JP2766779B2 - トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有するペプチドをコード
する新規なデオキシリボ核酸（以下“ＤＮＡ”と称す
る）に関する。更に詳しくは、本発明は抗血液凝固作用
及び血小板凝集抑制作用を有し、循環器系の疾患の治療
に有用なペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明
は、また、その新規なペプチドをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞に関する。

【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。 Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基

【０００３】また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチドは下記の如き略号で表されるデオ
キシリボヌクレオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限り、デオキシリボヌクレオチド配列の
左端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。

【０００４】

【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。

【０００５】現在これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤お
よび血小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併
用して、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管
閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（Ｄ
ＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾
患の治療及び予防に用いられている。しかしながら、こ
れらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制
剤は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の
極く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線
溶系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤
が要望されていた。

【０００６】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。

【０００７】ウサギ肺に存在する物質については、例え
ば、シー ティー エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）
ら、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
オブサイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁
（１９８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓ
ｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．）、２５７
巻、８５９頁（１９８２年）；シー ティー エスモン
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ
エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５８巻、１２２３８頁（１９８
２年）を参照することができる。

【０００８】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム．（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。また、ヒト肺に存
在する物質については、例えば楠本ら、生化学、５７
巻、１１０２頁（１９８５年）を参照することができ
る。

【０００９】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されている。しかしながら、その物質の構
造、例えばアミノ酸配列などは解明されておらず、未だ
にその物質は同定されていない。従って、上記の先行技
術文献に報告されている物質が単一物質であるか否か、
また、これらの先行技術文献の記載にしたがって同一の
物質が繰返し得られるか否かについては全く不明であ
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前述の通り、これらの
物質のアミノ酸配列の長さを始め、その物質をコードす
るＤＮＡの塩基配列やその制限酵素サイトについての情
報など全く手掛かりのない状態であって、遺伝子操作等
の技術により大量にこれらの物質を提供する術のない状
況にあった。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の技
術的背景にあって、トロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣ活性化を促進する物質の遺伝子を見出
すべく鋭意研究を重ねた。本発明のペプチド全長を含む
ｃＤＮＡの取得は困難を極め、本発明の参考例や実施例
に詳細に示される通り、最初に行ったヒト肺ｃＤＮＡラ
イブラリーからのクローニングにおいて、何度実施して
も結局、全長ｃＤＮＡを含むクローンの取得が不可能で
あった。即ち、ここで最終的に得られたＴＭ１３７の
５’末端側の塩基配列情報を参考に、さらに５’末端側
へ延長されたクローンの取得を何度も試みたが、これ以
上５’末端側へ延長したクローンは取得できず、結局、
本発明のペプチドのＮ末端をコードするクローンが取得
できないばかりか、結果的に確認されたことだが、本発
明のペプチドのコード領域の塩基配列において半分程度
しか取得できない結果と終わった。これは、本発明のペ
プチド全長を含むｍＲＮＡかかなり大きいものであり、
都合よくペプチド全長をコードする部分をｃＤＮＡとし
て逆転写できなかった、あるいは配列的な特徴により逆
転写しにくい構造をとっていたものと理解されるが、い
ずれにしてもこの状況においては、ｃＤＮＡ断片の繋ぎ
合わせにより全長ｃＤＮＡを作成することさえも不可能
であった。

【００１２】そこで本発明者らは、ヒト臍帯内皮細胞か
らｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤＮＡライブ
ラリーにおいて、先に得られた５’末端側の塩基配列情
報を参考にして、クローンの選択を行った結果、ＴＭＰ
５、さらにＴＭＰ２６を取得することに成功し、これら
を繋ぎ合わせて本発明のペプチドの全長ｃＤＮＡを調製
するに至った。従来より、しばしば経験されることであ
るが、全長ｃＤＮＡの取得は、採用するｃＤＮＡライブ
ラリーの種類か、目的とする配列の特徴により、成功す
ることもあれば不可能であることもあり、これは即ち、
ｃＤＮＡライブラリーを調製するに当たって使用するｍ
ＲＮＡをいずれの組織から取得するか、または、その時
に使用する試薬や手法等により左右されるものでもあ
る。本発明のＤＮＡは、十分な洞察と経験と試行錯誤の
結果取得することができるに至ったものであり、従来な
し得なかった貴重な技術をこの分野に提供するものと位
置づけられる。即ち、本発明により開示された塩基配列
の情報に従えば、今後本発明のＤＮＡを取得することは
当業者においては簡単であって、本発明の利益は莫大な
ものである。

【００１３】後記するように、本発明は、アミノ酸配列
や塩基配列で特定されるばかりでなく、制限酵素地図に
おける制限酵素サイトによっても定義されるが、制限酵
素サイトは、塩基配列を知っている場合か、または全長
ｃＤＮＡを取得した後、各種制限酵素による該全長ｃＤ
ＮＡの分解反応を検討することにより得られる情報であ
るが、本発明以前の状態においては、そもそも全長ｃＤ
ＮＡの取得さえも困難な状況であることから、上記の制
限酵素地図の制限酵素サイトによる定義は、発明として
十分な要件を充足しており、またこの制限酵素サイトの
情報が、遺伝子操作の手法においては最も大切であるこ
とは容易に理解されるところである。

【００１４】本発明者らの検討の結果、完成された本発
明のＤＮＡをペプチドとして発現させたところ、該ペプ
チドが、トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進して血液凝固を制御することが確認
された。また、組換えＤＮＡ技術によって他のヒト由来
蛋白をまったく含まない純粋な形態で、大量にかつ容易
に製造でき、医薬として利用しやすいことを確認した。
さらに、本発明のＤＮＡ、または本発明のＤＮＡを組み
換えた組換え体ＤＮＡを用いることにより、本発明のＤ
ＮＡがコードする全長のペプチドの他、相違するアミノ
酸配列を有したり、構成するアミノ酸の長さが異なるペ
プチドを取得する原料とすることができる有用なもので
ある。

【００１５】即ち、本発明の目的は、トロンビンに結合
し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
作用を有するペプチドをコードするヒト由来のＤＮＡま
たはその相補的ＤＮＡを提供することにある。更にま
た、本発明の他の目的は、該ペプチドをコードするＤＮ
Ａを含有する複製可能な組換え体ＤＮＡを提供すること
にある。更にまた、本発明の他の目的は、上述のような
組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞を提
供することにある。

【００１６】即ち、本発明は、配列番号１の１−５５７
（以下、式（Ｉ）と表記することがある）、または配列
番号３の１−５７５いずれかのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡである。上記のアミノ酸配列からなるペプチド
は、トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイン
Ｃの活性化を促進する作用を有するペプチドであって、
該ペプチドがトロンビンに結合することは、例えば、本
明細書の実施例に記載されているように、ＤＩＰ−トロ
ンビン〔ジイソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉ
ｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉ
ｎ）、またはＤＩＰ−トロンビン−アガロースに結合す
ることにより確認される。また、トロンビンによるプロ
テインＣの活性化を促進する活性を有することも、本明
細書の実施例に記載されている通りである。

【００１７】本発明のＤＮＡは、上記アミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡであり、該ＤＮＡは、抽出や分離、精
製、適当な切断等の適宜の処理により、人為的に調製さ
れていることが好ましく、さらに具体的に例示すれば、
配列番号２の１−１６７１（以下、式（ＩＩ）と表記す
ることがある）、または配列番号４の１−１７２５のい
ずれかの塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。

【００１８】さらに本発明のＤＮＡは、トロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有するペプチドをコードする塩基配列であり、
図１９の制限酵素地図に示された制限酵素サイトを有す
ることを特徴とする塩基配列を含むヒト由来のＤＮＡ、
またはそのペプチドコード領域ＤＮＡであると位置づけ
ることができる。

【００１９】上記のヒト由来のＤＮＡとしては、人為的
に調製された図１９の制限酵素地図に示されたＴＭＪ２
が、典型的な例として挙げられる。ＤＮＡの本質は内包
する遺伝情報を保存し、伝えることにあることから、ヒ
ト由来のＤＮＡは、ヒトから直接に採取されたＤＮＡと
の意味の他に、多くの場合には、ｍ−ＲＮＡからのｃＤ
ＮＡであったり、その増幅複製物であるＤＮＡであった
り、場合によっては、合成により調製されていてもよ
く、要は、内包する遺伝情報の由来がヒトの遺伝子オリ
ジンであることを意味するものである。

【００２０】図１９の制限酵素地図は、図１１のＴＭＪ
２を転記したものであって、その長さや位置関係等につ
いては図１１を参考にすることができる。また、より詳
しくは図１１に示されたＴＭ１３７やＴＭＰ５やＴＭＰ
２６のそれぞれの塩基配列を示す図４、図８及び図１０
から具体的には、開始コドン（ＡＴＧ）の最初の塩基で
あるＡから終始コドン（ＴＧＡ）の直前の塩基までの長
さが１７２５ｂｐであることがわかる。この１７２５ｂ
ｐという長さは、図１９の標準となる寸法と理解すべき
であるが、図１９または図１１において、開始コドン
（ＡＴＧ）の最初の塩基であるＡから終始コドン（ＴＧ
Ａ）の直前の塩基は、斜線および斜交線で示されてお
り、この間の長さが前記の１７２５ｂｐであることを意
味する。

【００２１】本発明で、ペプチドコード領域ＤＮＡと
は、本発明のペプチドをコードする塩基配列の領域を示
すものであって、文言から直接的に判断すれば、図１９
または図１１における斜交線の部分を意味することにな
るが、本発明の説明にもある通り、斜線として示される
リーダー配列を含んでもよいことから、斜線および斜交
線で示される部分を意味することも含む。具体的には、
斜交線の部分のＤＮＡとして、配列番号１の１−５５７
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらに好ましくは
配列番号２の１−１６７１の塩基配列が例示され、また
斜線および斜交線で示される部分のＤＮＡとして、配列
番号３の１−５７５のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、さらに好ましくは配列番号４の１−１７２５の塩基
配列が例示される。

【００２２】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡ
はまた、遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化され
た塩基配列を含有することも可能である。この場合、上
記置換により得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸
配列は前に定義したアミノ酸配列と一致する。

【００２３】従来種々のペプチドにおいて多型性と呼ば
れる自然の変異も存在することが知られている。そし
て、自然の変異によりまたは人工の変異により、ペプチ
ドの活性に重大な変化を与えることなく、ペプチドの構
造の一部を変化させることが可能である。本発明のＤＮ
Ａを用いてこれらのペプチドを人工的に作製することも
可能である。従って、本発明のＤＮＡは前記アミノ酸配
列を有するペプチドの相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕ
ｓ ｖａｒｉａｎｔ）に相当する構造を有するペプチド
をコードするＤＮＡも含む意味としてとらえることがで
きる。

【００２４】本発明のＤＮＡがコードするペプチドは少
なくとも１個の糖残基を含有していてもよいし、含有し
ていなくてもよい。すなわち、本発明では、少なくとも
アミノ酸配列として本明細書に説明された配列であるこ
とを示すのであって、特に糖残基により限定されるもの
ではない。本発明のＤＮＡは前述のペプチドを組換えＤ
ＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本
発明のＤＮＡは以下のようにして得ることができる。

【００２５】（１）トロンビンのプロテインＣ活性化を
促進することのできるヒト肺由来のペプチドに特異的
な、ウサギから得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製
したｃＤＮＡライブラリーからその抗体と結合するペプ
チドをコードするｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片
はトロンビンのプロテインＣ活性化を促進することので
きるヒト肺由来のペプチドの一部分をコードしている。
その部分はそのペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含ま
ない。

【００２６】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマー エクステ
ンション法により以下のようにして得る。まず、上記工
程（１）で得られたｃＤＮＡ断片のコードするペプチド
のＮ末端側のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ断片の一
部分を有機化学合成する。次に、合成したＤＮＡをプラ
イマーとして用いて通常の公知のプライマー エクステ
ンション法によりヒトさい帯内皮細胞より調製したポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡから上記工程（１）で得られるｃＤＮＡ
断片の５′末端の上流の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片
を得る。上記プライマー エクステンションを繰り返す
ことによりヒト肺由来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡ断片を得る。

【００２７】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を所望のペプチドの全アミノ酸配
列をコードするように結合することにより、Ｎ末端アミ
ノ酸のコドンから始まる１６７１塩基対（以下“ｂｐ”
と略する）のオープンリーディングフレームを含有する
ｃＤＮＡを得る。このオープンリーディングフレームの
塩基配列は前述の式（ＩＩ）で表される塩基配列と同じ
である。このようにして得られたｃＤＮＡの塩基配列は
公知の方法で分析して式（ＩＩ）で表される塩基配列と
一致することを確認する。

【００２８】本発明のＤＮＡは、本発明により開示され
て始めて明確に認識できるようになり、この開示に基づ
いて有機化学合成することによっても得ることができ
る。また、本発明のＤＮＡは、本発明の開示によれば、
前述のプライマー エクステンションを行うことなく、
前駆体ＤＮＡから調製することもできる。前駆体ＤＮＡ
は、前記工程（１）で得られるＤＮＡ断片またはそのＤ
ＮＡ断片の塩基配列に基づいて調製した合成ＤＮＡをプ
ローブとして用いる通常のハイブリダイゼーション法に
よってヒト染色体ＤＮＡライブラリーから得ることがで
きる。

【００２９】上述の配列番号１の１−５５７のアミノ酸
配列からなるペプチドをコードする人為的に調製された
ＤＮＡ、好ましくは、配列番号２の１−１６７１の塩基
配列からなるＤＮＡは、更に、例えば次式：Ｍｅｔ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表されるようなリー
ダー配列をコードする塩基配列を５′末端塩基配列とし
て含有していてもよく、そのようなＤＮＡの例示とし
て、配列番号３の１−５７５のアミノ酸配列からなるペ
プチドをコードする人為的に調製されたＤＮＡ、好まし
くは、配列番号４の１−１７２５の塩基配列からなるＤ
ＮＡが挙げられる。

【００３０】本発明によれば、上記ＤＮＡに対して相補
的なＤＮＡもまた提供される。本発明によれば、上記Ｄ
ＮＡとそれに相補的なＤＮＡが互いに相補的に結合して
２重鎖ＤＮＡを形成していてもよい。更にまた、本発明
によれば、前記の本発明のＤＮＡと複製可能な発現ベク
ターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡが提供され
る。該組換え体ＤＮＡは、それによって形質転換された
微生物または細胞中で、本発明のペプチドを発現するこ
とができる。適したベクターの例としては、プラスミド
ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、ＹＲｐ７、ｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）などが挙げられる。尚、
発現ベクターは宿主として使用する微生物または細胞に
適したものを選択する必要がある。

【００３１】更に本発明はまた、上述の複製可能な組換
え体ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞に関す
る。微生物の例としては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４
４６）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ⁻、λ⁻、プロトト
ロフィック、ＡＴＣＣ２７３７５）；バチラス サブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きバ
チラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモネラ チ
フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内
菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
種々の菌株；およびサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが
挙げられる。細胞の例としては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−８１）細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７およびＭＤＣＫ細胞株等の動物細胞が挙げられ
る。

【００３２】上述の本発明の形質転換された微生物また
は細胞は、例えば、 （ａ）前述のペプチドをコードするＤＮＡと複製可能な
発現ベクターに連結して、該ＤＮＡと該複製可能な発現
ベクターとからなる複製可能な組換え体ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離する ことを含む本発明のＤＮＡがコードするペプチドの製造
方法に利用することができる。

【００３３】本発明の方法によれば、前述の本発明のＤ
ＮＡが正しく転写し、それによって得られるｍＲＮＡか
らの翻訳が正しく行われるように本発明のＤＮＡを複製
可能な発現ベクターのプロモーターなどのＤＮＡ領域の
下流に組入れて該ＤＮＡを有する複製可能な組換え体Ｄ
ＮＡを得、得られた該組換え体ＤＮＡで微生物または細
胞を形質転換させて該組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体を得る。得られた形質転換体は、該組換え体ＤＮＡ
に与えられた表現型によって微生物または培養細胞の親
細胞から単離される。得られた形質転換体を培養して前
記ＤＮＡの有する遺伝情報を発現させて本発明のペプチ
ドを製造することができる。

【００３４】尚、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを
構築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター
や複製起源等をクローニングするためには原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好まし
い。原核細胞の例としてはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイーコリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４
６）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリー
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイ
ー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー
コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ⁻、λ⁻、プ
ロトトロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
の如きバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サルモ
ネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス（Ｓ
ｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外
の腸内細菌；シュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）などが挙げられる。

【００３５】これらの細菌のうちエシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい。上記
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適し
たプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発
現ベクターとして一般に用いられる。例えば大腸菌を形
質転換するためのプラスミドベクターとしてはプラスミ
ドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができ
る。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモータ
ー、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別す
るのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー
遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、β
−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター、トリプト
ファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の
例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリ
ン耐性遺伝子が挙げられる。

【００３６】一方、本発明のＤＮＡを発現して該ペプチ
ドを製造するためには上記の原核細胞を宿主として用い
る宿主−ベクター系および脊椎動物の細胞などの真核生
物の細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベクター系を使
用することができる。真核細胞の例としては前述の動物
の細胞株などの細胞が挙げられる。本発明のＤＮＡを前
述の真核細胞で発現させるために、本発明の組換え体Ｄ
ＮＡは一般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例
えば、複製起源、本発明のＤＮＡの上流に位置すべきプ
ロモーター、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位
や転写終止配列を含有している。本発明のＤＮＡを真核
細胞内で発現させるのに用いることのできるそのような
機能配列はウィルスやウィルス性物質から得ることがで
きる。

【００３７】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターはアデノウィルス２、ポリオーマウィルス、シ
ミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等から得ることができ
る。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーターやＳ
Ｖ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。ま
た、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用を
有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上流
の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−ベ
クター系で使用するのに適しているならば使用すること
ができる。複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水庖性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。

【００３８】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞は、前述のとおり、組換え
体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって
形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型
は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに
挿入することによって与えることができる。また複製可
能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利
用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、例
えば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコ
ードする遺伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をマーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲ
には様々のタイプがあるため、その使用するマーカー遺
伝子のコードしているＤＨＦＲのタイプによって用いる
べき宿主を選択しなければならない。

【００３９】例えば、マーカー遺伝子として野生型ＤＨ
ＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、宿主としてはＤ
ＨＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。ＤＨＦＲ欠損株は
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求するの
で、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
培地中では成育できない。しかしながら、ＤＨＦＲ欠損
株をＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転
換すると、その株はもはやヒポキサンチン、グリシン及
びチミジンを要求しなくなり、ヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンを含まない培地中でも成育することがで
きる。従って、形質転換細胞はヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準にして
形質転換されないで残った細胞から容易に選択すること
ができる。

【００４０】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。

【００４１】しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従っ
て、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判
断基準として用いて形質転換されていない細胞から選択
することができる。これに関し、真核細胞の大多数がＭ
ＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマー
カー遺伝子として用いるのに好都合である。

【００４２】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
も本発明のＤＮＡを発現するための宿主として用いるこ
とができる。酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。

【００４３】酵母細胞用の発現ベクターのプロモーター
の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボ
キシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６
−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの
解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。これらのうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターは、これらのプロモーターによる転写を宿主の
培養条件を変えることによって制御することができるの
で有利である。

【００４４】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発
現して本発明のペプチドを製造することができる。培養
後、本発明のペプチドは形質転換体の培養物から通常の
公知の方法、例えばカラムクロマトグラフィーなどを用
いて単離することができる。このようにして得られたペ
プチドは様々な種類と長さの糖鎖を少なくとも１種含有
していてもよい。得られたペプチドが糖鎖を含有してい
るか否かは用いる宿主細胞の種類によって異なる。ま
た、ペプチドが糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や
長さも用いる宿主細胞の種類によって異なる。

【００４５】一般に、翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻
訳されたペプチドは宿主細胞から分泌されるときにプロ
セッシングを受けて成熟蛋白になることが知られてい
る。本発明で提供されるペプチドの場合もそのようなプ
ロセッシングを受けることがある。ペプチドがプロセッ
シングを受ける部位は、宿主により、または培養条件に
より変化する場合がある。例えば、本発明のＤＮＡがコ
ードするペプチドが、式（Ｉ）で表されるペプチドとＮ
末端アミノ酸配列として前述の１８個のアミノ酸からな
るリーダー配列とを含むプロセッシングを受けていない
未成熟形で形質転換細胞中で産生される場合、その未成
熟形ペプチドはプロセッシングを受けてリーダー配列が
削除されて成熟形となることがある。しかしながら、前
述のように未成熟形ペプチドのプロセッシングを受ける
位置は使用する宿主の種類や宿主の培養条件により変化
するので必ずしも上記のようなプロセッシングが起きる
とは限らない。

【００４６】前述のとおり、トロンビンによるプロテイ
ンＣの活性化を促進する作用を有するペプチドは組換え
ＤＮＡ技術を用いる方法により製造することができる。
プロテインＣは血液凝固線溶機構において重要な役割を
演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビ
ンの作用により活性化される。活性型プロテインＣは、
生体内で血液凝固系補酵素の活性型第Ｖ因子、および活
性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有
するプラスミノーゲンアクチベーターの産生に関与して
いることが知られている。〔鈴木宏治、医学の歩み、第
１２５巻、９０１頁、（１９８３年）〕。該ペプチド
は、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進
して抗血液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテ
インＣを大量に産生せしめるものである。従って、該ペ
プチドは生体における抗血液凝固及び血栓溶解に大きく
寄与するものである。

【００４７】前述のように、該ペプチドは抗血液凝固作
用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので
例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、
閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、
狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療
及び予防に用いることができる。しかしながら、該ペプ
チドを含有する医薬組成物を製造するためには、高純度
の該ペプチドを再現性よく、かつ大量に製造することが
必須である。そのような方法としては、例えば本発明の
ＤＮＡを用いた遺伝子工学的手法が考えられる。この手
法によれば、高純度で他のヒト由来の蛋白を含まない形
態で該ペプチドを得ることができる。

【００４８】前述のように、先行文献によれば、これま
でにウサギ肺、ウシ肺、ヒト胎盤、ヒト肺について抽出
法により組織由来の該ペプチドについて研究がなされ、
その一般的性質が調べられてきた。しかしながら、その
物質の構造、例えばアミノ酸配列などは解明されておら
ず、未だにその物質は同定されていない。従って、上記
の先行技術文献に報告されている物質が単一物質である
か否か、医薬組成物を製造するのに十分な純度を有して
いるかどうか、また、これらの先行技術文献の記載の手
法にしたがえば、同一の物質が繰返し得られるか否かに
ついても全く不明である。

【００４９】本発明の医薬組成物となすに際しては、本
発明のペプチドと、薬剤として使用可能な担体とを混合
すればよい。通常、本発明のペプチドの性状から適当量
の界面活性剤を添加することが好ましい。即ち、上記の
疾患を治療または予防するのに有効な量の本発明のペプ
チドを適当な量の担体と混ぜて、患者に効果的に投与す
るのに適した医薬組成物を調製することができる。薬剤
として使用可能な担体としては、例えば、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースなどが例示される。

【００５０】また本発明の医薬組成物としては凍結乾燥
された製剤となすことが好ましい。また本発明の医薬組
成物は注射用製剤として用いることが好ましい。さらに
は、点滴静注用製剤とすることが好ましい。注射剤とし
て用いる場合に、上記の担体は、薬剤として投与可能で
あり、且つ注射可能な溶液となり得る担体であることが
好ましく、この担体としては、ショ糖、精製ゼラチン、
アルブミン、マンニトール、ブドウ糖および塩化ナトリ
ウムからなる群より選ばれた１種以上が例示され、また
各種無機塩のｐＨ調整剤などを添加することも好ましい
例として挙げられる。また本発明においては、上記担体
が、グリセリンであることもまた好ましい。上記の担体
は、製剤を調製する際に添加することが好ましいが、用
時に溶解された際において添加されることも許されるも
のである。

【００５１】本発明のペプチドの成人１回当たりの投与
量は年齢、性別、体重、症状等により異なるが、一般に
約０．１〜２００ｍｇであり、一日当たり一回または必
要に応じて数回、注射、好ましくは点滴静注により投与
する。本発明者は、本発明のペプチドが副作用の少ない
極めて有用なものであることを確認しており、例えば、
動物実験でラットｉｖ投与において約３ｍｇ／Ｋｇで全
く死亡例や害を生ずることがなく、有効な作用も認めら
れることから、ヒトの体重を約６０〜７０Ｋｇと考えて
上記の投与量が妥当なものとして提示される。

【００５２】本発明をより詳細に記述するために参考例
及び実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの
実施例にのみ限定されるものではない。

【実施例】参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定） 本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測
定は、合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシ
カルボニル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略
称である）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ
オーノ（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バ
イオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１
３８７頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわ
ち、プロテインＣ（最終濃度０．５μＭ）及びトロンビ
ン（最終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに本発
明で得られたペプチドを含む水溶液５μｌ（０〜０．０
１ Ａ_２８０／ｍｌ）を加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣ
ｌ_２、血清アルブミン及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）をそれぞれ最終濃度が０．１５Ｍ、２．５ｍＭ、１
ｍｇ／ｍｌ及び２０ｍＭになるように、そして全量が３
０μｌとなるように加えた。

【００５３】得られた混合物を３７℃で１５分間反応さ
せてプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロ
ンビンＩＩＩを１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリン
を含有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加
温して反応を停止させた。得られた反応混合物に、前述
の合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）製〕２０
０μＭを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）
２５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２
０％酢酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離して
きたＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃
度を励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分
光光度計ＲＦ−５４０型（島津製作所製、日本）により
測定した。得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍光
強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１分
間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量から
本発明で得られたペプチドを含まない水溶液を加えたと
きのＡＭＣ量を引いた値がサンプルのトロンビンによる
プロテインＣ活性化を促進する強さを示す。

【００５４】ここで、プロテインＣはヒト血しょうから
鈴木らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４頁、（１９８３
年等）〕で精製した。また、ヒトトロンビンはランドブ
ラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法〔ランドブラッド
（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．）６６巻、４８２頁（１９７５年）〕で精製した。

【００５５】参考例２ （１）：（ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手） ヒトの肺のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ_１１ｃＤＮＡライブラリーは、米国、ク
ローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，
Ａｖｅ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購
入した（カタログ番号ＨＬ１００４）。

【００５６】（２）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製） プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立
病院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを鋏で約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。

【００５７】次に、混合物を更に４℃で５分間、ホモジ
ナイズし氷中で５分間冷却した。上記のホモジナイズ及
び冷却操作を更に３回くり返した。得られたホモジェネ
ートを１２，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離
にかけて上澄液とペレットに分け、ペレットを集める。
これに０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２
５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ_２を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。

【００５８】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）〕を、
ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）
の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。

【００５９】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ
べンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨン
を集めた。溶出によって得られる各フラクションについ
て前記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進
能を測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロ
フォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ_２８０）を測定し
た。

【００６０】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ_２、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ_２、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。

【００６１】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、更に０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を３回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条
件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。な
お、溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集め
た。プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、０．１
Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ Ｐ
Ｘを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大きさの４回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ_２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出して得られ
たフラクションは１．９ｍｌずつ集めた。

【００６２】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^１％
_１ｃｍ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づ
き本精製品の量を計算したところ約５００μｇであっ
た。なお、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル
濃度５〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行な
い、銀染色によってバンドを観察したところ単一バンド
のみ確認された。

【００６３】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファ
ロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−０４４
０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩衝液で
充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセファロ
ースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。次い
で、０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍ
ｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）（米国Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ−６８８
２）を含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、こ
のタンパク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖
を含むいわゆるグリコペプチドであることがわかった。

【００６４】（３）：（トロンビンのプロテインＣ活性
化を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析） このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０
頁、（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エド
マン分析を行なった。

【００６５】遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）および米
国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用いて分析
を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ
酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１１個目まで
は下記アミノ酸配列を有するものであることがわかっ
た。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｓｅｒ−Ｇｌｎ

【００６６】（４）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブの作成） トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁、（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列を
コードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣ
Ｇ ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧ
ＧＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツ
カエト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａ
ｌ．）、ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６
０５頁、１９８５年〕に従って、デオキシイノシン
（“１”で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端か
らのアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
したがって精製し、実験書〔イー エフ マニアティス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレ
キュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、１２２頁、１９８２年）の記載にしたがっ
て、Ｔ_４ＤＮＡキナーゼ、およびγ−^３２Ｐ−ＡＴＰを
用いてラベル化した。

【００６７】（５）：（トロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体） トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペブチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。

【００６８】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペブチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。

【００６９】（６）：（ヒトさい帯内皮細胞の採集及び
培養） ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精製、
日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．Ｍａ
ｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁、（１９
８３年）〕に従って、私立病院より提供された新鮮なヒ
トさい帯から得た静脈より採集し培養した。

【００７０】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：（ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの調製） ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。

【００７１】（２）：（ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りのスクリーニング） ヒト肺のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ_１１に組み込んだｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュア
ルに従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ク
ローンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地
プレート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラ
ーク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独国）をプレートの上に載せ、
３７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩ
ＰＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上
にうつしとる。

【００７２】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国、カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ_１１に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３
と称した。

【００７３】（３）：（Ｎ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション） 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＩ３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁、（１９８４年）コールド スプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。ＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコード
するＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことがわ
かった。

【００７４】（４）：（ＴＭ１３の塩基配列） 参考例３−（２）で得られるクローンがするＤＮＡ断片
ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー エ
フ ら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロシー
ディング オブ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７７
年）にしたがって決定した。結果を図２及び図３に示
す。

【００７５】（５）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブ
としたヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング） ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕＩ
Ｉで消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これを
ニックトランスレーション法で^３２Ｐで標識した。この
ＤＮＡ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリ
ーよりプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性
のクローンをスクリーニングした。すなわち、常法に従
ってクローンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕ
ＩＩで消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、抽出、精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎ
ｇを得た。このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日
本）社製のニックトランスレーション キット（カタロ
グ番号Ｎ．５０００）を用い、それに添付のユーザー
マニュアルに従ってα−^３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識
した。

【００７６】この^３２Ｐで標識したＤＮＡ断片をプロー
ブとして実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、モレキユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁、１９８２年、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕
に従ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブ
リダイゼーションを行なった。陽性のクローンを単離
し、そのクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で
解析したところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも
前記ペプチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると
思われる約２，４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれて
いることがわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称
した。

【００７７】（６）：（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配
列） 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結
果を図３〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含まないことがわかった。

【００７８】（７）：（プライマー エクステンショ
ン） 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示した。

【００７９】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′ （２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′ （２０ｍｅｒ）

【００８０】次に、このＨＴＭ１３３をプライマーとし
て参考例３−（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内
皮細胞より調製したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをもちいて、い
わゆるプライマー エクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１
３７のさらに５′上流部分を合成した。すなわち、約１
μｇ／μｌのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／
μｌのＨＴＭ１３３溶液２０μｌを加え６５℃で２０分
間加熱後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以
降は、ｃＤＮＡ合成システム（アマシャム ジャパン
社、日本、カタログ番号ＲＰＮ１２５６）を用いて、そ
のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤ
ＮＡ合成システムに入っているオリゴ（ｄＴ）プライマ
ーのかわりにＨＴＭ１３３を用いて実施した。

【００８１】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１
株のコロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける
吸光度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌ
を集め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯ
ＰＳ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで５０ｍＭ
ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．
１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。

【００８２】得られた懸濁液を３０分間氷冷し、遠心
後、上澄を除去し、３０μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ
ＣａＣｌ_２と１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの
０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）の混合液中に懸濁さ
せた。懸濁液を２００μｌずつ分注し、前述のプラスミ
ドＤＮＡ溶液１０μｌをそれぞれに加えた。該混合液を
３０分間氷冷した後、４４℃で６０秒ヒートショックを
与え、ただちに、あらかじめ３７℃に温めておいた５ｍ
ｌのＬＢ培地を加えた。この溶液を３７℃で１時間培養
した後、それぞれの溶液を遠心し、上澄を除去し、細胞
ペレットを得た。該細胞ペレットにＬＢ培地を加え、撹
拌した後、懸濁液とした。該懸濁液を５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにまき３７℃で
１夜培養を行なった。

【００８３】このようにして得られるｃＤＮＡバンクよ
り、参考例２−（４）に記載した方法に従って５′末端
を^３２Ｐで標識したＨＴＭ１３１及びＨＴＭ１３２をそ
れぞれプローブとして、コロニーハイブリダイゼーショ
ンを参考例３−（３）と同様の方法で実施した。コロニ
ーハイブリダイゼーションで約７０，０００個の形質転
換体をスクリーニングしてＨＴＭ１３１及びＨＴＭ１３
２の両者のプローブと反応するコロニーが６クローン得
られた。この６クローンから、実験書〔マニアティス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、３６６頁、
１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラボラ
トリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってプラスミドＤＮＡ（これ
を“ｐＴＭＰ５”と称する）を調製し、各種の制限酵素
を用いて切断し、電気泳動で解析したところ、６クロー
ンから得られたプラスミドＤＮＡは全て同一であり、約
９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片とベクターからなるこ
とがわかった。このＤＮＡ断片をＴＭＰ５と命名した。

【００８４】（８）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーション） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。

【００８５】（９）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配
列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。結果を図８〜図９に
示す。

【００８６】（１０）：（第２回目のプイマー エクス
テンション） 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作成する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０，０
００個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１
３５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られ
た。この形質転換体が保有する組換え体に含まれている
ＤＮＡ断片をＴＭＰ２６と命名した。

【００８７】（１１）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末
端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブ
リダイゼーシヨン） 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。

【００８８】（１２）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基
配列） 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。

【００８９】（１３）：（ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭ
Ｐ５及びＴＭＰ１３７の接合） 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示す。図１１に示す
ようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧよ
りオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで続
く１，７２５ｂｐからなることが分かった。この各ＤＮ
Ａ断片にわたるオープンリーディングフレームをコード
するＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、Ｔ
ＭＰ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って継
ぎあわせた。

【００９０】（１３−１）（ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ） まず、λｇｔ_１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入されている
ＤＮＡ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７
−４９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次に、プラスミド
ｐＵＣ１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ、Ｅｃｏ
ＲＩで消化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社
製、ＭＡＸ−ＹＩＥＬＤ^Ｒ）を用いて約２，３００ｂｐ
のＤＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製
した。

【００９１】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏ
ｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍａ
Ｉサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を得
た。次に、このプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩで完全消化して約６０
０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片を得た。

【００９２】以上のようにしてプラスミドｐＵＣ１８Ｔ
Ｍ１３７より調製した約２，３００ｂｐのＤＮＡの断片
及びプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５より調製した約６０
０ｂｐのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩで消化して調製したベクターに挿入し
てプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を得た。この工程を図
１２に示す。 （１３−２）（ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＰ２６の継ぎ
あわせ） プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１，５００ｂｐの断片を回収した。

【００９３】一方、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６をプラスミド
ｐＵＣ１３（ファルマシア社製、スウェーデン、カタロ
グ番号２７−４９５４−０１）の制限酵素ＰｓｔＩサイ
トに挿入してプラスミドｐＵＣ１３ＴＭＰ２６を得た。
これをＢｂｅＩで完全消化した後、切断末端をＴ_４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて平滑末端にし、さらに制限酵素
ＢｇｌＩＩで完全消化して約１７０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。さらに別に、プラスミドｐＵＣ１３ＴＭＰ２６を
ＢｇｌＩＩ及びＤｄｅＩで完全消化して約２８０ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。次に、上記の約１７０ｂｐ、約２８
０ｂｐ、約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ_４ＤＮＡリガー
ゼを用いて継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した
後、５０Ｖの電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガ
ロースゲル電気泳動にかけて精製単離し、約１，４００
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【００９４】また別途、プラスミドｐＵＣ１８をＳｐｈ
Ｉで完全に消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼで切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完全
消化してベクターを調製した。このベクターに上述の約
１，４００ｂｐ及び約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ
_４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵＣ
１８ＴＭＪ２を得た。この工程を図１３に示す。

【００９５】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング） ヒト染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニ
ングは以下のようにして実施した。λファージのベクタ
ーＥＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国
クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖ
ｅ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーよ
り参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプ
ローブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でス
クリーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサート
を含有する染色体クローンが１種類得られた。この染色
体クローンを制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して１．０
％アガロースゲル電気泳動を行ない、実験書〔マニアテ
ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニ
ング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、３８２
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバーラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってサザン ブロット ハ
イブリダイゼーションを同じプーロブを用いて実施し
た。

【００９６】その結果、約４，０００ｂｐのＤＮＡ断片
に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法に従って
単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングした。この約４，０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−２）で
作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入されてい
るＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。

【００９７】実施例１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の作製） プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで完全消化してＳ
Ｖ４０の初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ター
ミネータを有するベクターを得た。次に参考例２−（１
３−２）で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨ
ｉｎｄＩＩＩで部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化し
て約２，９００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮ
Ａ断片をＴＭＪ２と称した。この２，９００ｂｐのＤＮ
Ａ断片と上記の如く調製したベクターとをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２を得た。プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程
を図１４に示す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２
についてはブダペスト条約の規定に基き、アメリカン
タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託
番号第６７２８３号として寄託されている。

【００９８】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換） ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）を培養器
中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（以下“Ｆ
ＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最小必須培地
（以下“ＭＥＭ”と略する）〔米国、フローラボラトリ
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、カタロ
グ番号１０−３３１）を用いて、３７℃で５％炭酸ガス
インキュベーター中で対数増殖期になるまで培養し、
０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを用いて培
養器に付着増殖した細胞を培養器よりはがして、ハンク
ス平衡塩類溶液〔米国、フローラボラトリー（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、カタログ番号１７
−１０１−２２〕に約１×１０^７／ｍｌの濃度になるよ
うに懸濁した。

【００９９】実施例１で得られたプラスミドｐＳＶ２Ｔ
ＭＪ２を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０ｐμｇのプラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を含む得られたプラスミド懸濁
液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試験管に
入れ、次いでこの試験管に上述の如く得られたＣＯＳ−
１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて０℃で１０分間
放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．Ｐ．ＳＹＳ
ＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型のキュベット
に移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回電気パルス
を与えた。その後懸濁液を再び元のエッペンドルフ型試
験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０％（ｖ／
ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍｌを以下
のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレートに移
した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むダル
ベッコのＭＥＭを懸濁液に加えてその混合物を組織培養
用プレートに移した。次いで、試験管を残りのダルベッ
コのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレートに加え
た。その後、プレートは５％ＣＯ_２存在下３７℃で２４
時間培養した。

【０１００】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認） 培養終了後、プレートの培地をＦＣＳを含まないダルベ
ッコのＭＥＭに交換し、４８時間培養した。培養上澄液
を５μｌ採取し、これを試料として参考例１に記載した
方法で、プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。更
に、直径１０ｃｍの組織培養用プレート１枚分の細胞を
米国コースター（Ｃｏａｓｔｅｒ）社製セルスクレイパ
ー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅｒ）（カタログ番号３０１
０）を用いて掻き取って集め、８００ｒｐｍ、１０分間
の条件で遠心分離して集める。このペレットを試料とし
て用い、参考例１に記載した方法でプロテインＣの活性
化を促進する作用を測定した。またコントロールとして
はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームし
たＣＯＳ−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレットを試料
として用いた。

【０１０１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結果、
細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化促進作用
を示し、生成したプロテインＣの量は約３００ｎｇであ
った。一方、コントロールとして用いたプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞では、この
活性は検出されなかった。

【０１０２】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 約４μｇのプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７１５０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿し
た。沈殿物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、
１ｍＭトリス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解し、５００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ
_４、ｐＨ７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５
Ｍ ＣａＣｌ_２を滴下し室温に１０分間放置した。一
方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／ｖ％ペニシリン
−ストレプトマイシン（米国、フローラボラトリー製、
カタログ番号１６−７００−４９）を含有するＨａｍ’
ｓＦ−１２培地（米国、フローラボラトリー社製、カタ
ログ番号１０−４２１−２０）を用いて直径６ｃｍの組
織培養用プレートにプレート１枚当たり細胞数約５×１
０^２程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（ＡＴＣＣＣＣＬＤ
６１）を１夜培養し、培地を新鮮な培地に交換し、更に
３時間培養した。

【０１０３】このＣＨＯ−ＫＩに前述のＣａＣｌ_２を滴
下したプラスミドＤＮＡ溶液を重層し、３７℃で約８時
間培養した。５ｍｌのＰＢＳ（−）（米国、フローラボ
ラトリー社製、カタログ番号２８−１０３−０５）を用
いて２回洗浄し、さらに、５ｍｌの前述の培地で洗浄
後、新鮮な培地を加えて約１６時間さらに培養した。プ
レートに付着した細胞を０．２５％トリプシン、０．０
２％ＥＤＴＡ溶液を用いて剥がし、直径１０ｃｍの組織
培養プレート４枚に広げて培養した。２４時間後、培地
を選択培地に交換した。選択培地の組成は前述の培地に
４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティシンＣ−４１８
（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８６０−１８１
１）を添加したものである。３〜４日おきに培地交換を
行いながら約２週間培養して、トランスフォームした細
胞をクローニングした。この操作で得られた細胞のクロ
ーンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プレートでコン
フルエントになるまで生育させた。途中、培地のＦＣＳ
濃度を１０％から１％に減らした培地に切り換えて培養
した。

【０１０４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結果、
細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化促進作用
を示した。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及びその培養
上澄液では本活性は検出されなかった。

【０１０５】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ_１２７Ｉ細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２をＨｉ
ｎｄＩＩＩで完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼを作
用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄＩＩＩ
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を得
た。次いで、このプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１をＰ
ｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩで完全消化して約４，１００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８の
ＨｉｎｃＩＩ及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに
挿入してプラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。

【０１０６】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化して得た約２，９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入して
プラスミドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミド
ｐＢＲＴＭＪ２−１をＨｉｎｄＩＩＩで完全消化したも
のとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７
１１１）をＨｉｎｄＩＩＩで完全消化して得た断片とを
Ｔ_４ＤＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ_１２７細胞発現
用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の
工程を図１５〜図１６に示す。

【０１０７】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例３
に記載の方法に準じてＣ_１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ
及び１（ｖ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン
（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６−
７００−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培
養したところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られ
たのでそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直
径１０ｃｍの組織細胞用プレートでコンフルエントにな
るまで生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培
地に置換して培養した。この培地で１日培養した後、培
養した細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例
１に記載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測
定したところ、強い活性が認められた。一方コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だけ
でトランスフォームした細胞では本活性は検出されなか
った。

【０１０８】実施例５ （本発明のＤＮＡのコードするペプチドの精製） 実施例３に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣＨ
Ｏ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を用
いて培養した。培養後、培養物を８００ｒｐｍで１０分
間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞ペレッ
トに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２
５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭＣａ
Ｃｌ_２を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。得られた抽出物を３，５０００ｇ、１０℃で６０分
間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液から、
以下の操作により本発明ＤＮＡのコードするペプチドの
精製品を得た。

【０１０９】細胞抽出物をｐＨ７．５に調製した後、Ｄ
ＩＰ−トロンビン−アガロースのカラムクロマトグラフ
ィーにかけて調製した。すなわち、エヌ エル エスモ
ン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ）、２５７巻、８５９頁、（１９８２年）〕の方法に
したがって作製したＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピ
ルホスホロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピー クオトレカ
サス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の方法〔ザ ジャ
ーナル オブバイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２４５巻、３５９頁、（１９７０
年）〕にしたがってブロムシアン化したアガロースに結
合させてＤＩＰ−トロンビン−アガロースを作製した。

【０１１０】次に、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ
ベズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次い
で、上記の細胞抽出物をカラムに供した。カラムを０．
３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭベン
ズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ Ｐ
Ｘを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。

【０１１１】溶出によって得られる各フラクションにつ
いて前記の方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定
した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォトメ
ータ−ＵＶ−２４０を用いて各フラクションの波長２８
０ｎｍにおける吸光度（Ａ_２８０）を測定した。活性の
ある画分を回収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣ
ａＣｌ_２、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ（半
井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で透析した。次いで、得られた透析液
を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロ
マトグラフィーに供した。

【０１１２】即ち、透析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの
大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムに通
し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、更に０．
４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ
／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出した。活性画分を回収し精製品を−８０℃で
凍結保存した。この製品の分子吸光係数を一般的な蛋白
質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^１％ _１ｃｍ・
２８０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づき精製
品の量を計算したところ約３μｇであった。尚、この精
製品をポリアクリルアミド濃度５−１０％のグラジェン
トを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、銀染色によってバンドを観察したところ単一のバ
ンドのみ確認された。

【０１１３】実施例６ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認） 精製した本発明のＤＮＡがコードするペプチドのプロテ
インＣ活性化の促進作用を以下の方法にて評価した。即
ち、０．１Ｍ ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ_２、１
０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロテ
インＣ、５ｎＭのトロンビンおよび５ｎＭの精製した本
発明のＤＮＡがコードするペプチドを加えて３７℃で反
応させた。反応物に３００μｇ／ｍｌのアンチトロンビ
ンＩＩＩ（米国シグマ社製）および５ｍＭ ＥＤＴＡを
加えて反応を停止して、生成した活性型プロテインＣの
量を前述の合成基質を用いる方法で測定した。

【０１１４】その結果を図１７に示すが、本発明のＤＮ
Ａがコードするペプチドを無添加の場合（Ｂ）では活性
化プロテインＣの生成は認められなかった（点線）が、
本発明のＤＮＡがコードするペプチドを添加した場合
（Ａ）には、反応時間と共に生成した活性化プロテイン
Ｃの量が増加した（実線）。

【０１１５】実施例７ （抗血液凝固作用の確認） 本発明のＤＮＡがコードするペプチドがトロンビンによ
るフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を阻害し、血
液凝固を実質的に阻害することはハインリッヒアメルン
グ社（独）製のコアギュロメーターＫＣ−１０を用いて
血液凝固時間を測定することによって調べた。即ち、５
ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に３．０μｇのフィ
ブリノーゲン（米国シグマ社製、フラクションＩ）を加
え、これに０−５０ｎＭの精製した本ペプチドを加え、
次いで、全量が０．４ｍｌになるように１０ｎＭのトロ
ンビンを加えて凝固時間を測定した。その結果を図１８
に示す。トロンビンにくらべ、添加した精製ペプチドの
量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長される
ことが確認された。

【０１１６】実施例８ 本発明のＤＮＡがコードするペプチドがトロンビンの血
小板凝集作用を実質的に阻害することはＳＩＥＮＣＯ社
（米国）製のプレートレットアグリゴメーターを用いて
評価した。即ち、３０万ｃｅｌｌｓ／μｌの血小板液
（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ、Ｐ．
Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに１単位のトロンビン（約０．４
μｇ）を加えると血小板が凝集するが、トロンビンを加
える前にその加えるトロンビンと等モル以上の精製した
本発明のＤＮＡがコードするペプチドを加えておくと血
小板の凝集が起きなかった。

【０１１７】

【発明の効果】本発明のＤＮＡがコードする、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
ペプチドは、抗血液凝固作用、血小板凝集抑制作用、血
栓溶解作用を併せ持ち副作用の少ない循環器系疾患など
の治療用薬として極めて有用な物質である。また、本ペ
プチドは、このような医薬用途以外に、例えば人工血
管、人工臓器、カテーテルなどの医用人工材料に結合さ
せて、血栓の形成を防止する薬剤として用いることがで
きる。

【０１１８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【０１１９】 配列番号：２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ

【０１２０】 配列番号：３ 配列の長さ：５７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質

【０１２１】 配列番号：４ 配列の長さ：１７２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肺から精製して得られるトロンビンによる
プロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチドを
参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロ
−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグラ
フである。

【図２】本発明の参考例３−（２）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭ１３の塩基配列を示すものである。

【図３】図２に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３の塩基配列を示
すものである。

【図４】本発明の参考例３−（５）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭ１３７の塩基配列を示すものである。

【図５】図４に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図６】図５に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図７】図６に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図８】本発明の参考例３−（７）で得られるＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を示すものである。

【図９】図８に続くＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配列を示
すものである。

【図１０】本発明の参考例３−（１０）で得られるＤＮ
Ａ断片ＴＭＰ２６の塩基配列を示すものである。

【図１１】ＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及び３−
（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＪ２
の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有する塩基
配列における対応関係を示すものであり、縦方向にみて
各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配列を有
することを示す。図中ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地
図の斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えられるオ
ープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本発
明のペプチドをコードする塩基配列が存在するものであ
る。

【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。

【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターにＴ
ＭＪ２を挿入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２の構築を示すフローチャートである。

【図１５】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図１６】図１５に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図１７】精製した本発明のＤＮＡがコードするペプチ
ドの存在下および非存在下におけるプロテインＣとトロ
ンビンとの反応によって生成した活性化プロテインＣの
量と反応時間との関係を示すグラフである。

【図１８】精製した本発明のＤＮＡがコードするペプチ
ドを添加した血液の凝固時間と精製した本発明のＤＮＡ
がコードするペプチドの添加量との関係を示すグラフで
ある。

【図１９】図１１の一部であるＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制
限酵素地図である。図中、斜線部分と斜交線部分とを含
む部分は考えられるオープンリーディングフレームであ
り、斜交線部分に本発明のペプチドをコードする塩基配
列が存在するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭62−169728（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503757（ＪＰ，Ａ) 生化学 第57巻 第８号 Ｐ．1102 Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．ＶＯ Ｌ．76，Ｐ．2178−2181 ＴＨＥ ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡ Ｌ．，ＶＯＬ．６，ＮＯ．７（1987) Ｐ．1891−1897 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の１−５５７、または配列番
   号３の１−５７５のいずれかのアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を含有するＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号２の１−１６７１、または配列
   番号４の１−１７２５のいずれかの塩基配列からなる請
   求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 トロンビンに結合し、トロンビンによる
   プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
   をコードする塩基配列であり、図１９の制限酵素地図に
   示された制限酵素サイトを有することを特徴とする塩基
   配列を含むヒト由来のＤＮＡ、またはそのペプチドコー
   ド領域ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 図１９の制限酵素地図に示された制限酵
   素サイトを有するＴＭＪ２である請求項３に記載のヒト
   由来のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
   に対して相補的なＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
   と複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換
   え体ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の複製可能な組換え体Ｄ
   ＮＡで形質転換された微生物または細胞。