JPH07155176A - トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する培養物 - Google Patents

トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する培養物

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JPH07155176A
JPH07155176A JP6119200A JP11920094A JPH07155176A JP H07155176 A JPH07155176 A JP H07155176A JP 6119200 A JP6119200 A JP 6119200A JP 11920094 A JP11920094 A JP 11920094A JP H07155176 A JPH07155176 A JP H07155176A
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修司 山本
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】特定のアミノ酸配列、またはその相同変異体の
アミノ酸配列を含有し、トロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドまたはその相
同変異体をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを複製
可能な発現ベクターに結合して、該ＤＮＡと該複製可能
な発現ベクターとを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡ
を得、（ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物また
は細胞を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、
（ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、（ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体
に該ＤＮＡを発現させて得られる、該ペプチドまたはそ
の相同変異体を含有する微生物または細胞の培養物。 【効果】本培養物は抗血液凝固作用、血小板凝集抑制作
用、血栓溶解作用を併有し副作用の少ない循環器系疾患
などの治療用薬として極めて有用な該ペプチドの遺伝子
工学的製造における中間体として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトロンビンのプロテイン
Ｃ活性化を促進する作用を有する新規なペプチドの遺伝
子工学的製造における中間体、としての微生物または細
胞の培養物に関する。更に詳しくは、本発明は血栓溶解
作用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有し、
循環器系の疾患の治療に有用なペプチドの遺伝子工学的
製造における中間体、としての微生物または細胞の培養
物に関する。本発明はまた、血液抗凝固反応、例えば活
性化プロテインＣ産生反応あるいは血液抗凝固反応等の
大量アッセイにおける、高再現性のエフェクターまたは
陽性標準として使用できる、該ペプチドの粗標品として
の培養物に関する。
【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。
【０００３】Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基
【０００４】また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチドは下記の如き略号で表されるデオ
キシリボヌクレオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限り、デオキシリボヌクレオチド配列の
左端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。
【０００５】
【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。現在これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤およ
び血小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用
して、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉
塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患
の治療及び予防に用いられている。しかしながら、これ
らの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極
く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線溶
系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤が
求められていた。
【０００６】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。
【０００７】ウサギ肺に存在する物質については、例え
ば、シー．ティー．エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）
ら、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
オブサイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁
（１９８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓ
ｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７
巻、８５９頁（１９８２年）；シー．ティー．エスモン
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ
エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５８巻、１２２３８頁（１９８
２年）を参照することができる。
【０００８】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム （Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。ヒト肺に存在する
物質については、例えば楠本ら、生化学、５７巻、１１
０２頁（１９８５年）を参照することができる。
【０００９】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されている。しかしながら、その物質の構
造、例えばアミノ酸配列などは解明されておらず、未だ
にその物質は同定されていない。従って、上記の先行技
術文献に報告されている物質が単一物質であるか否か、
また、これらの先行技術文献の記載にしたがって同一の
物質が繰返し得られるか否かについては全く不明であ
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上述の
技術的背景にあって、血液の凝固線溶系の一因子である
プロテインＣを活性化して血液凝固を抑制するだけでな
く、線溶作用を増進する物質を見出すべく鋭意研究を重
ねた結果、意外にも、後述するように特定のアミノ酸配
列を有するペプチドが、トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進して血液凝固を制御することができるだけ
でなく、線溶を促進することができ、血液凝固を制御す
る薬剤として有用であることを見出した。また該蛋白を
コードするＤＮＡを単離し、更にまた、そのペプチド
が、組換えＤＮＡ技術によって他のヒト由来蛋白をまっ
たく含まない純粋な形態で、大量にかつ容易に製造でき
ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて
完成した。
【００１１】即ち、本発明の目的は、トロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する作用を有する新規なペ
プチドまたはその相同変異体の遺伝子工学的製造におけ
る中間体、としての微生物または細胞の培養物を提供す
ることにある。本発明はまた、血液抗凝固反応、例えば
活性化プロテインＣ産生反応あるいは血液抗凝固反応等
の大量アッセイにおける、高再現性のエフェクターまた
は陽性標準として使用できる、該ペプチドの粗標品とし
ての培養物を提供することにある。更に、本発明の他の
目的は、詳しくは形質転換された微生物または細胞、好
ましくは遺伝子工学的産物の生産細胞として一般的に用
いられる、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ127細胞から選
ばれるいずれかを用い、これらを培養し、該ペプチドを
コードするいずれかの組換え体ＤＮＡを発現させて得ら
れる培養物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
少なくともアミノ酸配列として次式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表わされるアミノ酸配列、またはその相同変異体のア
ミノ酸配列を含有する、トロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドまたはその相
同変異体の遺伝子工学的製造における、中間体としての
培養物が提供される。
【００１３】本発明の培養物は実質的に前記式（Ｉ）で
表されるアミノ酸配列から成るペプチドを含んでいても
よいし、また、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列と、そ
のＮ末端及び／またはＣ末端に結合した少なくとも１種
の他のペプチドのアミノ酸配列を更に含有したペプチド
を含んでいてもよい。式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
と、少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を含
有するペプチドの例としては下記のペプチドの（１）〜
（５）が挙げられる。
【００１４】（１）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端に下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド。
【００１５】（２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端に下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド。
【００１６】（３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド。
【００１７】（４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド。
【００１８】（５）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ が結合してなるペプチド。
【００１９】該ペプチドはＮ末端アミノ酸残基としてア
ミノ酸メチオニンを含有していてもよい。該ペプチドは
また、Ｎ末端アミノ酸配列として、例えば次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるアミノ酸配列を有するリーダー配列を含有し
ていてもよい。自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性に重大な変化を与えることなく、ペ
プチドの構造の一部を変化させることが可能である。本
発明のペプチドは、前記アミノ酸配列を有するペプチド
の相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎ
ｔ）に相当する構造を有するペプチドも包含する。該ペ
プチドは少なくとも１個の糖残基を含有していてもよい
し、含有していなくてもよい。すなわち、本発明では少
なくともアミノ酸配列として、本明細書に説明された配
列であることを示すのであって、特に糖残基により限定
されるものではない。
【００２０】該ペプチドの遺伝子工学的製造に必要なＤ
ＮＡとしては次式（II）： ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧ ＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ ＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴ ＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴ ＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣ ＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ ＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ ＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡ ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ ＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧ ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧ ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧ ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧ ＣＡＣＧＧＡＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧ ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣ ＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡ ＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴ ＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡ ＣＴＧＴ で表される塩基配列を含有するＤＮＡがある。
【００２１】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、式（II）のＤＮ
Ａはまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化さ
れた塩基配列を含有することも可能である。この場合、
上記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ
酸配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。該ＤＮ
Ａは前記式（II）で表される塩基配列と、その５′末端
および／または３′末端に結合した少なくとも１種の他
の塩基配列とを含有していてもよい。式（II）で表され
る塩基配列と少なくとも１種の他の塩基配列とを含有す
るＤＮＡの例としては下記のＤＮＡ（１）〜（５）が挙
げられる。
【００２２】（１）式（II）で表される塩基配列の５′
末端に次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ。
【００２３】（２）式（II）で表される塩基配列の５′
末端に次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ。
【００２４】（３）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端にそれぞれ次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ。
【００２５】（４）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端にそれぞれ次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ。
【００２６】（５）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端にそれぞれ次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴ ＧＣＴＣＡＴＡＧＧＣ ＡＴＣＴＣＣＡＴＣＧ ＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧ ＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧ ＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧ ＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣ ＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧ ＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧ ＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧ ＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴ ＧＣＧＣＧＧＣＣＣＣ ＴＴＣＣＡＡＧＧＡＧ ＧＴＡＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＣＡＣＧＴＧＣＧ ＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧ ＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡ ＧＡＣＴＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ。
【００２７】上記本発明のＤＮＡは前述のペプチドを組
換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができ
る。本発明のＤＮＡは以下のようにして得ることができ
る。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したｃＤＮＡラ
イブラリーからその抗体と結合するペプチドをコードす
るｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤＮＡ断片の塩基
配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片はトロンビンの
プロテインＣ活性化を促進することのできるヒト肺由来
のペプチドの一部分をコードしている。その部分はその
ペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含まない。
【００２８】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマーエクステン
ション法により以下のようにして得る。まず、上記工程
（１）で得られたｃＤＮＡ断片のコードするペプチドの
Ｎ末端側のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ断片の一部
分を有機化学合成する。次に、合成したＤＮＡをプライ
マーとして用いて通常の公知のプライマーエクステンシ
ョン法によりヒトさい帯内皮細胞より調製したポリ
（Ａ）+ ＲＮＡから上記工程（１）で得られるｃＤＮＡ
断片の５′末端の上流の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片
を得る。上記プライマーエクステンションを繰り返すこ
とによりヒト肺由来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡ断片を得る。
【００２９】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を所望のペプチドの全アミノ酸配
列をコードするように結合することにより、Ｎ末端アミ
ノ酸のコドンから始まる１６７１塩基対（以下“ｂｐ”
と略する）のオープンリーディングフレームを含有する
ｃＤＮＡ（以下“ｃＤＮＡ−Ａ”と略する）を得る。こ
のオープンリーディングフレームの塩基配列は前述のＤ
ＮＡ（５）の塩基配列と同じである。このｃＤＮＡ−Ａ
から式（II）で表される塩基配列及び前述のＤＮＡ
（１）〜（４）の塩基配列とそれぞれ同じ塩基配列を有
するｃＤＮＡを以下のようにして調製することができ
る。
【００３０】（ｉ）ＤＮＡ（４）の塩基配列と同じ塩基
配列を含有するｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ−Ａからその５′
末端から数えて１４９５番目の塩基から下流の部分を位
置特異的変異法で削除することによって得られる。得ら
れたｃＤＮＡは５′末端にＮ末端アミノ酸のコドンを含
む１４９４ｂｐのＤＮＡである。 （ii）ＤＮＡ（３）の塩基配列と同じ塩基配列を含有す
るｃＤＮＡは、上記（ｉ）と同様にして得られる１４９
４ｂｐのｃＤＮＡからＮ末端アミノ酸配列に対応する６
７８ｂｐの部分を位置特異的変異法で削除することによ
って得られる。得られたｃＤＮＡは８１６ｂｐである。 （iii)ＤＮＡ（２）の塩基配列と同じ塩基配列を含有す
るｃＤＮＡは、上記（ｉ）と同様にして得られる１４９
４ｂｐのｃＤＮＡからＣ末端アミノ酸配列に対応する１
０８ｂｐの部分を位置特異的変異法で削除することによ
って得られる。得られたｃＤＮＡは１３８６ｂｐであ
る。
【００３１】（iv）ＤＮＡ（１）の塩基配列と同じ塩基
配列を含有するｃＤＮＡは、上記（iii)の１３８６ｂｐ
のｃＤＮＡから、Ｎ末端アミノ酸配列に対応する６７８
ｂｐの部分を位置特異的変異法で削除する。このように
して、ＤＮＡ（１）の塩基配列と同じ塩基配列を有する
７０８ｂｐのｃＤＮＡを得る。 （ｖ）式（II）で表される塩基配列と同じ塩基配列を含
有するｃＤＮＡは、以下のようにして得られる。まず初
めに、上記（ii）に記載されているのと同様の方法で１
３８６ｂｐのｃＤＮＡを得る。次に得られた１３８６ｂ
ｐのｃＤＮＡから、Ｎ末端アミノ酸配列に対応する１０
３２ｂｐからなる部分を位置特異的変異法で削除する。
このようにして、式（II）の塩基配列と同じ塩基配列を
有する３５４ｂｐのｃＤＮＡを得る。
【００３２】このようにして得られた各ｃＤＮＡの塩基
配列は公知の方法で分析して、ＤＮＡ（１）〜（５）の
塩基配列及び式（II）で表される塩基配列とそれぞれ一
致することを確認する。上記のＤＮＡは有機化学合成す
ることによっても得ることができる。また、このＤＮＡ
は前述のプライマーエクステンションを行うことなく、
前駆体ＤＮＡから調製することもできる。前駆体ＤＮＡ
は、前記工程（１）で得られるＤＮＡ断片またはそのＤ
ＮＡ断片の塩基配列に基づいて調製した合成ＤＮＡをプ
ローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション法に
よってヒト染色体ＤＮＡライブラリーから得ることがで
きる。
【００３３】上述の式（II）の塩基配列を含有するＤＮ
Ａは更に、例えば次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよい。上記ＤＮ
Ａと相補的なＤＮＡもまた調製できる。また前述のすべ
てのペプチドの相同変異体に相当する構造を有するペプ
チドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡを調製する
こともまた可能である。遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子
から生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となくその遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を
他の種類の塩基に置換することができる。従って、該Ｄ
ＮＡはまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化
された塩基配列を含有することも可能である。この場
合、上記置換により得られた塩基配列から演繹されるア
ミノ酸配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。
【００３４】更にまた、前記のＤＮＡと複製可能な発現
ベクターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡが調製で
きる。該組換え体ＤＮＡは、それによって形質転換され
た微生物または細胞中で、所望のペプチドを発現させ、
その培養物を回収することができる。適したベクターの
例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、
ＹＲｐ７、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）、ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）などが挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として
使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要
がある。
【００３５】上述の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転
換された微生物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３
１４４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ- 、λ- 、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス サブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如き
バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ
チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ
−７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられる。
【００３６】更にまた、本発明は上述のような形質転換
された微生物または細胞、好ましくは動物細胞、更に好
ましくは、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ127 細胞から選
ばれるいずれかを用い、通常の培養方法、好ましくは培
養方法として、ディッシュ付着培養法、ビーズ付着培養
法、浮遊培養法から選ばれるいずれかを用いてこれを培
養し、上記ペプチドをコードするいずれかの組換え体Ｄ
ＮＡを発現させて得られる培養物、好ましくは所望のペ
プチドが分泌され得る形態で含まれる培養液に関する。
【００３７】培養液中に分泌された該ペプチドは、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する活性物質
として検知され、回収される。通常本活性は、試料を
０．１５Ｍ食塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／
ｍｌ血清アルブミン、を含有するｐＨ７．４の２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液中にトロンビン及びプロテインＣの存
在下添加し、生成される活性化プロテインＣの量を定量
し評価される。従って、本発明の培養液は、該ペプチド
をコードするいずれかの組換え体ＤＮＡを発現させて得
られるペプチドの濃度が、上記緩衝液中に検知され得る
濃度、好ましくは少なくとも１０ｎｇ／ｍｌの濃度で可
溶性であるペプチドを含有する培養液に関する。このよ
うな可溶性であるペプチドが後述の製造方法や医薬組成
物となす場合において極めて有利であることは当然のこ
とである。
【００３８】トロンビンによるプロテインＣの活性化を
促進するペプチドは生体内では、血管内皮細胞膜上に次
式の一次構造で発現される。 Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ
【００３９】 該ペプチドを上記細胞で遺伝子工学的に発現させた場合、それら細胞膜上に発 現・濃縮される。このようにして発現された、トロンビンによるプロテインＣの 活性化を促進するペプチドを通常の膜タンパク質の抽出方法に習い、例えば界面 活性剤存在下に抽出される、抽出液として得る事も可能である、しかし、活性物 質を更に大量に得るためには、所望のペプチドが培養液中に分泌・濃縮されるの が望ましい。該ペプチドのアミノ酸配列のＣ末端から５９番目以降の配列： Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ を除くことにより、分泌され得る形態で培養液中に可溶
物として検知・回収できる。
【００４０】即ち本発明は、前述のいずれかの組換え体
ＤＮＡを発現させて得られる培養物、好ましくは分泌さ
れ得る可溶性の、トロンビンによるプロテインＣの活性
化を促進する作用を有するペプチドの濃度が、検知され
得る濃度、更に好ましくは少なくとも１０ｎｇ／ｍｌの
濃度である培養液に関する。更に詳しくは、本発明の培
養物は、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作
用を有する新規なペプチドの遺伝子工学的製造における
中間体、としての微生物または細胞の培養物に関する。
更に、本発明は血栓溶解作用、抗血液凝固作用及び血小
板凝集抑制作用を有し、循環器系の疾患の治療に有用な
ペプチドの遺伝子工学的製造における中間体、としての
微生物または細胞の培養物に関する。本発明はまた、血
液抗凝固反応、例えば活性化プロテインＣ産生反応ある
いは血液抗凝固反応等の大量アッセイにおける、高再現
性のエフェクターまたは陽性標準として使用できる、該
ペプチドの粗標品としての培養物に関する。
【００４１】本発明の方法によれば、前述のＤＮＡが正
しく転写し、それによって得られるｍＲＮＡからの翻訳
が正しく行われるように該ＤＮＡを複製可能な発現ベク
ターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の下流に組入れて
該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体ＤＮＡを得、得ら
れた該組換え体ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換さ
せて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体を得る。得
られた形質転換体は、該組換え体ＤＮＡに与えられた表
現型によって微生物または培養細胞の親細胞から単離さ
れる。得られた形質転換体を培養して前記ＤＮＡの有す
る遺伝情報を発現させて本発明の培養物を製造する。
【００４２】尚、上述のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを構
築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーターや
複製起源等をクローニングするためには原核細胞を宿主
として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好まし
い。原核細胞の例としてはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
ー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイ
ー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー
コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０(F- 、λ- 、プロ
トトロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
如きバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネ
ラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の
腸内細菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）などが挙げられる。これらの細菌のうちエシェリヒ
ア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好まし
い。
【００４３】上記微生物を宿主として使用する場合、こ
れら微生物に適したプラスミドベクターが組換え体ＤＮ
Ａの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。
例えば大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクター
としてはプラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを
用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起
源、プロモーター、および組換え体ＤＮＡで形質転換し
た細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに
与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの
例としては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモー
ター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マ
ーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子や
テトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００４４】一方、上述のＤＮＡを発現して本発明の培
養物を製造するためには上記の原核細胞を宿主として用
いる宿主−ベクター系および脊椎動物の細胞などの真核
生物の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベクター系を
使用することができる。真核細胞の例としては前述の動
物の細胞株などの細胞が挙げられる。上述のＤＮＡを前
述の真核細胞で発現させるために、本発明の組換え体Ｄ
ＮＡは一般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例
えば、複製起源、該ＤＮＡの上流に位置すべきプロモー
ター、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位や転写
終止配列を含有している。該ＤＮＡを真核細胞内で発現
させるのに用いることのできるそのような機能配列はウ
ィルスやウィルス性物質から得ることができる。
【００４５】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などから得ることが
できる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーター
やＳＶ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。
また、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用
を有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上
流の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−
ベクター系で使用するのに適しているならば使用するこ
とができる。
【００４６】複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。複製可能な組換
え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞は、前述
のとおり、組換え体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種
の表現型によって形質転換されずに残った親細胞から選
別される。表現型は少なくとも１種のマーカー遺伝子を
組換え体ＤＮＡに挿入することによって与えることがで
きる。
【００４７】また、複製可能な発現ベクターが本来有し
ているマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカ
ー遺伝子の例としては、例えば、ネオマイシン耐性など
の薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下
“ＤＨＦＲ”と称する）をコードする遺伝子などが挙げ
られる。これに関し、ＤＨＦＲ遺伝子をマーカー遺伝子
として用いる場合、ＤＨＦＲには様々のタイプがあるた
め、その使用するマーカー遺伝子のコードしているＤＨ
ＦＲのタイプによって用いるべき宿主を選択しなければ
ならない。例えば、マーカー遺伝子として野生型ＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を用いる場合、宿主としてはＤＨ
ＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。ＤＨＦＲ欠損株はヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求するので、
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない培地
中では成育できない。しかしながら、ＤＨＦＲ欠損株を
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると、その株はもはやヒポキサンチン、グリシン及びチ
ミジンを要求しなくなり、ヒポキサンチン、グリシン及
びチミジンを含まない培地中でも成育することができ
る。従って、形質転換細胞は、ヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準にして
形質転換されないで残った細胞から容易に選択すること
ができる。
【００４８】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐
性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換
すると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従
って、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を
判断基準として用いて形質転換されていない細胞から選
択することができる。これに関し、真核細胞の大多数が
ＭＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマ
ーカー遺伝子として用いるのに好都合である。
【００４９】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
もＤＮＡを発現するための宿主として用いることができ
る。酵母でＤＮＡを発現するためには複製可能な発現ベ
クターとして例えばプラスミドＹＲｐ７を用いることが
できる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐｌ遺伝子を含有し
ており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカー遺伝子として利
用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロ
モーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナー
ゼまたはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート
デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコ
ース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナー
ゼ、などの解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモー
ターやアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、
マルトース及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺
伝子のプロモーターが挙げられる。これらのうち、アル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素類、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及び
マルトース及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺
伝子のプロモーターは、これらのプロモーターによる転
写を宿主の培養条件を変えることによって制御すること
ができるので有利である。
【００５０】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより、所望のペプチドを含有する培養物を製造
することができる。培養後、本発明のペプチドは本培養
物から通常の公知の方法、例えばカラムクロマトグラフ
ィーなどを用いて単離することができる。このようにし
て得られたペプチドは様々な種類と長さの糖鎖を少なく
とも１種含有していてもよい。得られたペプチドが糖鎖
を含有しているか否かは用いる宿主細胞の種類によって
異なる。また、ペプチドが糖鎖を含有している場合の糖
鎖の種類や長さも用いる宿主細胞の種類によって異な
る。
【００５１】前述のとおり、本発明の培養物を中間体と
し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
作用を有するペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いる方法
により製造することができる。プロテインＣは血液凝固
線溶機構において重要な役割を演じているビタミンＫ依
存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化さ
れる。活性型プロテインＣは、生体内で血液凝固系補酵
素の活性型第Ｖ因子、および活性型第VIII因子を失活さ
せ、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲンアクチ
ベーターの産生に関与していることが知られている。
〔鈴木宏治、医学の歩み、第１２５巻、９０１頁、（１
９８３年）〕。該ペプチドは、このトロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と血栓溶
解作用を示す活性型プロテインＣを大量に産生せしめる
ものである。従って、該ペプチドは生体における抗血液
凝固及び血栓溶解に大きく寄与するものである。
【００５２】前述のように、該ペプチドは抗血液凝固作
用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので
例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、
閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、
狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療
及び予防に用いることができる。本発明をより詳細に記
述するために参考例及び実施例により説明するが、本発
明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００５３】
【実施例】
参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定）トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
ペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測定は、合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシカルボニ
ル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略称であ
る）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ オーノ
（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１３８７
頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわち、プロ
テインＣ（最終濃度０．５μＭ）およびトロンビン（最
終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに該ペプチド
を含む水溶液５μｌ（０〜０．０１ Ａ280 ／ｍｌ）を
加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣｌ2 、血清アルブミン及
びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をそれぞれ最終濃度
が０. １５Ｍ、２．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍｌ及び２０ｍＭ
になるように、そして全量が３０μｌとなるように加え
た。
【００５４】得られた混合物を３７℃で１５分間反応さ
せてプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロ
ンビンＩＩＩを１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリン
を含有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加
温して反応を停止させた。得られた反応混合物に、前述
の合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ（財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製、日本）２００
μＭを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２
５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０
％酢酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離してき
たＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度
を励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分光
光度計ＲＦ−５４０型（島津製作所製、日本）により測
定した。
【００５５】得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍
光強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１
分間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量か
ら該ペプチドを含まない水溶液を加えたときのＡＭＣ量
を引いた値がサンプルのトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する強さを示す。ここで、プロテインＣは
ヒト血漿から鈴木らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、
ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４
頁、（１９８３年等）〕で精製した。また、ヒトトロン
ビンはランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法
〔ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミ
カル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅs.
Ｃｏｍｍｕｎ．）６６巻、４８２頁、（１９７５年）〕
で精製した。
【００５６】参考例２ （１）：（ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手） ヒトの肺のポリ（Ａ）+ ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ11ｃＤＮＡライブラリーは、米国、クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ａ
ｖｅ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００４）。
【００５７】（２）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製） プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立病
院より提供されたヒト肺標本約８００ｇをはさみで約１
ｃｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片
に１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏ
ｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００
ｍｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとして
ＡｃｅＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。
【００５８】次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナ
イズし氷中で５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び
冷却操作を更に３回くり返した。得られたホモジェネー
トを１２，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離に
かけて上澄液とペレットに分け、ペレットを集める。こ
れに０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５
Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。
【００５９】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）〕を、
ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）
の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。
【００６０】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨン
を集めた。溶出によって得られる各フラクションについ
て前記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進
能を測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロ
フォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ280 ）を測定した。
【００６１】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ2 、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ2 、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む0.０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。プロテインＣ活性
化能のある画分を回収し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、
０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得ら
れた透析液を３回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロース
カラムクロマトグラフィーに供した。
【００６２】カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条件
は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロ
マトグラフィーの条件と全く同じ条件で行った。なお、
溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集めた。プ
ロテインＣ活性化能のある画分を回収し、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し
た後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大きさの４回目のＤＩＰ
−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに
供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ
2 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１Ｍ
ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／
ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出して得られたフラ
クションは１．９ｍｌずつ集めた。
【００６３】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ1% 1cm
・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本精
製品の量を計算したところ約５００μｇであった。なお
得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５〜１
０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀染色
によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確認さ
れた。
【００６４】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡ
セファロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−
０４４０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩
衝液で充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセ
ファロースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。
次いで０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
（Ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）（米国シグマ社製、カタログ番号Ｍ−６８８２）
を含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、このタ
ンパク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖を含
むいわゆるグリコペプチドであることがわかった。
【００６５】（３）：（トロンビンのプロテインＣ活性
化を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析） このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０
頁、（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エド
マン分析を行なった。遊離してくるフェニルチオヒダン
トイン・アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）
製高速液体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）
および米国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用
いて分析を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結
果、アミノ酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１
１個目までは下記アミノ酸配列を有するものであること
がわかった。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
【００６６】（４）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブの作成） トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁、（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列を
コードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣ
Ｇ ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧ
ＧＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツ
カエト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａ
ｌ．）、ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６
０５頁、１９８５年〕に従って、デオキシイノシン
（“Ｉ”で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端か
らのアミノ酸配列をコードする塩基配列として、
【００６７】 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
したがって精製し、実験書〔イー エフ マニアティス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレ
キュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、１２２頁、１９８２年）の記載にしたがっ
て、Ｔ4 ＤＮＡキナーゼ、およびγ−32Ｐ−ＡＴＰを用
いてラベル化した。
【００６８】（５）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体） トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。
【００６９】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。
【００７０】（６）：（ヒトさい帯内皮細胞の採集及び
培養） ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精製、
日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．Ｍａ
ｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁、（１９
８３年）〕に従って、私立病院より提供された新鮮なヒ
トさい帯から得た静脈より採集し培養した。
【００７１】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：（ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製） ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製した。
【００７２】（２）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより
のスクリーニング） ヒト肺のポリ（Ａ）+ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ11に組み込んだｃＤＮＡライブ
ラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュアル
に従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（クロ
ーンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地プ
レート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラー
ク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独）をプレートの上に載せ、３
７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩＰ
ＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上に
うつしとる。
【００７３】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国 カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ11に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３と
称した。
【００７４】（３）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション） 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＩ３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁、（１９８４年）コールド スプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコード
するＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことがわ
かった。
【００７５】（４）：（ＴＭ１３の塩基配列） 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するＤＮＡ
断片ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガ
ー、エフら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７
７年）にしたがって決定した。その結果を図２、図３に
示す。
【００７６】（５）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブ
としたヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング） ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕII
で消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これをニ
ックトランスレーション法で32Ｐで標識した。このＤＮ
Ａ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性のク
ローンをスクリーニングした。即ち、常法に従ってクロ
ーンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕIIで消化
してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抽出、
精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎｇを得た。
このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日本）社製のニ
ックトランスレーション キット（カタログ番号Ｎ．５
０００）を用いて、それに添付のユーザー マニュアル
に従ってα−32Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識した。
【００７７】この32Ｐで標識したＤＮＡ断片をプローブ
として実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキユラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁、１９８２年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従
ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブリダ
イゼーションを行なった。陽性のクローンを単離し、そ
のクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で解析し
たところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも前記ペ
プチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると思われ
る約２４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれていること
がわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称した。
【００７８】（６）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配
列） 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。そ
の結果を図４〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片
ＴＭ１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含まないことがわかっ
た。
【００７９】（７）：（プライマー エクステンショ
ン） 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示した。
【００８０】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′（２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′（２０ｍｅｒ） 次にこのＨＴＭ１３３をプライマーとして参考例３−
（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡをもちいて、いわゆるプライ
マーエクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１３７のさらに
５′上流部分を合成した。
【００８１】すなわち、約１μｇ／μｌのポリ（Ａ）+
ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／μｌのＨＴＭ１３３溶液２
０μｌを加え６５℃で２０分間加熱後、室温にまで約１
時間かけて冷却した。それ以降は、ｃＤＮＡ合成システ
ム（アマシャム ジャパン社、日本、カタログ番号ＲＰ
Ｎ１２５６）を用いて、そのマニュアルに従ってｃＤＮ
Ａを合成した。但し、ｃＤＮＡ合成システムに入ってい
るオリゴ（ｄＴ）プライマーのかわりにＨＴＭ１３３を
用いて実施した。
【００８２】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１
株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける
吸光度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌ
を集め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ
３−（Ｎーモルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯ
ＰＳ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで５０ｍＭ
ＣａＣｌ2 、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．
１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。
【００８３】得られた懸濁液を３０分間氷冷し、遠心
後、上澄を除去し、３０μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ
ＣａＣｌ2 と１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）の混合液中に懸濁さ
せた。懸濁液を２００μｌずつ分注し、前述のプラスミ
ドＤＮＡ溶液１０μｌをそれぞれに加えた。該混合液を
３０分間氷冷した後、４４℃で６０秒ヒートショックを
与え、ただちに、あらかじめ３７℃に温めておいた５ｍ
ｌのＬＢ培地を加えた。この溶液を３７℃で１時間培養
した後、それぞれの溶液を遠心し、上澄を除去し、細胞
ペレットを得た。該細胞ペレットにＬＢ培地を加え、撹
拌した後、懸濁液とした。該懸濁液を５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにまき３７℃で
１夜培養を行なった。
【００８４】このようにして得られるｃＤＮＡバンクよ
り、参考例２−（４）に記載した方法に従って５′末端
を32Ｐで標識したＨＴＭ１３１及びＨＴＭ１３２をそれ
ぞれプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション
を参考例３−（３）と同様の方法で実施した。コロニ−
ハイブリダイゼーションで約７００００個の形質転換体
をスクリーニングしてＨＴＭ１３１及びＨＴＭ１３２の
両者のプローブと反応するコロニーが６クローン得られ
た。この６クローンから、実験書〔マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、３６６頁、１９８
２年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）〕に従ってプラスミドＤＮＡ（これを“ｐ
ＴＭＰ５”と称する）を調製し、各種の制限酵素を用い
て切断し、電気泳動で解析したところ、６クローンから
得られたプラスミドＤＮＡは全て同一であり、約９００
ｂｐの大きさのＤＮＡ断片とベクターからなることがわ
かった。このＤＮＡ断片をＴＭＰ５と命名した。
【００８５】（８）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーション） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。
【００８６】（９）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配
列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。その結果を図８〜図
９に示す。
【００８７】（１０）：（第２回目のプライマー エク
ステンション） 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作製する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０００
０個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１３
５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られた。
この形質転換体が保有する組換え体に含まれているＤＮ
Ａ断片をＴＭＰ２６と命名した。
【００８８】（１１）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末
端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブ
リダイゼーシヨン） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。
【００８９】（１２）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基
配列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。
【００９０】（１３）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭ
Ｐ５及びＴＭＰ１３７の接合） 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示す。図１１に示す
ようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧよ
りオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで続
く１７２５ｂｐからなることが分かった。この各ＤＮＡ
断片にわたるオープンリーディングフレームをコードす
るＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭ
Ｐ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って継ぎ
あわせた。
【００９１】（１３−１）（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ） まず、λｇｔ11のＥｃｏＲＩサイトに挿入さているＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８（フ
ァルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７−４
９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミ
ドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次にプラスミドｐＵＣ
１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩで消
化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、ＭＡ
Ｘ−ＹＩＥＬＤR）を用いて約２３００ｂｐのＤＮＡ断
片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製した。
【００９２】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏ
ｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍａ
Ｉサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を得
た。次にこのプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵素
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで完全消化して約６００ｂ
ｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃII断片を得た。以上の様にし
てプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７より調製した約２３
００ｂｐのＤＮＡの断片及びプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ
Ｐ５より調製した約６００ｂｐのＤＮＡ断片プラスミド
ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して調
製したベクターに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ
１を得た。この工程を図１２に示す。
【００９３】（１３−２）（ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭ
Ｐ２６の継ぎあわせ） プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１５００ｂｐの断片を回収した。一方、ＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６をプラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製、
スウェーデン、カタログ番号２７−４９５４−０１）の
制限酵素ＰｓｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１
３ＴＭＰ２６を得た。これをＢｂｅＩで完全消化した
後、切断末端をＴ4 ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末
端にし、さらに制限酵素ＢｇｌIIで完全消化して約１７
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに別に、プラスミドｐ
ＵＣ１３ＴＭＰ２６をＢｇｌII及びＤｄｅＩで完全消化
して約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００９４】次に上記の約１７０ｂｐ、約２８０ｂｐ、
約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、５０Ｖ
の電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガロースゲル
電気泳動にかけて精製単離し、約１４００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。また別途、プラスミドｐＵＣ１８をＳｐｈ
Ｉで完全に消化した後Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ
で切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完全消化
してベクターを調製した。このベクターに上述の約１４
００ｂｐ及び約１５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ4ＤＮＡ
リガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭ
Ｊ２を得た。この工程を図１３に示す。
【００９５】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング）ヒト
染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニング
は以下のようにして実施した。λファージのベクターＥ
ＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖｅ．
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入した
（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーより
参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプロ
ーブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でスク
リーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサートを
含有する染色体クローンが１種類得られた。
【００９６】この染色体クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
で完全消化して１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
い、実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モ
レキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、３８２頁、１９８２年、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従っ
てサザン ブロットハイブリダイゼーションを同じプー
ロブを用いて実施した。その結果、約４０００ｂｐのＤ
ＮＡ断片に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法
に従って単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサ
イトにサブクローニングした。この約４０００ｂｐのＤ
ＮＡの塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−
２）で作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入さ
れているＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが
分かった。
【００９７】実施例１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ１、ｐ
ＳＶ２ＴＭＤ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ４及び、ｐＳＶ２ＴＭ
Ｄ５の作製） （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで完全消化してＳＶ４０の
初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネータ
を有するベクターを得た。次に参考例２−（１３−２）
で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨｉｎｄII
I で部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化して約２９０
０ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＴＭ
Ｊ２と称した。この２９００ｂｐのＤＮＡ断片と上記の
如く調製したベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を得た。プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程を図１４に示
す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２についてはブ
ダペスト条約の規定に基き、アメリカン タイプ カル
チャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号第６７２
８３号として寄託されている。
【００９８】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ１の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いでＨ
ｉｎｄIII で完全消化して約１９００ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＤ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。
【００９９】また別途、下記の塩基配列を有する削除用
ＤＮＡプローブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌｅｔｅ
ｒ）”と称する〕を有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣ
ＡＣＧ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭＤと称した。この様にして作成
したディリーターＴＭＤを用いて、メソッド イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３年）、ア
カデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に
記載の方法に従って部位特異的変異の手法で前記の如く
得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ１
３の１７７塩基からなる部分の削除を行った。
【０１００】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭＤ
及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバーサ
ルプライマー、宝酒造製、カタログ番号３８３１）の
５′末端をＴ4 キナーゼを用いてリン酸化した後、０．
５ｐｍｏｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１９ＴＭＪ
３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で５分間
加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位のＥ．ｃｏ
ｌｉＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ）、及び１０単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼを混合物
に加えて３７℃で３０分間インキュベートして混合物中
に組換え体プラスミドを生成させた。得られた混合物を
イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア
社製、スウェーデン、カタログ番号２７−１５５０）に
加えた。それによってこのイー コリを組換え体プラス
ミドでトランスフェクションした。３７℃で一夜培養し
て生じた寒天培地上のプラークをニトロセルロースフィ
ルターに移しとり、８０℃で２時間加熱後、プレハイブ
リダイゼーションを行った。
【０１０１】プレハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ
〔０．９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔ
ｓ’〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．
１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含
む溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施し
た。次いで上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮＡのかわり
に32ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用いてハイブ
リダイゼーション反応を５５℃、２時間実施した。次い
で６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエン酸三ナ
トリウムの水溶液）を用いてニトロセルロースフィルタ
ーを洗浄した。
【０１０２】洗浄は室温で、５分間、２回洗った後、５
５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上げていっ
て、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィルムＸＡ
Ｒ−５（イーストマン コダック社製、米国）を得られ
たニトロセルロースフィルターに密着させて−８０℃、
一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に強く露光した
黒いスポットが数１０個検出された。各スポットは組換
え体プラスミドで感染したクローンに対応するものであ
る。そのうち、６クローンを選択し、各クローンの組換
え体プラスミドを単離して制限酵素解析、及び塩基配列
の解析を行ったところ、これらのクローンの保有する組
換え体プラスミドは制限部位と塩基配列がそれぞれ同一
であることがわかった。得られた組換え体プラスミドを
Ｍ１３−ＴＭＤ１と称した。
【０１０３】更に、この組換え体プラスミドＭ１３−Ｔ
ＭＤ１は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４９８
個のアミノ酸からなるペプチドをコードする塩基配列を
含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することがわか
った。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１に含ま
れるＤＮＡ断片をＴＭＤ１と称した。図１５に組換え体
プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリータ−Ｔ
ＭＤとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に対応
するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。
【０１０４】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ１をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨ１で
完全消化してＴＭＤ１の約１９００ｂｐ ＤＮＡ断片を
単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴ
ＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ１とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を得た。
【０１０５】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ２の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′(25 mer)を有するディリーターＴＭｄ2 を
ディリーターＴＭＤの代わりに削除用ＤＮＡプローブと
して用いる以外は実施例１−（２）−（ａ）と実質的に
同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ２と称するＤＮＡ断片
を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ２を得た。Ｄ
ＮＡ断片ＴＭＤ２は実施例１−（２）−（ａ）で得られ
たＤＮＡ断片ＴＭＤ１の５′末端から６７８ｂｐのＤＮ
Ａが削除された構造を有する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ２
は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に２７２個のアミ
ノ酸からなるペプチドをコードする塩基配列を含む塩基
配列を有していた。図１６に組換え体プラスミドＭ１３
−ＴＭＤ１とディリーターＴＭｄ2 とがハイブリダイズ
し、ＤＮＡ断片ＴＭＤ１に対応するＤＮＡ領域の一部が
削除されるところを示す。
【０１０６】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ２をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ２の約１２００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ２とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を得た。
【０１０７】（４）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の作製 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ３の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いでＨ
ｉｎｄIII で完全消化して約１９００ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）のＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＪ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。
【０１０８】また別途、下記の塩基配列を有するディリ
ーターを有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧ
ＣＣＡ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭｄ3 と称した。この様にして作
製したディリーターＴＭｄ3 を用いて、メソッド イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３
年）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ）に記載の方法に従って部位特異的変異の手法で前
記の如く得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９
ＴＭＪ３の２８５ｂｐからなる部分の削除を行った。
【０１０９】すなわち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴ
Ｍｄ3 及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニ
バーサルプライマー、宝酒造社製、カタログ番号３８３
１）の５′末端をＴ4 キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換えプラスミドＭ１３ｍｐ１９
ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で
５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ
を混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートして
混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。
【０１１０】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによりイー
コリを組換え体プラスミドでトランスフェクションし
た。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上のプラーク
をニトロセルロースフィルターに移しとり、８０℃で２
時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行った。プ
レハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ〔０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、６ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’〔０．１％
（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％（ｗ
／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１％ＳＤＳ，１００
μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５５℃、
２時間加温して実施した。
【０１１１】次いで、上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮ
Ａのかわりに32ＰでラベルしたＴＭｄ3 を加えた溶液を
用いてハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実
施した。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍ
クエン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロ
ースフィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２
回洗った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度
を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米
国）を得られたニトロセルロースフィルターに密着させ
て−８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィルム上に
強く露光した黒いスポットが数１０個検出された。
【０１１２】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制御酵素解析、および塩基配列の解析を行ったとこ
ろ、これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは
制限部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかっ
た。得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ３と
称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３
は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４２６個のア
ミノ酸からなるペプチドをコードする塩基配列を含有す
るＤＮＡ断片を有することがわかった。この組換え体プ
ラスミドＭ１３−ＴＭＤ３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭ
Ｄ３と称した。図１７に組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３とディリーターＴＭｄ3 とがハイブリダ
イズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に対応するＤＮＡ領域の一
部が削除されるところを示す。
【０１１３】（ｂ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ４の作製 部位特異的変異の手法を用いてディリーターＴＭｄ3 の
代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリー
ターＴＭｄ2 を用いる以外は実施例１−（４）−（ａ）
と実質的に同様の方法で、上述の如く得られた組換え体
プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３の一部を削除して、ＴＭＤ
４と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３
−ＴＭＤ４を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ４は実施例１−
（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の５′末
端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有する。
【０１１４】このＤＮＡ断片ＴＭＤ４は開始コドン（Ａ
ＴＧ）と、その下流に２３６個のアミノ酸からなるペプ
チドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１８に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ2 とがハイブリダイスし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとこ
ろを示す。
【０１１５】（ｃ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ４をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ４の約１１００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ４とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を得た。
【０１１６】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ５の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′(25 mer)。 を有するディリーターＴＭｄ4 をディリーターＴＭｄ2
の代わりに削除用ＤＮＡプローブとして用いる以外は、
実施例１−（４）−（ｂ）と実質的に同様の方法を繰り
返して、ＴＭＤ５と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プ
ラスミドＭ１３−ＴＭＤ５を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ５
を実施例１−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ３の５′末端から１０３２ｂｐのＤＮＡが削除された
構造を有する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ５は開始コドン
（ＡＴＧ）と、その下流に１１８個のアミノ酸からなる
ペプチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有して
いた。図１９に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３と
ディリーターＴＭｄ4とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断
片ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されると
ころを示す。
【０１１７】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ５をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ５の約７４０ｂｐ ＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ５とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を得た。
【０１１８】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換）ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）を培養器中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血
清（以下“ＦＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最
小必須培地（以下“ＭＥＭ”と略する）〔米国、フロー
ラボラトリ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社
製、カタログ番号１０−３３１）を用いて、３７℃で５
％炭酸ガスインキューベーター中で対数増殖期になるま
で培養し、０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ
を用いて培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはがし
て、ハンクス平衡塩類溶液〔米国、フローラボラトリー
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、カタロ
グ番号１７−１０１−２２〕に約１×１０7 個／ｍｌの
濃度になるように懸濁した。
【０１１９】実施例１−（５）で得られたプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試
験管に入れ、この試験管に上述の如く得られたＣＯＳ−
１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて０℃で１０分間
放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．Ｐ．ＳＹＳ
ＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型のキュベット
に移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回電気パルス
を与えた。その後懸濁液を再び元のエッペンドルフ型試
験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０％（ｖ／
ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍｌを以下
のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレートに移
した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むダル
ベッコのＭＥＭを懸濁液に加えてその混合物を組織培養
用プレートに移した。次いで、試験管を残りのダルベッ
コのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレートに加え
た。その後、プレートは５％ＣＯ2 存在下３７℃で２４
時間培養した。
【０１２０】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認）培養終了後、プレートの培地をＦ
ＣＳを含まないダルベッコのＭＥＭに交換し、４８時間
培養した。培養上澄液を５μｌ採取し、これを試料とし
て参考例１に記載した方法で、プロテインＣ活性化の促
進作用を測定した。更に、直径１０ｃｍの組織培養用プ
レート１枚分の細胞を米国コースター（Ｃｏａｓｔｅ
ｒ）社製セルスクレイパー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅ
ｒ）（カタログ番号３０１０）を用いて掻き取って集
め、８００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心分離して集め
る。このペレットを試料として用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣの活性化を促進する作用を測定し
た。またコントロールとしてはプラスミドｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒでトランスフォームしたＣＯＳ−１細胞の培養上
澄液及び細胞ペレットを試料として用いた。その結果を
表１に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を
組織培養用プレート１枚分に換算したものである。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表２に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表３に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。
【０１２５】
【表３】
【０１２６】実施例５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表４に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】実施例６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果、細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化促進
作用を示し、生成したプロテインＣの量は約３００ｎｇ
であった。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞ではこ
の活性は検出されなかった。
【０１２９】実施例７ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＨＯ細胞の形質
転換と形質転換細胞における発現）約４μｇのプラスミ
ドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５０）、及び
約２０μｇの実施例１−（５）で作成したプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を混合してエタノール沈殿した。沈殿物
を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５０
０μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4、ｐＨ７．
１２）を加えた。次いで、５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣ
ｌ2 を滴下し室温に１０分間放置した。
【０１３０】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、フローラ
ボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（米国、フローラボラ
トリー社製、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０2 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ2 を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。
【０１３１】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。このＦＣＳ含有選択培地で培養した
培養液５０μｌをとり、これを用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣ活性化を促進する作用を測定した
ところ、強いプロテインＣ活性化促進作用が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳＶ
２−ｎｅｏだけでトランスフォームした細胞では本活性
は検出されなかった。
【０１３２】実施例８ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４により形質転換
された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテ
インＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトラ
ンスフォームした細胞では本活性は検出されなかった。
【０１３３】実施例９ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２により形質転換
された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテ
インＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトラ
ンスフォームした細胞では本活性は検出されなかった。
【０１３４】実施例１０ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１により形質転換
された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテ
インＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトラ
ンスフォームした細胞では本活性は検出されなかった。
【０１３５】培養液についてウェスタンブロッティング
による該ペプチドの確認を行った。非還元ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動後、蛋白をニトロセルロースフィ
ルターに転写し、参考例で作製したウサギ抗ヒトＴＭ抗
体、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ及び基質溶液（オルトフ
ェニレンジアミン）を使用し発色させたところ、主に高
分子側にテーリングを示す分子量約７万のバンドが確認
された。
【０１３６】実施例１１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）約４μｇ
のプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５
０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプラスミド
ｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿した。沈殿
物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭト
リス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５
００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０
ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ
７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ2を滴下し室温に１０分間放置した。
【０１３７】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、フローラ
ボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（米国、フローラボラ
トリー社製、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０2 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ2 を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。
【０１３８】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。
【０１３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を細胞ペレットを試料と
して用いて測定したところ強いプロテインＣ活性化促進
作用が認められた。一方、コントロールとして用いたプ
ラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及び
その培養上澄液では本活性は検出されなかった。
【０１４０】実施例１２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣ127 Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（５）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約１７００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１を得た。
【０１４１】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コバ
スルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得た約２６００ｂｐのＤＮＡ断片を
挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１を得た。このプ
ラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１をＨｉｎｄIII で完全消化
したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣ
Ｃ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片
とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ127 細胞発
現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１を得た。以上
の工程を図２０、図２１に示す。
【０１４２】次に、実施例７に記載の方法に準じてｐｄ
ＢＰＶＴＭＤ５−１でＣ127 Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７０
０−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１
０ｃｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるま
で生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に
置換して培養した。この培地で１日培養した培養液５０
μｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活
性が認められた。一方、コントロールとして用いたプラ
スミドｐＢＶ−１（９−１）だけでトランスフォームし
た細胞では本活性は検出されなかった。
【０１４３】実施例１３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣ127 Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（４）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２１００ｂｐの断
片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃII及
びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入してプラス
ミドｐＵＣＴＭＤ４−１を得た。
【０１４４】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得た約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を
挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１を得た。このプ
ラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１をＨｉｎｄIII で完全消化
したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣ
Ｃ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断
片とをＴ 4 ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ127 細胞
発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１を得た。以
上の工程を図２２、図２３に示す。
【０１４５】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７０
０−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１
０ｃｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるま
で生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に
置換して培養した。この培地で１日培養した培養液５０
μｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活
性が認められた。一方、コントロールとして用いたプラ
スミドｐＢＰＶ−（９−１）だけでトランスフォームし
た細胞では本活性は検出されなかった。
【０１４６】実施例１４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣ127 Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（３）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２２００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１を得た。
【０１４７】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得た約３０７０ｂｐのＤＮＡ断片を
挿入して、プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１を得た。この
プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１をＨｉｎｄIII で完全消
化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴ
ＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た
断片とＴ 4 ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ127 細胞発現用
のプラスミドｐｂＢＰＶＴＭＤ２−１を得た。以上の工
程を図２４、図２５に示す。
【０１４８】次にｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び１
（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマインシ（米国、
フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした
細胞では本活性は検出されなかった。
【０１４９】実施例１５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣ127Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（２）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約３１００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１を得た。
【０１５０】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラスミ
ドｐＢＲＴＭＤ１−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴ
ＭＤ１−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）を
ＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継いで、Ｃ127細胞発現用のプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１を得た。以上の工程を図２６、
図２７に示す。
【０１５１】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７０
０−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１
０ｃｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるま
で生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に
置換して培養した。この培地で１日培養した培養液５０
μｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活
性が認められた。一方、コントロールとして用いたプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォーム
した細胞では本活性は検出されなかった。
【０１５２】実施例１６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ127Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（１）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約４１００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。
【０１５３】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラスミ
ドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴ
ＭＪ２−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）を
ＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ4 ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継いで、Ｃ127細胞発現用のプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の工程を図２８、
図２９に示す。
【０１５４】次にｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例７に
記載の方法に準じてＣ127Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７０
０−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１
０ｃｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるま
で生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に
置換して培養した。この培地で１日培養した後、培養し
た細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例１に
記載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定し
たところ、強い活性が認められた。一方、コントロール
として用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけで
トランスフォームした細胞では本活性は検出されなかっ
た。
【０１５５】実施例１７ （本発明の培養液からのトロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドの精製）実施
例７に記載した方法で培養したプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏ及びプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォー
ムしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート
２５枚で培養した。培地は１日おきに４回新鮮な培地と
交換した。この培養液をすべて集め（約１００ｍｌ）、
ｐＨ７．５に調製した後ＤＩＰ−トロンビン−アガロー
スのカラムクロマトグラフィーにかけて調製した。
【０１５６】すなわち、エヌ エル エスモン（Ｎ．
Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナルオブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５
７巻、８５９頁、（１９８２年）〕の方法にしたがって
作製したＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピルホスホロ
トロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピー クオトレカサス（Ｐ．
Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の方法〔ザ ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ）、２４５巻、３５９頁、（１９７０年）〕に従
ってブロムシアン化したアガロースに結合させてＤＩＰ
−トロンビン−アガロースを作製した。
【０１５７】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の上澄液をカラムに供した。カラムを０．３
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ
を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗
浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。
【０１５８】溶出によって得られる各フラクションにつ
いて前記の方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定
した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォトメ
ーターＵＶ−２４０を用いて、各フラクションの波長２
８０ｎｍにおける吸光度（Ａ 280）を測定した。活性の
ある画分を回収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣ
ａＣｌ2 、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（半
井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を２回目
のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラ
フィーに供した。
【０１５９】即ち、透析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの
大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに通
し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、さらに
０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
7.５）で溶出した。活性画分を回収し精製品を−８０℃
で凍結保存した。この製品の分子吸光係数を一般的な蛋
白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ1% 1cm・２
８０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づき精製品
の量を計算したところ約４．７μｇであった。尚、この
精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−１０％のグラ
ジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ単
一のバンドのみ確認された。
【０１６０】実施例１８ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４．５
μｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲ
ル濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバ
ンドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。
【０１６１】実施例１９ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃
度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンド
を観察したところ単一のバンドのみ確認された。
【０１６２】実施例２０ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ1% 1cm・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５
−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観
察したところ単一のバンドのみ確認された。
【０１６３】実施例２１ 実施例１１に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｊ２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣ
ＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を
用いて培養した。培養後、培養物を８００ｒｐｍで１０
分間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞ペレ
ットに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．
２５Ｍ庶糖、１ｍＭ、ベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ2 を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを
用いて４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物
を得た。
【０１６４】得られた抽出物を３５０００ｇ、１０℃で
６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液
から、実施例１７と同様の操作により本発明のペプチド
の精製品を得、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子
吸光係数にならない１０．０（Ｅ1% 1cm・２８０ｎｍ＝
１０．０）と規定して、それに基づき精製品の量を計算
したところ約３μｇであった。尚、この精製品をポリア
クリルアミド濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色
によってバンドを観察したところ単一のバンドのみ確認
された。
【０１６５】実施例２２ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認）本発明の培養物から精製した各ペプチドのプロ
テインＣ活性化の促進作用を以下の方法にて評価した。
即ち、０．１Ｍ ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ2 、
１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロ
テインＣ、５ｎＭのトロンビンおよび５ｎＭの精製した
各ペプチドを加えて３７℃で反応させた。反応物に３０
０μｇ／ｍｌのアンチトロンビンＩＩＩ（米国シグマ社
製）および５ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止して、
生成した活性型プロテインＣの量を前述の合成基質を用
いる方法で測定した。その結果を図３０〜図３４図に示
すが、各ペプチドを無添加の場合（Ｂ）では活性化プロ
テインＣの生成は認められなかった（点線）が、ペプチ
ドを添加した場合（Ａ）には、反応時間と共に生成した
活性化プロテインＣの量が増加した（実線）。
【０１６６】実施例２３ （抗血液凝固作用の確認）本発明の培養物から精製した
各ペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲンのフィ
ブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に阻害する
ことはハインリッヒ アメルング社（独）製のコアギュ
ロメーターＫＣ−１０を用いて血液凝固時間を測定する
ことによって調べた。即ち、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．
１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に３．０μｇのフィブリノーゲン（米国シグ
マ社製、フラクションＩ）を加え、これに０−５０ｎＭ
の精製した各ペプチドを加え、次いで、全量が０．４ｍ
ｌになるように１０ｎＭのトロンビンを加えて凝固時間
を測定した。その結果を図３５〜図３９に示す。トロン
ビンにくらべ、添加した精製ペプチドの量が多くなるに
したがって、血液凝固時間が延長されることが確認され
た。
【０１６７】実施例２４ （血小板凝集抑制作用の確認）本発明の培養物から精製
した各ペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実質的
に阻害することはＳＩＥＮＣＯ社（米国）製のプレート
レットアグリゴメーターを用いて評価した。即ち、３０
万ｃｅｌｌｓ／μｌの血小板溶液（Ｐｌａｔｅｌｅｔ
Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、Ｐ．Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに
１単位のトロンビン（約０．４μｇ）を加えると血小板
が凝集するが、トロンビンを加える前にその加えるトロ
ンビンと等モル以上の精製した各ペプチドを加えておく
と血小板の凝集が起きなかった。
【０１６８】
【適用例】以下に本発明の培養物から精製したペプチド
の適用例を応用例をもって説明する。 応用例１ 本発明の培養物から精製したペプチド １０ ｍｇ 精製ゼラチン ２０ ｍｇ マンニトール １００ ｍｇ 塩化ナトリウム ７．８ｍｇ リン酸ナトリウム １５．４ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、無菌バイアル
に入れ、−３５℃で２時間予備凍結し、−３５℃で真空
度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時間一次乾燥し、次いで３
０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒで５時間二次乾燥して、
注射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直
前に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液５００ｍｌに溶
解して点滴静注するのに用いられる。
【０１６９】応用例２ 本発明の培養物から精製したペプチド ２．５ｍｇ アルブミン ５ｍｇ マンニトール ２５ ｍｇ 塩化ナトリウム １．９５ｍｇ リン酸ナトリウム ３．８５ｍｇ 上記成分にて、応用例１と実質的に同様の方法により注
射用バイアルを製造した。
【０１７０】
【発明の効果】本発明のトロンビンのプロテインＣ活性
化を促進する作用を有する新規なペプチドを含有する微
生物または細胞の培養物は、抗血液凝固作用、血小板凝
集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の少ない循
環器系疾患などの治療用薬として極めて有用な物質であ
る該ペプチドの遺伝子工学的製造における中間体として
有用である。また、本発明の培養物は、このような医薬
用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテーテ
ルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防止
する薬剤としての該ペプチドの製造における中間体とし
ても用いることができる。更に活性化プロテインＣ産生
反応あるいは血液抗凝固反応等の大量アッセイにおけ
る、高再現性のエフェクターまたは陽性標準として使用
できる。
【配列表】
【０１７１】配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115
【０１７２】配列番号：２ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55
【０１７３】配列番号：３ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235
【０１７４】配列番号：４ 配列の長さ：４６２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460
【０１７５】配列番号：５ 配列の長さ：２７２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270
【０１７６】配列番号：６ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly
【０１７７】配列番号：７ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555
【０１７８】配列番号：８ 配列の長さ：３５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC TGT 354
【０１７９】配列番号：９ 配列の長さ：７０８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708
【０１８０】配列番号：１０ 配列の長さ：１３８６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1386
【０１８１】配列番号：１１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816
【０１８２】配列番号：１２ 配列の長さ：１４９４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494
【０１８３】配列番号：１３ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC 1584 AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロ−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグ
ラフである。
【図２】本発明の参考例３−（２）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭ１３の塩基配列を示すものである。
【図３】図２に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３の塩基配列を示
すものである。
【図４】本発明の参考例３−（５）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭ１３７の塩基配列を示すものである。
【図５】図４に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。
【図６】図５に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。
【図７】図６に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。
【図８】本発明の参考例３−（７）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を示すものである。
【図９】図８に続くＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配列を示
すものである。
【図１０】本発明の参考例３−（１０）で得られるＤＮ
Ａ断片ＴＭＰ２６の塩基配列を示すものである。
【図１１】上記のＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、
ＴＭＰ５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及
び３−（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴ
ＭＪ２の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有す
る塩基配列における対応関係を示すものであり、縦方向
にみて各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配
列を有することを示す。図中ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限
酵素地図の斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えら
れるオープンリーディングフレームであり、斜交線部分
に本発明の塩基配列が存在するものである。
【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。
【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。
【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターにＴ
ＭＪ２を挿入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２の構築を示すフローチャートである。
【図１５】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭＤが相補的にハイブリダイズしたところを示すもの
であり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズし
ている部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされ
ているアミノ酸配列を示すものである。
【図１６】実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え
体プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１にディリーターＴＭｄ2
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。
【図１７】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭｄ3が相補的にハイブリダイズしたところを示すも
のであり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズ
している部分の周辺の塩基配列とそれによってコードさ
れているアミノ酸配列を示すものである。
【図１８】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ2
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。
【図１９】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ4
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。
【図２０】複製可能な組換え体ＤＮＡであるプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフローチャートで
ある。
【図２１】図２０に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図２２】複製可能な組換え体ＤＮＡであるプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフローチャートで
ある。
【図２３】図２２に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図２４】複製可能な組換え体ＤＮＡであるプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフローチャートで
ある。
【図２５】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図２６】複製可能な組換え体ＤＮＡであるプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフローチャートで
ある。
【図２７】図２６に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図２８】複製可能な組換え体ＤＮＡであるプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチャートで
ある。
【図２９】図２８に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図３０】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。
【図３１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。
【図３２】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。
【図３３】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。
【図３４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。
【図３５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。
【図３６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。
【図３７】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。
【図３８】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。
【図３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物または細胞の培養物にして、
    （ａ）少なくともアミノ酸配列として次式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表わされるアミノ酸配列、またはその相同変異体のア
    ミノ酸配列を含有し、トロンビンによるプロテインＣの
    活性化を促進する作用を有するペプチドまたはその相同
    変異体をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを複製可
    能な発現ベクターに結合して、該ＤＮＡと該複製可能な
    発現ベクターとを含有する複製可能な組み換え体ＤＮＡ
    を得、（ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物また
    は細胞を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、
    （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
    選別し、（ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体
    に該ＤＮＡを発現させて得られる、該ペプチドまたはそ
    の相同変異体を含有する微生物または細胞の培養物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の微生物または細胞の培
    養物にして、（ａ）少なくともアミノ酸配列として次式
    （Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表わされるアミノ酸配列、またはその相同変異体のア
    ミノ酸配列を含有し、可溶性である、トロンビンによる
    プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
    またはその相同変異体をコードする塩基配列を含有する
    ＤＮＡを複製可能な発現ベクターに結合して、該ＤＮＡ
    と該複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組
    み換え体ＤＮＡを得、（ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮ
    Ａで微生物または細胞を形質転換させて形質転換体を形
    成せしめ、（ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の
    親細胞から選別し、（ｄ）該形質転換体を培養して、該
    形質転換体に該ＤＮＡを発現させて得られる、該ペプチ
    ドまたはその相同変異体を含有する微生物または細胞の
    培養液。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の微生物または細胞の培
    養物にして、（ａ）少なくともアミノ酸配列として次式
    （Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表わされるアミノ酸配列、またはその相同変異体のア
    ミノ酸配列を含有し、 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ で表わされるアミノ酸配列を含有しない、トロンビンに
    よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプ
    チドまたはその相同変異体をコードする塩基配列を含有
    するＤＮＡを複製可能な発現ベクターに結合して、該Ｄ
    ＮＡと該複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能
    な組み換え体ＤＮＡを得、（ｂ）該複製可能な組換え体
    ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて形質転換体
    を形成せしめ、（ｃ）該形質転換体を該微生物または細
    胞の親細胞から選別し、（ｄ）該形質転換体を培養し
    て、該形質転換体に該ＤＮＡを発現させて得られる、該
    ペプチドまたはその相同変異体を含有する微生物または
    細胞の培養液。
  4. 【請求項４】 ペプチドが式（Ｉ）で表わされるアミノ
    酸配列からなるペプチドである、請求項２または請求項
    ３に記載の微生物または細胞の培養液。
  5. 【請求項５】 ペプチドが、少なくともアミノ酸配列と
    して式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、下記
    のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチドである、請求項２または請求項
    ３に記載の微生物または細胞の培養液。
  6. 【請求項６】 ペプチドが、少なくともアミノ酸配列と
    して式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、下記
    のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチドである、請求項２または請求項
    ３に記載の微生物または細胞の培養液。
  7. 【請求項７】 ペプチドが、少なくともアミノ酸配列と
    して式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末
    端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチドである、請求項２または請求項
    ３に記載の微生物または細胞の培養液。
  8. 【請求項８】 ペプチドが、少なくともアミノ酸配列と
    して式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末
    端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチドである、請求項２または請求項
    ３に記載の微生物または細胞の培養液。
  9. 【請求項９】 微生物または細胞が、動物細胞である請
    求項１に記載の培養物。
  10. 【請求項１０】 動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細
    胞、Ｃ127 細胞のいずれかである請求項１に記載の培養
    物。
JP6119200A 1994-05-31 1994-05-31 トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する培養上澄液 Expired - Lifetime JP2824392B2 (ja)

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