JPH10113195A - 凍結乾燥製剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 製造が容易であり、使用しやすい、血液凝固
を制御するため、または血小板凝集を制御するため、ま
たは血栓溶解のために有用な凍結乾燥製剤を得るもので
ある。 【解決手段】 トロンビンに結合し、トロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する作用を有し、少なくと
も界面活性剤の非存在下で可溶性である実質的に精製さ
れた可溶性ペプチドと、投与可能、かつ生理食塩水又は
ブドウ糖注射液に溶解し得る担体とを含有する水溶液
を、凍結乾燥することを特徴とする凍結乾燥製剤の製造
法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トロンビンに結合
し、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用を
有し、可溶性の新規なペプチドを有効成分とする凍結乾
燥製剤に関する。更に詳しくは、本発明は血栓溶解作
用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有する凍
結乾燥製剤であって、したがって、血液凝固を制御する
ための、または血小板凝集を制御するための、または血
栓溶解のための医薬組成物として有用な凍結乾燥製剤に
関する。

【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基

【０００３】また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチドは下記の如き略号で表されるデオ
キシリボヌクレオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の左
端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。

【０００４】

【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血
小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用し
て、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞
症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患
の治療及び予防に用いられている。しかしながら、これ
らの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極
く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線溶
系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤が
要望されていた。

【０００５】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。ウサギ肺に存在する物質については、例え
ば、シー ティー エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）
ら、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁
（１９８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓ
ｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７
巻、８５９頁（１９８２年）；シー ティー エスモン
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ
エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１２２３８頁（１９８
２年）を参照することができる。

【０００６】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス．クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。また、ヒト肺に存
在する物質については、例えば楠本ら、生化学、５７
巻、１１０２頁（１９８５年）を参照することができ
る。

【０００７】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されているが、その物質の構造、例えばアミ
ノ酸配列などは解明されておらず、未だにその物質は同
定されていない。従って、上記の先行技術文献に報告さ
れている物質が単一物質であるか否か、また、これらの
先行技術文献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得
られるか否かについては全く不明である。さらにまた、
上記の先行技術文献に報告されている物質は、細胞膜上
に存在するものであり、界面活性剤の非存在下では不溶
性であって、循環器疾患の治療などの医薬組成物として
用いる場合にはそのままでは投与量を多くすることがで
きないものであり、そもそも生体由来であることから十
分な量が確保できず、その物質が本当に医薬として使用
できるものであるか否かの検討さえも出来ない状態であ
った。注射剤とする場合に不溶物が存在することは、循
環器疾患を有する患者において致命的であることから、
界面活性剤の添加を必須とするが、上記の問題を有する
患者にとって界面活性剤の添加は予想外の問題を引き起
こす可能性は否定できず、場合によっては好ましいもの
ではない。

【０００８】また、一部には細胞膜上に存在する以外の
形態、例えば血中や尿中に存在する旨の開示があるが
〔イシイら、ジャーナル オブ クリニカル インベス
ティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、７
６巻、２１７８頁（１９８５年）〕、精製が十分にされ
ていないことが明確であり、またその活性や作用、物性
やその由来等の解析や検討が不十分であり、ましてやア
ミノ酸配列等の構造についての解析は全くなく、そもそ
も医薬として使用できる効果と安全性を有し、しかも医
薬として常に安定的に供給し得るものとの位置づけをす
ることはできないものであった。即ち、従来、上記物質
においては、その物性や構造等についての十分な解析が
ない状況であって、トロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する性質
が得られ、且つ十分な可溶性を有するペプチドを含む凍
結乾燥製剤など望むべき状況では全くなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従来より、主に血液凝
固を制御するための、または血小板凝集を制御するため
の、または血栓溶解のための、有用な医薬組成物、特に
凍結乾燥製剤の提供が求められていた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の技
術的背景にあって、血液の凝固線溶系の一因子であるプ
ロテインＣを活性化して血液凝固を抑制するだけでな
く、線溶作用を増進する物質を見出すべく鋭意研究を重
ねた結果、意外にも、後述するように本発明のペプチド
が、トロンビンに結合し、且つトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進して血液凝固を制御することができ
るだけでなく、線溶を促進することができ、血液凝固を
制御する薬剤、即ち、血液凝固を制御するための、また
は血小板凝集を制御するための、または血栓溶解のため
の医薬組成物として有用であることを見出した。また該
ペプチドをコードするＤＮＡを単離し、更にまた、その
ペプチドが、組換えＤＮＡ技術によって、好ましくは他
のヒト由来蛋白をまったく含まない純粋な形態で、大量
にかつ容易に製造でき、しかも可溶性のペプチドと担体
からなる本発明の医薬組成物が凍結乾燥製剤として容易
に製造されることを確認した。本発明は、これらの知見
に基づいて完成したものである。

【００１１】即ち本発明は、トロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
し、少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性である実
質的に精製された可溶性ペプチドと、投与可能、かつ生
理食塩水又はブドウ糖注射液に溶解し得る担体とを含有
する水溶液を、凍結乾燥することを特徴とする凍結乾燥
製剤（以下、医薬組成物ということもある）の製造法で
ある。本発明の実質的に精製された可溶性ペプチドとし
ては、下記（ａ）〜（ｆ）に規定される可溶性ペプチド
が好ましい。 （ａ）トロンビンに結合し、（ｂ）トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有する、（ｃ）少
なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性である、（ｄ）
トロンビンによる凝固時間を延長する、（ｅ）トロンビ
ンによる血小板凝集を抑制する、（ｆ）ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上にて、銀染色が可能である。

【００１２】本発明のペプチドは、トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する活性物質として検知さ
れ、回収される。通常本活性は、試料を０．１５Ｍ食
塩、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍｇ／ｍｌ血清アル
ブミンを含有するｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液中にトロンビン及びプロテインＣの存在下添加し、生
成される活性化プロテインＣの量を定量し評価される。
従って、本発明のペプチドは、上記緩衝液中に少なくと
も検知され得る濃度まで可溶性であるし、後述の通り、
少なくとも界面活性剤の非存在下で溶解でき、例えば血
管内に注射可能な水溶液となり得る性質を有する可溶性
ペプチドであればよい。

【００１３】このように、ペプチドが可溶性であること
は、そのペプチドを医薬組成物として使用するに際して
極めて有用なことであることについては、既に述べた通
りであるが、例えば、従来の物質においては、界面活性
剤の非存在下では不溶性であり、不溶物が存在する注射
剤としないために界面活性剤の添加を必須とするが、種
々の問題を有する循環器疾患の患者において、この界面
活性剤の添加は予想外の問題を引き起こす可能性は否定
できないし、また界面活性剤の添加量との兼ね合いもあ
って、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤が調製できな
い可能性もあることが考えられるが、これに対し、本発
明のペプチドは、可溶性であるが故に、これらの問題は
ことごとく解決されるものである。また、本発明のペプ
チドの精製が容易であることの他、凍結乾燥製剤を製造
する場合においても、またその凍結乾燥製剤を再溶解し
て使用する場合にも極めて都合のよいことである。

【００１４】本発明のペプチドがトロンビンに結合する
ことは、本明細書実施例に記載されているように、ＤＩ
Ｐ−トロンビン−アガロ−スに結合することにより確認
される。また、トロンビンによるプロテインＣの活性化
を促進する活性を有すること、トロンビンによる凝固時
間を延長すること、トロンビンによる血小板凝集を抑制
することも、本明細書実施例に記載されている通りであ
る。本発明の凍結乾燥製剤に用いる可溶性ペプチドが本
発明の実施例に示される通り、医薬組成物に適する程度
に実質的に精製されていることが必要である。また、該
可溶性ペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
にて、銀染色が可能であることも実施例に記載の通りで
ある。

【００１５】また、本発明の可溶性ペプチドが、ＤＩＰ
−トロンビン−アガロースカラムに結合せしめたとき
に、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノー
ル（商品名；Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ）を含む０．０２Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる性質を
有することも好ましいし、また該可溶性ペプチドが、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．５
％（ｖ／ｖ）ポリドカノールを含む０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロースカラムに、該緩衝液にて該可溶性ペ
プチドを溶解せしめた溶液を接触せしめた場合に、該可
溶性ペプチドが前記カラムに結合せしめることができる
性質を有することも好ましい。また、本発明のペプチド
が、少なくとも、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｎのアミノ酸配列を含有することを特徴とする場合も好
ましい。

【００１６】本発明のペプチドは、トロンビンに結合
し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
作用を有し、少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性
である性質を有すれば特に限定されなくともよいが、本
発明の可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同性が、該ア
ミノ酸配列の範囲において、図４０の制限酵素地図に示
された制限酵素サイトを有することにより特徴付けられ
るヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結合
し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一致する
相同性であることが好ましい。このヒト由来のＤＮＡ
は、図４０の制限酵素地図の開始コドンの最初の塩基か
ら終止コドンの直前の塩基までの１７２５ｂｐの塩基配
列がコード領域であり、コードされるそのアミノ酸配列
の具体的例示としては、配列番号７の１−５７５のアミ
ノ酸配列が好ましい例として挙げられる。なお、図４０
は図１１の一部分を示したものである。本発明で用いる
ペプチドは可溶性であるため、上記のヒト由来のＤＮ
Ａ、具体的にはＴＭＪ２がコードし得るアミノ酸配列の
全配列自体と区別されることは明白である。

【００１７】本発明のペプチドにおいては、トロンビン
に結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有し、界面活性剤の非存在下で可溶性であ
れば特に限定されないが、前記の各性質を有することが
好ましく、好ましい具体例としては、配列番号１の１−
１１８のアミノ酸配列、即ち、下記式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。

【００１８】勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
は、最も好ましい例であって、上記の活性に程度の差が
あっても、上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）
で表されるアミノ酸配列に拘泥する必要はない。また、
ヒトにおいては、多型性と言われる変異があることは通
常十分に考えられることである。即ち、本発明のペプチ
ドは実質的に前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列から
成っていてもよいし、また、その作用と機能を阻害しな
い限り若干の欠損、付加、置換等があっても、その相同
変異体のアミノ酸配列であってもよく、式（Ｉ）で表さ
れるアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端に結合し
た少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を更に
含有してもよい。

【００１９】例えば、ペプチドが、配列番号３の１−４
９８のアミノ酸配列、またはそのＮ末端及び／又はＣ末
端の任意の個数のアミノ酸が削除されているアミノ酸配
列からなり、トロンビンに結合し、トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチドで
あることも好ましい。また、ペプチドが、配列番号８の
１−２７２のアミノ酸配列、またはそのＮ末端及び／又
はＣ末端の任意の個数のアミノ酸が削除されているアミ
ノ酸配列からなり、トロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプ
チドであることも好ましい。また、ペプチドが、配列番
号６の１−２３６のアミノ酸配列、またはそのＮ末端及
び／又はＣ末端の任意の個数のアミノ酸が削除されてい
るアミノ酸配列からなり、トロンビンに結合し、トロン
ビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有す
るペプチドであることも好ましい。すなわち、本発明の
ペプチドが、（ｉ）配列番号３の１−４９８のアミノ酸
配列からなるペプチド、（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のペ
プチドのアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、且つトロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
活性を有する可溶性ペプチド、のいずれかであることも
好ましい。上記の（ｉｉ）の欠失、置換若しくは付加に
ついては、１若しくは数個のアミノ酸が通常想定される
が、本願明細書に示される開示にしたがい、当業者は特
にこれらに限定されないものと理解するものである。ま
た、可溶性ペプチドが、（ｉ）配列番号８の１−２７２
のアミノ酸配列において、少なくとも該配列番号８の１
１９−２３６のアミノ酸配列を包含するように該配列番
号８のＮ末端及び／又はＣ末端の任意の個数のアミノ酸
が削除されていてもよいアミノ酸配列からなるトロンビ
ンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を
促進する作用を有する可溶性ペプチド、（ｉｉ）前記
（ｉ）に記載のペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
且つトロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイン
Ｃの活性化を促進する作用を有する活性を有する可溶性
ペプチド、のいずれかである場合が好ましい。因みに、
これらの更に具体的なペプチドの例としては、（１）上
記式（Ｉ）のペプチドの他、下記のペプチドの（２）〜
（５）が挙げられる。

【００２０】（２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端に下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−２３
６のアミノ酸配列）。

【００２１】（３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−２７
２のアミノ酸配列）。

【００２２】（４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−４９
８のアミノ酸配列）。

【００２３】（５）配列番号１４の１−４６２のアミノ
酸配列からなるペプチド。 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

【００２４】本発明のペプチドはＮ末端アミノ酸残基と
してアミノ酸メチオニンを含有していてもよい。本発明
のペプチドはまた、Ｎ末端アミノ酸配列として例えば次
式：Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表さ
れるアミノ酸配列を有するリーダー配列、またはその一
部を含有していてもよい。

【００２５】自然の変異によりまたは人工の変異によ
り、ペプチドの活性および可溶性に重大な変化を与える
ことなく、ペプチドの構造の一部を変化させることが可
能である。本発明のペプチドは、トロンビンに結合し、
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
を有する限り、前記アミノ酸配列を有するペプチドの相
同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）に
相当する構造を有するペプチドも包含する。本発明のペ
プチドは少なくとも１個の糖残基を含有していてもよい
し、含有していなくてもよい。即ち、本発明では少なく
ともアミノ酸配列として、本明細書に説明された配列で
あることを示すものであって、特に糖残基により限定さ
れるものではない。

【００２６】本発明のペプチドを製造するに当たって
は、例えば、以下の方法により遺伝子操作技術を用いる
ことが好ましい。この遺伝子操作技術に用いるヒト由来
の遺伝子としては、例えば図１１に示される制限酵素地
図のＴＭＪ２等の遺伝子を出発原料として、本明細書に
開示されるトロンビンに結合し、トロンビンによるプロ
テインＣの活性化を促進する作用を有し、好ましくは配
列番号７の１−５７５のアミノ酸配列の部分配列からな
る、また他の好ましい態様としては界面活性剤の非存在
下で可溶性であるペプチドである、ペプチドをコードす
る遺伝子へと、通常の遺伝子操作技術で変更すれば良い
ものであり、例えば、本明細書で開示された種々のペプ
チドをコードする遺伝子を用いればよい。

【００２７】本発明における好ましい遺伝子を例示すれ
ば、以下の例が挙げられる。例えば、次式（II）（即
ち、配列番号４の１−３５４の塩基配列）： ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧ ＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ ＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴ ＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴ ＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣ ＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ ＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ ＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡ ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ ＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧ ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧ ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧ ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧ ＣＡＣＧＧＡＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧ ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣ ＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡ ＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴ ＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡ ＣＴＧＴ で表される塩基配列を含有するＤＮＡである。

【００２８】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。

【００２９】本発明のＤＮＡは前記式（II）で表される
塩基配列と、その５′末端および／または３′末端に結
合した少なくとも１種の他の塩基配列とを含有していて
もよい。式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種
の他の塩基配列とを含有するＤＮＡの例としては下記の
ＤＮＡ（１）〜（５）が挙げられる。 （１）上記式（II）で表されるＤＮＡ（即ち、配列番号
４の１−３５４の塩基配列）。

【００３０】（２）式（II）で表される塩基配列とその
５′末端に結合した次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号９の１−７０８の塩基配列）。

【００３１】（３）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号１１の１−８１６の塩基配列）。

【００３２】（４）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号５の１−１４９４の塩基配列）。

【００３３】（１５）配列番号１５の１−１３８６の塩
基配列からなるＤＮＡ。 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC GACTGT

【００３４】本発明のＤＮＡは、例えば、以下のように
して得ることができる。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したｃＤＮＡラ
イブラリーからその抗体と結合するペプチドをコードす
るｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤＮＡ断片の塩基
配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片はトロンビンの
プロテインＣ活性化を促進することのできるヒト肺由来
のペプチドの一部分をコードしている。その部分はその
ペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含まない。

【００３５】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマー エクステ
ンション法により以下のようにして得る。

【００３６】まず、上記工程（１）で得られたｃＤＮＡ
断片のコードするペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列に
対応するｃＤＮＡ断片の一部分を有機化学合成する。次
に、合成したＤＮＡをプライマーとして用いて通常の公
知のプライマー エクステンション法によりヒトさい帯
内皮細胞より調製したポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡから上記工程
（１）で得られるｃＤＮＡ断片の５′末端の上流の塩基
配列を有するｃＤＮＡ断片を得る。上記プライマー エ
クステンションを繰り返すことによりヒト肺由来のペプ
チドのＮ末端アミノ酸配列を含み、さらにそのＮ末端側
に後記のリーダー配列をコードするｃＤＮＡ断片を得
る。

【００３７】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を適宜結合することにより、開始
コドンから始まる１７２５塩基対（以下“ｂｐ”と略す
る）のオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮ
Ａ（以下“ｃＤＮＡ−Ａ”と略する）を得る。このオー
プンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１０
の１−１７２５の塩基配列である。またリーダー配列を
コードする塩基配列を除外し、ヒト肺由来のペプチドの
Ｎ末端アミノ酸配列からの塩基配列とすれば、配列番号
１２の１−１６７１の塩基配列となる。このｃＤＮＡ−
Ａから、前述のＤＮＡ（１）〜（５）の塩基配列と実質
的に同等の塩基配列を有するｃＤＮＡは、以下の部分を
位置特異的変異法で削除することによって得ることがで
きる。

【００３８】（ｉ）ＤＮＡ（４）の塩基配列と実質的に
同等の塩基配列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっ
ては、削除する部分としては、前記のオープンリーディ
ングフレームにおける開始コドンの最初の塩基から数え
て１５４９番目から１７２５番目の塩基までの部分であ
る。 （ii）ＤＮＡ（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１４４１番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 (iii)ＤＮＡ（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら７３２番目および１５４９番目から１７２５番目の塩
基までの部分である。

【００３９】(iv) ＤＮＡ（２）の塩基配列と実質的に
同等の塩基配列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっ
ては、削除する部分としては、前記のオープンリーディ
ングフレームにおける開始コドンの最初の塩基から数え
て５５番目から７３２番目および１４４１番目から１７
２５番目の塩基までの部分である。 (ｖ) ＤＮＡ（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら１０８６番目および１４４１番目から１７２５番目の
塩基までの部分である。このようにして得られた各ｃＤ
ＮＡの塩基配列は公知の方法で分析して、ＤＮＡ（１）
〜（５）の塩基配列とそれぞれ一致することを確認す
る。

【００４０】上記の本発明のＤＮＡは有機化学合成する
ことによっても得ることができる。また、本発明のＤＮ
Ａは前述のプライマー エクステンションを行うことな
く、前駆体ＤＮＡから調製することもできる。前駆体Ｄ
ＮＡは、前記工程（１）で得られるＤＮＡ断片またはそ
のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて調製した合成ＤＮＡ
をプローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション
法によってヒト染色体ＤＮＡライブラリーから得ること
ができる。

【００４１】前述の如く、式（II）の塩基配列を含有す
る本発明のＤＮＡは次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよく、通常細胞
等での発現においてこのリーダー配列の全部又は一部は
削除され得る。

【００４２】本発明によれば、上記ＤＮＡと相補的なＤ
ＮＡもまた提供される。本発明によれば、上記ＤＮＡと
それに相補的なＤＮＡが互いに相補的に結合して２重鎖
ＤＮＡを形成していてもよい。本発明のＤＮＡは前述の
すべてのペプチドの相同変異体に相当する構造を有する
ペプチドをコードする塩基配列を含有することも可能で
ある。

【００４３】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、そ
の遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類
の塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮ
Ａはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変化さ
れた塩基配列を含有することも可能である。この場合、
上記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ
酸配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。すなわ
ち、本発明は前述の種々のペプチドのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡまたはその相補的ＤＮＡである。

【００４４】更にまた、本発明によれば、前記の本発明
のＤＮＡと複製可能な発現ベクターとからなる複製可能
な組換え体ＤＮＡが提供される。該組換え体ＤＮＡは、
それによって形質転換された微生物または細胞中で、本
発明のペプチドを発現することができる。適したベクタ
ーの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２
７、ＹＲｐ７、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）、ｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）などが挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として
使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要
がある。

【００４５】更に本発明はまた、上述の複製可能な組換
え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞に関す
る。微生物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ２７３７５）；バチラス サブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ チ
フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられ
る。

【００４６】例えば、前述の配列番号７の１−５７５の
アミノ酸配列をコードする遺伝子の場合を例にとると、
生体内では、血管内皮細胞膜上に次式の一次構造（即
ち、配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列）で発現
される。

【００４７】 Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ

【００４８】また上記遺伝子をＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞
またはＣ₁₂₇ 細胞で遺伝子工学的に発現させた場合も、
同様にそれら細胞膜上に発現・濃縮され、培養液中には
活性が検知されないので、トリトンＸ−１００等の界面
活性剤の存在下調製する。しかし、該ペプチドのアミノ
酸配列のＣ末端から５９番目以降の配列 Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ を除くことにより、分泌され得る形態で培養液中に可溶
物として検知・回収できる。

【００４９】本発明のペプチドを製造する方法は、例え
ば以下の方法が好ましい例として挙げられるが、他の方
法によることも本発明が達成される限り特に限定されな
い。 （ａ）前述のペプチドをコードするＤＮＡと複製可能な
発現ベクターに連結して、該ＤＮＡと該複製可能な発現
ベクターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡを得、
（ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、（ｃ）該形
質転換体を該微生物または細胞の親細胞から選別し、
（ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして（ｅ）
該ペプチドを培養した形質転換体から単離する

【００５０】本発明の方法によれば、前述の本発明のＤ
ＮＡが正しく転写し、それによって得られるｍＲＮＡか
らの翻訳が正しく行われるように本発明のＤＮＡを複製
可能な発現ベクターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の
下流に組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体Ｄ
ＮＡを得、得られた該組換え体ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体を得る。得られた形質転換体は、該組み換え体ＤＮ
Ａに与えられた表現型によって微生物または培養細胞の
親細胞から単離される。得られた形質転換体を培養して
前記ＤＮＡの有する遺伝情報を発現させて本発明のペプ
チドを製造する。

【００５１】上述のペプチドの製造方法の（ｄ）工程に
おいて、形質転換体を培養して該ペプチドを生産させる
に際して、本明細書の実施例５の表４において、血清を
含有しないか、または通常よりその含有量を減少せしめ
た培地にて培養した場合に、本ペプチドが増加すること
が示され、有益な方法であることがわかる。したがっ
て、この方法により製造された場合には、血清由来蛋白
質を実質的に含有しないペプチドが得られるものであ
り、医薬組成物としてきわめて優れたものとなる。ま
た、本実施例の通り、ポリドカノール（Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ）等の界面活性剤の存在下で該ペプチドを精製する
場合には、結果として本発明の医薬組成物としては、界
面活性剤を含有するものとなる。

【００５２】トロンビンに結合し、トロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチドに
関して、従来、アミノ酸配列等の解明が不可能であって
遺伝子操作により製造された例はなく、したがって、実
質的に他のヒト由来の成分を含有しない精製されたペプ
チドとしては、天然型の配列番号１３の１−５５７のア
ミノ酸配列からなるペプチドも含めて従来、知られてい
ないものであって、本発明の開示するところによって、
初めて遺伝子操作により製造された実質的に他のヒト由
来の成分を含有しない精製された可溶性ペプチドが取得
し得たものである。したがって、前述のとおり、該可溶
性ペプチドとして、ヒト由来の夾雑成分を実質的に含有
しない組換えペプチドが好ましい例として挙げられる。

【００５３】尚、本発明のＤＮＡ及び組み換え体ＤＮＡ
を構築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモータ
ーや複製起源等をクローニングするためには原核細胞を
宿主として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好ま
しい。

【００５４】原核細胞の例としてはエシェリヒア コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えば
イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ
３１４４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５
３７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイ
ー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ− 、プロ
トトロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
如きバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネ
ラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の
腸内細菌；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）などが挙げられる。

【００５５】これらの細菌のうちエシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい。上記
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適し
たプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発
現ベクターとして一般に用いられる。例えば大腸菌を形
質転換するためのプラスミドベクターとしてはプラスミ
ドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができ
る。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモータ
ー、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別す
るのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー
遺伝子等を含んでいる。

【００５６】プロモーターの例としては、β−ラクタマ
ーゼ及びラクトースプロモーター、トリプトファンプロ
モーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例として
は、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺
伝子が挙げられる。一方、本発明のＤＮＡを発現して本
発明のペプチドを製造するためには上記の原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系および脊椎動物の細胞
などの真核生物の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベ
クター系を使用することができる。真核細胞の例として
は前述の動物の細胞株などの細胞が挙げられる。本発明
のＤＮＡを前述の真核細胞で発現させるために、本発明
の組換え体ＤＮＡは一般に遺伝子発現を制御するための
機能配列、例えば、複製起源、本発明のＤＮＡの上流に
位置すべきプロモーター、リボゾーム結合部位、ポリア
デニル化部位や転写終止配列を含有している。本発明の
ＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることのでき
るそのような機能配列はウィルスやウィルス性物質から
得ることができる。

【００５７】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などから得ることが
できる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーター
やＳＶ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。
また、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用
を有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上
流の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−
ベクター系で使用するのに適しているならば使用するこ
とができる。

【００５８】複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。

【００５９】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞は、前述のとおり、組換え
体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって
形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型
は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに
挿入することによって与えることができる。また複製可
能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利
用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、例
えば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコ
ードする遺伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をマーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲ
には様々のタイプがあるため、その使用するマーカー遺
伝子のコードしているＤＨＦＲのタイプによって用いる
べき宿主を選択しなければならない。

【００６０】例えば、マーカー遺伝子として野生型ＤＨ
ＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、宿主としてはＤ
ＨＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。ＤＨＦＲ欠損株は
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求するの
で、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
培地中では成育できない。しかしながら、ＤＨＦＲ欠損
株をＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転
換すると、その株はもはやヒポキサンチン、グリシン及
びチミジンを要求しなくなり、ヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンを含まない培地中でも成育することがで
きる。従って、形質転換細胞はヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準にして
形質転換されないで残った細胞から容易に選択すること
ができる。

【００６１】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよく、ＤＨＦＲを
欠損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。

【００６２】しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従っ
て、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判
断基準として用いて形質転換されていない細胞から選択
することができる。これに関し、真核細胞の大多数がＭ
ＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマー
カー遺伝子として用いるのに好都合である。

【００６３】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
も本発明のＤＮＡを発現するための宿主として用いるこ
とができる。酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。

【００６４】酵母細胞用の発現ベクターのプロモーター
の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボ
キシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６
−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの
解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。これらのうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターは、これらのプロモーターによる転写を宿主の
培養条件を変えることによって制御することができるの
で有利である。

【００６５】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発
現して本発明のペプチドを製造することができる。培養
後、本発明のペプチドは形質転換体の培養物から通常の
公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどを用
いて単離することができ、本明細書の記載に従って、本
発明の医薬組成物として使用できる程度に実質的に精製
されることが通常行われる。

【００６６】このようにして得られたペプチドは、本発
明の作用と可溶性を有する限り、様々な種類と長さの糖
鎖を少なくとも１種含有していてもよいし、また複数の
アミノ酸配列からなるペプチドの混合物であってもよ
い。得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは用
いる宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチドが
糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿
主細胞の種類によって異なる。

【００６７】一般に翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻訳
されたペプチドは宿主細胞から分泌されるときにプロセ
ッシングを受けて成熟蛋白になることが知られている。
本発明のペプチドの場合もそのようなプロセッシングを
受けることがある。ペプチドがプロセッシングを受ける
部位は、宿主により、または培養条件により変化する場
合がある。例えば、本発明のペプチドが、式（Ｉ）で表
されるペプチドとＮ末端アミノ酸配列として前述の１８
個のアミノ酸からなるリーダー配列とを含むプロセッシ
ングを受けていない未成熟形で形質転換細胞中で産生さ
れる場合、その未成熟形ペプチドはプロセッシングを受
けてリーダー配列が削除されて成熟形となることがあ
る。しかしながら、前述のように未成熟形ペプチドのプ
ロセッシングを受ける位置は使用する宿主の種類や宿主
の培養条件により変化するので必ずしも上記のようなプ
ロセッシングが起きるとは限らない。

【００６８】前述のとおり、本発明のトロンビンによる
プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
は組換えＤＮＡ技術を用いる方法により製造することが
できる。また、本発明のペプチドは通常の公知の方法に
より、例えば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて
有機合成により製造することもできる。本発明のペプチ
ドはトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作
用を有する。プロテインＣは血液凝固線溶機構において
重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であ
り、トロンビンの作用により活性化される。活性型プロ
テインＣは、生体内で血液凝固系補酵素の活性型第Ｖ因
子、および活性型第ＶＩＩ因子を失活させ、また血栓溶
解作用を有するプラスミノーゲンアクチベーターの産生
に関与していることが知られている。〔鈴木宏治、医学
の歩み、第１２５巻、９０１頁、（１９８３年）〕。

【００６９】本発明のペプチドは、このトロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と血
栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に産生せし
めるものである。従って、本発明のペプチドは生体にお
ける抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄与するものであ
る。前述のように、本発明の医薬組成物は抗血液凝固作
用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するの
で、血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制
御するための医薬組成物として用いることが可能であ
り、具体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、
末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症
候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒
症等の疾患の治療及び予防に用いることができる。

【００７０】本発明の凍結乾燥製剤を製造するに際して
は、実質的に精製された可溶性ペプチドと、投与可能、
かつ生理食塩水又はブドウ糖注射液に溶解し得る担体と
を含有する水溶液を、凍結乾燥すればよく、この凍結乾
燥の手法や条件は、本実施例や適用例を参考に行うこと
ができ、例えば、一次、二次の２回に分割して凍結乾燥
することも一括して行うことも任意である。

【００７１】薬剤として投与可能であり、かつ生理食塩
水又はブドウ糖注射液に溶解し得る担体としては、ショ
糖、精製ゼラチン、アルブミン、マンニトール、ブドウ
糖および塩化ナトリウムからなる群より選ばれた１種以
上が例示され、また各種無機塩のｐＨ調整剤などを添加
することも好ましい例として挙げられる。その結果、本
発明の凍結乾燥製剤は、医薬組成物全体として可溶性で
あり、且つ綺麗に凍結乾燥が可能であって、好ましい。
また本発明においては、上記担体が、グリセリンである
こともまた可能である。上記の担体は、製剤を調製する
際に添加することが好ましい。

【００７２】本発明のペプチドの成人１回当たりの投与
量は、年齢、性別、体重、症状等により異なるが、一般
に約０．１〜２００ｍｇであり、一日当たり一回または
必要に応じて数回、例えば血管内注射、好ましくは点滴
静注により投与する方法が例示される。本発明者等は、
本発明のペプチドが副作用の少ない極めて有用なもので
あることを確認しており、例えば、動物実験でラットｉ
ｖ投与において約３ｍｇ／Ｋｇで全く死亡例や害を生ず
ることがなく、有効な作用も認められることから、ヒト
の体重を約６０〜７０Ｋｇと考えて上記の投与量が妥当
なものとして提示される。

【００７３】

【実施例】本発明をより詳細に記述するために参考例及
び実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの実
施例にのみ限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定）本発明の
ペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測定は、合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシカルボニ
ル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略称であ
る）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ オーノ
（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１３８７
頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわち、プロ
テインＣ（最終濃度０．５μＭ）およびトロンビン（最
終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに本発明のペ
プチドを含む水溶液５μｌ（０〜０．０１ Ａ₂₈₀ ／ｍ
ｌ）を加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂ 、血清アルブ
ミン及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をそれぞれ最
終濃度が０．１５Ｍ、２．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍｌ及び２
０ｍＭになるように、そして全量が３０μｌとなるよう
に加えた。得られた混合物を３７℃で１５分間反応させ
てプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロン
ビンIII を１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリンを含
有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加温し
て反応を停止させた。

【００７４】得られた反応混合物に、前述の合成基質Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ〔財団
法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）製〕２００μＭを含む
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２５０μｌを
加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０％酢酸０．
５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離してきたＡＭＣ
（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度を励起波
長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分光光度計Ｒ
Ｆ−５４０型（島津製作所製、日本）により測定した。
得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍光強度と比較
して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１分間当りに生
成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量から本発明のペ
プチドを含まない水溶液を加えたときのＡＭＣ量を引い
た値がサンプルのトロンビンによるプロテインＣ活性化
を促進する強さを示す。

【００７５】ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木
らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４頁（１９８３年
等）〕で精製した。また、ヒトトロンビンはランドブラ
ッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法〔ランドブラッド
（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．）６６巻、４８２頁（１９７５年）〕で精製した。

【００７６】参考例２ （１）：（ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手） ヒトの肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ₁₁ｃＤＮＡライブラリーは、米国、クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ａ
ｖｅ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００４）。

【００７７】（２）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製） プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立
病院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを鋏で約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。
次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナイズし氷中で
５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び冷却操作を更
に３回くり返した。得られたホモジェネートを１２，０
００ｇで４℃において３０分間遠心分離にかけて上澄液
とペレットに分け、ペレットを集める。これに０．５％
（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５Ｍ庶糖、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む
０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌ
に懸濁し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分
間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得た。

【００７８】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピ
ー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の
方法〔（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。

【００７９】次に、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨンを集
めた。溶出によって得られる各フラクションについて前
記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進能を
測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォ
トメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの波長
２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ₂₈₀ ）を測定した。

【００８０】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂ 、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。

【００８１】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）
Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を３回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条
件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。な
お、溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集め
た。プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、０．１
Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ Ｐ
Ｘを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大きさの４回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出して得られ
たフラクションは１．９ｍｌずつ集めた。

【００８２】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm
・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本精
製品の量を計算したところ約５００μｇであった。な
お、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５
〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀
染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確
認された。

【００８３】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファ
ロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−０４４
０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩衝液で
充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセファロ
ースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。次いで
０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（米国Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ−６８８２）を
含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、このタン
パク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖を含む
いわゆるグリコペプチドであることがわかった。

【００８４】（３）：（トロンビンのプロテインＣ活性
化を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析） このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０頁
（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン
分析を行なった。遊離してくるフェニルチオヒダントイ
ン アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高
速液体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）およ
び米国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用いて
分析を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、ア
ミノ酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１１個目
までは下記アミノ酸配列を有するものであることがわか
った。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ

【００８５】（４）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブの作成） トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツカ
エト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ．）、
ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６０５頁
（１９８５年）〕に従って、デオキシイノシン（“Ｉ”
で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端からのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
従って精製し、実験書〔イー エフ マニアティスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレキ
ュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、１２２頁（１９８２年）〕の記載にしたがって、
Ｔ₄ ＤＮＡキナーゼ、およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰを用いて
ラベル化した。

【００８６】（５）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体） トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。

【００８７】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。

【００８８】（６）：（ヒトさい帯内皮細胞の採集及び
培養） ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精社
製、日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．
Ｍａｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅ
ｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁（１
９８３年）〕に従って、私立病院より提供された新鮮な
ヒトさい帯から得た静脈より採集し培養した。

【００８９】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：（ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製） ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製した。

【００９０】（２）：（ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りのスクリーニング） ヒト肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ１１に組み込んだｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュア
ルに従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ク
ローンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地
プレート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラ
ーク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独国）をプレートの上に載せ、
３７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩ
ＰＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上
にうつしとる。

【００９１】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国、カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ１１に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３
と称した。

【００９２】（３）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション） 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁（１９８４年）、コールド スプリング ハーバ
ー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。Ｄ
ＮＡ断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことが
わかった。

【００９３】（４）：（ＴＭ１３の塩基配列） 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するＤＮＡ
断片ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー
エフ ら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７
７年）にしたがって決定した。結果を図２、図３に示
す。

【００９４】（５）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブ
としたヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング） ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕII
で消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これをニ
ックトランスレーション法で³²Ｐで標識した。このＤＮ
Ａ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性のク
ローンをスクリーニングした。すなわち、常法に従って
クローンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕIIで
消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抽
出、精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎｇを得
た。このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日本）社製
のニックトランスレーション キット（カタログ番号
Ｎ．５０００）を用い、それに添付のユーザー マニュ
アルに従ってα−³²Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識した。

【００９５】この³²Ｐで標識したＤＮＡ断片をプローブ
として実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキユラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁（１９８２年）、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に
従ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブリ
ダイゼーションを行なった。陽性のクローンを単離し、
そのクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で解析
したところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも前記
ペプチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると思わ
れる約２，４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれている
ことがわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称し
た。

【００９６】（６）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配
列） 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結
果を図４〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含まないことがわかった。

【００９７】（７）：（プライマー エクステンショ
ン） 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示した。

【００９８】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′（２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′（２０ｍｅｒ） 次に、このＨＴＭ１３３をプライマーとして参考例３−
（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを用いて、いわゆるプライマ
ー エクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１３７のさらに
５′上流部分を合成した。

【００９９】すなわち、約１μｇ／μｌのポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／μｌのＨＴＭ１３３溶液２
０μｌを加え、６５℃で２０分間加熱後、室温にまで約
１時間かけて冷却した。それ以降は、ｃＤＮＡ合成シス
テム（アマシャム ジャパン社製、日本、カタログ番号
ＲＰＮ１２５６）を用いて、そのマニュアルに従ってｃ
ＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ合成システムに入っ
ているオリゴ（ｄＴ）プライマーのかわりにＨＴＭ１３
３を用いて実施した。

【０１００】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１頁
（１９８２年）、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１
株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける
吸光度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌ
を集め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯ
ＰＳ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで５０ｍＭ
ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．
１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。

【０１０１】得られた懸濁液を３０分間氷冷し、遠心
後、上澄を除去し、３０μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ
ＣａＣｌ₂ と１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）の混合液中に懸濁さ
せた。懸濁液を２００μｌずつ分注し、前述のプラスミ
ドＤＮＡ溶液１０μｌをそれぞれに加えた。該混合液を
３０分間氷冷した後、４４℃で６０秒ヒートショックを
与え、ただちに、あらかじめ３７℃に温めておいた５ｍ
ｌのＬＢ培地を加えた。この溶液を３７℃で１時間培養
した後、それぞれの溶液を遠心し、上澄を除去し、細胞
ペレットを得た。該細胞ペレットにＬＢ培地を加え、撹
拌した後、懸濁液とした。該懸濁液を５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにまき３７℃で
１夜培養を行なった。このようにして得られるｃＤＮＡ
バンクより、参考例２−（４）に記載した方法に従って
５′末端を³²Ｐで標識したＨＴＭ１３１及びＨＴＭ１３
２をそれぞれプローブとして、コロニーハイブリダイゼ
ーションを参考例３−（３）と同様の方法で実施した。

【０１０２】コロニハイブリダイゼーションで約７０，
０００個の形質転換体をスクリーニングしてＨＴＭ１３
１及びＨＴＭ１３２の両者のプローブと反応するコロニ
ーが６クローン得られた。この６クローンから、実験書
〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、３６６頁（１９８２年）、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってプラ
スミドＤＮＡ（これを“ｐＴＭＰ５”と称する）を調製
し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析し
たところ、６クローンから得られたプラスミドＤＮＡは
全て同一であり、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片と
ベクターからなることがわかった。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＰ５と命名した。

【０１０３】（８）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーション） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。

【０１０４】（９）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配
列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。結果を図８〜図９に
示す。

【０１０５】（１０）：（第２回目のプライマー エク
ステンション） 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作成する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０，０
００個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１
３５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られ
た。この形質転換体が保有する組換え体に含まれている
ＤＮＡ断片をＴＭＰ２６と命名した。

【０１０６】（１１）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末
端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブ
リダイゼーシヨン） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。

【０１０７】（１２）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基
配列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。

【０１０８】（１３）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭ
Ｐ５及びＴＭＰ１３７の接合） 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示した。図１１に示
すようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ
酸配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧ
よりオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで
続く１，７２５ｂｐからなることが分かった。この各Ｄ
ＮＡ断片にわたるオープンリーディングフレームをコー
ドするＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、
ＴＭＰ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って
継ぎあわせた。

【０１０９】（１３−１）（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ） まず、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入されている
ＤＮＡ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７
−４９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次にプラスミドｐ
ＵＣ１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩ
で消化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
ＭＡＸ−ＹＩＥＬＤＲ）を用いて約２，３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製し
た。

【０１１０】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐ
ｏｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍ
ａＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を
得た。次にこのプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで完全消化して約６００
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃII断片を得た。以上の様に
してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７より調製した約
２，３００ｂｐのＤＮＡの断片及びプラスミドｐＵＣ１
８ＴＭＰ５より調製した約６００ｂｐのＤＮＡ断片プラ
スミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化
して調製したベクターに挿入してプラスミドｐＵＣ１８
ＴＭＪ１を得た。この工程を図１２に示した。

【０１１１】（１３−２）（ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭ
Ｐ２６の継ぎあわせ） プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１，５００ｂｐの断片を回収した。一方、ＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６をプラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社
製、スウェーデン、カタログ番号２７−４９５４−０
１）の制限酵素ＰｓｔＩサイトに挿入してプラスミドｐ
ＵＣ１３ＴＭＰ２６を得た。これをＢｂｅＩで完全消化
した後、切断末端をＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平
滑末端にし、さらに制限酵素Ｂｇl IIで完全消化して約
１７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに別に、プラスミ
ドｐＵＣ１３ＴＭＰ２６をＢｇl II及びＤｄｅＩで完全
消化して約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【０１１２】次に上記の約１７０ｂｐ、約２８０ｂｐ、
約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用い
て継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、５０Ｖ
の電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガロースゲル
電気泳動にかけて精製単離し、約１，４００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。また別途、プラスミドｐＵＣ１８をＳｐ
ｈＩで完全に消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼで切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完
全消化してベクターを調製した。このベクターに上述の
約１，４００ｂｐ及び約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片を
Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵ
Ｃ１８ＴＭＪ２を得た。この工程を図１３に示す。

【０１１３】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング）ヒト
染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニング
は以下のようにして実施した。λファージのベクターＥ
ＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖｅ．
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入した
（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーより
参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプロ
ーブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でスク
リーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサートを
含有する染色体クローンが１種類得られた。この染色体
クローンを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して１．０％
アガロースゲル電気泳動を行ない、実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、３８２頁
（１９８２年）、コールド スプリング ハーバーラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってサザン ブロット ハ
イブリダイゼーションを同じプーロブを用いて実施し
た。

【０１１４】その結果、約４，０００ｂｐのＤＮＡ断片
に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法に従って
単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングした。この約４，０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−２）で
作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入されてい
るＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。

【０１１５】実施例１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ１、ｐ
ＳＶ２ＴＭＤ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ４及び、ｐＳＶ２ＴＭ
Ｄ５の作製） （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化してＳＶ４
０の初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネ
ータを有するベクターを得た。次に参考例２−（１３−
２）で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨｉｎ
ｄIII で部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化して約
２，９００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断
片をＴＭＪ２と称した。この２，９００ｂｐのＤＮＡ断
片と上記の如く調製したベクターとをＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼを用いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を
得た。プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程を図
１４に示す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２につ
いてはブダペスト条約の規定に基き、アメリカン タイ
プ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号
第６７２８３号として寄託されている。

【０１１６】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ１の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いでＨ
ｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＤ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。また別途、下記の塩基配列を有す
る削除用ＤＮＡプローブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌ
ｅｔｅｒ）”と称する〕を有機合成した：５′−ＧＧＡ
ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧ−３′
(25 mer)。合成ディリーターをＴＭＤと称した。

【０１１７】このようにして作成したディリーターＴＭ
Ｄを用い、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００巻、
４６８頁（１９８３年）、アカデミック プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って部位
特異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体プラス
ミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ１３の１７７塩基からなる
部分の削除を行った。即ち、２５ｐｍｏｌのディリータ
ーＴＭＤおよび１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３
（ユニバーサルプライマー、宝酒造社製、カタログ番号
３８３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸化
した後、０．５ｐｍｏｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９
５℃で５分間加熱後、室温にまで冷却した。

【０１１８】次いで、５単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポ
リメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及
び１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガーゼを混合物に加えて３７
℃で３０分間インキュベートして混合物中に組換え体プ
ラスミドを生成させた。得られた混合物をイー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウ
ェーデン、カタログ番号２７−１５５０）に加えた。そ
れによって、このイーコリを組換え体プラスミドでトラ
ンスフェクションした。３７℃で一夜培養して生じた寒
天培地上のプラークをニトロセルロースフィルターに移
しとり、８０℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼー
ションを行った。プレハイブリダイゼーションは６×Ｓ
ＥＴ〔０．９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｔｓ’〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．
１％（ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、
０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
を含む溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施
した。

【０１１９】次いで上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮＡ
のかわりに³²ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用い
てハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施し
た。次に６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエン
酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロースフ
ィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗っ
た後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上げ
ていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィル
ムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米国）を
得られたニトロセルロースフィルターに密着させて−８
０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に強く露
光した黒いスポットが数１０個検出された。

【０１２０】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制限酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは、制
限部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかっ
た。得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ１と
称した。さらにこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ
１は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４９８個の
アミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配
列を含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することが
わかった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１に
含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ１と称した。図１５に組換
え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリータ
−ＴＭＤとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に
対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１２１】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ１をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ１の約１，９００ｂｐ ＤＮＡ断片
を単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ａ
ＴＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完
全消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片
ＴＭＤ１とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、
プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を得た。

【０１２２】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ２の作製 下記の塩基配列：５′−ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧ
ＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有する
ディリーターＴＭｄ₂ をディリーターＴＭＤの代わりに
削除用ＤＮＡプローブとして用いる以外は実施例１−
（２）−（ａ）と実質的に同様の方法を繰り返して、Ｔ
ＭＤ２と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ
１３−ＴＭＤ２を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ２は、実施例
１−（２）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ１の
５′末端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ２は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に２７２個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１６に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１とデ
ィリーターＴＭｄ₂とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ１に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとこ
ろを示す。

【０１２３】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ２をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ２の約１，２００ｂｐＤＮＡ断片を
単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴ
ＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ２とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を得た。

【０１２４】（４）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の作製 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ３の作製 前記工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次いでＨ
ｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一
方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日本、カ
タログ番号３１１９）のＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで
消化してベクターを調製した。このベクターにＤＮＡ断
片ＴＭＪ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３を得た。また別途、下記の塩基配列を有す
るディリーターを有機合成した：５′−ＧＧＡＧＧＣＣ
ＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡ−３′(25 me
r)。合成ディリーターをＴＭｄ₃と称した。

【０１２５】このようにして作製したディリーターＴＭ
ｄ₃ を用い、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００
巻、４６８頁（１９８３年）、アカデミック プレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従っ
て部位特異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体
プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３の２８５ｂｐから
なる部分の削除を行った。即ち、２５ｐｍｏｌのディリ
ーターＴＭｄ₃ 及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ
３（ユニバーサルプライマー、宝酒造社製、カタログ番
号３８３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸
化した後、０．５ｐｍｏｌの組換えプラスミドＭ１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９
５℃で５分間加熱後、室温にまで冷却した。

【０１２６】次いで５単位のＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメ
ラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１
０単位のＴ₄ ＤＮＡリガーゼを混合物に加えて３７℃で
３０分間インキュベートして混合物中に組換え体プラス
ミドを生成させた。得られた混合物をイー コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデ
ン、カタログ番号２７−１５５０）に加えた。それによ
りイー コリを組換え体プラスミドでトランスフェクシ
ョンした。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上のプ
ラークをニトロセルロースフィルターに移しとり、８０
℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行っ
た。プレハイブリダイゼーションは、６×ＳＥＴ〔０．
９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’
〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％
（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１％
ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶
液中で５５℃、２時間加温することにより実施した。

【０１２７】次に上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮＡの
かわりに³²ＰでラベルしたＴＭｄ₃を加えた溶液を用い
てハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施し
た。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエ
ン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロース
フィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗
った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上
げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィ
ルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米国）
を得られたニトロセルロースフィルターに密着させて−
８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィルム上に強く
露光した黒いスポットが数１０個検出された。各スポッ
トは組換え体プラスミドで感染したクローンに対応する
ものである。そのうち、６クローンを選択し、各クロー
ンの組換え体プラスミドを単離して制御酵素解析、及び
塩基配列の解析を行ったところ、これらのクローンの保
有する組換え体プラスミドは制限部位と塩基配列がそれ
ぞれ同一であることがわかった。

【０１２８】得られた組換え体プラスミドをＭ１３−Ｔ
ＭＤ３と称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３−
ＴＭＤ３は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４６
２個のアミノ酸からなるペプチドをコードする塩基配列
（配列番号１５の１−１３８６の塩基配列）を含有する
ＤＮＡ断片を有することがわかった。この組換え体プラ
スミドＭ１３−ＴＭＤ３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ
３と称した。図１７に組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ
１９ＴＭＪ３とディリーターＴＭｄ₃ とがハイブリダイ
ズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に対応するＤＮＡ領域の一部
が削除されるところを示す。

【０１２９】（ｂ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ４の作製 部位特異的変異の手法を用いて、ディリーターＴＭｄ₃
の代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリ
ーターＴＭｄ₂ を用いる以外は実施例１−（４）−
（ａ）と実質的に同様の方法で、上述の如く得られた組
換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３の一部を削除して、
ＴＭＤ４と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミド
Ｍ１３−ＴＭＤ４を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ４は実施例
１−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の
５′末端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ４は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に２３６個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１８に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ₂ とがハイブリダイスし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとこ
ろを示す。

【０１３０】（ｃ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ４をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ４の約１，１００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ４とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を得た。

【０１３１】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ５の作製 下記の塩基配列：５′−ＣＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＣＧＧ
ＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有する
ディリーターＴＭｄ₄ をディリーターＴＭｄ₂ の代わり
に削除用ＤＮＡプローブとして用いる以外は実施例１−
（４）−（ｂ）と実質的に同様の方法を繰り返して、Ｔ
ＭＤ５と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ
１３−ＴＭＤ５を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ５を実施例１
−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の５′
末端から１，０３２ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ５は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に１１８個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１９に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ₄ とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとこ
ろを示す。

【０１３２】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ５をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ５の約７４０ｂｐ ＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
５とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を得た。

【０１３３】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換）ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）を培養器中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血
清（以下“ＦＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最
小必須培地（以下“ＭＥＭ”と略する）〔米国、フロー
ラボラトリ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
社製、カタログ番号１０−３３１）〕を用いて、３７℃
で５％炭酸ガスインキュベーター中で対数増殖期になる
まで培養し、０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴ
Ａを用いて培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはが
して、ハンクス平衡塩類溶液〔米国、フロー ラボラト
リー（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、カタ
ログ番号１７−１０１−２２〕に約１×１０⁷ 個／ｍｌ
の濃度になるように懸濁した。

【０１３４】実施例１−（５）で得られたプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試
験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得られたＣ
ＯＳ−１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて、０℃で
１０分間放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．
Ｐ．ＳＹＳＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型の
キュベットに移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回
電気パルスを与えた。その後懸濁液を再び元のエッペン
ドルフ型試験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０
％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍ
ｌを以下のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ートに移した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを
含むダルベッコのＭＥＭを懸濁液に加えて、その混合物
を組織培養用プレートに移した。次いで試験管を残りの
ダルベッコのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレー
トに加えた。その後、プレートは５％ＣＯ₂ 存在下３７
℃で２４時間培養した。

【０１３５】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認）培養終了後、プレートの培地をＦ
ＣＳを含まないダルベッコのＭＥＭに交換し、４８時間
培養した。培養上澄液を５μｌ採取し、これを試料とし
て参考例１に記載した方法で、プロテインＣ活性化の促
進作用を測定した。更に、直径１０ｃｍの組織培養用プ
レート１枚分の細胞を米国コースター（Ｃｏａｓｔｅ
ｒ）社製セルスクレイパー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅ
ｒ）（カタログ番号３０１０）を用いて掻き取って集
め、８００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心分離して集め
る。このペレットを試料として用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣの活性化を促進する作用を測定し
た。またコントロールとしてはプラスミドｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒでトランスフォームしたＣＯＳ−１細胞の培養上
澄液及び細胞ペレットを試料として用いた。結果を表１
に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。

【０１３６】

【表１】

【０１３７】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表２に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。

【０１３８】

【表２】

【０１３９】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表３に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。

【０１４０】

【表３】

【０１４１】実施例５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表４に示す。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光
度を組織培養用プレート１枚分に換算したものである。

【０１４２】

【表４】

【０１４３】実施例６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果、細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化促進
作用を示し、生成したプロテインＣの量は約３００ｎｇ
であった。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞ではこ
の活性は検出されなかった。

【０１４４】実施例７ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＨＯ細胞の形質
転換と形質転換細胞における発現）約４μｇのプラスミ
ドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５０）、及び
約２０μｇの実施例１−（５）で作成したプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を混合してエタノール沈殿した。沈殿物
を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５０
０μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄、ｐＨ７．
１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ
₂ を滴下し室温に１０分間放置した。

【０１４５】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、フロー
ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４９）
を含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（米国、フロー ラ
ボラトリー社製、カタログ番号１０−４２１−２０）を
用いて直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚
当たり細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株
（ＡＴＣＣ ＣＣＬＤ６１）を１夜培養し、培地を新鮮
な培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−Ｋ
Ｉに前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液
を重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（米国、フロー ラボラトリー社製、カタログ番
号２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、
５ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１
６時間さらに培養した。

【０１４６】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。

【０１４７】この操作で得られた細胞のクローンをそれ
ぞれ直径１０ｃｍの組織培養プレートでコンフルエント
になるまで生育させた。途中、培地のＦＣＳ濃度を１０
％から１％に減らした培地に切り換えて培養した。この
ＦＣＳ含有選択培地で培養した培養液５０μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化を促進する作用を測定したところ、強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトランス
フォームした細胞では、本活性は検出されなかった。

【０１４８】実施例８ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によって形質転
換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロ
テインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロ
ールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでト
ランスフォームした細胞では、本活性は検出されなかっ
た。

【０１４９】実施例９ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によって形質転
換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロ
テインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロ
ールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでト
ランスフォームした細胞では、本活性は検出されなかっ
た。

【０１５０】実施例１０ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例７と同様の操
作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によって形質転
換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプ
ロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロ
テインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロ
ールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでト
ランスフォームした細胞では、本活性は検出されなかっ
た。

【０１５１】実施例１１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）約４μｇ
のプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５
０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプラスミド
ｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿した。沈殿
物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭト
リス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５
００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０
ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ
７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ₂ を滴下し室温に１０分間放置した。

【０１５２】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、フロー
ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４９）
を含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（米国、フロー ラ
ボラトリー社製、カタログ番号１０−４２１−２０）を
用いて直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚
当たり細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株
（ＡＴＣＣ ＣＣＬＤ６１）を１夜培養し、培地を新鮮
な培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−Ｋ
Ｉに前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液
を重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（米国、フロー ラボラトリー社製、カタログ番
号２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、
５ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１
６時間さらに培養した。

【０１５３】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。

【０１５４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を細胞ペレットを試料と
して用いて測定したところ強いプロテインＣ活性化促進
作用が認められた。一方、コントロールとして用いたプ
ラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及び
その培養上澄液では、本活性は検出されなかった。

【０１５５】実施例１２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（５）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
５をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約１，７００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１を得た。

【０１５６】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得た約２６００ｂｐのＤＮＡ断片を
挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１を得た。このプ
ラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１をＨｉｎｄIII で完全消化
したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣ
Ｃ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断
片とをＴ₄ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇ 細胞
発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１を得た。以
上の工程を図２０〜図２１に示す。

【０１５７】次に、実施例７に記載の方法に準じてｐｄ
ＢＰＶＴＭＤ５−１でＣ₁₂₇ Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、フ
ロー ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ強い活性が認
められた。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＢＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細胞
では、本活性は検出されなかった。

【０１５８】実施例１３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（４）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
４をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２１００ｂｐ
の断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ
II及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入してプ
ラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１を得た。

【０１５９】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２，９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得た約３，０００ｂｐのＤＮＡ断
片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１を得た。こ
のプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１をＨｉｎｄIII で完全
消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（Ａ
ＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得
た断片とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇
細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１を得
た。以上の工程を図２２〜図２３に示す。

【０１６０】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇ Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、
フロー ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００
−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０
ｃｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで
生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置
換して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μ
ｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性
が認められた。一方、コントロールとして用いたプラス
ミドｐＢＰＶ−（９−１）だけでトランスフォームした
細胞では、本活性は検出されなかった。

【０１６１】実施例１４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（３）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２, ２００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１を得た。

【０１６２】一方プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コバ
スルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄIII で消化して得た約２，９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約３，０７０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を挿入して、プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１を得
た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１をＨｉｎｄIII
で完全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消
化して得た断片とＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ₁₂₇
細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１を得
た。以上の工程を図２４〜図２５に示す。

【０１６３】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇ Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマインシ（米国、フ
ロー ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ強い活性が認
められた。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では、本活性は検出されなかった。

【０１６４】実施例１５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（２）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ
１をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約３, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１を得た。

【０１６５】一方プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コバ
スルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２, ９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラス
ミドｐＢＲＴＭＤ１−１を得た。このプラスミドｐＢＲ
ＴＭＤ１−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）
をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡ
リガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇ 細胞発現用のプラスミ
ドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１を得た。以上の工程を図２６
〜図２７に示す。

【０１６６】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇ Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、
フロー ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００
−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０
ｃｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで
生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置
換して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μ
ｌをとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性
が認められた。一方、コントロールとして用いたプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームし
た細胞では、本活性は検出されなかった。

【０１６７】実施例１６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（１）で作成したプラスミドｐＳＶ２７ＭＪ
２をＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガー
ゼを作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄ
III サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１
を得た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を
ＰｖｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約４, １００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿
入してプラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。

【０１６８】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２，９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラス
ミドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミドｐＢＲ
ＴＭＪ２−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）
をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡ
リガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇ 細胞発現用のプラスミ
ドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の工程を図２８
〜図２９に示す。

【０１６９】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇ Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１（ｖ／ｖ％）ペニシリン−ストレプトマイシン（米
国、フロー ラボラトリー社製、カタログ番号１６−７
００−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養
したところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られた
のでそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径
１０ｃｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになる
まで生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地
に置換して培養した。この培地で１日培養した後、培養
した細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例１
に記載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定
したところ、強い活性が認められた。一方、コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけ
でトランスフォームした細胞では本活性は検出されなか
った。

【０１７０】実施例１７ （本発明の培養液からのトロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドの精製）実施
例７に記載した方法で培養したプラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏ及びプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォー
ムしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート
２５枚で培養した。培地は１日おきに４回新鮮な培地と
交換した。この培養液をすべて集め（約１００ｍｌ）、
ｐＨ７．５に調製した後ＤＩＰ−トロンビン−アガロー
スのカラムクロマトグラフィーにかけて調製した。すな
わち、エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら
〔ザ ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５７巻、８５９頁、
（１９８２年）〕の方法にしたがって作製したＤＩＰ−
トロンビン〔ジイソプロピルホスホロトロンビン（ｄｉ
ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｒｏｍｂｉ
ｎ）〕を、ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２４
５巻、３５９頁（１９７０年）〕にしたがってブロムシ
アン化したアガロースに結合させてＤＩＰ−トロンビン
−アガロースを作製した。

【０１７１】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の上澄液をカラムに供した。カラムを０．３
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ
を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗
浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。
溶出によって得られる各フラクションについて前記の方
法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。同時に
島津製作所（日本）製スペクトロフォトメーターＵＶ−
２４０を用いて、各フラクションの波長２８０ｎｍにお
ける吸光度（Ａ₂₈₀ ）を測定した。活性のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、
０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（半井化学薬品
製、日本）を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で透析した。得られた透析液を２回目のＤＩＰ
−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに
供した。

【０１７２】即ち、透析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの
大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに通
し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、さらに
０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で溶出した。活性画分を回収し、精製品を−８
０℃で凍結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般
的な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1%
_1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づ
き精製品の量を計算したところ約４．７μｇであった。
尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−１０
％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察した
ところ単一のバンドのみ確認された。

【０１７３】実施例１８ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４．５
μｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲ
ル濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバ
ンドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１７４】実施例１９ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃
度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンド
を観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１７５】実施例２０ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い本発明のペプチドの精製品を得、波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品の
分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならい
１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定し
て、それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇ
であった。尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５
−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観
察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１７６】実施例２１ 実施例１１に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｊ２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣ
ＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を
用いて培養した。培養後、培養上澄液を８００ｒｐｍで
１０分間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞
ペレットに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、
０．２５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダー
を用いて４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出
物を得た。得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃で
６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液
から、実施例１７と同様の操作により本発明のペプチド
の精製品を得、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子
吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝
１０．０）と規定して、それに基づき精製品の量を計算
したところ約３μｇであった。尚、この精製品をポリア
クリルアミド濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色
によってバンドを観察したところ単一のバンドのみ確認
された。

【０１７７】実施例２２ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認）精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性
化の促進作用を次の方法にて評価した。即ち、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１０ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロテインＣ、５ｎ
Ｍのトロンビン及び５ｎＭの精製した本発明のペプチド
を加えて３７℃で反応させた。反応物に３００μｇ／ｍ
ｌのアンチトロンビンIII(米国シグマ社製）および５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止して、生成した活性型
プロテインＣの量を前述の合成基質を用いる方法で測定
した。結果を図３０〜図３４に示すが、本発明のペプチ
ドを無添加の場合（Ｂ）では活性化プロテインＣの生成
は認められなかった（点線）が、本発明のペプチドを添
加した場合（Ａ）には、反応時間と共に生成した活性化
プロテインＣの量が増加した（実線）。

【０１７８】実施例２３ （抗血液凝固作用の確認）本発明のペプチドがトロンビ
ンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を阻害
し、血液凝固を実質的に阻害することはハインリッヒ
アメルング社（独国）製のコアギュロメーターＫＣ−１
０を用いて血液凝固時間を測定することによって調べ
た。即ち、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に３．
０μｇのフィブリノーゲン（米国シグマ社製、フラクシ
ョンＩ）を加え、これに０−５０ｎＭの精製した本発明
のペプチドを加え、次いで、全量が０．４ｍｌになるよ
うに１０ｎＭのトロンビンを加えて凝固時間を測定し
た。結果を図３５〜図３９に示す。トロンビンにくら
べ、添加した精製ペプチドの量が多くなるにしたがっ
て、血液凝固時間が延長されることが確認された。

【０１７９】実施例２４ （血小板凝集抑制作用の確認）本発明のペプチドがトロ
ンビンの血小板凝集作用を実質的に阻害することはＳＩ
ＥＮＣＯ社（米国）製のプレートレットアグリゴメータ
ーを用いて評価した。即ち、３０万ｃｅｌｌｓ／μｌの
血小板液（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍ
ａ、Ｐ．Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに１単位のトロンビン
（約０．４μｇ）を加えると血小板が凝集するが、トロ
ンビンを加える前にその加えるトロンビンと等モル以上
の精製した本発明のペプチドを加えておくと血小板の凝
集が起きなかった。

【０１８０】

【適用例】以下に上記の各実施例で得られた種々の可溶
性のペプチドの適用例を応用例をもって説明するが、本
発明はそれら応用例により何ら限定されるものではな
い。 応用例１ 精製した本発明のペプチド １０ ｍｇ 精製ゼラチン ２０ ｍｇ マンニトール １００ ｍｇ 塩化ナトリウム ７．８ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム １５．４ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。

【０１８１】応用例２ 精製した本発明のペプチド ２．５ ｍｇ アルブミン ５ ｍｇ マンニトール ２５ ｍｇ 塩化ナトリウム １．９５ｍｇ リン酸（１及び２）ナトリウム ３．８５ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−３５℃で２時間予備
凍結し、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解され、その溶解液は、点滴静
注するのに用いられる。

【０１８２】

【発明の効果】本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、
血小板凝集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の
少ない循環器系疾患などの治療用薬として極めて有用な
物質である。また、本発明のペプチドは、このような医
薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテー
テルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防
止する薬剤として用いることができる。

【０１８３】

【配列表】

出願人氏名：旭化成工業株式会社 発明の名称：凍結乾燥製剤の製造法 整理番号 ：Ｐ９７１１１２Ａ 出願日 ：平成９年１１月１２日 配列の数 ：１５ 配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115

【０１８４】配列番号：２ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55

【０１８５】配列番号：３ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly

【０１８６】配列番号：４ 配列の長さ：３５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC TGT 354

【０１８７】配列番号：５ 配列の長さ：１４９４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494

【０１８８】配列番号：６ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235

【０１８９】配列番号：７ 配列の長さ：５７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 515 520 525 Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly 530 535 540 Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 545 550 555 560 Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 565 570 575

【０１９０】配列番号：８ 配列の長さ：２７２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270

【０１９１】配列番号：９ 配列の長さ：７０８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708

【０１９２】配列番号：１０ 配列の長さ：１７２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG 96 CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC 144 AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC 192 TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC 240 GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC 288 GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG 336 GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT 384 GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG 432 GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG 480 AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG 528 CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC 576 TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG 624 GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC 672 ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG 720 GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC 768 AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC 816 CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC 864 AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC 912 TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA 960 CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT 1008 CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC 1056 CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG 1104 TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT 1152 AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG 1200 CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC 1248 TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC 1296 CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC 1344 GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC 1392 ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1440 GAC TCC GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG 1488 CCC AGC CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC 1536 GTG CAT TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG 1584 GTG GTG GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC 1632 GCC GCC AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG 1680 GTA GTG CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1725

【０１９３】配列番号：１１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816

【０１９４】配列番号：１２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC 1584 AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671

【０１９５】配列番号：１３ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555

【０１９６】配列番号：１４ 配列の長さ：４６２ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460

【０１９７】配列番号：１５ 配列の長さ：１３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGT 1386

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロ−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグ
ラフである。

【図２】参考例３−（２）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３の塩基配列を示すものである。

【図３】図２に続き参考例３−（２）で得られる、ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３の塩基配列を示すものである。

【図４】参考例３−（５）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７の塩基配列を示すものである。

【図５】図４に続き参考例３−（５）で得られる、ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３７の塩基配列を示すものである。

【図６】図５に続き参考例３−（５）で得られる、ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３７の塩基配列を示すものである。

【図７】図６に続き参考例３−（５）で得られる、ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３７の塩基配列を示すものである。

【図８】参考例３−（７）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ５の塩基配列を示すものである。

【図９】図８に続き参考例３−（７）で得られる、ＤＮ
Ａ断片ＴＭＰ５の塩基配列を示すものである。

【図１０】参考例３−（１０）で得られる、ＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６塩基配列を示すものである。

【図１１】ＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及び３−
（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＪ２
の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有する塩基
配列における対応関係を示すものであり、縦方向にみて
各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配列を有
することを示す。図中ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地
図の斜線部分は斜交線部分とを含む部分は考えられるオ
ープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本発
明の塩基配列が存在するものである。

【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。

【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターにＴ
ＭＪ２を挿入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２の構築を示すフローチャートである。

【図１５】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭＤが相補的にハイブリダイズしたところを示すもの
であり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズし
ている部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされ
ているアミノ酸配列を示すものである。

【図１６】実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え
体プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１７】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭｄ₃が相補的にハイブリダイズしたところを示すも
のであり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズ
している部分の周辺の塩基配列とそれによってコードさ
れているアミノ酸配列を示すものである。

【図１８】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１９】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₄
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図２０】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２１】図２０に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２２】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２３】図２２に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２４】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２５】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２６】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２７】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２８】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２９】図２７に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図３０】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３２】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３３】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３７】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３８】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図４０】ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地図である。
図中、斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えられる
オープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本
発明のペプチドをコードする塩基配列が存在するもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 14/745 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭62−305876 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305877 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305878 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トロンビンに結合し、トロンビンによる
   プロテインＣの活性化を促進する作用を有し、少なくと
   も界面活性剤の非存在下で可溶性である実質的に精製さ
   れた可溶性ペプチドと、投与可能、かつ生理食塩水又は
   ブドウ糖注射液に溶解し得る担体とを含有する水溶液
   を、凍結乾燥することを特徴とする凍結乾燥製剤の製造
   法。
2. 【請求項２】 実質的に精製された可溶性ペプチドが、
   下記（ａ）〜（ｆ）に規定される可溶性ペプチドである
   請求項１に記載の製造法。 （ａ）トロンビンに結合し、（ｂ）トロンビンによるプ
   ロテインＣの活性化を促進する作用を有する、（ｃ）少
   なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性である、（ｄ）
   トロンビンによる凝固時間を延長する、（ｅ）トロンビ
   ンによる血小板凝集を抑制する、（ｆ）ＳＤＳ−ポリア
   クリルアミドゲル上にて、銀染色が可能である。
3. 【請求項３】 該可溶性ペプチドが、組換えペプチドで
   あって、少なくとも該組換えペプチド中に、ヒト由来の
   夾雑成分を実質的に含有しない請求項１または２に記載
   の製造法。
4. 【請求項４】 該可溶性ペプチドのアミノ酸配列の相同
   性が、該アミノ酸配列の範囲において、下記の制限酵素
   地図 【化１】 に示された制限酵素サイトを有することにより特徴付け
   られるヒト由来のＤＮＡがコードし得るトロンビンに結
   合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
   る作用を有するペプチドのアミノ酸配列と完全に一致す
   る相同性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれ
   かに記載の製造法。
5. 【請求項５】 該可溶性ペプチドが、ＤＩＰ−トロンビ
   ン−アガロースカラムに結合せしめたときに、１Ｍ Ｎ
   ａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ベンズアミジ
   ン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノールを含む０．
   ０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出でき
   る性質を有するか、又は該可溶性ペプチドが、０．１Ｍ
   ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．５％（ｖ／
   ｖ）ポリドカノールを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
   （ｐＨ７．５）により平衡化したＤＩＰ−トロンビン−
   アガロースカラムに、該緩衝液にて該可溶性ペプチドを
   溶解せしめた溶液を接触せしめた場合に、該可溶性ペプ
   チドが前記カラムに結合せしめることができる性質を有
   することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の
   製造法。
6. 【請求項６】 該可溶性ペプチドが、少なくとも、Ａｌ
   ａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
   −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎのアミノ酸配列を含
   有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載
   の製造法。
7. 【請求項７】 該凍結乾燥製剤が、血液凝固を制御する
   ための、または血小板凝集を制御するための、または血
   栓溶解のための凍結乾燥製剤であること、又は該凍結乾
   燥製剤が静注用製剤であること、又は該凍結乾燥製剤中
   に可溶性ペプチドが１回投与量として０．１〜２００ｍ
   ｇ含有されること、のいずれかを特徴とする請求項１〜
   ６のいずれかに記載の製造法。
8. 【請求項８】 該可溶性ペプチドが、（ｉ）配列番号３
   の１−４９８のアミノ酸配列からなる可溶性ペプチド、
   （ｉｉ）前記（ｉ）に記載の可溶性ペプチドのアミノ酸
   が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
   り、且つトロンビンに結合し、トロンビンによるプロテ
   インＣの活性化を促進する作用を有する活性を有する可
   溶性ペプチド、のいずれかであることを特徴とする請求
   項１〜７のいずれかに記載の製造法。
9. 【請求項９】 該可溶性ペプチドが、（ｉ）配列番号８
   の１−２７２のアミノ酸配列において、少なくとも該配
   列番号８の１１９−２３６のアミノ酸配列を包含するよ
   うに該配列番号８のＮ末端及び／又はＣ末端の任意の個
   数のアミノ酸が削除されていてもよいアミノ酸配列から
   なるトロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイン
   Ｃの活性化を促進する作用を有する活性を有する可溶性
   ペプチド、（ｉｉ）前記（ｉ）に記載の可溶性ペプチド
   の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
   されたアミノ酸配列からなり、且つトロンビンに結合
   し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
   作用を有する活性を有する可溶性ペプチド、のいずれか
   であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載
   の製造法。
10. 【請求項１０】 該可溶性ペプチドが、トロンビンに結
    合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
    る作用を有し、少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶
    性であって、以下のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配
    列からなる実質的に精製された可溶性ペプチドであるこ
    とを特徴とする請求項１〜９に記載の製造法。 （ｉ）配列番号１の１−１１８のアミノ酸配列、（ｉ
    ｉ）配列番号１の１−１１８のアミノ酸配列において１
    若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
    たアミノ酸配列であり、且つトロンビンに結合し、トロ
    ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
    する活性を発現するアミノ酸配列。