JPH05252954A - 新規な組織因子インヒビターをコードする遺伝子断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 正常なヒト肝細胞に由来する、組織因子イン
ヒビターとして知られる抗血液凝固活性を有する物質を
コードする新規なＤＮＡ配列を提供する。さらに本発明
の遺伝子断片を適当な発現系において発現させることに
より、臨床治療薬や診断薬に有用な抗血液凝固活性を有
するペプチドおよびその抗体を提供する。 【構成】 正常なヒト肝細胞に由来するｃＤＮＡから組
織因子インヒビターをコードするｃＤＮＡを取得した。
本発明のｃＤＮＡは、従来から知られる組織因子インヒ
ビターの配列と比較して、塩基配列において３４カ所が
異なり、翻訳されるアミノ酸配列においても２０カ所が
異なる新規なペプチドをコードするｃＤＮＡである。本
発明のｃＤＮＡを用いて調製される発現産物は、本来の
組織因子インヒビター活性を保持しており、臨床治験薬
や診断薬に極めて有用な材料となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組織因子インヒビター
（ＴＦＩ）、外因系凝固インヒビター（ＥＰＩ）あるい
は、リポタンパク結合性凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）
として知られる血液凝固インヒビターに関する。さらに
詳細には、正常細胞から取得される、全長のＴＦＩをコ
ードしているcDNA遺伝子断片に関する。

【０００２】

【発明の背景】出血は生体にとって最も重篤な病態の一
つであり、生体内ではこれを制御するための一連の血液
凝固反応が存在している。この血液凝固反応は内因系凝
固反応と外因系凝固反応の２つの経路に分類される。現
在、生理的には内因系凝固反応よりもむしろ、Tissue F
actor（以下TF）に始まる外因系凝固反応の方が重要視
されている［Nemerson Y.ら Blood, 71 p1-8 (198
8)］。外因系凝固反応では、TFは通常血液に接触するこ
とはないが、血管の損傷や、他の何らかの原因によって
血液にさらされることにより、血漿中の血液凝固Factor
VII/VIIaと速やかに結合する。この結果生じたTF/VIIa
複合体が、血液凝固FactorIX、Ｘを活性化することで最
終的に血液を凝固させる反応系である。このTFによる血
液凝固開始反応の制御に関する初期の研究で、血清が組
織トロンボプラスチン（TF）の阻害活性を示すことが示
唆されていた［Thomas L.,Bull.Johns Hopkins Hosp.81
p26-42(1947)］。また、この阻害活性はカルシウムイ
オンの存在に依存していた。さらにHjortは、この阻害
物質がVIIa、Ca²⁺、およびトロンボプラスチンの複合体
を認識していることを示した［Hjort,P.F., Scand.J.Cl
in.Lab.Invest.9 p1-182(1957)］。1980年代に入っ
て、Sandersらはこの阻害活性にはFactor Ｘが必要であ
ることを示し［Sanders,N.L., Blood, 66 p204-212 (19
85)］、血漿の密度勾配遠心でリポプロテイン画分に存
在することも明らかになってきた。この阻害物質と阻害
機構は、おもにBrozeらの研究によって明らかにされ
た。

【０００３】Brozeらはヒト肝腫瘍細胞（HepG2）の培養
液からこの阻害物質（以下LACI）を精製し［Broze G.J.
Jr., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84 p1886-1890 (198
7)］、その抗体を用いてヒト胎盤のλgt11cDNAライブラ
リーからLACIをコードするcDNAをスクリーニングした。
そして、その塩基配列から全アミノ酸配列が推定された
［Wun,T-C. J.Biol.Chem., 263 p6001-6004 (1988)］。
これによるとLACIは、シグナル配列２８個を含む３０４
個のアミノ酸からなり、Kunitz型のプロテアーゼインヒ
ビターと相同なアミノ酸配列３カ所を有する。Kunitz型
のプロテアーゼインヒビターは、アプロチニンに代表さ
れるように種々のプロテアーゼを阻害する活性をもって
いることが知られている。LACIの場合は、Ｘａの阻害に
は３つの領域のうち第２の反応部位が必要で、TFとFact
orVIIaの複合体には第１と第２の反応部位の両方が必要
であることが明らかとなった。また第３の反応部位はこ
れらの阻害活性には不必要であることも示された［Gira
rd,T.J., Nature, 338 p518-520 (1989)］。

【０００４】もうひとつのLACIの特徴であるリポプロテ
インとの結合については、前述のようにLACIが血液中で
はリポプロテイン画分に存在すること、血漿より精製し
たLACIをSDS-PAGEで展開すると、非還元状態では多くの
高分子量のバンドとして確認でき、それらにはアポリポ
プロテインＡIIが存在すること、また還元状態ではリポ
プロテインと解離することから明らかとなった［Novotn
y,W.F., J.Biol.Chem., 264 p18832-18837 (1989)］。
しかし、LACIのリポプロテインとの結合様式、およびそ
の意義についてはいまだ不明である。リポプロテインは
種々の条件でその血漿中の濃度が大きく変動するが、特
に動脈硬化に代表されるような病態において、血栓形成
機構との関連を明らかにするうえで、LACIは非常に重要
なファクターである可能性が高い。

【０００５】LACIの生理的意義を明らかにするためには
種々の病態時におけるLACIを測定する必要があるが、そ
の際問題となるのはその生合成の場所と血液中での存在
様式である。従来LACIは肝臓で合成されるほか、内皮細
胞、単球由来細胞など種々の細胞で合成され［Bajaj,M.
S., J.Clin.Invest., 79 p1874-1878 (1987)］、また血
小板からも遊離することが報告されている［Novotny,W.
F., Blood, 72 p2020-2025 (1988)］。一方、LACIはリ
ポプロテインと結合して存在する以外にも、ヘパリン様
物質と結合して内皮細胞に存在する可能性も指摘されて
いる。しかしながら、これらのLACIを分別定量する手段
は今のところない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】LACIをコードするcDNA
は、本発明者以外にも他の研究者によっていろいろな臓
器に由来するcDNAライブラリーからスクリーニングされ
ている。例えばHepG2［Pedersen,A.H., J.Biol.Chem, 2
65 p16786-16793 (1990)］、Fetal liver、胎盤［Wun,T
-C J.Biol.Chem., 263 p6001-6004 (1988)］、HUVEC
（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）［Girard,T.J., Thromb.
Res.,55 p37-50 (1989)］である。これらは、いずれも
培養上清中に高いLACI活性を産生するものであるが、正
常な肝細胞に由来するLACIがどのようなものかは不明で
あった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
末、正常な肝細胞に由来するLACIのcDNAを取得した。こ
のcDNAの塩基配列を解析したところ、本発明のcDNAは、
公知のLACIをコードする遺伝子の塩基配列（特開平1-16
5383号）とはオープンリーディングフレームにおいて34
カ所もの塩基が異なっており、これにコードされるアミ
ノ酸配列においても20もの残基が異なる新規なペプチド
をコードする遺伝子断片であることが確認された。さら
に本発明の遺伝子断片を動物細胞にて発現させたとこ
ろ、発現産物において本来のLACIが有する抗血液凝固活
性が確認された。

【０００８】正常ヒト肝細胞からLACIのcDNAを得るに
は、公知の方法でヒトの肝細胞に由来するmRNAから調整
されるcDNAを用いることができる［Sambrook,J.,Molecu
lar cloning:A Laboratory manual（1989）Cold Spring
Harbor Laboratory］。すなわち、このcDNAをλファー
ジに組み込んで得られるファージライブラリーをスクリ
ーニングして、LACIのcDNAを得る方法である。またその
ほかにPolymerase ChainReaction（PCR）法により、LAC
IのcDNAをより効率的に増幅することが可能である。

【０００９】ヒト肝細胞から抽出したmRNAを鋳型として
逆転写酵素を作用させることにより、first strandのcD
NAを合成した。これを鋳型として、LACIの遺伝子に特異
的なプライマーを用いてPCR反応を実施することによっ
てLACIをコードするcDNAが得られた。このcDNA断片を精
製後、大腸菌のクローニングベクター（BluescriptIISK
(+)：東洋紡（株））に組み込み、これを用いて大腸菌
を形質転換させた。このサブクローニングで得られたク
ローンからLACIのcDNAを含むプラスミドを得、その塩基
配列を決定した。これを公知の塩基配列と比較すると、
オープンリーディングフレームにおいて34カ所もの塩基
が異なっており、これにコードされるアミノ酸配列でも
20の残基が異なっていた。

【００１０】本発明のLACIcDNAを発現する手段として、
宿主としては大腸菌、酵母、動物細胞などが利用可能で
あり、発現ベクターもそれぞれの発現系に応じたものが
常法に準じて利用できる。本発明においては、好ましく
は動物細胞を宿主細胞として使用することにより、LACI
cDNAが有する本来のシグナルペプチドを有効に作用さ
せ、成熟したペプチドとして宿主細胞に発現させること
が可能である。また、より好ましくはジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（dhfr）を欠損した（dhfr(-)）株、例えばChi
nese hamster ovary （CHO）細胞のDG44（dhfr(-)）株
を宿主とし、LACIの遺伝子とともにdhfr遺伝子を組み込
んだ発現ベクターを導入して得られる形質転換細胞を、
dhfr遺伝子が増幅する培養条件下にて培養することによ
って目的のLACIをより効率よく発現させることが可能と
なる。

【００１１】このように形質転換細胞を培養することに
より、容易に抗血液凝固活性を有するペプチドが得られ
る。本発明により得られる発現産物を純化精製して得ら
れたペプチドのＮ末端分析から、本発明のcDNA塩基配列
から翻訳されるアミノ酸配列においては、公知のものと
同じく28個のシグナル配列を含むことが明らかにされ
た。従って、本発明の遺伝子断片とは、翻訳開始コドン
(ATG)に始まる３０４個のアミノ酸からなるLACIをコー
ドする遺伝子断片およびシグナルペプチド領域を除いた
２７６アミノ酸からなる成熟LACIをコードする遺伝子断
片の両者を言う。さらに、本発明のペプチドは、上記の
いずれかの遺伝子断片を発現させることにより得られる
ペプチド、及び配列表：配列番号１に記載するアミノ酸
配列のうちアミノ酸順位で１から３０４までのアミノ酸
配列からなるペプチド並びに２９から３０４までのアミ
ノ酸配列からなるペプチドを言う。

【００１２】このように本発明のLACIcDNAを発現させる
ことにより得られたペプチドを免疫用抗原として用い、
マウス免疫・細胞融合などの一連の操作を常法に従い行
うことにより本発明のLACIペプチドに特異的なモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。このようなモノク
ローナル抗体を用いることにより、血栓症に代表される
種々の病態における凝固系の異常を調べることができ
る。例えば、サンプル中のLACIペプチドの存在またはそ
の定量を行う際に、ELISA等の抗原抗体反応を用いて極
めて有効に測定することが可能となる。また、このよう
なモノクローナル抗体は、これをキメラ化することによ
り、血栓症等に対する治療薬としての応用も有効である
と考えられる。

【００１３】本発明のLACIcDNAは、実施例４の結果から
も判るとおり、従来から知られている遺伝子とは別にヒ
ト生体中に存在する遺伝子由来のものであり、このよう
な遺伝子および活性ペプチドの存在は、本発明により初
めて明らかにされるものである。

【００１４】以下、本発明を実施例に沿ってさらに詳細
に説明するが、下記の実施例により限定されるものでは
ない。

【００１５】

【実施例】実施例１：LACIcDNAのサブクローニングと塩基配列の決
定 ヒト正常肝細胞由来Poly(A+)RNAはClonetech社から、pB
luescriptIISK(+)、KS(+)は東洋紡（株）から、各種制
限酵素、修飾酵素、リンカーは宝酒造（株）から購入し
た。

【００１６】(1) first strand cDNAの調整 Poly(A+)RNAをoligo(dT)₁₇とともに70℃、10分間処理
し、RNase Inhibitor存在下で逆転写酵素を添加し、37
℃、1hrインキュベートすることにより、ファーストス
トランド(f.s)cDNAを調整した。

【００１７】(2) LACIcDNAの増幅 (1)で得られたf.s cDNAを鋳型とし、Wunらの報告したシ
ークエンス（Wun,T-CJ.Biol.Chem.,263（1988）6001-60
04）から考慮される5'末端および3'末端の合成オリゴヌ
クレオチドを下記に示すDNA配列をプライマーとして、P
olymerase Chain Reaction（PCR）法30サイクルの反応
［94℃1分間、50℃1分間および72℃4分間を30サイク
ル］によりLACIcDNAを増幅した。 5'-CTC GAG ATG ATT TAC ACA ATG AAG AAA GTA 5'-GGA TCC TTA GTA GAA TTA ATG TTA CAT TGC

【００１８】(3) LACIcDNAのクローニング (2)で得られたcDNA溶液をアガロースゲル電気泳動によ
り分離精製し、制限酵素XhoＩ、BamHＩで消化した後、
プラスミドpBluescriptIISK(+)へT4DNAリガーゼを用い
て挿入し、環状化したプラスミドpBL.LACI.11を構築し
た。さらにこのpBL.LACI.11を制限酵素BamHIで消化し、
リン酸化SalIリンカーをT4DNAリガーゼを用いて挿入
し、環状化したプラスミドpBL.LACI.Sa.219を構築し
た。また、インサートDNAの向きを変えたプラスミド
は、pBL.LACI.Sa.219を制限酵素SacI、KpnIで消化して
得られるLACIをコードするDNA断片を精製した後、同じ
くSacI、KpnIで消化したpBluescriptIIKS(+)にT4DNAリ
ガーゼを用いて挿入し、環状化することによって構築し
た（プラスミドpBL.LACI.Sa.219R）。

【００１９】(4) cDNAの塩基配列およびその予想タンパ
ク配列 (3)で得られたプラスミドpBL.LACI.Sa.219およびpBL.LA
CI.Sa.219Rを導入した大腸菌JM109に、それぞれM13ファ
ージ（K07、10¹⁰PFU/ml）1μlを添加し、37℃、30分イ
ンキュベートすることによってM13ファージを感染させ
た。これを10mlの2×YT培地（1.6%Bacto Trypton、1%Ba
cto YeastExtract、0.5%NaCl）に添加し、37℃、24hr培
養した。培養上清中の一本鎖DNAを20%ポリエチレングリ
コールで分画し、フェノール処理、エーテル処理した
後、エタノール沈澱によって精製一本鎖DNAを得た。

【００２０】得られた2つの一本鎖DNAを鋳型としてM13
プライマーをもちいてジデオキシ法によりcDNAの塩基配
列を決定した。用いた試薬および方法は、宝酒造（株）
の7-DEAZAシークエンシングキットに準じた。公知の塩
基配列と比較してみると、オープンリーディングフレー
ム912塩基対の中で34カ所、また塩基配列から予想され
るアミノ酸配列ではシグナル配列を含む304残基中20残
基のアミノ酸が異なっていた。

【００２１】実施例２：動物細胞発現プラスミドの構築
と動物細胞での発現 実施例１で構築したプラスミドpBL.LACI.Sa219を、制限
酵素XhoI、SalIで消化し、精製したLACIをコードするDN
A断片を、T4DNAリガーゼをもちいてニワトリβ-アクチ
ンプロモーターを有するシャトルベクターpSAc.dhfr
（特開平2-5884号）へ連結環状化し、LACI発現プラスミ
ドpSAc.LACI.dhfrを構築した。

【００２２】チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞
のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（DHFR(-)株）、DG4
4［Somatic Cell and Molecular Genetics 12, p555-56
6 (1986)］2×10⁵個/穴をファルコン社製組織培養6穴マ
ルチプレート内で、10%牛胎児血清を含むMEMアルファ培
地（ヌクレオシドを含む）3ml/穴を用いてCO₂インキュ
ベーター内で37℃、一晩培養した。前述の発現プラスミ
ドpSAc.LACI.dhfrをもちいて、CHO細胞をリン酸カルシ
ウム法にて形質転換した。リン酸カルシウム法と試薬
は、STRATAGENE社のキットに準じた。

【００２３】16hr培養の後、3ml/穴の透析した10%牛胎
児血清を含むヌクレオシドを含まないMEMアルファ培地
（以下選択培地）へ培地交換し、その後3〜4日毎に新し
い選択培地に交換しながら培養を続けると、pSAc.LACI.
dhfrが導入され、DHFR(+)となった細胞のみが生存する
ようになった。形質転換より約1カ月後、新しい選択培
地と交換し、1日当たりのTF/VIIa複合体によるＸａ生成
の阻害活性［Sandset,P.M., Thromb.Res., 47, 389-400
(1987)］で、0.2U/10⁶個/day（バリウム吸着血清中の
阻害活性を1U/mlとする）でLACI活性を発現する細胞を
得た。

【００２４】上記で得られたLACIを産生するCHO細胞（C
HO.LACI株）を、限界希釈法でクローニングした。クロ
ーニングした細胞をヌンク社製組織培養96穴プレートに
まき、0.1ml/穴の選択培地中で培養し各クローンの細胞
培養上清中のLACI活性を測定した。次にLACIの遺伝子を
増幅させる目的で、各クローンを50nMのメトトレキセー
ト（MTX）を含む選択培地にて培養した。3〜4日おきに
新しい50nMMTXを含む選択培地と培地交換しながら、2週
間培養を続けた。さらに250nMのMTXを含む選択培地にて
培養し、以下同様の手順で、1μMの濃度までMTX濃度を
段階的に上昇させることで遺伝子増幅を実施し、最終的
に1μMのMTXで10U/10⁶個/dayでLACI活性を発現する細胞
（CHO.LACI.JK1）を得た。

【００２５】実施例３：組換えLACIの純化 実施例２で得られたCHO細胞（CHO.LACI.JK1）の無血清
培養上清から組換えLACIを精製した。

【００２６】実施例２で得られたLACI産生細胞、CHO.LA
CI株（CHO.LACI.JK1）を、ファルコン組織培養6穴プレ
ート（ベクトンデイッキンソン社製）内で、1μMMTXを
含む選択培地で培養し、最終的にヌンク社製のcell fac
tory（6000cm²）へ拡張した。37℃で3〜4日間培養した
後、無血清培地（味の素（株）製、ASF104KK）に培地交
換した。1〜2日おきに培地交換し、最終的に培養上清15
リットルを得た。

【００２７】得られた無血清培養上清からの精製法は、
Pedersenらの方法［Pedersen,A.H.,J.Biol.Chem,265 16
786-16793 (1990)］に準じた。上記で得られた無血清培
養上清に最終濃度10mMのベンズアミジン、1mMDFP、10mM
HEPES(pH7.2)を添加し、0.45μmのメンブランフィルタ
ーで濾過後、アミコン社製ホローファイバーメンブラン
（H1P30-20）でおよそ10分の1量まで濃縮した。この濃
縮培地を、0.2MNaClを含むバッファーＢ（20mM Tris・HC
l pH7.5、10%グリセリン）で平衡化したヘパリンセファ
ロース（Pharmacia社製）にアプライした。溶出は1MNaC
lまでのグラジエントによって実施した。LACI活性を持
つ画分をプールし、バッファーＢに対して透析した後、
25mMNaClを含むバッファーＢで平衡化したMonoＱHR5/5
（Pharmacia社製）にアプライし、0.5MまでのNaClグラ
ジエントで溶出した。この溶出画分を、バッファーＣ
（20mMクエン酸ナトリウムpH5.0、10%グリセリン）に対
して透析し、同じバッファーで平衡化したMonoＳHR5/5
（Pharmacia社製）にアプライした。バッファーＣか
ら、イミダゾールバッファー（50mMイミダゾールpH.7.
4、0.6MNaCl、10%グリセリン）までのリニアグラジエン
トで溶出した。MonoＳ工程をもう一度繰り返し、最終的
に比活性約15000U/mgの精製組換えLACIを得た。

【００２８】精製した組換えLACIをSDS-PAGE電気泳動
後、ナイロンフィルターに転写し、Ｎ末端分析を実施し
た（エドマン法、アプライドバイオシステムズ社製、プ
ロテインペプチドシークエンサーモデル477A）。29番目
のアミノ酸から20残基のアミノ酸配列が決定され（下
記）、これは塩基配列から予想されるものと一致した。
28番目まではシグナルペプチドであり、本発明者らの実
施したCHO細胞における発現タンパクでも公知のもの［N
ovotny,W.F., J.Biol.Chem., 264, p18832-18837(198
9)］と同様にこのシグナル領域は切断されたと考えられ
る。下記に示すアミノ酸配列のうち8番目のTyr(Y)は、
これまでに報告されている配列ではHis(H)であり、本発
明のペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する。

【００２９】Asp-Ser-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-Tyr-Thr-Il
e-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu-Leu-Pro-Pro-Leu-Lys

【００３０】実施例４：種々のライブラリー中のLACIcD
NAのスクリーニング PCRによるDNA増幅においてはプライマーの3'末端が本質
的に重要であり、これが鋳型のcDNAと異なっていれば目
的遺伝子はほとんど増幅されない。これを利用して、公
知の塩基配列と本発明の塩基配列で異なる部位を2カ所
選び、その部分を3'末端とするプライマーを作成し、こ
れらを用いていくつかのcDNAライブラリーを鋳型とした
PCRを実施した。以下に用いたプライマーの配列をそれ
ぞれの塩基配列とともに示す。

【００３１】W-43、W-345： 公知の塩基配列に合致する
プライマー K-43、K-345： 本発明の塩基配列に合致するプライマー W-43 CAGTCGACACTTTGGGCTTCTG（5'末
端にSalIサイトを持つ） 5'ACAATGAAGAAAGTACATGCACTTTGGGCTTCTGTAT（公知塩基
配列） 5'ACAATGAAGAAAGTACATGCACTTTGGGTTTCCATAT（本発明塩
基配列） K-43 CAGTCGACACTTTGGGTTTCCA（5'末
端にSalIサイトを持つ） W-345 TTGGATCCTTTTCTTGTTGCAATGTT（5'末端にBamH
Iサイトを持つ） 3'TTAGACCGAAAAGAACAACGTTACAACAGAA（公知塩基配列） 3'TTAGACCGAAAAGAACAACGTTACGGCAGAA（本発明塩基配
列） K-345 TTGGATCCTTTTCTTGTTGCAATGCC（5'末端にBamH
Iサイトを持つ）

【００３２】正常な肝細胞に由来する３つの異なるライ
ブラリー、正常ヒト肝細胞cDNAライブラリー（λgt10;C
lonetech社製）、正常ヒト肝細胞cDNAライブラリー（λ
gt11;Clonetech社製）、正常ヒト肝細胞cDNAライブラリ
ー（5'-STRETCH/λgt11;Clonetech社製）、およびヒト
胎盤cDNAライブラリー（5'-STRETCH/λgt11;Clonetech
社製）のそれぞれ1μlを滅菌蒸留水10μlに加え、100
℃、2分間煮沸することによりファージ粒子を破壊し、
これらを鋳型として、の4つのプライマーでPCR（30サ
イクル）を実施した。

【００３３】PCRサンプルの一部をアガロース電気泳動
によって展開したところ、プライマーの異なる組み合わ
せの場合（W43とK345、K43とW345）目的サイズのDNA
（約300bp）は増幅されなかった。一方胎盤のライブラ
リー、正常肝細胞（5'-STRETCH）のライブラリーでは、
W43とW345の組み合わせと、K43とK345の組み合わせの両
方で目的サイズのDNAが増幅された。また他の2つの正常
なヒト肝細胞cDNAライブラリーからは、K43とK345の組
み合わせの場合のみ、すなわち本発明の塩基配列をもつ
DNA断片のみが増幅された。その結果を下の表１に示
す。

【００３４】

【表１】 ─────────────────────────────────── cDNAライブラリー プライマー組み合わせ W43/W345 K43/K345 W43/K345 K43/W345 ─────────────────────────────────── 正常肝細胞（λgt10） − ＋ − − （λgt11） − ＋ − − （5'-STRETCH/λgt11） ＋ ＋ − − 胎盤 （5'-STRETCH/λgt11） ＋ ＋ − − ───────────────────────────────────

【００３５】以上のことよりヒト生体中には、すでに公
知の塩基配列を有するLACIをコードするDNA断片とは別
に、本発明の塩基配列を有するDNA断片が存在すること
は明かである。

【００３６】尚、本発明のLACIをコードするcDNAを有す
るプラスミドは、大腸菌に組み込まれた形で Escherich
ia coli JK-LA219（微工研菌寄第12395号、FERM P-1239
5）として本出願人らにより寄託されている。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、抗血液凝固活性を有する
物質をコードする新規なＤＮＡ配列が提供される。さら
に本発明の遺伝子断片を適当な発現系において発現させ
て得られる抗血液凝固活性を有するペプチドは、血液凝
固系に異常をきたした疾患、例えばＤＩＣ（汎発性血管
内凝固）等に対する血栓予防治療剤として有用と考えら
れる。また本発明によるペプチドを免疫して得られる抗
体を利用して、血液凝固系の動態を追う有力な手段とな
る。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ヒト 配列 ATG ATT TAC ACA ATG AAG AAA GTA CAT GCA CTT TGG GTT TCC ATA TGC 48 Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Val Ser Ile Cys 1 5 10 15 CTG ATG CTT AAT CTT GCC CCT GCT CCT CTT AAT GCT GAT TCT GAG GAA 96 Leu Met Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30 GAT GAA GAA TAC ACA ATT ATC ACA GAT ACT GAG TTG CCA CCA CTG AAA 144 Asp Glu Glu Tyr Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45 CTT ATG CAT TCA TTT TGC GCA TTC AAG CCA GAT GAT GGC CCA TGT AAA 192 Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Pro Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60 GCA ATC ATG AAG AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG TGT GAA 240 Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu 65 70 75 80 GAA TTT ATA TAT GGG GGA TGT GGA GGA AAT CAG AAT CGA TTT GAA AGT 288 Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 ATG GAA GAG TGC AAA AAA GTA TGT ACA AGA GAT AAT GTA CAC AGG ATT 336 Met Glu Glu Cys Lys Lys Val Cys Thr Arg Asp Asn Val His Arg Ile 100 105 110 ATA CAG ACG GCA TTG CAA CAA GAA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA 384 Ile Gln Thr Ala Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125 GAA GAT CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC 432 Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140 AAT CAG TCA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC 480 Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160 AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG AAC ACC TGT GAA 528 Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Thr Cys Glu 165 170 175 GAT GGT TTG AAT GGT TTC CAG GTG GAT AAT TAT GGA ACC CAG CTC AAT 576 Asp Gly Leu Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn 180 185 190 GCT GTG AAT AAC TCC CAG ACT CCA CAA TCA ACC AAG GTT CCC AGC TTT 624 Ala Val Asn Asn Ser Gln Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Phe 195 200 205 TTT GAA TTT CAC GGT CCC TCA TGG TGT CTC GCT CCA GCA GAC AGA GGA 672 Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Ala Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220 TTG TGT CGT GCC AAT GAG AAC AGA TTC TAC TAC AAT TCA GTC ATT GGG 720 Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly 225 230 235 240 AAA TGC CGC CCA TTT AAG TAC AGT GGA TGT GGG GGA AAT GAA AAC AAT 768 Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255 TTT ACT TCT AAA AGA GAA TGT CTG AGG GCA TGT AAA AAA GGT TTC ATC 816 Phe Thr Ser Lys Arg Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile 260 265 270 CAA AGA ATA TCA AAA GGA GGC CTA ATT AAA ACC AAA AGA AAA AGA AAG 864 Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285 AAG CAG AGA GTG AAA ATA GCA TAT GAA GAA GTT TTT GTT AAA AAT ATG 912 Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Val Phe Val Lys Asn Met 290 295 300 TGAATTCGTT ATAGCAATGT AACATTAATT CTACTAAA 950

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/64 8314−4Ｃ 39/395 Ｐ 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列図：配列番号１に記載のＤＮＡ配列
   を有することを特徴とする、抗血液凝固インヒビターを
   コードする遺伝子断片。
2. 【請求項２】 配列表：配列番号１に記載するＤＮＡ断
   片を形質転換細胞内で発現させることにより得られる抗
   血液凝固活性を有するペプチド。
3. 【請求項３】 該形質転換細胞が動物細胞である前記第
   (2)項記載のペプチド。
4. 【請求項４】 配列表：配列番号１に記載するアミノ酸
   配列のうちアミノ酸順位で２９から３０４までのアミノ
   酸配列からなる抗血液凝固活性を有するペプチド。
5. 【請求項５】 前記第(2)から(4)項のいずれかに記載の
   ペプチドを免疫抗原として用いて調製されることを特徴
   とするモノクローナル抗体。