスティリニン配列を含むことが適当である。たとえば、このようなポリヌクレオチドは、配列識別番号1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、25および43のいずれか1つから選択することが可能である。
【0100】
組換えポリヌクレオチドは、プラスミド等の自己再生型染色体外ベクターか、宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい発現ベクターを含むことが好ましい。
【0101】
転写および翻訳の調節核酸は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適する。多数のタイプの適切なな発現ベクターおよび適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関する技術分野で知られている。
【0102】
一般に、転写および翻訳の調節核酸としては、プロモーター配列、リーダーもしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列、転写終止配列、翻訳開始配列、転写終止配列、エンハンサー配列または活性化因子配列んどが挙げられるがその限りではない。
【0103】
本発明では、当技術分野で周知の構成プロモーターまたは誘導プロモーターを考える。プロモーターは、天然プロモーターか、複数のプロモーターのエレメントを結合するハイブリッドプロモーターの、いずれであってもよい。
【0104】
好ましい実施形態では、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、発現ベクターは、選択可能なマカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
【0105】
発現ベクターは、本発明の組換えポリペプチドが、前述の融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現されるように、融合パートナー(一般に発現ベクターにより適用される)を含んでもよい。融合パートナーの主な利点は、上述の融合ポリペプチドの同定および/または精製を助けることである。
【0106】
前述の融合ポリペプチドを発現させるためには、融合パートナーの翻訳リーディングフレームと本発明のヌクレオチド配列が一致するように、本発明によるヌクレオチド配列を発現ベクターに連結させる必要がある。
【0107】
融合パートナーの周知の例としては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、ヒトIgGのFe部分、マルトース結合性タンパク質(MBP)およびヘキサヒスチジン(HIS6)が挙げられるが、その限りではなく、これらは、アフィニティクロマトグラフィによる融合ポリペプチドの単離に特に有用である。アフィニティクロマトグラフィによる融合ポリペプチドの精製のために、適当なアフィニティクロマトグラフィ用マトリックスは、それぞれ、グルタチオン共役樹脂、アミロース共役樹脂、およびニッケル共役樹脂またはコバルト共役樹脂である。多くのこのようなマトリックスは、(HIS6)融合パートナーと共に有用なQIAexpress(登録商標)システム(Qiagen)およびPharmacia GST精製システム等の「キット」の形で入手できる。
【0108】
当技術分野で周知の別の融合パートナーは、緑色蛍光タンパク質(GFP)である。この融合パートナーは、顕微鏡またはフローサイトメトリーによる本発明の融合ポリペプチドの同定を可能にする蛍光「タグ」の役割をする。このGFPタグは、本発明の融合ポリペプチドの亜細胞局在性を評価するとき、または本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞の単離に有用である。この後者の用途には、蛍光活性化セルソーター(FACS)等のフローサイトメトリー法が特に有用である。
【0109】
融合パートナーは、Xaまたはトロンビン等(適切なプロテアーゼに本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化させ、その結果、本発明の組換えポリペプチドをそれから放出させる)に対するプロテアーゼ切断部位も有することが好ましい。次いで、放出されたポリペプチドを、次のクロマトグラフィー分離によって、融合パートナーから単離することができる。
【0110】
本発明による融合パートナーは、通常、特定の抗体を利用できる短いペプチド配列である、「エピトープタグ」もその範囲内に含む。特定のモノクロナル抗体を容易に利用できるエピトープの周知の例としては、c−Mycタグ、インフルエンザウイルスタグ、赤血球凝集素タグおよびFLAGタグが挙げられる。
【0111】
組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するステップは、トランスフェクション、形質転換を含む適当な方法で行うことが可能であり、その選択は、使用される宿主細胞によって異なる。このような方法は、当業者に周知である。
【0112】
本発明の組換えポリペプチドは、本発明によるテキスティリニンポリペプチド、フラグメント、変異型または誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することによって生成することができる。タンパク質発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なる。これは、当業者により通常の実験で容易に確認されるであろう。
【0113】
発現に適した宿主細胞は、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。本発明によるポリペプチドの発現に好ましい1つの宿主細胞は細菌である。使用される細菌は、Escherichia coliであってもよい。あるいは、宿主細胞は、たとえば、バキュロウイルス発現システムと共に使用することが可能なSF9細胞等の、昆虫細胞であってもよい。
【0114】
当業者は、たとえば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Press, 1989)(参照により本明細書に援用する)、特にセクション16および17、Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley & Sons, Inc. 1994−1998)(参照により本明細書に援用する)、特に10章および16章、ならびにColigan et al., CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE(John Wiley & Sons, Inc. 1995−1997)(参照により本明細書に援用する)、特に1章、5章および6章に記載の標準的なプロトコールを使用して、組換えタンパク質を便利に調製することができる。
【0115】
組換えポリペプチドはリフォールディングを必要とする場合もある。ポリペプチドをリフォールディングする代表的な方法としては、たとえば、Bieri et al.(1995, Biochemistry, 34:13059−13065)およびNorris et al.(1994、Novo Nordiskに付与された米国特許第5,373,090号)(参照により本明細書に援用する)に記載のものが挙げられる。
【0116】
あるいは、たとえば、Nicholson編、Blackwell Scientific Publicatios出版の、「合成ワクチン」と題する出版物に掲載されている、「ペプチド合成」と題する9章に、Atherton and Shephardにより記載されている溶液合成または固相合成を使用して、テキスティリニンポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、またはこれらの変異型もしくは誘導体を合成することが可能である。
【0117】
3.本発明のポリヌクレオチド
3.1 テキスティリニンポリペプチド
本発明は、上述のテキスティリニンポリペプチド、フラグメント、変異型または誘導体をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。上述のポリヌクレオチドは、配列識別番号1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、25および43、配列識別番号1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、25または43のいずれか1つのポリヌクレオチドフラグメント、および前述の配列のポリヌクレオチド相同体からなる群から選択されることが適当である。これらの配列は、上述の通り、プラスミンの一段階競合阻害を示す生成物をコードすることが好ましい。
【0118】
さらに十分に後述する通り、Pseudonaja textilis textilisから、プラスミンの一段階競合阻害をコードするテキスティリニン(Txln)遺伝子のファミリーが得られている。配列識別番号1は、配列識別番号2に明示された約7kDaの成熟Txln 1ポリペプチドをコードするTxln 1遺伝子の一部に対応し、配列識別番号3は、配列識別番号4に明示された約7kDaの成熟Txln 2ポリペプチドをコードするTxln 2遺伝子の一部に対応する。配列識別番号5、7、9および11は、それぞれ、Txln 3、Txln 4、Txln 5、およびTxln 6遺伝子の一部に対応する。これらの部分は、それぞれ、成熟Txln 3ポリペプチド、成熟Txln 4ポリペプチド、成熟Txln 5ポリペプチド、成熟Txln 6ポリペプチドをコードする。
【0119】
本発明は、Txln 1、Txln 2、Txln 3、Txln 4、Txln 5およびTxln 6に関連した全長オープンリーディングフレーム(ORF)ポリヌクレオチドも提供する。前述の各全長ポリヌクレオチドは、24残基のリーダーペプチドをコードする第1の配列、および成熟Txlnポリペプチドをコードする第2の配列を含む。第1の配列は、配列識別番号15を含むことが好ましい。配列識別番号17、19、21、23および25は、それぞれ、Txln 1、Txln 2、Txln 3、Txln 4、Txln 5およびTxln 6に関する全長ORFポリヌクレオチドに対応する。配列識別番号43は、Txln 1に関して得られた最大のcDNA配列に対応し、ORF配列に加えて、5’UTR配列および3’UTR配列を含む。
【0120】
あるいは、遺伝子コードを利用し、たとえば、オリゴヌクレオチドシーケンサーを使用して、宿主細胞が翻訳したときに、配列識別番号2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24または26によるポリペプチド、そのポリペプチドフラグメントを結果として生成するヌクレオチドの配列を合成することにより、本発明のテキスティリニンポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を便利に調製することが可能である。
【0121】
3.2 ポリヌクレオチド相同体
下記の手順:
(i)適当な宿主から核酸抽出物を得ることと、
(ii)それぞれが参照ポリヌクレオチドの一部を含む、任意に変性するプライマーを製作することと、
(iii)上述のプライマーを使用して、核酸増幅技術により、上述の核酸抽出物から少なくとも1つの増幅生成物を増幅すること(前述の増幅生成物はポリヌクレオチド相同対に対応する)と
に従って、本発明の適当なポリヌクレオチド相同対調製することができる。
【0122】
核酸抽出物が得られる宿主は、ヘビである。適当なヘビは、Elapidae科、およびViperae科からなる群から選択される。
【0123】
プライマーは、
(A)ATGAARGAYAGRCCHGARYTNGAR[配列番号27]
(B)GTRCTYTCRTGYTCYTCY[配列番号28]
(C)ATATATGGATCCAAGGACCGGCCTGACTTC[配列番号29]
(D)AACGCGAATTCTCAGAGCCACACGTGCTTTC[配列番号30]
(E)AACGGGAATTCTCATGAGCCACAGGTAGACTC[配列番号31]
(F)CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGGAGTGGTAACAACGCAGAGT[配列番号32]
(G)CTAATACGACTCACTATAGGGC[配列番号33]
(H)AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT[配列番号34]
(I)ATCAGCGGATCCATGTCTGGAGGT[配列番号35]
(J)TCTCCTGAATTCTCAGGCAGCACAGGT[配列番号36]
(K)ATTATAGGATCCAAGGACCGTCCGGAT[配列番号37]
(L)ATTATAGGATCCAAGGACCGTCCAGAG[配列番号38]
(M)AACGTCGGATCCAAGGACCGTCCAAAT[配列番号39]
(N)AACGTCGGATCCAAGGACCATCCAAAA[配列番号40]
(O)AACGTCGGATTCAAGGACCGTCCAAAA[配列番号41]
(P)ATTGTCGGATCCAAGGACCTGCCAAAG[配列番号42]
からなる群から選択されることが適当である。
【0124】
あるいは、ヘビの組織から誘導されるポリヌクレオチドライブラリーから、本発明のポリヌクレオチド相同体を得ることができる。このようなライブラリーは、ヘビcDNAライブラリーであってもよく、ヘビゲノムDNAライブラリーであってもよい。
【0125】
適当な核酸増幅技術は熟練者に周知であり、たとえば、Ausubelら(1994−1998、前掲、15章)(参照により本明細書に援用する)に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、たとえば、米国特許第5,422,252号に記載の鎖置換増幅(SDA)、たとえば、Liu et al,(1996, J. Am. Chem. Soc. 118:1587−1594および国際出願WO92/0183)およびLizardi et al., (国際出願WO97/19193)(参照により本明細書に援用する)に記載のローリングサークル複製、たとえば、Sooknanan et al.,(1994, Biotechniques 17:1077−1080)(参照により本明細書に援用する)に記載の核酸配列に基づく増幅(NASBA)、および、たとえば、Tyagi et al.,(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5395−5400)(参照により本明細書に援用する)に記載のQ−Bレプリカーゼ増幅などが挙げられる。
【0126】
一般に、参照ポリヌクレオチドに実質的に相補的なポリヌクレオチド相同体は、核酸がマトリックス(ニトロセルロース等の合成膜が好ましい)上に固定されるステップ、その後のハイブリダイゼーションステップ、および検出ステップを含むブロッティング技術により同定される。相補的DNA配列の同定にはサザンブロッティンッグが使用され、相補的RNA配列の同定にはノーザンブロッティングが使用される。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングを使用して、相補的DNA/DNA、DNA/RNAまたはRNA/RNAポリヌクレオチド配列を同定することができる。このような技術は、当業者に周知であり、Ausubel et al.(1994−1998、前掲)の2.9.1〜2.9.20ページに記載されている。
【0127】
このような方法によれば、サザンブロッティングは、ゲル電気泳動でサイズによりDNA分子を分離すること、サイズ分離したDNAを合成膜に移動させること、および膜結合したDNAを、放射的、酵素的もしくは蛍光色素的に標識した相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。ドットブロッティングおよびスロットブロッティングでは、上述の通り、ハイブリダイゼーションの前に、DNA試料を合成膜に直接適用する。
【0128】
プラークハイブリダイゼーション法またはコロニーハイブリダイゼーション法等により、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリー内の相補的ポリヌクレオチドを同定するとき、代替ブロッティングステップが使用される。この方法の代表例は、Sambrook et al.(1989、前掲)8〜12章に記載されている。
【0129】
一般に、下記の一般手順を使用して、ハイブリダイゼーション条件を決定することができる。上述の通り、ポリヌクレオチドを、合成膜にブロットする/移動させる。上述の通りに、本発明のヌクレオチド等の参照ポリヌクレオチドを標識し、この標識ポリヌクレオチドが固定化ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる能力を分析する。
【0130】
熟練者は、多数の因子がハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことを認識するであろう。検出可能なシグナルを提供するために、放射標識したポリヌクレオチド配列の比活性は、約108dpm/mg以上であるべきである。比活性108〜109dpm/mgの放射標識ヌクレオチド配列は、約0.5pgのDNAを検出することができる。検出できるためには、十分なDNAを膜上に固定しなければならないことは、当技術分野で周知である。過剰な固定化DNA、通常は10μgを有することが望ましい。ハイブリダイゼーション中に、10%(w/v)硫酸デキストラン(分子量500,000)またはポリエチレングリコール6000等の不活性なポリマーを加えると、ハイブリダイゼーションの感度を高めることができる(Ausubel、前掲、2.10.10参照)。
【0131】
膜上に固定されたポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションから意味深い結果を得るためには、洗浄後、固定化ポリヌクレオチドに十分な量の標識ポリヌクレオチドをハイブリダイズしなければならない。洗浄することにより、標識ポリヌクレオチドと所望の程度の相補性を有する固定化ポリヌクレオチドのみに、標識ポリヌクレオチドがハイブリダイズされることが保証される。
【0132】
本発明によるポリヌクレオチド相同体は、ストリンジェントな条件で、参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが理解されるであろう。代表的なストリンジェントな条件としては、たとえば、(1)0.75M リン酸水素ナトリウム/0.5M リン酸ナトリウム/1mM EDTAニナトリウム/1%sarkosyl、約42℃にて少なくとも30分間、または(2)6.0M 尿素/0.4%ラウリル硫酸ナトリウム/0.1×SSC、約42℃にて少なくとも30分間、または(3)0.1×SSC/0.1%SDS、約68℃にて少なくとも20分間、または(4)1×SSC/0.1%SDS、約55℃にて約60分間、または(5)1×SSC/0.1%SDS、約62℃にて約60分間、または(6)1×SSC/0.1%SDS、約68℃にて約60分間、または(7)0.2×SSC/0.1%SDS、約55℃にて約60分間、または(8)0.2×SSC/0.1%SDS、約62℃にて約1時間、または(9)0.2×SSC/0.1%SDS、約68℃にて約60分間などが挙げられる。詳細な例については、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、前掲、2.10.1〜2.10.16ページおよびMOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbour Press, 1989)のセクション1.101〜1.104におけるSambrook et al.(参照により本明細書に援用する)を参照されたい。
【0133】
ストリンジェントな洗浄は、一般に、約42℃〜68℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度もストリンジェントな条件に適する可能性があることを理解するであろう。DNA−DNAハイブリッドの形成の場合、最高のハイブリダイゼーションは、一般に、Tmより約20℃〜25℃低い温度で起こる。Tmが、融解温度、すなわち、2つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当技術分野で周知である。Tmを推定する方法は、当技術分野で周知である(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 前掲、2.10.8ページ参照)。DNA−RNAハイブリッドの場合、最高のハイブリダイゼーションは、一般に、Tmより約10℃〜15℃低い温度で起こる。
【0134】
その他のストリンジェントな条件は、当技術分野で周知である。熟練者は、様々な因子を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化できることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確保するのに役立つことができる。
【0135】
固定化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドを検出する方法は、当業者に周知である。このような方法としては、オートラジオグラフィー検出法、ケミルミネッセンス検出法、蛍光検出法および比色検出法などが挙げられる。
【0136】
4.ベクター
ポリヌクレオチドを1つまたは複数の調節核酸と操作可能に連結することにより、本発明によるポリヌクレオチドは、宿主において、都合よく発現可能になる。このようにして製作された合成構築物すなわちベクターを、生物またはその一部に先ず導入してから、特定の細胞型または組織型で、その構築物を発現させることが可能である。単細胞生物ならびに多細胞生物を含んでもよい適当な生物が、本発明で考えられる。適当な単細胞生物としては細菌が挙げられる。代表的な多細胞生物としては、酵母、哺乳類および植物が挙げられる。
【0137】
ベクターの構築は、たとえば、Ausubel et al.(前掲)およびSambrook et al.(前掲)の関連したセクションに記載されている適当な技術によって行うことが可能である。しかし、本発明は、ベクターを構築するための、いずれか1つの特定の技術に依存もしくは関連するものではないことに留意されたい。
【0138】
ポリヌクレオチドの発現の調節に使用することが可能な調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなどが挙げられるが、その限りではない。このような調節配列は当業者に周知である。本発明のポリヌクレオチドの発現の誘導に使用することが可能な適当なプロモーターとしては、構成プロモーターおよび誘導プロモーターが挙げられる。
【0139】
5.治療薬
本発明のさらなる特徴は、血液消失に対して患者を軽減する薬学的組成物の有効成分としての本発明のペプチド、フラグメント、改変体または誘導体(治療薬)である。適切には、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【0140】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、全身投与に安全に使用され得る固体もしくは液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当該分野において周知の様々な薬学的に受容可能なキャリアが使用され得る。これらのキャリアは、糖、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝化溶液、乳化剤、等張生理食塩水、ならびに発熱物資を含まない水を含む群から選択され得る。
【0141】
任意の適切な投与経路は、患者に本発明の組成物を提供するために使用され得る。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを用い得る。好ましくは、静脈内経路が用いられる。
【0142】
剤形としては、錠剤、散布剤、懸濁剤、注射剤、懸濁液、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアゾル、経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形はまた、特にこの目的のために設計される注入用もしくはインプラント用制御放出デバイスまたはこの様式で付加的に作用するために改良されたインプラントの形態を含む。治療薬の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪酸アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸を含む疎水性ポリマーならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体で該治療薬を被覆することによって生じ得る。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはマイクロスフェアを用いることによって生じ得る。
【0143】
経口または皮経口投与に適切な本発明の薬学的組成物は、それぞれ予め定められた量の1以上の本発明の治療薬を含有するカプセル、小袋または錠剤などの個別単位、粉末または顆粒あるいは水性液体、非水性液体、水中油滴乳濁液もしくは油中水滴乳濁液中の溶液もしくは懸濁液として含有する。そのような組成物は、薬学的方法のいずれかによって調製され得るが、すべての方法は、上記の1種以上の免疫原因子と1種以上の必要な成分を構成するキャリアとを関連させる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の免疫原因子と液体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアもしくは両方とを均一あるいは完全に混合し、次いで必要であれば生成物を所望の体裁に形成することによって調製される。
【0144】
投与処方物に適合する方法、および血液消失から患者を軽減するのに治療上有効である量で、上記の組成物を投与し得る。患者に投与される用量は、本明細書に関し、期間中に患者において血液消失の低減または停止などの有益な応答を生じるのに十分であるべきである。投与すべき治療薬の量は、年齢、性、重量およびその一般的健康状態を含む治療すべき被験体に依存する。これに関し、投与のための治療薬の正確な量は、実施者の判断に依存する。血液消失の治療において投与すべき治療薬の有効量を決定する場合、医師は、期間中の血液消失の進行を評価し得る。いずれにしても、当業者であれば、本発明の治療薬の適切な用量を容易に決定することができるであろう。そのような用量は、治療薬のナノグラムからミリグラムのオーダーである。
【0145】
6.抗腫瘍剤
本発明はまた、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、抗フィブリン抗体にコンジュゲートした誘導体の改変体を含む抗腫瘍剤にまで及ぶ。従って、そのようなコンジュゲートは、そのような腫瘍の進行および浸潤を阻害すべきであり得る。この点については、参考文献としてRautおよびGaffney(1996,Fivrinolysis 10(補遺4):1−26、要約No39)(参考として本明細書に援用されている)による要約があり得る。
【0146】
抗フィブリン抗体は、フィブリン、好ましくはヒトフィブリンに結合またはコンジュゲートする任意の適切な抗体を含み得る。例えば、抗フィブリン抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、例えば、ポリクローナル抗体血清を得るためのマウスまたはウサギを含み得る産生種にフィブリンを注入することによって調製してもよい。
【0147】
産生種において得られる抗フィブリンポリクローナル抗血清の代わりに、例えば、KohlerおよびMilstein(1975,Nature 256:495−497)による記事に記載の標準的な方法を用いて、
【0148】
またはフィブリンを接種された産生種由来の脾臓もしくは他の抗体産生細胞を不死化することによって、「CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY」(1994,Coligan,A.M.Krisbeek,D.H.Margiles,E.M.ShevachおよびW.Strober編、John Wiley and Son Inc.
【0149】
(参考として本明細書に援用される))より最近のその改良法によって、モノクローナル抗体を産生してもよい。
【0150】
本発明の抗腫瘍剤を産生するために使用され得る好ましいモノクローナル抗体としては、Tymkewyczら(1993,Blood Coagul.Fibrinol.4:211−221)(参考として本明細書に援用される)により記載の抗フィブリンモノクローナル抗体またはRautおよびGaffney(1996、前掲)により記載のモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0151】
上記のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のFcもしくはFabフラグメントを含む抗フィブリン抗体も考慮される。あるいは、抗フィブリン抗体は、フィブリンに対する単一鎖Fv抗体(scFvs)を含み得る。そのようなscFvsは、例えば、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号においてそれぞれ記載の方法またはWinterおよびMilstein(1991,Nature349:293)(参考として本明細書に援用される)に従い調製され得る。
【0152】
任意の適切な手順を使用して、抗フィブリン抗体と本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、改変体または誘導体とをコンジュゲートし得る。参考文献として、例えば、GrabarekおよびGergely(1990,Anal.Biochem.185:131−135)(参考として本明細書に援用される)があり得る。
【0153】
本発明を容易に理解し実用効果を得るために、以下の非制限的実施例により特に好適な実施態様について説明する。
【0154】
(実施例)
実施例1
動物モデルにおいて出血を阻害するPseudonnja Textilis Textilis由来の2つのプラスミンインヒビターの特徴付け
材料および方法
材料
回収および凍結乾燥されたP textilis毒を、Mr Peter Mirtschin,Venom Supplies,Tanunda,South Australiaより得た。毒を0.05M tris−HCl緩衝液(pH7.4)、10mg/mlにて再構成し、クロマトグラフィーまたは分析前に遠心分離(2,000g、30分間)した。Sephacryl S−300、Sephacryl S−100、con A−SepharoseおよびDEAE−Sepharose CL−6Bは、Pharmacia Uppsala,Swedenより入手し、合成発色物質S−2251はChromogenix,Molndal,Swedenより入手した。いくつかの動力学的実験のために、Sanofi/Choay Laboratories(Paris)由来の高度に精製されたプラスミンを使用した。他の全ての緩衝液および試薬は分析用であった。
【0155】
プラスミノーゲンおよびプラスミンの調製
他に記載のアフィニティークロマトグラフィー手順(DeutschおよびMertz.1970,Science 170:1095)を用いて、過去に回収され、クエン酸処理された血漿より、ヒトプラスミノーゲンを精製した。ウロキナーゼ結合Sepharose4Bで活性化することによって、プラスミノーゲンよりヒトプラスミンを調製し(Robbins、KC.,1978「プラスミン」:Handbook of experimental pharmacology,Markwardt F編、Berlin:Springer 46:317)、プラスミンの内部標準(77/558)に対して較正した。
【0156】
プラスミン阻害アッセイ
本質的に他に記載(Fribergerら、1978,Haemostasis 7:138)の通り、プラスミン阻害アッセイを行った。900μLの0.15Mtris−HCl、pH7.4、25μL(0.1IU)のプラスミン、25μLのインヒビターを50μLの基質S−2251(3.0mM)に添加し、Hitachi557記録分光光度計において405nmの吸収を連続測定することによって、残存プラスミンを決定した。内部標準(77/558)を使用して、プラスミン活性の標準曲線を調製した。
【0157】
Txln1および2の精製
ここで、本発明者らは、2つの異なる形態のTxlnインヒビターの単離を可能にする精製手順についてはじめて記載する。Sephacryl S−300カラム(5.0×95cm)を、4℃にて0.1M酢酸アンモニウム緩衝液(pH7.0)で、1分間あたり1mLの流速で平衡化した。500mgの凍結乾燥P.texilis毒を25mLのカラム緩衝液において再構成し、続いて10,000rpmで20分間、遠心分離を行った。LKBフラクションコレクターを使用して12mL画分を回収し、ラインUV検出器のAltex二波長を用いて、溶出物を280nmで監視した。YM3メンブランを有するAmicon攪拌型セル濃縮機Model402を使用して、回収したプラスミンインヒビーター画分を濃縮し、この濃縮物をDEAE−Sepharoseカラムに適用した。DEAE−Sepharoseカラム(2.5×12cm)を、4℃にて0.05Mリン酸緩衝液(pH8.0)で、1分間あたり1.0mLの流速で平衡化した。濃縮されたプラスミンインヒビターを適用後、カラムを緩衝液で洗浄し、プラスミンインヒビター活性を有さない非結合タンパク質のピークを得た。2つの形態のTxlnを分離するために、NaCl(0−0.5M、500mL)の直線勾配を1分間あたり1.0mLの流速で適用した。回収したプラスミンインヒビター1および2(Amiconセルにおいて濃縮された)を、0.05M Tris−HCl(pH7.4)で平衡化したSephacryl(登録商標)S−100上で個々にさらに精製した。最大のプラスミン阻害活性を有する画分を回収し、濃縮し、Tris緩衝化生理食塩水中約1mg/mL(143μM)の濃度で保存した。最後に、0.15MTris−HCl緩衝液(pH7.4)で緩衝化されたCon A−Sepharose(1×10cm)のカラムに適用することにより、微小の混入物をTxln1およびTxln2サンプルから除去した。回収および濃縮したプラスミンインヒビターを、1分間あたり1.0mLの流速でこのカラムに適用し、洗浄ピークにおいて阻害活性を見出した。
【0158】
水中0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)で緩衝化し、0.05%TFA中0〜70%アセトニトリル勾配を用いて展開するWaters C18μ結合充填カラム(0.6×30cm)上の逆相(RP)HPLCによって、Txln調製物の精製を確認した。クロマトグラフィーを214nmを監視し、60分間で勾配を展開した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)(WeberおよびOsborn,1969.J.Biol.Chem.244:4406)を用いて精製を確認する一方、サンプル溶液中4M尿素を組み入れる方法(GaffneyおよびDobos.1971,FEBS Lett.15:13)によってサンプルを調製した。
【0159】
アミノ酸配列決定
アルゴン下、37℃で10mMジチオトレイトール(DTT)を有する6M塩酸グアニジン、0.1 M Tris−HCl緩衝液、1mM EDTA、(pH9.5)において、Txln1およびTxln2の還元およびカルボキシメチル化を行った。15mMヨード酢酸、30分間でカルボキシメチル化(CM)工程を行った。(1:100)の酵素対基質比を使用し、50mMリン酸緩衝液、pH8.0中、それぞれエンドプロテイナーゼLysCおよびエンドプロテイナーゼAspNで37℃にて18時間処理することにより、CM Txln1および2を消化した。TFAによる酸化で反応を停止し、ダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard1090液体クロマトグラフを使用するVydac C8カラム(2.1×150cm)上のRP−HPLCによって、消化物を分画した。0.2ml/分の流速で、水中0.1%TFA〜70%アセトニトリル中0.1%TFAの直線勾配を形成した。全てのクロマトグラフィーは、室温で行った。Txln1および2の長N末端配列決定を最初に行うことによって、Hewlett Packard G10005Aシークエンサー上で、アミノ酸配列決定を行った。エンドLysCおよびエンドプロテイナーゼAspN消化から得られるC末端フラグメントから、Txln1および2のC末端配列を誘導した。配列の証拠は、全分子の長N末端配列長、逆相クロマトグラフィーによって単離されるペプチドの1つのさらなるクロマトグラフィーによって得られるエンドLys Cペプチドの伸長配列およびエンドプロテイナーゼAsp Nペプチドの配列から誘導される。C末端の2つのアミノ酸を、クローニングおよびE.coliにおけるテキシチリニンの発現中に得られる全長cDNA配列から同定した(以下の実施例2に記載する)。
【0160】
質量分析
マトリックス援用レーザー脱着/イオン化(MALDI)飛行時間型質量分析(Bruker−Franzen Analytik GMBH,Breman,Germany)は、リフレクトロン(reflectron)様式で排他的に作動した。サンプルを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する30%アセトニトリル水溶液およびステンレススチール標的上に0.5〜1mLを沈積する前に、クエン酸水素二アンモニウムを含有する2,6−ジヒドロアセトフェノンから成る2mLのマトリックスに希釈した。
【0161】
マウス尾出血モデル
ケタミン(100mg/mL)およびRompun(ジラジン、40mg/mL)の等量混合物の10倍希釈の0.4mLの腹腔内注射による麻酔導入後、雌雄の成熟異系交配Quackenbush(平均20グラム)を用いて、出血モデルを確立した。麻酔を確立し、2分後にそれぞれのマウスにつき尾摘出を行った後、アプロチニン、2種のtxln(それぞれの物質について100μg/100μLの生理食塩水)の尾静脈の静脈内送達を行った。これらの実験で使用されたプラスミンインヒビターの用量は、20グラムのマウスの重量に対して調節されたヒトCPB手術中での用量に類似した。予め秤量したエッペンドルフチューブに回収することによって、血液消失を測定した。正確性のため、血液消失は容量よりむしろ重量によって測定した。頚部脱臼により全てのマウスを安楽死させた。全てのマウス実験は、Princess Alexandra Hospitalの倫理委員会より承認された。該委員会は、用量応答研究を促進しなかったため、本発明者らは、ヒト手術において用いられる調整された用量は、これらの初期研究ついて現実的なレベルであった。Txlnのそのような用量は、2日間観察した場合、マウスに対して任意の有害作用を誘導しないことが認められた。
【0162】
プラスミン阻害の動力学
2種の精製されたテキシチリニン(Txln1およびTxln2)によるプラスミン阻害動力学の研究手順は、他に記載されている通り(Stoneら、1984,Biochem.Pharmacol.33:175)であり、不純なTxln調製物を研究するために使用される方法(Willmottら、1995、前掲)とは、4倍および36倍高い酵素濃度を使用した点で異なった。この後者のアプローチは、1時間から10分未満への時間尺度の短縮を可能にした。25℃にて0.01%(v/v)Tween80を含有する0.1M Tris/HCl、pH7.4において酵素インヒビターアッセイを行った。75μM発色物質(S−2251)および16〜410nM Txlnを使用するこれらの実験では、2nMまたは18nMプラスミンのいずれかの濃度を使用した。プラスミン阻害のパターンは、遅いタイトバインディング阻害に関連する形態のパターンであったため、進行曲線を以下の関係について分析した。
[P]=vst+(vs−v0){1−exp(−kt)}/k (式1)
該式は、初期値(v0)および最終的に達成された(vs)速度ならびに初期および最終(定常)状態の間の転移についての見かけの速度定数(k)の関数として発色生成物[P]の濃度の時間依存性を表す。本発明のシステムでは、発色物質の濃度[S]を固定して実施した実験の初期速度は、インヒビター濃度[I]に依存しなかった(v0がプラスミンインヒビターの非存在下で初期速度として同定され得る簡素化環境(式2を参照のこと))。これらの条件下で、速度定数(k)は、競合的インヒビター定数(KI)および発色物質のミカエリス定数(Km)について以下の式として表現され得る。
k=kd[1+(I)/{KI(1+[S]/Km)}] (式2)
式中、kdはプラスミン−インヒビター複合体の解離に対する速度定数である(Stoneら、1984、前掲)。定常状態の速度、vsは、最大速度Vおよび古典的競合阻害について表現され得る。即ち、
vs=V[S]/{[S]+Km(1+(I)/KI)} (式3)
インヒビター定数KIおよび解離速度定数kdは、進行曲線の包括的分析から生じる2つの曲線固定パラメータであった。
【0163】
結果
精製データ
図1は、3つの大きなピークおよび2つの小さなピークを示す粗毒からのタンパク質(1〜5と標記される)のSephacryl S−300クロマトグラフィー分離を示す。プラスミン阻害活性は、溶出画分を監視するためのプラスミン中和アッセイを使用して、右肩上がりのピーク4(斜線を施した領域を参照のこと)で示される。さらに、回収したインヒビターの分画(Amicon YM3濃縮)を、DEAE−Sepharose CL−6Bカラム上で行った。図3は、プラスミン阻害活性の2つの異なるピークを示す得られた分離を示し、中実の水平棒で表し、1および2と標記される。それぞれのピークを個別に回収し、濃縮し、Sephacryl S−100カラムに適用して微量の不純物を除去した。図2は、Txln1の溶出プロフィールを示し、これは、Txln1の溶出プロフィールに同一である。但し、図2の挿入は、このカラムとは異なる溶出容積を有するそれぞれを示すそれぞれのTxlnの逆相HPLCプロフィールを示す。SDS−PAGEゲル電気泳動によって、Sephacryl S−100溶出物質の純度をさらに実証した(データ示さず)。最終的に濃縮されたプラスミンインヒビターを、0.05M Tris−HCl緩衝化生理食塩水中、約1mg/mLの最終濃度で、−20℃で保存した。
【0164】
これらの調製物は、動力学的および物理的特徴付けに適切である一方、Txln1および2は、血液消失を評価するために使用されたマウスモデルにおいて困難を生じたことが認められた。そのような実験では、他に記載(Masci PP.1986.凝固および線溶に対するオーストラリアヘビ毒の影響 Masters Thesis;University of Queensland)のCon A−Sepahroseカラムを使用して、微量の強力なプロトロンビンアクチベーター複合体を除去する必要があった。
【0165】
一次配列
図5は、Txln1および2のアミノ酸配列ならびに、比較のために、アプロチニンおよびAustralian Eastern Taipan、Oxyutanus scutellatusの毒から単離されたTaicotoxin関連プラスミンインヒビター(Txln1および2に最も近い相同性を有する)のアミノ酸配列を示す。4つの全てのプラスミンインヒビターは、このグループのプラスミンインヒビターに典型的であり、該インヒビターに安定性を付与するシステイン配位を有することが認められ得る。Txln1および2は、80℃で2時間加熱した場合でも阻害活性を失わないことが見出された(データ公開せず)。Txln1とTxln2との間には6つのアミノ酸の配列の差異が認められたが、それぞれ、アプロチニンに45および43%の相同性を示した。Txln1および2間では、それぞれ58%および55%の相同性が認められ、Taicotoxinは、プラスミンインヒビターに関連した。両Txlnは、正味の負電荷が−4(Txln1)および−6(Txln2)であるかなりの酸性タンパク質であるが、アプロチニンはかなりの塩基性であり、正味の電荷が+6である。Txln1および2に関する質量分析のデータは、6682.4および6689.3の分子量を示し(データ示さず)、アミノ酸組成由来の分子量と十分に一致した。
【0166】
動力学的データ
図4は、0〜410nM Txln1の存在下で2nMプラスミンによる発色物質の加水分解に対する進行曲線を示す。これらのデータは、アプロチニンについて報告されたデータ(Willmottら、1995、前掲)により緊密に類似し、本発明者らの不純Txlnに関する過去のデータは簡単な競合的阻害を示唆したが、精製されたTxln1および2に関するこれらの後のデータは、アプロチニンの2段階メカニズムの方に類似する。式1〜3に関する包括的分析によるデータから推定されるインヒビター定数(KI)を、Txln2およびDEAE−Sepharoseクロマトグラフィーの前に共クロマトグラフィーを行ったテキシチリニンの混合物の対応する値と共に表3に示す。
【0167】
【表3】
【0168】
高プラスミン濃度(18nM)による実験についての進行曲線から得られる対応する結果も表3にまとめる。単離されたTxln1および2に関するインヒビター定数(相互に区別され得る)と部分精製された調製物の定数との比較は、イオン交換および排除(extra)Sephacryl S−100クロマトグラフィー工程によって3〜5倍のタンパク質の純化が達成されたことを示唆する。表3に示されるインヒビター定数は、不純Txlnについて先に報告された150μMの値(Willmottら、1995、前掲)よりもはるかに小さい。本発明の研究において観察されたTxln−プラスミン結合の強度の増加は、おそらく、本発明のより広範な精製手順の後者の工程の間に、Txlnから同定されていない化合物が除去されたことを反映していると思われる。このことにも係わらず、プラスミンに関する純粋TxlnのKi値は、アプロチニンについて観察される値(Willmottら、1995、前掲)よりも約100倍少ない。
【0169】
動物出血モデルにおけるTxlnの挙動
プラスミン活性のTxln阻害は、アプロチニンについて観察される値よりもかなり弱い(100倍、表3を参照のこと)ため、血液消失を阻止するTxlnについて、アプロチニンと同じ用量で使用する場合の有効性を確立するために動物モデルが使用されている。
【0170】
摘出されたマウス尾静脈からの血液消失に対する(尾静脈)Txln1および2の静脈内送達の効果を表4に示し、比較のため、アプロチニンの結果も示す。
【0171】
【表4】
【0172】
使用された量は、重量レベルでヒトにおいて臨床的に使用されるアプロチニンの量に等価であり、これは、平均20グラムのマウスあたりで研究されたそれぞれの物質の100μgであった。アプロチニンは血液消失を60%抑制したが、両Txlnは、生理食塩水を注射された対照と比較して、同様の程度で血液消失を抑制した。動物モデルで使用されたTxlnおよびアプロチニンの量はin vitroでのプラスミンの中和に基づいており、何らかの誤差を生じ得る、これらの比較の確認はさらに調査を必要とし得る。将来実験に使用すべきこれらのインヒビターの量は、モルで比較するのがより適切であろう。
【0173】
考察
血液供与の状態が悪化しているため、主な手術または以後の外傷での血流の抑制が現在の関心事である。血液へのウイルス混入の発生率が上昇していることは、社会医学上の問題となってきており、緩和されていないようである。HIV、B型およびC型肝炎ウイルスの血液への混入に関する不安がある一方、ウシ海綿状脳症(BSE)およびクロイツフェルト−ヤコブ病(CJD)に関連するプリオンによって交差混入の可能性が依然としてあり、主に全血輸血中に生じ得る。
【0174】
ウシ肺から誘導されるアプロチニンは、人工心肺などの手術手順中の血流を阻止するために使用される(Royston D.1990.Blood Coagul.Fibrinol.1:53;Royston D.1992.J.Cardiothorac.Vasc.Anesh.6:76)。実際に、CPBは、アプロチニンが使用される主な手術環境であるが、この薬物を使用して、神経手術(GurdettiおよびSpallone.1981.Surg.Neurol.15:239)、整形外科(Kerterlら、1982.Medisinishe Welt33:480)、肝(Neuhausら、1989 Lancet 11:924)および泌尿器科(KostersおよびWand、1973.Urologe 12:295)手術中の血液消失が抑制されている。血栓症(Van der Meerら、1996.Thromb.Haemost.75:1;Cosgroveら、1992.Ann.Thorac.Surg.54:1031;Samamaら、1994 Thromb.Haemost.71:663)および心臓手術中の致死性アナフィラキシー(Diefenbachら、1995.Anesth.Analg.80:830)の若干の報告があるにも係わらず、このような広範な使用が認められる。アプロチニンの正確な作用機序については不明であるが、プラスミン阻害が血液消失抑制能の中心であることが現在受け入れられている(Royston D.1990、前掲;Orchardら、1993.Br.J.Haematol.85:596)。しかし、アプロチニンは、凝固カスケードおよび血小板機能に対して他の効果を有する(Westaby,S.1993.Ann.Thorac.Surg.55:1033)。血小板付着の主な原因であるGPIIb/IIIaレセプターは、バイパス回路表面との接触により影響を受けないが、プラスミンは血小板を分解し、血小板が止血栓を形成する能力を抑制することができる(Wengerら、1989.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.97:235)。プラスミン阻害はまた、止血栓の安定性を増強するこの後者の血小板メカニズムに影響を与え得る。ここで、アプロチニンがタンパク質Cを阻害し、次いで、トロンビン産生の減少および線溶の増強が生じる(Gaffney PJ,Edgell TA.線溶と止血のバランス「新旧の概念の調和」、Recent progress in blood coagulation and fibrionolysis.Takada A,Collen D,Gaffney PJ編、Amsterdam;Elsevier Science BV 127,1997)ことが見出されていることを示すのは価値がある。
【0175】
これらの後者の両効果は、血液消失を抑制するアプロチニンの有効性を減少し得る。アプロチニンに特異性がなければその作用機序に混乱が生じるが、プラスミンの阻害はその有効性に重要であるようである。アプロチニン処置患者においてフィブリンフラグメントD二量体の形成が抑制されることは、プラスミン阻害がその機序に重要であることの証拠であるが、フィブリン形成の阻害およびそれによるプラスミノーゲンのプラスミンへのフィブリン介在性活性化もD二量体レベルの減少についての説明を提供し得る。
【0176】
プラスミン阻害に基づく他の代替的止血を提供するために、数年もの間ヘビ毒が研究されている。ヘビ毒に見出されるプラスミン/トリプシンインヒビターに関する最初の報告は、Takahashiら、1972.FEBS Lett.27:207)によるものであったが、他のクサリヘビおよびコブラ科毒におけるプラスミンインヒビターのさらなる報告もある(Shafqutら、1990.Eur.J.Biochem.194(2):337;Shajqutら、1990.FEBS Lett.27:6;Yamakawaら、1987.Biochtm.Biophys.Acta925:124;Ritonjaら、1983.Eur.J.Biochem.133:427;Strydomら、1979.Biochim.Biophys.Acta 491:361)。オーストラリアクサリヘビ毒のスクリーニングでは、2種のヘビ属が強力なプラスミンインヒビターを有することが明らかにされた(Masci PP.Masters Thesie 1986、前掲)。これらは、PseudonajaおよびOxyuranus属である。Pseudonaja属では、全ての種由来の毒がプラスミンのインヒビターを有することが明らかにされた。このインヒビターは部分精製され、textilis亜種から動力学的に特徴付けされており、その後テキシチリニン(Txln)と命名されている。さらなる精製(図1および3)により、このインヒビターには2つの形態、Txln1および2が存在することが明らかにされている。Oxyuranus属では、ただ1つの種の毒がプラスミン・トリプシンインヒビターを含有することが明らかにされており、これは配列が決定され、多量体複合体で会合することが明らかにされている。この複合体は、α神経毒を含有するカルシウムチャンネル、ホスホリパーゼおよびタイコトキシンと呼ばれるトリプシンインヒビターであることが実証された。図5は、このトリプシンインヒビター(TAC)がそれぞれTxln1および2に58%および55%の相同性を有し、これは、天然に存在する既知のプラスミンインヒビターであるテキシチリニンに最も近い相同性であることを示す。Txln1および2とアプロチニンとの間では、それぞれ45%および43%の相同性しかない。Txln1および2間では6つのアミノ酸の差異があり、両者とも正味の負の電荷(それぞれ−4および−6)含有する酸性であり、塩基性分子(+6)であるアプロチニンとは異なる。
【0177】
部分精製されたP.texilis由来のプラスミンインヒビター調製物の動力学を研究する一方、このインヒビターは、迅速かつアプロチニン(FritzおよびWanderer.1983.Drug Res.4:479)より特異的にプラスミンに結合することが観察されている(Wilmottら、1995、前掲)。結果はまた、テキシチリニンが、アプロチニンよりも強固にはプラスミンに結合しないことを示した。アプロチニンの特異性は、広範にtPA、ウロキナーゼおよびカリクレイン、ならびにならびにプラスミンおよびトリプシン中和する(FritzおよびWanderer.1983、前掲)ことに基づいており、ヘビ毒プラスミンインヒビター、Txlnの研究により、可逆的であると思われる迅速な一段階反応でより特異的にプラスミンおよびトリプシンに結合することが明らかにされている(Wilmottら、1995、前掲)。アプロチニンは、静脈移植片閉塞および血栓症の発症率の増加に関連することが報告されている(Van der Meerら、1996、前掲;Cosgroveら、1992、前掲;Samamaら、1994、前掲)ため、Txlnなどの強固ではない結合インヒビターが、臨床的により効果的であり得ることが概略された。この元の所見により、本発明者らは毒よりTxlnのさらなる精製を進め、次いで、それぞれのヘビ毒が2つの形態のTxlnを含有することを見出した。このことは他の研究者の研究にも反映しており(Takahashiら、1974.Toxicon.12:193)、該他の研究者もRussellのクサリヘビ毒プラスミンインヒビターの2つの改変体について報告した。両Txlnは、アプロチニンほど強固にプラスミンに結合しないが、先に報告されている部分精製された物質で示されている結合(Wilmottら、1995、前掲)よりは強い。
【0178】
Txln1および2は、アプロチニンと同等に効率的にマウス尾静脈出血モデルの血液消失を抑制する(表4)。このモデルでの血液消失の抑制が、示唆されているように(Royston D,1992、前掲)、止血栓形成部位でのプラスミン中和に関連する場合、それらが好適に同等であることは驚くべきことではない。アプロチニンとは対照的にTxlnがカリクレインを中和できない(本発明者らのデータ公開せず)ことは、臨床的重要性を有し得る。もちろん、これは、創傷治癒部位でのプラスミンの産生に対するカリクレイン−第XII因子経路の寄与に依存する(Kluftら、1987.Setm.Thromb.Haemost.13:50)。実際、アプロチニンのカリクレイン阻害効果は、この薬物のプロトロンビン効果または前出血(prohaemorrhagic)効果のいずれかに対する寄与因子であり得る。一般的見解では、カリクレイン−第XII因子を介する外因性凝固経路は、凝固、続いてCPB機械への血液の通過を阻害する傾向がある(Westaby S,1993、前掲)。
【0179】
このヘビの噛み傷に伴うヒト凝固の不均衡においてTxln分子が果たす役割については不明である。何故なら、毒液の注入は線溶活性の劇的な増加を伴い、噛まれた個体で血管内凝固が広がることに関連するからである(Masciら、1990.Thrombosis Research 59:859;Tibballsら、1992.Anesthesia and Jntensive Care 20:28)。おそらく、この線溶活性は、プロトロンビン介在性フィブリン複合体によって刺激される(GaffneyおよびEdgel、1997、前掲)。線溶のその後の阻害が微小血管のこのフィブリン介在性閉塞に寄与し得ることは妥当である。
【0180】
現在、Txlnの動力学的プロフィールおよび狭い特異性は、血液消失を抑制するアプロチニンの臨床的有益性があることを強く示唆する。マウス出血モデルのデータは、血液消失を比較的抑制することを示すことは疑いもないが、Txlnがアプロチニンよりも有害な副作用が少ないことを示唆する生理学的データはない。しかし、Txlnで処置した全てのマウスは、副作用を示さなかった。この証拠が得られていないにも係わらず、アプロチニンの反復的治療的使用が禁忌であるという事実(Wuthrichら、1992 Lancet 340:173)により、これらの新規の出血インヒビターのクローニングおよび発現が十分に正当化される。
【0181】
実施例2
テキスティリニンcDNAのクローニングおよび配列決定
材料および方法
材料
処置され得ない臨床状態を有する破壊すべきと思われる爬虫類より一般のBrown Snake毒腺を入手した。致死量のペントバルビトン(60mg/Kg)で動物を安楽死させた後、直ちに、滅菌状態下で毒腺を外科的に取り出した。Department of Environment and HeritageおよびUniversity of Queensland動物倫理委員会は、これらの爬虫類の殺傷を承認した。2つの摘出された毒腺(約100mgの湿組織)を、液体窒素中で直ちに凍結し、総RNA抽出までに−70℃で保存した。
【0182】
変性プライマー
Masci−3 (センス) ATGAARGAYAGRCCHGARYINGAR [配列番号27];
Masci−5 (アンチセンス) GTRCTYTCRTGYTCYTCY [配列番号28];
【0183】
総RNAの単離
Dynal Bead総RNA抽出キットを使用して、総RNAを単離した。凍結毒腺(2)を、Eppendorf(登録商標)チューブ中の1.0mLの溶解緩衝液(キットに供給されている)中に置き、RNAaseを含まない滅菌Polytron(登録商標)プローブを用いて直ちに均質化した。均質化は、氷上にて4×10秒間隔で行った。均質物を0.5mLアリコートに分割し、等容積のフェノール−クロロホルム(1:1)抽出を行った。RNAおよびDNAを含有する水層(上部)を分離し、等容積のイソプロパノールで1晩沈殿させた。13,000rpm、20分間、4℃での遠心分離後、70%エタノール洗浄を行った。沈殿したRNAを、DEPC処置した水中で再構成し、以下の式を用い、260nmの吸収を測定することによって、希釈アリコートに対して核酸含有量を決定した。
総RNA(mg)=A260×[0.04mg/(1A260×1mL)]×希釈倍数×容積(mL)
【0184】
その後、取扱説明書の通りに、TRIzol(登録商標)(Life Technologies)を使用して、総RNAの調製を行った。簡単に説明すると、100mgの組織を(小さなホモゲナイジングアタッチメントを有するPolytron(登録商標)ホモゲナイザーを使用して)1mLのTRIzol(登録商標)試薬中で均質化した。
【0185】
サンプルを変性ホルムアルデヒドアガロース/EtBrゲル上で電気泳動することによって、RNA分析を行った。哺乳動物の総RNAは、4.5および19kbで典型的な2つの明るいバンドを示した。これらのバンドは、28Sおよび18SリボゾームRNAに相当する。これらのバンドの強度の比は、約2:1であった。
【0186】
mRNAの単離
供給者の推薦通りに、Dynal Magnetic Beadsを使用して、メッセンジャーRNAを単離した。磁気ビーズからmRNAを溶出後、1μgを逆転写(RT)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に使用し、残りを10分の1容積の3M酢酸ナトリウム、pH5.2/2容積の無水エタノール中で沈殿させ、−70℃で保存した。
【0187】
RT−PCR
Promega RTキットMMLV逆転写酵素および単離された総RNAならびにテンプレートとしてmRNAを42℃で1.5時間使用して、RT−PCRを行った。得られたcDNAを、第2鎖の合成に使用した。T4 DNAポリメラーゼ、テンプレートして第1鎖cDNAを使用して、第2鎖の合成を行った。
【0188】
反応は、14℃で3時間行った。第2合成反応の最終容積は100μLであった。フェノール−クロロホルム抽出を行い、水層(上部、二本鎖cDNAを含有する)をきれいなEppendorfに移し、エタノールで1晩cDNAを沈殿させた。13,000rpm、20分間、4℃での遠心分離後、沈殿物を70%エタノールで洗浄し、10μLの滅菌水中で再構成して、Txln1および2に対する変性プライマーを用いるPCR増幅Txln cDNAにおいて使用するまで−20℃で凍結保存した。
【0189】
Txln cDNAのPCRによる増幅
Txln1のアミノ酸配列より、センスおよびアンチセンス変性オリゴヌクレオチドプライマーMasci−3/Masci−5を設計した。Brown Snakeの肝組織よりゲノムDNAを単離し、変性プライマーを使用するPCRにおいてプライマーとして使用し、Txln cDNAの任意のイントロンの存在を決定した。
【0190】
94℃/1分;46℃、1分間;72℃、1分間、35サイクルから成る増幅パラメータを使用して、予想59アミノ酸をコードするポリヌクレオチドに対応する177塩基対のPCR産物を得た。同様に、ゲノムDNAを使用して、177塩基対産物を得た。177塩基対PCR産物を、それぞれp−GEM 5zfおよびpGEX−2Tに連結した。得られた組換えプラスミドを、自動化ヌクレオチド配列分析のためのテンプレートとして使用した。Txln1およびTxln2に関する成熟ポリペプチドをコードするそれぞれのヌクレオチド配列を図6および7に示す。
【0191】
pGEM−2Tベクターの調製
pGEM−2T(Pharmacia−Biotech、約5pmol)をBamHIおよびEcoRIで切断した。消化産物をTAEアガロースゲル電気泳動で分画し、QIAquick(登録商標)DNA抽出キット(QIAGEN)を使用して線状化されたベクターを精製し、続いてエタノール沈殿した。
【0192】
連結
pGEM−2TまたはpGEXベクター(0.03pmol)、および1.5pmolの177塩基対PCR産物を、総容積30μL中2単位のT4 DNAリガーゼを含有する献血混合物に添加した。連結は、14℃で1晩インキュベーションしながら行った。
【0193】
形質転換
3分の1の連結混合物を使用し、E.coli株DH5αを宿主としてエレクトロポレーションを行った(標準条件)。0.1mgアンピシリン/mLを含有する指示標準LBプレート上で、それぞれの構築物について、合計で10未満のコロニーを選択した。特異的に設計されたプライマーにより6個のcDNA異性体を同定した。それらの配列を示す。
【0194】
線状化された分子のそれぞれの末端を超えて伸張している3’末端チミジンを有する線状化pGEX−Tベクター(Promega Corporation;カタログ番号A3600、部品番号A360A、ロット番号96814)を用いて、クローニングを行った。精製されたTxln PCR産物(Advantage2 Taqポリメラーゼ酵素システム(Clontech))を、T4 DNAリガーゼ(Promega Corporation)を用いて、これらの末端に連結した。次いで、Txln cDNAをE.coliDH5αにエレクトロポレートし、従来の青/白選択基準を使用して、適切な形質転換体を選択した。Txln cDNA PCR産物(177塩基対または全長)を含有する少なくとも10個の陽性コロニーを同定した。染料ターミネーターマトリックスを使用して、Txln cDNA挿入物の配列決定を行い、ABI Prism(登録商標)Model377シークエンサーを用いる配列決定に供した。
【0195】
発現
良好なコンセンサス配列を有する少なくとも10個のコロニーを選択し、100μg/mLアンピシリンおよび発現を誘導するための0.1M IPTGの存在下で2YT培地中にて培養した。Laemmli,UK(1979,Nature 277;680)に従う12%SDS−PAGEによって、融合タンパク質の直接検出を行った。
【0196】
アフィニティークロマトグラフィーグルタチオン−Sepharose(登録商標)4B(Amersham−Pharmacia Biotech;カタログ番号17−0756−01)を使用して、Txln−GST融合タンパク質を精製した。グルタチオン−Sepharose(登録商標)4BゲルをPBSで4回洗浄し、Txln−GST融合タンパク質とのインキュベート前に全てのトロンビンインヒビターを除去することを確実にした。トロンビン(5U/mgの融合タンパク質)(Pharmacia−Biotech)とインキュベートすることによって、Txln−GST融合タンパク質結合グルタチオン−Sepharose(登録商標)4Bから組換えTxlnを切断した。1ml培養物由来のTxln−GST融合タンパク質を含有する1mLの充填ゲルついて、50単位のトロンビンを添加し、室温で21時間インキュベートした。2、7および21時間に上清サンプルを取り出し、組換えTxlnについてSDS−PAGEにより試験した。
【0197】
組換えTxlnの再生
組換えTxlnの再生効率を最大にするために、Bieriら(1995,Biochemistry,34:13059−13065)(参考として本明細書に援用される)、およびNorrisら、(1994.アプロチニンアナログおよびその産生プロセス、米国特許第5,373,090号、Novo Nordisk)(参考として本明細書に援用される)による例に記載のように、手順の組み合わせについて検討した。
【0198】
簡単に説明すると、2M塩酸グアニジンを添加した20mM NH4HCO3、pH8.3中の組換えTxlnを45mM DTTで15分間50℃で還元した。次いで、還元および再生されたTxlnを、20mM重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.3に添加することによって迅速に100倍希釈し(最終塩濃度は0.05M未満)、18時間放置した。天然Txlnに関する記載のように、希釈されたTxln溶液をDEAE−Sepharose(登録商標)(1.0×10cm)イオン交換カラムに適用することによって、活性型組換えTxln(1〜10mg)の濃縮および精製得を行った。S−2251(3.0mM)発色アッセイを用いて、プラスミン(0.1U)を阻害することによって、活性型組換えTxlnをアッセイした。マウス尾静脈出血モデルにおいて、組換えTxlnの臨床効果について検討した。
【0199】
結果
変性プライマー(Masci−3/Masci−5)を使用して得られたテキシチリニンのcDNA配列
プライマー(Masci−3/Masci−5)は、アミノ酸の重複性に基づき、そしてTxln1およびTxln2配列(以下に記載)のN末端およびC末端の特異的領域を選択することによって、設計された。それらを用いて、Brwonヘビ毒腺から単離された総RNAから産生されたcDNAを増幅した。平滑末端クローニングを用いて、PCR産物をpGEM−5zf(+)にクローニングした。Masci−3/Masci−5をプライマー、およびmini−prep手順により調製したプラスミドDNAをテンプレートとして使用することによって、PCRスクリーニングにより挿入物を含有する陽性クローン(白)をさらにサブ染色した。ABI染料−ターミネーターキットを使用するDNA配列分析により、Txln1およびTxln2に対する2つの個別の配列(図6および7)を得た。少なくとも10個の個別のクローンを用いて、これらの配列を得た。
【0200】
Txln cDNAの5’および3’非翻訳領域(UTR)を決定するための遺伝子特異的プライマーの設計
2つのヌクレオチドの変更を伴うプライマーの新しい組(F1およびR1;Txln2R1)を設計し、G−C含有量を増加し、それによってDNAに対するプライマーのアラインメントを増大した。2つの変更は、コドン6でTTTをTTC(Fへのコードは維持する)に変更し、コドン5でGATをGAC(同じく、同一アミノ酸、Dを維持する)に変更する。以下の配列を有する新しい前方プライマー、F1を設計した。
F1:Txln1遺伝子特異的前方プライマー
ATATATGGATCCAAGGACCGGCCTGACTTC [配列番号29]
BamHI
【0201】
後方プライマーの場合、R1コドンAGT(アミノ酸59をコードする)をTCAに変更して、アミノ酸、セリン(S)を保存し、さらにR1プライマーのGC含有量を増加した。コドンGG(N)(アミノ酸58をコードする)をCに変更し、プライマーのDNAに対する結合を最適にした。対応するTxln2に特異的な後方プライマー、R2も用いた。プライマーの配列を以下に列挙する。
R1:Txln1遺伝子特異的後方プライマー
AACGGGAATTCTCAGAGCCACACGTGCTTTC [配列番号30]
EcoRI 終止
R2:Txln2遺伝子特異的後方プライマー
AACGGGAATTCTCATGAGCCACAGGTAGACTC [配列番号31]
EcoRI 終止
(Txln2遺伝子特異的後方プライマーは陽性PCR産物を生じるが、使用しなかった。)
【0202】
アガロースゲル電気泳動によって増幅産物を分離し、QIAquiok(登録商標)PCR精製キット(QIAGEN)を使用して、177bp増幅物を精製した。1〜2μg精製Txln−cDNA PCR産物をpGEM−2Tベクターに連結し、染料ターミネーターキット(Perken−Elmer Corporationノート、1995年8月)を使用して、配列決定を行った。Txln cDNAのヌクレオチド配列により、本発明者らは、遺伝子の5’および3’配列を決定するためのTxln1遺伝子特異的プライマーの第2の組を設計することが可能になった(3’および5’RACE方法)。それらのプライマー配列を以下に示し、最初の組と区別するために、遺伝子特異的プライマー(TX1FNおよびTX1RN)と呼ぶ。
5’および3’−SMART(登録商標)RACEcDNA増幅(Clonetech)
【0203】
5’−および3’−RACE反応について、cDNAの新調製物を調製した。SMART(登録商標)RACEキットは、2つの個別のcDNA集団:5’−RACE Ready cDNAおよび3’−RACE Ready cDNAの合成のためのプロトコルを含む。修飾ロック−ドッキングオリゴ(dT)プライマーおよびSMART(登録商標)IIオリゴを使用して、5’−RACEのためのcDNAを合成した。修飾されたオリゴ(dT)プライマーを5’−RACE cDNA合成プライマー(5’−CD)と呼び、これは3’末端に2つの変性オリゴ位置を有する。これらのヌクレオチドは、ポリA+テイルの開始位置にプライマーを置き、従来のオリゴ(dT)プライミングに固有の3’異種性を消失する(Borsenら、1994、PCR Methods Applic.2:144−148)。
【0204】
従来の逆転写手順を用い、しかし特殊なオリゴ(dT)プライマーを伴って、3’RACE cDNAを合成した。3’−RACE cDNA合成(3’−CD)は、5’−CD同様にロック−ドッキングヌクレオチド位を含み、5’末端同様にSMART(登録商標)配列の一部も有する。両5’および3’−RACE−Ready(登録商標)cDNA集団にSMART(登録商標)配列を取り込むことによって、異なるTxln遺伝子特異的プライマーと組み合わせてSMART(登録商標)配列を認識するユニバーサルプライマー混合物(Universal Primer Mix)(UPM)を用い、両RACE PCR反応をプライムすることができる。RACEのために使用されるプライマーの組は以下の通りである。
ユニバーサルプライマー混合物:
長ユニバーサルプライマー(0.2μM)
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT [配列番号32]
短ユニバーサルプライマー(1μM)
CTAATACGACTCACTATAGGGC [配列番号33]
ネステッドユニバーサルプライマー(NUP;10μM)
AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT [配列番号34]
【0205】
図8は、Txln遺伝子特異的プライマーによって得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動の移動パターンを示す。PCR産物(両5’−および3’−RACE)を電気泳動し、切り出し、そしてQLAquick(登録商標)ゲル抽出キット(QIAGEN)を用いてゲル精製した。
【0206】
Txln1の前形態をコードする領域のクローニング
5’および3’RACE配列より、TX1FN中にBamHI制限部位(最初の12ヌクレオチド)およびTX1RN中にEcoRI部位(12ヌクレオチド)を含有するTxln遺伝子特異的前方(TX1FN)および後方(TX1RN)プライマーを設計した。これらのプライマーの配列を以下に列挙する。
TX1FN
ATCAGCGGATCCATGTCTGGAGGT [配列番号35]
TX1RN
TCTCCTGAATTCTCAGGCAGCACAGGT [配列番号36]cDNAをプライマーとしておよびAdvantage2(登録商標)Taqポリメラーゼを用い、以下の条件:92℃/1分;50℃/1分;72℃/1分、30サイクルを使用して、PCRを行った。これらのプライマーは、Txln1前形態(83アミノ酸)をコードする配列に対応する産物を増幅した。
【0207】
Txln1前形態のクローニング
ゲルから3つの全てのPCR産物を精製し、挿入物に隣接するpGEM特異的プライマーを使用して、DNA配列決定のためにpGEM−2Tにクローニングした。3’および5’RACE産物を配列決定することによって、図9に概略されたヌクレオチドおよび推定アミノ酸[それぞれ、配列番号43および44]を誘導した。これにより、フレーム内のAAG(K)の上流外72ヌクレオチドの同定が可能となった。このことは、存在していたTxln1の全形態の存在を示唆する。外24種アミノ酸は、コード59アミノ酸の直ぐ上流に存在する。5’UTRの11ヌクレオチドも、3’UTRの143ヌクレオチドと共に同定された。さらに、3’RACE配列決定より、終止コドンの直ぐ上流の2つのアミノ酸は、アラニン、グリシンではなく、それほど正確な配列決定ではない本来の配列から誘導されるセリン(setine)であることが示された。しかし、Txln1およびTxln2に対するさらなる配列を、複数のクローンを配列決定することによって得た。広範な配列決定後、6つの個別なTxln遺伝子があることが明らかである。
【0208】
Txln1のコード領域のクローニング
同様に、Txln遺伝子特異的プライマーを設計して、活性型ペプチド(59種アミノ酸)をコードするPCR産物を得た。さらに、この場合、BamHI部位を前方プライマー(TX1TF)に取り込ませた。後方プライマーはRACE−Readyユニバーサルプライマー(長SMART(登録商標))であった。
【0209】
Txln活性型ペプチド配列プライマー:
TX1TF(前方)
ATTATAGGATCCAAGGACCGTCCGGAT [配列番号37];
RACE−Ready長ユニバーサルプライマー
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT [配列番号32]
【0210】
さらなるTxln遺伝子のクローニング
長ユニバーサルプライマー(LUP,Clontech RACE−Readyキット)と組み合わせて、上記のPCR条件を用いて、Txln2〜6(以下)のための前方プライマーも設計した。これらのプライマーの配列を以下に示す。
Txln2の前方プライマー(TX2T)
ATTATAGGATCCAAGGACCGTCCAGAG [配列番号38]Txln3の前方プライマー(TX3T)
AACGTCGGATCCAAGGACCGTCCAAAT [配列番号30]Txln4の前方プライマー(TX4T)
AACGTCGGATCCAAGGACCATCCAAAA [配列番号40]Txln5の前方プライマー(TX5T)
AACGTCGGATTCAAGGACCGTCCAAAA [配列番号41];および
Txln6の前方プライマー(TX6T)
ATTGTCGGATCCAAGGACCTGCCAAAG [配列番号42]
【0211】
全ての場合において、前方プライマーはクローニングを容易にするために挿入されたBamHI部位を有した。下線を付した配列は、コード配列の開始トリプレットを示す。
【0212】
上記のプライマーを用いて得られる増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分画し、適切なサイズでDNAを精製し、pGEM−2Tベクターにクローニングした。Clontech染料ターミネーターマトリックスおよびABI Prim(登録商標)モデル377シークエンサーを用いて、組換えプラスミドの配列決定を行った。この手順によって得られるTxln−6のヌクレオチド配列を、対応する推定アミノ酸配列と共に図10に示す。図11を見れば明らかなように、Txlnアミノ酸配列は高度に相同であり、この点ではコンセンサス配列が提供されている。
【0213】
Txln cDNAゲル精製されたPCR産物のpGEM−2T発現ベクターへの再クローニング
pGEM−2T構築物を用いて、組換えTxln(両59アミノ酸ペプチドおよび24アミノ酸ペプチドを含有する83アミノ酸分子)を発現させた。組換え発色物質S−2251および酵素プラスミンを用いて、Txln活性をアッセイした(Fribergerら、1978)。SDS−PAGEおよびTxlnに対する多価抗体を用いるウエスタンブロッティングにより、組換えTxlnを同定した(図12)。
【0214】
実施例3
フィブリン特異的モノクローナル抗体−テキシチリニン1コンジュゲートの産生 GrabarekおよびGergely(1990,Anal.Biochem.185:131−135)に従う2工程ゼロ長架橋手順によって、フィブリン特異的モノクローナル抗体、MAb 12B3.B10(IgG2A/κ)(Tymkewyczら、1993、前掲)を、化学的にプラスミンインヒビターTxlnにコンジュゲートする。簡単に説明すると、Txln1を、N−ヒドロキシスクシンイミド(スルホ−NHS)の存在下で水溶性カルボジイミド(EDC)と共にインキュベートすると、GluまたはAspのカルボキシル基がスクシンイミジルエステルに変換する。ゲル濾過によって過剰のEDCを除去した後、MAb 12B3.B10を活性化されたTxln1に添加する。架橋は、求核置換の2時間のインキュベーションによってIgGのリジン−アミノ基をスクシンイミジル部分にすることによって生じる。次いで、RautおよびGaffney(1996,Fibrinolysis 10(補遺4):1−26、要約番号39)Sepahdex200HR 10/30カラム上でサイズ排除HPLCを介して、IgG−Txln1コンジュゲートを、遊離のTxln1から精製する。次いで、精製された構築物を、発色物質S−2251を用い、プラスミン阻害活性についてELISAによって試験する。
【0215】
本明細書全体を通して、任意の1つの実施態様または特徴の特定の収集に対し、本発明を制限することなく、本発明の好適な実施態様を説明することを目的としてきた。当業者であれば、本発明の開示内容に照らし合わせて、本発明の範囲から逸脱することなく、具体化された特定の実施態様において様々な改変および変更を行うことができることを理解するであろう。そのような全ての改変および変更は、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【0216】
表の説明
表1.保存的アミノ酸および置換
表2.改変されたペプチドの作製のための非保存的アミノ酸
表3.阻害定数の概要。Enzfitter分析プログラムを用いて測定されたTxln S−100回収物のKiは、プラスミン濃度0.5nMを用い、0.15μM(n=6)であった。*先の研究(Willmottら、1995、前掲)から得られたデータを示す。ここで、プラスミンの濃度を用いて、アプロチニンが0.5nMであった場合のKiを決定する。
表4.マウス尾出血モデル−出血消失の決定。アプロチニンおよび2つの形態のTxln(1および2)で処置したマウスの血液消失を生理食塩水群と比較して示す。血液消失の減少%も示す。
【図面の簡単な説明】
本願発明を速やかに理解して実行に移せるようにするために、好ましい態様を、添付の図面を参照して実施例の形式で以下に記載する。
【図1】 オーストラリア・ブラウン・スネークからの毒のセファクリル(登録商標)S-300溶出プロファイルを示す。5つのタンパク質のピーク(1-5)が得られて、プラスミン阻害活性(即ち、Txln)は、カラムに添加された総タンパク質量の約2%からなるショルダーのピーク4において得られた。
【図2】 DEAE-セファロース(登録商標)CL-6Bクロマトグラフィーから得られた2つのプールされ濃縮されたフラクションの1つのセファクリル(登録商標)S-100溶出プロファイルを示す。示されたプロファイルは、Txln 1のものであるが、Txln 2のプロファイルも同一である。一方、挿入図は、逆相C18HPLCクロマトグラフィーを用いたTxln 1、Txln 2各々に対する2つの異なった溶出プロファイルを示す。
【図3】 図1におけるセファクリル(登録商標)S-300クロマトグラフィー由来の濃縮されたプラスミン阻害活性のDEAE-セファロース(登録商標)CL-6Bカラムの溶出プロファイルを表す。太線はプラスミン阻害活性の2つの分離したピークを示す(1及び2の記号)。
【図4】 プラスミン(2nM)のTxln 1(0-410nM)阻害のシグマプロット(Sigmaplot)を用いたリアルタイムカーブフィット分析を図示する。同様な阻害曲線がTxln 2で得られた(データは示さない)。
【図5】 Txln 1及びTxln 2のアミノ酸配列を、タイコトキシン(Taicotoxin)関連プラスミンインヒビター(TAC)及びアプロチニン(APRO)と同様に示す。配列は6つのシステインの位置によってアラインメントされた。
【図6】 Txln 1の部分的cDNA配列をリストする。この部分的配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に1文字表記で示される。文字「N」は不特定のヌクレオチドを表す。
【図7】 Txln 2の部分的cDNA配列をリストする。この部分的配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に1文字表記で示される。文字「N」は不特定のヌクレオチドを表す。
【図8】 2%アガロースゲル上での電気泳動の移動パターンをTxln遺伝子特異的プライマーで得られたPCR産物のEtBrによる染色で示す。レーン1,対照(テンプレート、プライマーなし);レーン2,5’−RACE PCR産物;レーン3,3’−RACE PCR産物;レーンM,サイズマーカー。
【図9】 5’及び3’RACE産物のヌクレオチド配列分析由来のTxln 1 cDNA配列をリストする。
【図10】 Txln 1-6の個々のプロフォーム(proform)に関連するヌクレオチド及び推定上のアミノ酸配列を示す。
【図11】 GCGウィスコンシン・スーツ(Wisconsin Suite)のPILEUPプログラムを用いたテキスティリニン・ポリペプチド配列の配列比較を示す。
【図12】 pGEM-2T-Txln 1組換えクローンを停留する多くのコロニーから発現されたテキスティリニン-GST融合タンパク質の還元条件下での15%SDSポリアクリルアミドゲルに関する。コロニーは配列特異的プライマーを用いてPCRスクリーニングによって選択された。数字はクローンの指示番号を表す。
【配列表】
Claims (51)
- プラスミンの一段階の競合的インヒビターであることを特徴とするプラスミンインヒビターの調製物であって、アミノ酸配列ECESTCAAを含み、一般式:KDZPZY”CZLBBZBGXCZXXXBXFA”YXBZZZZCBZFBYGGCXBNANNFXTXEECESTCAAを有し、
ただし、Xはいずれかのアミノ酸であり;
Y”は疎水性アミノ酸であり;
A”は芳香族アミノ酸又はヒスチジンであり;
ZはK,R,H,D,E,QまたはNであり;及び
Bは中性アミノ酸、もしくはP,A,G,S,T,VまたはLであり、19番目のXはRであり;並びに、医薬的に許容される担体及び/又は希釈剤を含み、調製物中の総物質の少なくとも60%がプラスミンインヒビターである、前記調製物。 - 3番目のZがHまたはRである請求項1の調製物。
- 5番目のZがK,N,EまたはDである請求項1の調製物。
- 6番目のY”がFまたはLである請求項1の調製物。
- 8番目のZがEまたはKである請求項1の調製物。
- 10番目のBがPまたはLである請求項1の調製物。
- 11番目のBがPまたはAである請求項1の調製物。
- 12番目のZがEまたはDである請求項1の調製物。
- 13番目のBがTまたはIである請求項1の調製物。
- 15番目のXがP,SまたはRである請求項1の調製物。
- 17番目のZがK,N,E,DまたはRである請求項1の調製物。
- 18番目のXがD,G,AまたはVである請求項1の調製物。
- 20番目のXがT,P,FまたはIである請求項1の調製物。
- 21番目のBがG,VまたはPである請求項1の調製物。
- 22番目のXがA,SまたはRである請求項1の調製物。
- 24番目のA”がYまたはHである請求項1の調製物。
- 26番目のXがSまたはNである請求項1の調製物。
- 27番目のBがP,AまたはTである請求項1の調製物。
- 28番目のZがDまたはRである請求項1の調製物。
- 29番目のZがE,D,HまたはQである請求項1の調製物。
- 30番目のZがH,K,RまたはQである請求項1の調製物。
- 31番目のZがK,QまたはEである請求項1の調製物。
- 33番目のBがLまたはIである請求項1の調製物。
- 34番目のZがEまたはKである請求項1の調製物。
- 36番目のBがLまたはIである請求項1の調製物。
- 41番目のXがE,GまたはKである請求項1の調製物。
- 42番目のBがCまたはGである請求項1の調製物。
- 48番目のXがK,NまたはIである請求項1の調製物。
- 50番目のXがK,QまたはIである請求項1の調製物。
- プラスミンインヒビターが更にアミノ酸配列NANNFを含む、請求項1に記載の調製物。
- プラスミンインヒビターが更にアミノ酸配列YGGCを含む、請求項1に記載の調製物。
- プラスミンインヒビターが、
(a)配列番号2
(b)配列番号4
(c)少なくとも15の連続した配列番号2又は4のアミノ酸配列を含み、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持している配列番号2又は4いずれか1つの生物学的活性断片
(d)プラスミンの一段階の競合的阻害を保持している配列番号2又は4の配列に少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含むプラスミンインヒビターである、請求項1、請求項30又は31に記載の調製物。 - ポリペプチドが、一段階の競合的阻害を保持する、少なくとも15の連続したアミノ酸配列及び配列番号14の配列を含むリーダーペプチド又は生物学的活性を有するそのフラグメントを含むポリペプチドである、請求項32に記載の調製物。
- ポリペプチドが、配列番号16及び配列番号18からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項33に記載の調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して1×10-8M-1から1×10-10M-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜34のいずれかの調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して5×10-8M-1から8×10-9M-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜34のいずれかの調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して1×10-9M-1から5×10-9M-1の範囲の解離定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜34のいずれかの調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して4×10-5秒-1M-1から5×10-7秒-1M-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜37のいずれかの調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して1×10-6秒-1M-1から1×10-7秒-1M-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜37のいずれかの調製物。
- プラスミンインヒビターが、プラスミンに対して2×10-6秒-1M-1から9×10-6秒-1M-1の範囲の解離速度定数をもつことをさらに特徴とする請求項1〜37のいずれかの調製物。
- 調製物中の全物質の少なくとも75%がプラスミンインヒビターである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の調製物。
- 調製物中の全物質の少なくとも90%がプラスミンインヒビターである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の調製物。
- 調製物中の全物質の少なくとも95%がプラスミンインヒビターである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の調製物。
- 調製物中の全物質の少なくとも99%がプラスミンインヒビターである、請求項1〜40のいずれか一項に記載の調製物。
- 請求項1〜34のいずれか一項に記載されたプラスミンインヒビターのアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項45に記載の単離されたポリヌクレオチドが、
(a)配列番号1;
(b)配列番号3;及び
(c)前記ポリヌクレオチド配列のいずれかの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、前記単離されたポリヌクレオチド。 - リーダーポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む、請求項46に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号13、又は前記配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、プラスミンの一段階の競合的阻害を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列である、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号15、配列番号17、及び配列番号43からなる群から選択される、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 患者における血液損失を軽減するための医薬組成物であって、請求項1〜34のいずれか一項に記載の調製物及び医薬的に許容される担体を含む上記組成物。
- 抗フィブリン抗体にコンジュゲート(conjugate)された請求項1〜34のいずれか一項に記載の調製物を含む抗腫瘍剤。
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