JP2738428B2 - トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチド - Google Patents
トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドInfo
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Description
〔発明の属する技術分野〕 本発明は、トロンビンに結合し、トロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する新規なペプチドに
関する。更に詳しくは、本発明は血栓溶解作用、抗血液
凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有し、したがって、
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として、循環器系の疾患の治療に有
用なペプチドに関する。本発明は、また、その新規なペ
プチドをコードするデオキシリボ核酸（以下“DNA"と称
する）、該DNAを含有する複製可能な組換え体DNA、該組
換えDNAで形質転換された微生物または細胞及び組換えD
NA技術による該ペプチドの製造方法に関連する。本発明
は、また、該ペプチドを含有する医薬組成物、詳しくは
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として有用な医薬組成物に関連す
る。 本明細書において、アミノ酸及びペプチドは下記に示
すIUPAC−IUB生化学命名委員会（CBN）で採用された略
号を用いて表される。なお、アミノ酸などに関し光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。更に、特に明示しない限りペプチドのアミ
ノ酸配列の左端及び右端はそれぞれＮ末端およびＣ末端
である。 Gln:グルタミン残基 Asp:アスパラギン酸残基 Pro:プロリン残基 Tyr:チロシン残基 Val:バリン残基 Lys:リジン残基 Glu:クルタミン酸残基 Ala:アラニン残基 Asn:アスパラギン残基 Leu:ロイシン残基 Phe:フェニルアラニン残基 Gly:グリシン残基 His:ヒスチジン残基 Ser:セリン残基 Thr:スレオニン残基 Ile:イソロイシン残基 Trp:トリプトファン残基 Arg:アルギニン残基 Met:メチオニン残基 Cys:システイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌ
クレオチドの配列により表記する。 A:2′−デオキシアデニル酸残基 C:2′−デオキシシチジル酸残基 G:2′−デオキシグアニル酸残基 T:チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の
左端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。 〔従来の技術〕 現在、血栓溶解剤として用いられるものには、ストレ
プトキナーゼやウロキナーゼがある。また、抗血液凝固
剤としてはヘパリンやワーファリンが用いられている。
さらに、血小板凝集抑制剤としてはアスピリン、スルフ
ィンピラゾン、ジリダモール等が使われている。これら
の血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は、それぞれ別個に、あるいは併用して、例えば、心筋
梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬
化症、血管内血液凝固症候群（DIC）、狭心症、一過性
脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療及び予防に用い
られている。しかしながら、これらの血栓溶解剤、抗血
液凝固剤および血小板凝集抑制剤は非常に複雑な機構か
ら成り立つ血液の凝固線溶系の極く一部に作用するにす
ぎない。そこで、血液の凝固線溶系に広く作用し、優れ
た血液凝固抑制作用を示す薬剤が要望されていた。 ところで、血液凝固機構において重要な役割を演じて
いるビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテインＣが知
られている。近年、そのプロテインＣの活性化を促進
し、トロンビンの作用による血小板の活性化とフィブリ
ン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの肺、ヒト
の肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬剤に比べ
て優れた血液凝固抑制作用を有することが報告されてい
る。ウサギ肺に存在する物質については、例えば、シー
ティー エスモン（C.T.Esmon）ら、プロシーディン
グ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、78巻、22
49頁（1981年）；エヌ エル エスモン（N.L.Esmon）
ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、257巻、859頁（1982年）；シー
ティー エスモン（C.T.Esmon）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、257巻、7944頁（1982年）；エヌ エル エスモ
ン（N.L.Esmon）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258巻、12238
頁（1982年）を参照することができる。 ウシの肺に存在する物質については、例えば楠本ら、
生化学、56巻、890頁（1984年）を参照することができ
る。また、ヒト胎盤に存在する物質については、例えば
特開昭60−199819;黒沢ら、日本血液学会誌、47巻、632
頁（1984年）；エッチ エッチ サーレム（H.H.Sale
m）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、259巻、12246頁（1984年）；エ
ス．クロサワ（S.Kurosawa）ら、トロンボシス リサー
チ（Thrombosis Research）、37巻、353頁（1985年）
を参照することができる。また、ヒト肺に存在する物質
については、例えば楠本ら、生化学、57巻、1102頁（19
85年）を参照することができる。 上記の先行技術文献には上記物質の一般的性質が記載
されているが、その物質の構造、例えばアミノ酸配列な
どは解明されておらず、未だにその物質は同定されてい
ない。従って、上記の先行技術文献に報告されている物
質が単一物質であるか否か、また、これらの先行技術文
献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得られるか否
かについては全く不明である。さらにまた、上記の先行
技術文献に報告されている物質は、細胞膜上に存在する
ものであり、界面活性剤の非存在下では不溶性であっ
て、循環器疾患の治療などの医薬組成物として用いる場
合にはそのままでは投与量を多くすることができないも
のであり、そもそも生体由来であることから十分な量が
確保できず、その物質が本当に医薬として使用できるも
のであるか否かの検討さえも出来ない状態であった。 また注射剤とする場合に不溶物が存在することは、循
環器疾患を有する患者において致命的であることから、
界面活性剤の添加を必須とするが、上記の問題を有する
患者にとって界面活性剤の添加は予想外の問題を引き起
こす可能性は否定できず、好ましいものではない。ま
た、一部には細胞膜上に存在する以外の形態、例えば尿
中に存在する旨の開示があるが、その活性や作用、性質
の検討が不十分であり、ましてやアミノ酸配列等の構造
についての解析は全くなく、いずれにしてもそもそも医
薬として使用できる硬化と安全性を有し、しかも医薬と
して常に安定的に供給され得る物質との位置づけをする
ことはできないものであった。 〔発明が解決しようとする課題〕 従来より、血液凝固を制御するための、または血小板
凝集を制御するためのさらに有用なペプチドの提供が求
められていた。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、上述の技術的背景にあって、血液の凝
固線溶系の一因子であるプロテインＣを活性化して血液
凝固を抑制するだけでなく、線溶作用を増進する物質を
見出すべく鋭意研究を重ねた結果、意外にも、後述する
ように特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、従来知
られていない新規物質であって、トロンビンに結合し、
且つトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進して血
液凝固を制御することができるだけでなく、線溶を促進
することができ、血液凝固を制御する薬剤、即ち、血液
凝固を制御するための、または血小板凝集を制御するた
めの医薬組成物として有用であることを見出した。また
該ペプチドをコードするDNAを単離し、更にまた、その
ペプチドが、組換えDNA技術によって、好ましくは他の
ヒト由来蛋白をまったく含まない純粋な形態で、大量に
かつ容易に製造でき、しかも該ペプチドが可溶性であっ
て、医薬組成物自体やその製造において顕著に好ましい
性質を有することを見出した。本発明は、これらの知見
に基づいて完成したものである。 即ち本発明によれば、少なくともアミノ酸配列とし
て、配列番号３の１−498のアミノ酸配列からなるトロ
ンビンに結合し、トロンビンによるプロティンＣの活性
化を促進する作用を有するペプチドが提供される。 本発明のペプチドがトロンビンに結合することは、例
えば、本明細書実施例に記載されているように、DIP−
トロンビン〔ジイソプロピルホスフォロトロンビン（di
isopropylphosphoro−thrombin）、またはDIP−トロン
ビン−アガロースに結合することにより確認される。ま
た、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
活性を有することも、本明細書実施例に記載されている
通りである。 本発明のペプチドは、トロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する活性物質として検知され、回収され
る。通常本活性は、試料を0.15M食塩、2.5mM塩化カルシ
ウム、1mg/ml血清アルブミンを含有するpH7.4の20mMト
リス塩酸緩衝液中にトロンビン及びプロテインＣの存在
下添加し、生成される活性化プロテインＣの量を定量し
評価される。従って、本発明のペプチドは、上記緩衝液
中に少なくとも検知され得る濃度まで可溶性であるし、
界面活性剤の非存在下でそれ以上の十分に濃い濃度の注
射用水溶液となり得る性質を有する可溶性ペプチドであ
る。このように可溶性であるペプチドを用いると、医薬
組成物として極めて有用であることは既に述べた通りで
あるが、例えば、従来の物質においては、界面活性剤の
非存在下では不溶性であり、不溶物が存在する注射剤と
しないために界面活性剤の添加を必須とするが、種々の
問題を有する循環器疾患の患者において、この界面活性
剤の添加は予想外の問題を引き起こす可能性は否定でき
ないし、また界面活性剤の添加量との兼ね合いもあっ
て、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤が調製できない
可能性もあることが考えられるが、これに対し、本発明
のペプチドは、可溶性であるが故に、これらの問題にこ
とごとく解決されるものである。また、医薬組成物を製
造する場合においても、本発明の可溶性であるペプチド
が極めて有利であることは当然のことであって、例え
ば、精製が容易であること、製剤にするときに凍結乾燥
等が容易であること等が挙げられる。 本発明のペプチドは、トロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、
界面活性剤の非存在下で可溶性であるが、類似のペプチ
ドを挙げると以下の通りである。例えば、配列番号１の
１−118のアミノ酸配列、即ち、下記式（Ｉ）： で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、最も好
ましい例であって、上記の活性に程度の差があっても、
上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）で表される
アミノ酸配列に拘泥する必要はない。即ち、これらのペ
プチドは実質的に前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
から成っていてもよいし、また、その作用と機能を阻害
しない限り若干の欠損、置換等があっても、式（Ｉ）で
表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端に結
合した少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を
更に含有してもよい。 因みに、これらの更に具体的なペプチドの例として
は、（１）上記式（Ｉ）のペプチドの他、下記のペプチ
ドの（２）〜（５）が挙げられる（但し、配列番号３の
１−498のアミノ酸配列である）。 （２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端に下記
のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−236
のアミノ酸配列）。 （３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ
末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−172
のアミノ酸配列）。 （４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ
末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−498
のアミノ酸配列）。 （５）配列番号14の１−462のアミノ酸配列、即ち、 からなるペプチドである。 本発明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有し
ていてもよいし、含有していなくてもよい。即ち、本発
明では少なくともアミノ酸配列として、本明細書に説明
された配列であることを示すものであって、特に糖残基
により限定されるものではない。 本発明のペプチドを製造するに当たっては、例えば、
以下の方法により遺伝子操作技術を用いることが好まし
い。この遺伝子操作技術に用いる遺伝子としては、本明
細書に開示されるペプチドを製造することができれば特
に限定されず、本明細書で開示されたペプチドをコード
する遺伝子を用いればよい。この場合に、提供される好
ましい本発明のペプチドは、実質的に他のヒト成分を含
まない精製された組換ペプチドであることを特徴とする
ペプチドである。 本発明における好ましい遺伝子を例示すれば、配列番
号５の１−1494の塩基配列、または遺伝暗号の縮重に基
づき少なくとも１個の塩基が置換されている塩基配列が
挙げられる。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子の
塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置
換することができる。従って、本発明のDNAはまた、遺
伝略号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前に
定義したアミノ酸配列と一致する。 また前述の類似するペプチドに関する塩基配列を参考
のために挙げれば以下の通りである。 例えば、次式（II）（即ち、配列番号４の１−354の
塩基配列）： で表される塩基配列を含有するDNAである。 また、このDNAは前記式（II）で表される塩基配列
と、その５′末端および／または３′末端に結合した少
なくとも１種の他の塩基配列とを含有していてもよい。
式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種の他の塩
基配列とを含有するDNAの例としては下記のDNA（１）〜
（５）が挙げられる（なお、配列番号５の１−1494の塩
基配列は本発明の塩基配列である）。 （１）上記式（II）で表されるDNA（即ち、配列番号４
の１−354の塩基配列）。 （２）式（II）で表される塩基配列とその５′末端に結
合した次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号９の１−708の塩基配列）。 （３）式（II）で表される塩基配列の５′末端および
３′末端に夫々次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号11の１−816の塩基配列）。 （４）式（II）で表される塩基配列の５′末端および
３′末端に夫々次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号５の１−1494の塩基配列）。 （５）配列番号15の１−1386の塩基配列、即ち、 からなるDNAである。 本発明のDNAは、例えば、以下のようにして得ること
ができる。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したcDNAライブ
ラリーからその抗体と結合するペプチドをコードするcD
NA断片を単離し、単離したcDNA断片の塩基配列を分析す
る。得られたcDNA断片はトロンビンのプロテインＣ活性
化を促進することのできるヒト肺由来のペプチドの一部
分をコードしている。その部分はそのペプチドのＣ末端
を含むがＮ末端を含まない。 （２）上述のように、得られたcDNA断片はヒト肺由来の
ペプチドの全アミノ酸配列をコードしておらず、そのペ
プチドのＮ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列を欠い
ているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコードするcDNA断片
を上記工程（１）で得られるcDNA断片を利用して通常の
公知のプライマーエクステンション法により以下のよう
にして得る。 まず、上記工程（１）で得られたcDNA断片のコードす
るペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列に対応するcDNA断
片の一部分を有機化学合成する。次に、合成したDNAを
プライマーとして用いて通常の公知のプライマーエクス
テンション法によりヒトさい帯内皮細胞より調製したポ
リ（Ａ）+RNAから上記工程（１）で得られるcDNA断片の
５′末端の上流の塩基配列を有するcDNA断片を得る。上
記プライマーエクステンションを繰り返すことによりヒ
ト肺由来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードする
cDNA断片を得る。 （３）次に、前記工程（１）及び（２）で得られたcDNA
断片を適宜結合することにより、開始コドンから始まる
1725塩基対（以下“bp"と略する）のオープンリーディ
ングフレームを含有するcDNA（以下“cDNA−A"と略す
る）を得る。このオープンリーディングフレームの塩基
配列は、配列番号10の１−1725の塩基配列である。また
リーダー配列をコードする塩基配列を除外し、ヒト肺由
来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列からの塩基配列とす
れば、配列番号12の１−1671の塩基配列となる。 このcDNA−Ａから、前述のDNA（１）〜（５）の塩基
配列と実質的に同等の塩基配列を有するcDNAは、以下の
部分を位置特異的変異法で削除することによって得るこ
とができる。 （ｉ）DNA（４）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するに当たっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて1549番目から1725
番目の塩基までの部分である。 （ii）DNA（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて1441番目から1725
番目の塩基である。 （iii）DNA（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から732番
目および1549番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 （iv）DNA（２）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から732番
目および1441番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 （ｖ）DNA（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から1086番
目および1441番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 このようにして得られた各cDNAの塩基配列は公知の方
法で分析して、DNA（１）〜（５）の塩基配列とそれぞ
れ一致することを確認する。 上記本発明のDNAは有機化学合成することによっても
得ることができる。また、本発明のDNAは前述のプライ
マーエクステンションを行うことなく、前駆体DNAから
調製することもできる。前駆体DNAは、前記工程（１）
で得られるDNA断片またはそのDNA断片の塩基配列に基づ
いて調製した合成DNAをプローブとして用いる通常のハ
イブリダイゼーション法によってヒト染色体DNAライブ
ラリーから得ることができる。 前述の如く、式（II）の塩基配列を含有する本発明の
DNAは次式： で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよく、通常細胞
等での発現においてこのリーダー配列の全部又は一部は
削除され得る。 本発明によれば、上記DNAと相補的なDNAもまた提供さ
れる。本発明によれば、上記DNAとそれに相補的なDNAが
互いに相補的に結合して２重鎖DNAを形成していてもよ
い。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子の
塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置
換することができる。従って、本発明のDNAはまた、遺
伝略号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前に
定義したアミノ酸配列と一致する。すなわち、本発明は
前述の種々のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA
またはその相補的DNAである。 更にまた、本発明によれば、前記の本発明のDNAと複
製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換え体DN
Aが提供される。該組換え体DNAは、それによって形質転
換された微生物または細胞中で、本発明のペプチドを発
現することができる。適したベクターの例としては、プ
ラスミドpBR322、pBR327、YRp7、pSV2−dhfr（ATCC 37
146）、pBPV−１（９−１）（ATCC 37111）などが挙げ
られる。尚、発現ベクターは宿主として使用する微生物
または細胞に適したものを選択する必要がある。 更に本発明はまた、上述の複製可能な組換え体DNAで
形質転換された微生物または細胞に関する。微生物の例
としては、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）
の菌株、例えばイー コリ（E.coli）K12株294（ATCC
31446）、イー コリ（E.coli）Ｂ、イー コリ（E.col
i）X1776（ATCC 31537）、イー コリ（E.coli）C600
およびイー コリ（E.coli）C600hfl並びにイー コリ
（E.coli）W3110（Ｆ−、λ−、プロトトロフィック、A
TCC 27375）；バチラス サブチリス（Bacillus subt
ilis）の如きバチラス（Bacillus）属の菌株；サルモネ
ラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）また
はセラチア マーセサンス（Serratia marcesans）等
の大腸菌以外の腸内菌；シュードモーナス（Pseudomona
s）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられる。
細胞の例としては、VERO（ATCC CCL−81）細胞、HeLa
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、W13
8、BHK、COS−７およびMDCK細胞膜等の動物細胞が挙げ
られる。 前述の配列番号７の１−575のアミノ酸配列をコード
する遺伝子は、生体内では、血管内皮細胞膜上に次式の
一次構造（即ち、配列番号13の１−557のアミノ酸配
列）で発現される。 また上記遺伝子をCOS細胞、CHO細胞またはC127細胞で
遺伝子工学的に発現させた場合も、同様にそれら細胞膜
上に発現・濃縮され、培養液中には活性が検知されない
ので、トリトンＸ−100等の界面活性剤の存在下調製す
るが、本発明のペプチドは、分泌され得る形態で培養液
中に可溶物として検知・回収できる。勿論、界面活性剤
の存在下で精製することも可能であり、本発明の実施例
に示される通り、界面活性剤の存在下で精製し、界面活
性剤を含有するペプチドを取得することもできる。 本発明のペプチドを製造する方法は、例えば以下の方
法が好ましい例として挙げられるが、他の方法によるこ
とも本発明が達成される限り特に限定されない。 （ａ）前述のペプチドをコードするDNAと複製可能な発
現ベクターに連結して、該DNAと該複製可能な発現ベク
ターとからなる複製可能な組換え体DNAを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体DNAで微生物または細胞を
形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該DNA
を発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離する。 本発明の方法によれば、前述の本発明のDNAが正しく
転写し、それによって得られるmRNAからの翻訳が正しく
行われるように本発明のDNAを複製可能な発現ベクター
のプロモーターなどのDNA領域の下流に組入れて該DNAを
有する複製可能な組換え体DNAを得、得られた該組換え
体DNAで微生物または細胞を形質転換させて該組換え体D
NAを含有する形質転換体を得る。得られた形質転換体
は、該組換え体DNAに与えられた表現型によって微生物
または培養細胞の親細胞から単離される。得られた形質
転換体を培養して前記DNAの有する遺伝情報を発現させ
て本発明のペプチドを製造する。 尚、本発明のDNA及び組換え体DNAを構築するために必
要なDNA配列、例えばプロモーターや複製起源等をクロ
ーニングするためには原核細胞を宿主として用いる宿主
−ベクター系を使用するのが好ましい。原核細胞の例と
してはエシェリヒア コリ（Escherichia coli）の菌
株、例えばイー コリ（E.coli）K12株294（ATCC 3144
6）、イー コリ（E.coli）Ｂ、イー コリ（E.coli）X
1776（ATCC 31537）、イー コリ（E.coli）C600およ
びイー コリ（E.coli）C600hfl並びにイー コリ（E.c
oli）W3110（Ｆ−、λ−、プロトトロフィック、ATCC
27375）；バチラス サブチリス（Bacillus subtili
s）の如きバチラス（Bacillus）属の菌株；サルモネラ
チフィムリウム（Salmonella typhimuriumu）または
セラチア マーセサンス（Serratia marcesans）等の
大腸菌以外の腸内細菌；シュードモナス（Pseudomona
s）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられる。 これらの細菌のうち、エシェリヒア コリ（E.coli）
K12株294が最も好ましい。上記微生物を宿主として使用
する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが
組換え体DNAの複製可能な発現ベクターとして一般に用
いられる。例えば大腸菌を形質転換するためのプラスミ
ドベクターとしてはプラスミドpBR322やpBR327などを用
いることができる。プラスミドベクターは通常複製起
源、プロモーター、および組換え体DNAで形質転換した
細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体DNAに与え
るマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例と
しては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ
ー、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マー
カー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテ
トラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。 一方、本発明のDNAを発現して本発明のペプチドを製
造するためには、上記の原核細胞を宿主として用いる宿
主−ベクター系および脊椎動物の細胞などの真核生物の
細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベクター系を使用す
ることができる。真核細胞の例としては前述の動物の細
胞株などの細胞が挙げられる。本発明のDNAを前述の真
核細胞で発現させるために、本発明の組換え体DNAは一
般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例えば、複
製起源、本発明のDNAの上流に位置すべきプロモータ
ー、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終
止配列を含有している。本発明のDNAを真核細胞内で発
現させるのに用いることのできるそのような機能配列は
ウィルスやウィルス性物質から得ることができる。 例えば、本発明で用いることのできるプロモーター
は、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、シミアン
ウィルス40（SV40）などから得ることができる。特に、
アデノウィルス２の主後期プロモーターやSV40の初期お
よび後期プロモーターが好ましい。また、トロンビンの
プロテインＣ活性化を促進する作用を有するヒト肺由来
のペプチドをコードする遺伝子の上流の位置に本来存在
するプロモーターも、上述の宿主−ベクター系で使用す
るのに適しているならば使用することができる。 複製起源については、外来性の起源、例えば、アデノ
ウィルス、ポリオーマ、SV40、水痘性口内炎ウィルス
（VSV）、ウシ乳頭腫ウィルス（BPV）等のウィルス由来
の複製起源を用いることができる。また、発現ベクター
として宿主染色体に組み込まれるような性質を有するベ
クターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用する
ことができる。 本発明の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微
生物または細胞は、前述のとおり、組換え体DNAに与え
られた少なくとも１種の表現型によって形質転換されず
に残った親細胞から選別される。表現型は少なくとも１
種のマーカー遺伝子を組換え体DNAに挿入することによ
って与えることができる。また複製可能な発現ベクター
が本来有しているマーカー遺伝子を利用することもでき
る。マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネオマイシ
ン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（以下“DHFR"と称する）をコードする遺伝子などが
挙げられる。これに関し、DHFR遺伝子をマーカー遺伝子
として用いる場合、DHFRには様々のタイプがあるため、
その使用するマーカー遺伝子のコードしているDHFRのタ
イプによって用いるべき宿主を選択しなければならな
い。例えば、マーカー遺伝子として野生型DHFRをコード
する遺伝子を用いる場合、宿主としてはDHFR欠損株を用
いるのが好ましい。DHFR欠損株はヒポキサンチン、グリ
シン及びチミジンを要求するので、ヒポキサンチン、グ
リシン及びチミジンを含まない培地中では成育できな
い。 しかしながら、DHFR欠損株をDHFR遺伝子を含有する組
換え体DNAで形質転換すると、その株はもはやヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンを要求しなくなり、ヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを含まない培地中で
も成育することができる。従って、形質転換細胞は、ヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンについての栄養要
求性を判断基準にして形質転換されないで残った細胞か
ら容易に選択することができる。 一方、メトトレキセート（MTX）に対する親和性の低
い変異体DHFRをコードする遺伝子（以下“MTX耐性DHFR
遺伝子”と称する）をマーカー遺伝子として用いる場合
には、宿主細胞は正常なDHFRをコードする遺伝子を有し
ていればよくDHFRを欠損している必要はない。その理由
は以下のとおりである。正常DHFRはMTXによって阻害さ
れるため、正常DHFRをコードする遺伝子を含有する宿主
細胞はMTXの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及び
チミジンを要求する。しかしながら、その宿主細胞がMT
X耐性DHFR遺伝子を含有する組換え体DNAで形質転換する
と形質転換細胞はMTX存在下においてももはやヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従って、
形質転換細胞は、MTX存在下におけるヒポキサンチン、
グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準
として用いて形質転換されていない細胞から選択するこ
とができる。これに関し、真核細胞の大多数がMTX感受
性であるのでMTX耐性DHFR遺伝子はマーカー遺伝子とし
て用いるのに好都合である。 サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerev
isiae）などの酵母も本発明のDNAを発現するための宿主
として用いることができる。酵母で本発明のDNAを発現
するためには複製可能な発現ベクターとして例えばプラ
スミドYRp7を用いることができる。プラスミドYRp7はtr
p1遺伝子を含有しており、このtrp1遺伝子をマーカー遺
伝子として利用することができる。 酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例として
は、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの解糖系に
関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファ
ターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース及びラク
トースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
が挙げられる。これらのうち、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒
素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びラク
トースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
は、これらのプロモーターによる転写を宿主の培養条件
を変えることによって制御することができるので有利で
ある。 酵母細胞中における転写や翻訳を制御するための複製
起源や終止コドンおよびその他のDNA配列としては、酵
母細胞に適している通常の公知のDNA配列を用いること
ができる。形質転換した微生物または細胞は通常の栄養
培地を用いて通常の公知の方法で培養することにより本
発明のペプチドをコードするDNAを発現して本発明のペ
プチドを製造することができる。培養後、本発明のペプ
チドは形質転換体の培養物から通常の公知の方法、例え
ばカラムクロマトグラフィーなどを用いて単離すること
ができ、本明細書の記載に従って、本発明の医薬組成物
として使用できる程度に実質的に精製されることが通常
行われる。このようにして得られたペプチドは、アミノ
酸配列が同一であるのであれば、様々な種類と長さの糖
鎖を少なくとも１種含有していてもよいし、また勿論、
類似する他のペプチドとの混合物として用いてもよい。
得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは用いる
宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチドが糖鎖
を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿主細
胞の種類によって異なる。 一般に翻訳開始シグナルのATGから翻訳されたペプチ
ドは宿主細胞から分泌されるときにプロセッシングを受
けて成熟蛋白になることが知られている。本発明のペプ
チドの場合もそのようなプロセッシングを受けることが
ある。ペプチドがプロセッシングを受ける部位は、宿主
により、または培養条件により変化する場合がある。例
えば、本発明のペプチドが、式（Ｉ）で表されるペプチ
ドとＮ末端アミノ酸配列として前述の18個のアミノ酸か
らなるリーダー配列とを含むプロセッシングを受けてい
ない未成熟形で形質転換細胞中で産生される場合、その
未成熟形ペプチドはプロセッシングを受けてリーダー配
列が削除されて成熟形となることがある。しかしなが
ら、前述のように未成熟形ペプチドのプロセッシングを
受ける位置は使用する宿主の種類や宿主の培養条件によ
り変化するので必ずしも上記のようなプロセッシングが
起きるとは限らない。 前述のとおり、本発明のトロンビンによるプロテイン
Ｃの活性化を促進する作用を有するペプチドは組換えDN
A技術を用いる方法により製造することができる。ま
た、本発明のペプチドは通常の公知の方法により、例え
ば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて有機合成に
より製造することもできる。本発明のペプチドはトロン
ビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用を有す
る。プロテインＣは血液凝固線溶機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロ
ンビンの作用により活性化される。活性型プロテインＣ
は、生体内で血液凝固系補酵素の活性型第Ｖ因子、およ
び活性型第VIII因子を失活させ、また血栓溶解作用を有
するプラスミノーゲンアクチベーターの産生に関与して
いることが知られている。〔鈴木宏治、医学の歩み、第
125巻、901頁（1983年）〕。本発明のペプチドは、この
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血
液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを
大量に産生せしめるものである。従って、本発明のペプ
チドは生体における抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄
与するものである。 前述のように、本発明の医薬組成物は抗血液凝固作用
と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので、
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として用いることが可能であり、具
体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血
管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群
（DIC）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の
疾患の治療及び予防に用いることができる。 本発明の医薬組成物となすに際しては、本発明のペプ
チドと、薬剤として使用可能な担体とを混合すればよ
い。即ち、上記の疾患を治療または予防するのに有効な
量の本発明のペプチドを適当な量の担体と混ぜて、患者
に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調製するこ
とができる。薬剤として使用可能な担体としては、例え
ば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースな
どが例示される。また本発明の医薬組成物としては、凍
結乾燥された製剤となすことが好ましい。また本発明の
医薬組成物は注射用製剤として用いることが好ましい。
さらには、点滴静注用製剤とすることが好ましい。注射
剤として用いる場合に、上記の担体は、薬剤として投与
可能であり、且つ注射可能な溶液となり得る担体である
ことが好ましく、この担体としては、ショ糖、精製ゼラ
チン、アルブミン、マンニトール、ブドウ糖および塩化
ナトリウムからなる群より選ばれた１種以上が例示さ
れ、また各種無機塩のpH調整剤などを添加することも好
ましい例として挙げられるが、その場合には医薬組成物
全体として可溶性であり、且つ綺麗に凍結乾燥が可能で
あって、好ましい。また本発明においては、上記担体
が、グリセリンであることもまた好ましい。上記の担体
は、製剤を調製する際に添加することが好ましいが、用
時に溶解された際において添加されることも許されるも
のである。 本発明のペプチドの成人１回当たりの投与量は年齢、
性別、体重、症状等により異なるが、一般に約0.1〜200
mgであり、一日当たり一回または必要に応じて数回、注
射、好ましくは点滴静注により投与する。本発明者ら
は、本発明のペプチドが副作用の少ない極めて有用なも
のであることを確認しており、例えば、動物実験でラッ
トiv投与において約3mg/Kgで全く死亡例や害を生ずるこ
とがなく、有効な作用も認められることから、ヒトの体
重を約60〜70Kgと考えて上記の投与量が妥当なものとし
て提示される。 〔実施例〕 本発明をより詳細に記述するために参考例及び実施例
により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定） 本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の
測定は、合成基質Boc−Leu−Ser−Thr−Arg−MCA（Boc
及びMCAはそれぞれｔ−ブトキシカルボニル基及び４−
メチルクマリル−７−アミドの略称である）を用いる公
知のプロテインＣ測定法〔ワイ オーノ（Y.Ohno）ら、
ザ ジャーナル オブ バイオケミストリー（J.Bioche
m.）90巻、1387頁（1981年）〕に従って行なった。すな
わち、プロテインＣ（最終濃度0.5μＭ）およびトロン
ビン（最終濃度80nM）を含有する水溶液５μｌに本発明
のペプチドを含む水溶液５μｌ（０〜0.01 A280/ml）
を加え、これにNaCl、CaCl2、血清アルブミン及びトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.4）をそれぞれ最終濃度が0.15M、2.
5mM、1mg/ml及び20mMになるように、そして全量が30μ
ｌとなるように加えた。 得られた混合物を37℃で15分間反応させてプロテイン
Ｃを活性化した後に２μＭのアンチトロンビンIIIを10
μｌ及び10単位/mlのヘパリンを含有する水溶液を10μ
ｌ加えて37℃で15分間加温して反応を停止させた。得ら
れた反応混合物に、前述の合成基質Boc−Leu−Ser−Thr
−Arg−MCA〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会
（Peptide Institute）製、日本〕200μＭを含む20mM
トリス塩酸緩衝液（pH7.4）250μｌを加え、37℃で10分
間反応させた後、20％酢酸0.5mlを加えて反応を停止さ
せ、遊離してきたAMC（７−アミノ−７−メチル−クマ
リン）の濃度を励起波長380nm、発光波長440nmで蛍光分
光光度計RF−540型（島津製作所製、日本）により測定
した。得られた蛍光強度を既知濃度のAMCの蛍光強度と
比較して、遊離したAMC量を求めた。値は１分間当りに
生成するAMC量で表わす。このAMC量から本発明のペプチ
ドを含まない水溶液を加えたときのAMC量を引いた値が
サンプルのトロンビンによるプロテインＣ活性香を促進
する強さを示す。 ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木らの方法
〔鈴木（Suzuki）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258巻、1914
頁（1983年等）〕で精製した。 また、ヒトトロンビンはランドブラッド（Lundblad）
らの方法〔ランドブラッド（Lundblad）ら、バイオケミ
カル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーション（Biochem.Biophys.Res.Commun.）66巻、482
頁（1975年）〕で精製した。 参考例２ （１）：ヒト肺cDNAライブラリーの入手 ヒトの肺のポリ（Ａ）+RNAより調製したバクテリオフ
ァージλgt11cDNAライブラリーは、米国、クローンテッ
ク社（Clontech Laboratories,Inc.、922 Industria
l,Ave.Palo Alto,CA94303）より購入した（カタログ番
号HL1004）。 （２）：トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進す
る作用のあるグリコペプチドの精製 プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプ
チドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公
立病院より提供されたヒト肺標本約800gを鋏で約1cm四
方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に1mM
のDFP（Diisopropyl fluorophosphate）を含む４℃に
冷却した500mlの生理食塩水を加え、ワーリングブレン
ダーとしてAce Homogenizer AM−１型（日本精器会社
製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズした。
ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。次に
混合物を更に４℃で５分間、ホモジナイズし氷中で５分
間冷却した。上記のホモジナイズ及び冷却操作を更に３
回くり換した。得られたホモジェネートを12,000gで４
℃において30分間遠心分離にかけて上澄液とペレットに
分け、ペレットを集める。これに0.5％（v/v）トリトン
Ｘ−100、0.25M庶糖、1mMベンズアミジン塩酸、0.5mM
CaCl2を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸
濁し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分間、５
回ホモジナイズして細胞抽出物を得た。 得られた抽出物を35,000g、10℃で60分間遠心分離に
かけて上澄液を集めた。エヌ エル エスモン（N.L.Es
mon）ら〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、257巻、859頁（1982
年）〕の方法に従って作成したDIP−トロンビン〔ジイ
ソプロピルホスフォロトロンビン（diisopropylphospho
ro−thrombin）をピー クオトレカサス（P.Cuatrecasa
s）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、245巻、3059頁（1970
年）〕に従ってブロムシアン化したアガロースに結合さ
せて、DIP−トロンビン−アガロースを作成した。 次に、DIP−トロンビン−アガロースを2.5cmφ×10cm
の大きさのカラムに充填してDIP−トロンビン−アガロ
ースカラムを作成し、室温で0.1M NaCl、0.5mM CaC
l2、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PX
（半井科学薬品製、日本）を含む0.02Mトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）でカラムを平衡化した。次いで上記の抽出
上澄液をカラムに供した。カラムを0.3M NaCl、0.5mM
CaCl2、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol
PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した
後、1M NaCl、0.1mM EDTA、1mMベンズアミジン塩酸0.
5％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（p
H7.5）で溶出して2.0mlずつフラクシヨンを集めた。溶
出によって得られる各フラクションについて前記の方法
でトロンビンのプロテインＣの活性化促進能を測定し
た。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォトメー
ターUV−240を用いて各フラクションの波長280nmにおけ
る吸光度（A280）を測定した。 プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、0.1M Na
Cl、0.5mM CaCl2、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.0
2Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透
析液を２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を1.5cmφ×1
0cmの大きさのDIP−トロンビン−アガロースカラムに供
し、0.4M NaCl、0.5mM CaCl2、0.1％（v/v）Lubrol
PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄後、さ
らに0.4M NaCl、0.1mM EDTA、0.1％（v/v）Lubrol P
Xを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄し、次
いで1M NaCl、0.5mM EDTA、0.1％（v/v）Lubrol PX
を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で溶出した。 プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、さらに0.
1M NaCl、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透析液を３
回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマトグ
ラフィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶
出条件は２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラム
クロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。
なお、溶出して得られるフラクションは2mlずつ集め
た。プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、0.1M
NaCl、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）で透析した後、0.9cmφ×8cmの大きさ
の４回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマ
トグラフィーに供した。0.35M NaCl、0.5mM CaCl2、
0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトルス塩酸緩衝液
（pH7.5）で洗浄後、1M NaCl、0.5mM EDTA、0.1％（v
/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
で溶出した。溶出して得られたフラクションは1.9mlず
つ集めた。 この第４回目のDIP−トロンビン−アガロースカラム
クロマトグラフィーの溶出パターンを第１図に示す。フ
ラクションナンバー48番目から56番目までを回収した。 このようにして精製されたフラクションの吸光度か
ら、得られた精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の
分子吸光係数にならない10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.
0）と規定してそれに基づき本精製品の量を計算したと
ころ約500μｇであった。なお、得られた精製画分をポ
リアクリルアミドゲル濃度５〜10％のグラジェントを用
いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を50Vの電圧
で２時間行ない、銀染色によってバンドを観察したとこ
ろ単一バンドのみ確認された。 また、この精製タンパク約10μｇを200mMのNaClおよ
び0.1％（v/v）Lubrol PXを含む50mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したConAセフ
ァロース（ファルマシア社製、カタログ番号17−0440）
のカラム（樹脂量約1ml）に供し、同じ緩衝液で充分洗
浄したところ、このタンパクはConAセファロースに吸着
して洗浄液中には溶出されなかった。 次いで、0.5Mのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
（Methyl−α−Ｄ−mannopyranoside）（米国Sigma社
製、カタログ番号Ｍ−6882）を含む以外は上記と同じ緩
衝液を通したところ、このタンパク質は溶出した。従っ
て、このタンパク質は糖を含むいわゆるグリコペプチド
であることがわかった。 （３）：トロンビンのプロテインＣ活性化を促進するグ
リコペプチドのアミノ酸配列分析 このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして
分析した。 精製したグリコペプチドを0.1％（v/v）ラウリル硫酸
ナトリウム（SDS）水溶液で室温で16時間透析してアミ
ノ酸配列分析用試料とする。アプライドバイオシステム
ズ社（米国）製アミノ酸シークエンシングアナライザー
（モデル470A）を用い、アール エム ヘウイック（R.
M.Hewick）らの方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）256巻、7990頁
（1981年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン分析
を行なった。遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（SP8100）および米国デュ
ポン社製ゾルバックスODSカラムを用いて分析を行な
い、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ酸配列
の一部が明らかになり、Ｎ末端より11個目までは下記ア
ミノ酸配列を有するものであることがわかった。 Ala−Pro−Ala−Glu−Pro−Gln−Pro−Gly−Gly−Ser−
Gln （４）:N末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブの
作成 トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリ
コペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Nucleic Acid Res.）、９巻、R43頁（1981年）〕、
Ｎ末端からのアミノ酸配列をコードする塩基配列とし
て、５′CTGGG AGCCG CCGGG CTGGG GCTCG GCGGGGG
C3′の33merを、また大塚ら〔イー オーツカ エト
アール（E.Ohtsuka,et al.）、ザ ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）第26
0巻、2605頁（1985年）〕に従って、デオキシイノシン
（“I"で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端から
のアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′GCICC IGCIG AACCI CAGCC IGG3′ （２）５′GCICC IGCIG AGCCI CAACC IGG3′ （３）５′GCICC IGCIG AGCCI CAGCC IGG3′ （４）５′GCICC IGCIG AACCI CAACC IGG3′ の４種類の23merを米国アプライド バイオシステズ（A
pplied Biosystems）社製の380A型DNA合成機で合成
し、メーカーマニュアルに従って精製し、実験書〔イー
エフ マニアティスら（Maniatis E.F.,et al）、
モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、12
2頁（1982年）〕の記載にしたがって、T4DNAキナーゼ、
およびγ−32P−ATPを用いてラベル化した。 （５）：トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進す
る作用のあるグリコペプチドの抗体 トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のあ
るグリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のように
して精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促
進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用い
て、成書〔エル ハドソンら（L.hudson et al.）、
プラクティカル イムノロジー（Practical Immunolog
y）、９頁（1976年）、ブラックウェル サイエンティ
フィック パブリケーションズ（Blackwell Scientifi
c Publications）〕に従って作製した。 この抗体がトロンビンによるプロテインＣ活性化を促
進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドと反応す
ることを以下の様にして確認した。すなわち、参考例２
−（２）に記載の方法で得た精製タンパクの約10ngをニ
トロセルロースのフィルターにスポットする。よく風乾
した後、この抗体を一次抗体としてニトロセルロースフ
ィルター上のタンパクと反応させ、次いでヤギで調製し
たビオチン化抗ウサギIgG（ザイメット ラボラトリー
社製、米国、カタログ番号62−1840）を二次抗体として
反応させた後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由
来パーオキシダーゼ（アマシャムジャパン社製、日本、
カタログ番号RPN.1051）を作用させる方法で発色させる
と黒褐色のスポットを与えた。 （６）：ヒトさい帯内皮細胞の採集及び培養 ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼII（合同酒精社
製、日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Y.Ma
no,et al.）、エクスペリンエンシア（Experienti
a）、第39巻、第1144頁（1983年）〕にしたがって、私
立病院より提供された新鮮なヒトさい帯から得た静脈よ
り採集し培養した。 参考例３ （組換え体DNAの取得） （１）：ポリ（Ａ）+RNAの調製 ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Chirgwin,J.M.et al.）、バイオケミス
トリー（Biochemistry）、第18巻、5294頁（1979年）〕
に従ってポリ（Ａ）+RNAを調製した。 （２）：ヒト肺cDNAライブラリーよりのスクリーニング ヒト肺のポリ（Ａ）+RNAより調製したcDNAをバクテリ
オファージλgt11に組み込んだcDNAライブラリー（クロ
ーンテック社製、米国）をそのマニュアルに従ってイー
コリ（E.coli）Y1090（クローンテック社製、米国）
に感染させたものをLB培地プレート上に15cm径プレート
１枚当り約10万プラーク程度になる様に移植した。42℃
で3.5時間培養後、あらかじめ10mMのIPTG（isopropyl−
β−Ｄ−thiogalactopyranoside）に浸してから乾燥さ
せたニトロセルロースフィルター（BA85メンブランフィ
ルター、シュライヒャー アンド シェル社製、独国）
をプレートの上に載せ、37℃で3.5時間インキュベート
して、ペプチドをIPTGで誘導発現させてニトロセルロー
スフィルター上にうつしとる。 このニトロセルロースフィルターに、マニュアルに従
って、ウサギで調製したトロンビンのプロテインＣ活性
化を促進する作用を有する参考例２−（５）で得られた
グリコペプチドに対する抗体を一次抗体として反応さ
せ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギIgG（ザ
イメッド ラボラトリー社製、米国、カタログ番号62−
1840）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビオ
チン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマーシ
ャム ジャパン社製、日本、カタログ番号RPN.1051）で
発色させて、陽性のクローンを単離した。この陽性クロ
ーンの保有する組換え体cDNA/λgt11に含まれるcDNA断
片をTM13と称した。 （３）:N末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブと
のハイブリダイゼーション 参考例３−（２）で得られたDNA断片TMI3が参考例２
−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードするDN
Aプローブとハイブリダイズするか否かを実験書〔シル
ハービイ（Silhavy）ら、エクスペリメンツ ウイズ
ジーン フュージョンズ（Experiments With Gene F
usions）、191頁（1984年）コールド スプリングハー
バー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborato
ry）〕に従って実施した。DNA断片TM13はいずれのＮ末
端アミノ酸配列をコードするDNAプローブともハイブリ
ダイズしないことがわかった。 （４）:TM13の塩基配列 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するDNA
断片TM13の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー エ
フ ら（Sanger,F.et al.）、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエ
スエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、74巻、5463頁（19
77年）にしたがって決定した。結果を第２（ａ）図〜第
２（ｂ）図に示す。 （５）:DNA断片TM13をプローブとしたヒト肺cDNAライブ
ラリーのスクリーニング DNA断片TM13を制限酵素Kpn IおよびPvu IIで消化して
約440塩基対のDNA断片を得、これをニックトランスレー
ション法で32Pで標識した。このDNA断片をプローブとし
てヒト肺cDNAライブラリーよりプラークハイブリダイゼ
ーションを行なって陽性のクローンをスクリーニングし
た。すなわち、常法に従ってクローンTM13のDNAをKpn I
およびPvu IIで消化してポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離し、抽出、精製して約440bpの精製断片約500ng
を得た。このDNAをアマーシャム ジャパン（日本）社
製のニックトランスレーション キット（カタログ番号
N.5000）を用い、それに添付のユーザー マニュアルに
従ってα−32P−dCTPを用いて標識した。 この32Pで標識したDNA断片をプローブとして実験書
〔マニアティス（Maniatis）ら、モレキユラー クロー
ニング（Molecular Cloning）、320頁、1982年、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Sp
ring Harbor Laboratory）〕に従ってヒト肺cDNAライ
ブラリーのプラークハイブリダイゼーションを行なっ
た。 陽性のクローンを単離し、そのクローンが含有する組
換え体を各種制限酵素で解析したところ、得られた組換
え体にはTM13よりも前記ペプチドのＮ末端側の塩基配列
をコードしていると思われる約2400bpのDNA断片が組み
込まれていることがわかった。このDNA断片をTM137と称
した。 （６）:DNA断片TM137の塩基配列 前記（５）で得られたDNA断片TM137の塩基配列を参考
例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結果を第
３（ａ）図〜第３（ｄ）図に示す。 この結果より、DNA断片TM137は、参考例２−（３）に
記載したＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列を含
まないことがわかった。 （７）：プライマー エクステンション 参考例３−（４）で得られたDNA断片の塩基配列のう
ち、DNA断片TM13のＮ末端側の配列を基に３種類の合成D
NAを参考例２−（４）に記載と同様にして作成し、HTM1
31、HTM132、HTM133と命名した。なお、合成DNAの設計
に当っては、ヒトさい帯内皮細胞より調製したmRNAとハ
イブリダイズする側の塩基配列を利用した。各合成DNA
の塩基配列は、以下のとおりであり、それらの合成DNA
が対応するDNA断片TM13での位置を第２（ａ）図に、ま
たTM137での位置を第３（ａ）図に示す。 HTM131: ５′GACGCAGAGGTAGCTAGTTT ３′（20mer） HTM132: ５′AACATCTGGCACCTG ３′ （15mer） HTM133: ５′GACAGGCAGTCTGGTTGCAA ３′（20mer） 次に、このHTM133をプライマーとして参考例３−
（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）+RNAを用いて、いわゆるプライマー
エクステンション（Primer Extension）法を行なっ
て、DNA断片TM137のさらに５′上流部分を合成した。 すなわち、約１μg/μｌのポリ（Ａ）+RNA5μｌに約2
7ng/μｌのHTM133溶液20μｌを加え65℃で20分間加熱
後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以降は、
cDNA合成システム（アマシャム ジャパン社、日本、カ
タログ番号RPN1256）を用いて、そのマニュアルに従っ
てcDNAを合成した。但し、cDNA合成システムに入ってい
るオリゴ（dT）プライマーのかわりにHTM133を用いて実
施した。 合成されたcDNAは実験書〔マニアティス（Maniatis）
ら、モレキュラー クローニング（Molecular Clonin
g）、241頁、1982年、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）〕に従って両末端にＣテールをつけ、両末端にＧテ
ールをつけたpBR322（ATCC 37017）と混合し、65℃、
５分間加熱後57℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温
に戻した後、大腸菌K12MC1061（ベックマン シティ
オブ ホープ メディカルインスティテュート、米国よ
り入手）を形質転換した。詳しくは、大腸菌K12MC1061
株のコロニーをLB培地を用いて、550nmにおける吸光度
が0.3になるまで培養した。該培養物50mlを集め、25ml
の10mM RbClを含む10mM ３−（Ｎ−モルホリノ）プロ
パン−スルホン酸（MOPS）（pH7.0）溶液で洗浄し、次
いで、50mM CaCl2、10mM RbClを含む25mlの0.1M MOP
S（pH6.5）に再び懸濁した。 得られた懸濁液を30分間氷冷し、遠心後、上澄を除去
した。30μｌのDMSOおよび50mM CaCl2と10mM RbClを
含む2.0mlの0.1M MOPS（pH6.5）の混合液中に懸濁させ
た。懸濁液を200μｌずつ分注し、前述のプラスミドDNA
溶液10μｌをそれぞれに加えた。 該混合液を30分間氷冷した後、44℃で60秒ヒートショ
ックを与え、ただちに、あらかじめ37℃に温めておいた
5mlのLB培地を加えた。この溶液を37℃で１時間培養し
た後、それぞれの溶液を遠心し、上澄を除去し、細胞ペ
レットを得た。該細胞ペレットにLB培地を加え、撹拌し
た後、懸濁液とした。該懸濁液を５μg/mlのテトラサイ
クリンを含むLB寒天プレートにまき37℃で１夜培養を行
なった。このようにして得られるcDNAバンクより、参考
例２−（４）に記載した方法に従って５′末端を32Pで
標識したHTM131及びHTM132をそれぞれプローブとして、
コロニーハイブリダイゼーションを参考例３−（３）と
同様の方法で実施した。 コロニハイブダイゼーションで約70,000個の形質転換
体をスクリーニングしてHTM131及びHTM132の両者のプロ
ーブと反応するコロニーが６クローン得られた。この６
クローンから、実験書〔マニアティス（Maniatis）ら、
モレキュラー クローニング（Molecular Cloning）、
366頁、1982年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）〕に
従ってプラスミドDNA（これを“pTMP5"と称する）を調
製し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析
したところ、６クローンから得られたプラスミドDNAは
全て同一であり、約900bpの大きさのDNA断片とベクター
からなることがわかった。このDNA断片をTMP5と命名し
た。 （８）:DNA断片TMP5とＮ末端アミノ酸配列をコードする
DNAプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5がＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブ
とハイブリダイズするか否かを調べた。 DNA断片TMP5はいずれのＮ末端DNAプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。 （９）:DNA断片TMP5の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5の塩基配列を決定した。結果を第４（ａ）図〜第
４（ｂ）図に示す。 （10）：第２回目のプライマー エクステンション 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5の塩基配列を基にしてHTM134、HTM135、HTM136の
３本の20merの合成DNAを作成する。これらの合成DNAと
対応するDNA断片TMP5における位置を第４（ａ）図に示
す。 参考例３−（７）に記載の方法と同様にしてプライマ
ー エクステンションをHTM136をプライマーとし、HTM1
34、及びHTM135をプローブとして実施した。約50,000個
の形質転換体から、HTM134、及びHTM135とハイブリダイ
ズする形質転換体が一種類得られた。この形質転換体が
保有する組換え体に含まれているDNA断片をTMP26と命名
した。 （11）:DNA断片TMP26とＮ末端アミノ酸配列をコードす
るDNAプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてDNA断片T
MP26がＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブと
ハイブリダイズするか否かを調べた。 その結果、DNA断片TMP26は参考例２−（４）で合成し
た33merのＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブ
及び４種の25merのプローブのミックスプローブとハイ
ブリダイズした。つまり、DNA断片TMP26はＮ末端アミノ
酸配列部分をコードしていることが分かった。 （12）:DNA断片TMP26の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP26の塩基配列を決定した。DNA断片TMP26のカルボ
キシル末端からの約540塩基の塩基配列を第５図に示
す。 （13）:DNA断片TMP26、TMP5及びTMP137の接合 参考例３−（１）〜（12）で得られ、塩基配列を決定
した４本のDNA断片（TM13、TM137、TMP5及びTMP26）の
その塩基配列における対応関係および簡単な制限酵素地
図を第６図に示した。第６図に示すようにDNA断片TMP26
に含まれるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列の
上流にある最初のATGよりオープンリーディングフレー
ムを組むとDNA断片TMP26、TMP5を通過してTM137の途中
まで続く1725bpからなることが分かった。この各DNA断
片にわたるオープンリーディングフレームをコードする
DNA断片を得るためにDNA断片TMP26、TMP5及びTM137を次
のようにして常法に従って継ぎあわせた。 （13−１）:DNA断片TM137とTMP5の継ぎあわせ まず、λgt11のEcoR Iサイトに挿入されているDNA断
片TM137を単離し、プラスミドpUC18（ファルマシア社
製、スウェーデン、カタログ番号27−4949−01）のEcoR
Iサイトに挿入してプラスミドpUC18TM137を得た。 次に、プラスミドpUC18TM137を制限酵素Hinc II、Eco
R Iで消化して４％（v/v）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
MAX−YIELDR）を用いて約2,300bpのDNA断片を回収し、
エタノール沈殿を行なって精製した。 一方、参考例３−（７）で得られたTMP5をプラスミド
pBR322に組み込んだプラスミドpTMP5をDde Iで完全に消
化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラーゼ（Kleno
w Pol I断片）を用いて平滑末端にして約800bpのDNA断
片を回収し、このDNA断片をpUC18のSma Iサイトに挿入
してプラスミドpUC18TMP5を得た。次にこのプラスミドp
UC18TMP5を制限酵素BamH IおよびHinc IIで完全消化し
て約600bpのBamH I−Hinc II断片を得た。 以上の様にしてプラスミドpUC18TM137より調製した約
2,300bpのDNAの断片及びプラスミドpUC18TMP5より調製
した約600bpのDNA断片プラスミドpUC18のBamH IおよびE
coR Iで消化して調製したベクターに挿入してプラスミ
ドpUC18TMJ1を得た。この工程を第７図に示した。 （13−２）:DNA断片TMJ1とTMP26の継ぎあわせ プラスミドpUC18TMJ1を制限酵素Dde I、Kpn I及びBam
H Iで完全消化し、約950bp及び薬1500bpの断片を回収し
た。 一方、DNA断片TMP26をプラスミドpUC13（ファルマシ
ア社製、スウェーデン、カタログ番号27−4954−01）の
制限酵素Pst Iサイトに挿入してプラスミドpUC13TMP26
を得た。これをBbe Iで完全消化した後、切断末端をT4D
NAポリメラーゼを用いて平滑末端にし、さらに制限酵素
Bgl IIで完全消化して約170bpのDNA断片を得た。 さらに別に、プラスミドpUC13TMP26をBgl II及びDde
Iで完全消化して約280bpのDNA断片を得た。 次に、上記の約170bp、約280bp、約950bpのDNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、制限酵素Kpn Iで消
化した後、50Vの電圧で４℃で２時間、1.3％低融点アガ
ロースゲル電気泳動にかけて精製単離し、約1400bpのDN
A断片を得た。 また別途、プラスミドpUC18をSph Iで完全に消化した
後、E.coli DNAポリメラーゼで切断末端を平滑末端に
した後、BamH Iで完全消化してベクターを調製した。こ
のベクターに上述の約1,400bp及び約1,500bpのDNA断片
をT4DNAリガーゼを用いて挿入して、プラスミドpUC18TM
J2を得た。この工程を第８図に示す。 参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング） ヒト染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリー
ニングは以下のようにして実施した。 λファージのベクターEMBL−３に入ったヒト染色体ラ
イブラリーは米国クローンテック社（Clontech Labora
tries,Inc.922 Industrial Ave.Palo Alto,CA9430
3）より購入した（カタログ番号HL1006）。このライブ
ラリーより参考例３−（２）で得られたDNA断片TM13を
プローブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法で
スクリーニングを行なったところ、約２万bpインサート
を含有する染色体クローンが１種類得られた。この染色
体クローンを制限酵素BamH Iで完全消化して1.0％アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、実験書〔マニアティス
（Mantiatis）ら、モレキュラー クローニング（Molec
ular Cloning）、382頁、1982年、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）〕に従ってサザン ブロット ハイブリダ
イゼーションを同じプーロブを用いて実施した。 その結果、約4,000bpのDNA断片に強い陽性のバンドを
得たのでその断片を常法に従って単離し、プラスミドpU
C18のBamH Iサイトにサブクローニングした。この約4,0
00bpのDNAの塩基配列を決定したところ、参考例３−（1
3−２）で作製したプラスミドpUC18TMJ2に挿入されてい
るDNA断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。 実施例１ （プラスミドpSV2TMJ2、pSV2TMD1、pSV2TMD2、pSV2TMD4
及び、pSV2TMD5の作製） （１）プラスミドpSV2TMJ2の構築 プラスミドpSV2−dhfr（ATCC37146）をHind III及びB
gl IIで完全消化してSV40の初期転写プロモーター及びS
V40の転写ターミネータを有するベクターを得た。次に
参考例２−（13−２）で作成したプラスミドpUC18TMJ2
をHind IIIで部分消化した後BamH Iで完全消化して約2,
900bpのDNA断片を単離した。このDNA断片をTMJ2と称し
た。この2,900bpのDNA断片と上記の如く調製したベクタ
ーとをT4DNAリガーゼを用いて継ぎ合わせ、プラスミドp
SV2TMJ2を得た。プラスミドpSV2TMJ2を構築する工程を
第９図に示す。 得られたプラスミドpSV2TMJ2についてはブタペスト条
約の規定に基き、アメリカン タイプ カルチャー コ
レクション（ATCC）に寄託番号第67283号として寄託さ
れている。 （２）プラスミドpSV2TMD1の構築 （ａ）DNA断片TMD1の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドpSV2TMJ2をNc
o Iで完全消化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラ
ーゼを用いて平滑末端にした。次いでHind IIIで完全消
化して約1,900bpのDNA断片を得た。得られたDNA断片をT
MJ3と称した。一方、ファージＭ−13mp19（宝酒造社
製、日本、カタログ番号3119）をHind III及びHinc II
で消化してベクターを調製した。このベクターにDNA断
片TMD3を挿入して組換え体プラスミドＭ−13mp19TMJ3を
得た。 また別途、下記の塩基配列を有する削除用DNAプロー
ブ〔以下“ディリーター（deleter）”と称する〕を有
機合成した： ５′−GGAGGCCGCTCAGCCCGAATGCACG−３′（25mer）。合
成ディリーターをTMDと称した。 このようにして作成したディリーターTMDを用い、メ
ソッド イン エンザイモロジー（Method in Enzymo
logy）、第100巻、468頁（1983年）、アカデミック プ
レス（Academic Press）に記載の方法に従って部位特
異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体プラスミ
ドＭ−13mp19TMJ13の177塩基からなる部分の削除を行っ
た。 即ち、25pmolのディリーターTMDおよび10pmolのM13プ
ライマーM3（ユニバーサルプライマー、宝酒造社製、日
本、カタログ番号3831）の５′末端をT4キナーゼを用い
てリン酸化した後、0.5pmolの組換え体プラスミドM13mp
19TMJ3のシングルストランドDNAを加え、95℃で５分間
加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位のE.coli
DNAポリメラーゼ１（Klenow Fragment）、及び10単位
のT4DNAリガーゼを混合物に加えて37℃で30分間インキ
ュベートして混合物中に組換え体プラスミドを生成させ
た。 得られた混合物をイー コリ（E.coli）JM105（ファ
ルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号27−1550）
に加えた。それによって、このイー コリを組換え体プ
ラスミドでトランスフェクションした。37℃で一夜培養
して生じた寒天培地上のプラークをニトロセルロースフ
ィルターに移しとり、80℃で２時間加熱後、プレハイブ
リダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーショ
ンは６×SET〔0.9M NaCl、180mMトリス緩衝液（pH8.
0）、6mM EDTA〕、５×Denharts′〔0.1％（w/v）フィ
コール（Ficoll）、0.1％（w/v）ポリビニルピロリド
ン、0.1％（w/v）、ウシ血清アルブミン（BSA）〕、0.1
％SDS,100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で55℃、
２時間加温することにより実施した。 次いで上記の溶液中の変性サケ精子DNAのかわりに32P
でラベルしたTMDを加えた溶液を用いてハイブリダイゼ
ーション反応を55℃、２時間実施した。次いで６×SSC
（0.9M食塩、0.09Mクエン酸三ナトリウムの水溶液）を
用いてニトロセルロースフィルターを洗浄した。洗浄は
室温で、５分間、２回洗った後、55℃、65℃、75℃、と
段階的に温度を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ
洗った。Ｘ線フィルムXAR−５（イーストマン コダッ
ク社製、米国）を得られたニトロセルロースフィルター
に密着させて−80℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィ
ルム上に強く露光した黒いスポットが数10個検出され
た。各スポットは組換え体プラスミドで感染したクロー
ンに対応するものである。 そのうち、６クローンを選択し、各クローンの組換え
体プラスミドを単離して制限酵素解析、及び塩基配列の
解析を行ったところ、これらのクローンの保有する組換
え体プラスミドは制限部位と塩基配列がそれぞれ同一で
あることがわかった。得られた組換え体プラスミドをM1
3−TMD1と称した。さらにこの組換え体プラスミドM13−
TMD1は、開始コドン（ATG）と、その下流に498個のアミ
ノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配列を
含む塩基配列を含有するDNA断片を有することがわかっ
た。この組換え体プラスミドM13−TMD1に含まれるDNA断
片をTMD1と称した。第10図に組換え体プラスミドＭ−13
mp19TMJ3とディリーターTMDとがハイブリダイズし、DNA
断片TMJ3に対応するDNA領域の一部が削除されるところ
を示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD1の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD1をHind IIIおよびBamH Iで完全消化してT
MD1の約1,900bp DNA断片を単離した。一方、プラスミ
ドpSV2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで
完全消化してベクターを得た。このベクターとDNA断片T
MD1とをT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミド
pSV2TMD1を得た。 （３）プラスミドpSV2TMD2の構築 （ａ）DNA断片TMD2の作製 下記の塩基配列： ５′−CTCCACGCTGCAGGGGAACCCCAGG−３′（25mer）を有
するディリーターTMd2をディリーターTMDの代わりに削
除用DNAプローブとして用いる以外は実施例１−（２）
−（ａ）と実質的に同様の方法を繰り返して、TMD2と称
するDNA断片を含む組換え体プラスミドM13−TMD2を得
た。DNA断片TMD2は実施例１−（２）−（ａ）で得られ
たDNA断片TMD1の５′末端から678bpのDNAが削除された
構造を有する。このDNA断片TMD2は開始コドン（ATG）
と、その下流に272個のアミノ酸からなる本発明のペプ
チドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。第11図に組換え体プラスミドM13−TMD1とディリー
ターTMd2とがハイブリダイズし、DNA断片TMD1に対応す
るDNA領域の一部が削除されるところを示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD2の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD2をHind IIIおよびBamH Iで完全消化してT
MD2の約1200bpDNA断片を単離した。一方、プラスミドpS
V2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD2
とをT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミドpSV
2TMD2を得た。 （４）プラスミドpSV2TMD4の作製 （ａ）DNA断片TMD3の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドpSV2TMJ2をNc
o Iで完全消化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラ
ーゼを用いて平滑末端にした。次いでHind IIIで完全消
化して約1,900bpのDNA断片を得た。得られたDNA断片をT
MJ3と称した。一方、ファージＭ−13mp19（宝酒造社
製、日本、カタログ番号3119）のHind III及びHinc II
で消化してベクターを調製した。このベクターにDNA断
片TMJ3を挿入して組換え体プラスミドＭ−13mpTMJ3を得
た。 また別途、下記の塩基配列を有するディリーターを有
機合成した： ５′−GGAGGCCGCTCAACAGTCGGTGCCA−３′（25mer）。合
成ディリーターをTMd3と称した。 このようにして作製したディリーターをTMd3用い、メ
ソッド イン エンザイモロジー（Method in Enzymo
logy）、第100巻、468頁（1983年）、アカデミック プ
レス（Academic Press）に記載の方法にしたがって部
位特異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体プラ
スミドＭ−13mp19TMJ3の285bpからなる部分の削除を行
った。即ち、25pmolのディリーターTMd3及び10pmolのM1
3プライマーM3（ユニバーサルプライマー、宝酒造社
製、日本、カタログ番号3831）の５′末端をT4キナーゼ
を用いてリン酸化した後、0.5pmolの組換えプラスミドM
13mp19TMJ3のシングルストランドDNAを加え、95℃で５
分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位のE.co
li DNAポリメラーゼ１（Klenow Fragment）、及び10
単位のT4DNAリガーゼを混合物に加えて37℃で30分間イ
ンキュベートして混合物中に組換え体プラスミドを生成
させた。 得られた混合物をイー コリ（E.coli）JM105（ファ
ルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号27−1550）
に加えた。それによりイー コリを組換え体プラスミド
でトランスフェクションした。37℃で一夜培養して生じ
た寒天培地上のプラークをニトロセルロースフィルター
に移しとり、80℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼ
ーションを行った。プレハイブリダイゼーションは、６
×SET〔0.9M NaCl、180mMトリス緩衝液（pH8.0）、6mM
EDTA〕、５×Denharts′〔0.1％（w/v）フィコール
（Ficoll）、0.1％（w/v）ポリビニルピロリドン、0.1
％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）〕、0.1％SDS,100
μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で55℃、２時間加
温することにより実施した。 次いで、上記の溶液中の変性サケ精子DNAのかわりに
32PでラベルしたTMd3を加えた溶液を用いてハイブリダ
イゼーション反応を55℃、２時間実施した。次いで６×
SSC（0.9M食塩、0.09Mクエン酸三ナトリウムの水溶液）
を用いてニトロセルロースフィルターを洗浄した。洗浄
は室温で、５分間、２回洗った後、55℃、65℃、75℃、
と段階的に温度を上げていって、それぞれ５分間２回ず
つ洗った。Ｘ線フィルムXAR−５（イーストマン コダ
ック社製、米国）を得られたニトロセルロースフィルタ
ーに密着させて−80℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フ
ィルム上に強く露光した黒いスポットが数10個検出され
た。各スポットは組換え体プラスミドで感染したクロー
ンに対応するものである。そのうち、６クローンを選択
し、各クローンの組換え体プラスミドを単離して制限酵
素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、これらの
クローンの保有する組換え体プラスミドは制限部位と塩
基配列がそれぞれ同一であることがわかった。得られた
組換え体プラスミドをM13−TMD3と称した。更にこの組
換え体プラスミドM13−TMD3は、開始コドン（ATG）と、
その下流に462個のアミノ酸からなるペプチドをコード
する塩基配列を含有する（すなわち、配列番号15の１−
1386の塩基配列）DNA断片を有することがわかった。こ
の組換え体プラスミドM13−TMD3に含まれるDNA断片をTM
D3と称した。第12図に組換え体プラスミドＭ−13mp19TM
J3とディリーターTMd3とがハイブリダイズし、DNA断片T
MJ3に対応するDNA領域の一部が削除されるところを示
す。 （ｂ）DNA断片TMD4の作製 部位異特異的変異の手法を用いてディリーターTMd3の
代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリー
ターTMd2を用いる以外は実施例１−（４）−（ａ）と実
質的に同様の方法で、上述の如く得られた組換え体プラ
スミドM13−TMD3の一部を削除して、TMD4と称するDNA断
片を含む組換え体プラスミドM13−TMD4を得た。DNA断片
TMD4は、実施例１−（４）−（ａ）で得られたDNA断片T
MD3の５′末端から678bpのDNAが削除された構造を有す
る。このDNA断片TMD4は開始コドン（ATG）と、その下流
に236個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコード
する塩基配列を含む塩基配列を有していた。第13図に組
換え体プラスミドM13−TMD3とディリーターTMd2とがハ
イブリダイズし、DNA断片TMD3に対応するDNA領域の一部
が削除されるところを示す。 （ｃ）プラスミドpSV2TMD4の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD4をHind III及びBamH Iで完全消化してTMD
4の約1,100bpDNA断片を単離した。一方、プラスミドpSV
2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD4と
をT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミドpSV2T
MD4を得た。 （５）プラスミドpSV2TMD5の構築 （ａ）DNA断片TMD5の作製 下記の塩基配列： ５′−CACGGGCTCCACGGGGAACCCCAGG−３′（25mer）を有
するディリーターTMd4をディリーターTMd2の代わりに削
除用DNAプローブとして用いる以外は実施例１−（４）
−（ｂ）と実質的に同様の方法を繰り返して、TMD5と称
するDNA断片を含む組換え体プラスミドM13−TMD5を得
た。DNA断片TMD5を実施例１−（４）−（ａ）で得られ
たDNA断片TMD3の５′末端から1032bpのDNAが削除された
構造を有する。このDNA断片TMD5は開始コドン（ATG）
と、その下流に118個のアミノ酸からなる本発明のペプ
チドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。第14図に組換え体プラスミドM13−TMD3とディリー
ターTMd4とがハイブリダイズし、DNA断片TMD3に対応す
るDNA領域の一部が削除されるところを示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD5の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD5をHind III及びBamH Iで完全消化してTMD
5の約740bp DNA断片を単離した。一方、プラスミドpSV
2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD5と
をT4DNAリガーゼを用いて継ぎあせ、プラスミドpSV2TMD
5を得た。 実施例２ （プラスミドpSV2TMD5によるCOS−１細胞の形質転換） COS−１細胞（ATCC CRL1650）を培養器中に入れた10
％（v/v）のウシ胎児血清（以下“FCS"と略する）を加
えたダルベッコの最小必須培地（以下“MEM"と略する）
〔米国、フローラボラトリ（Flow Laboratories）社
製、カタログ番号10−331）を用いて、37℃で５％炭酸
ガスインキューベーター中で対数増殖期になるまで培養
し、0.1％トリプシン及び0.02％EDTAを用いて培養器に
付着増殖した細胞を培養器よりはがして、ハンクス平衡
塩類溶液〔米国、フローラボラトリー（Flow Laborato
ries）社製、カタログ番号17−101−22〕に約１×107個
/mlの濃度になるように懸濁した。 実施例１−（５）で得られたプラスミドpSV2TMD5を約
２μg/μｌになるように1mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）
に懸濁した。約10μｇのプラスミドpSV2TMD5を含む得ら
れたプラスミド懸濁液５μｌを1.5ml容量のエッペンド
ルフ型試験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得
られたCOS−１細胞の細胞懸濁液200μｌを入れて、０℃
で10分間放置した。試験管内の懸濁液を米国D.E.P.SYST
EM社製細胞融合装置FPH1001型のキュベットに移し、1.2
kVで40μ秒の条件で２回電気パルスを与えた。その後懸
濁液を再び元のエッペンドルフ型試験管に移し、０℃で
５分間放置した後、10％（v/v）FCSを加えたダルベッコ
のMEM10mlを以下のように用いて直径10cmの組織培養用
プレートに移した。即ち、少量の10％（v/v）FCSを含む
ダルベッコのMEMを懸濁液に加えてその混合物を組織培
養用プレートに移した。次いで、試験管を残りのダルベ
ッコのMEMで数回洗浄して洗浄液を同じプレートに加え
た。その後、プレートは５％CO2存在下37℃で24時間培
養した。 （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認） 培養終了後、プレートの培地をFCSを含まないダルベ
ッコのMEMに交換し、48時間培養した。培養上澄液を５
μｌ採取し、これを試料として参考例１に記載した方法
で、プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。 更に、直径10cmの組織培養用プレート１枚分の細胞を
米国コースター（Coaster）社製セルスクレイパー（Cel
l Scraper）（カタログ番号3010）を用いて掻き取って
集め、800rpm、10分間の条件で遠心分離して集める。こ
のペレットを試料として用いて参考例１に記載した方法
でプロテインＣの活性化を促進する作用を測定した。ま
たコントロールとしてはプラスミドpSV2−dhfrでトラン
スフォームしたCOS−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレ
ットを試料として用いた。結果を第１表に示した。表中
に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織培養用プレー
ト１枚分に換算したものである。 実施例３ （プラスミドpSV2TMD4によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD4によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第２表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例４ （プラスミドpSV2TMD2によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第３表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例５ （プラスミドpSV2TMD1によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD1によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第４表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例６ （プラスミドpSV2TMJ2によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMJ2を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMJ2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果、細胞ペレ
ットの試料が強いプロテインＣ活性化促進作用を示し、
生成したプロテインＣの量は約300ngであった。一方、
コントロールとして用いたプラスミドpSV2−dhfrでトラ
ンスフォームした細胞ではこの活性は検出されなかっ
た。 実施例７ （プラスミドpSV2TMD5によるCHO細胞の形質転換と形質
転換細胞における発現） 約４μｇのプラスミドpSV−２−neo（ATCC 3715
0）、及び約20μｇの実施例１−（５）で作成したプラ
スミドpSV2TMD5を混合してエタノール沈殿した。沈殿物
を風乾後、450μｌのTE（pH7.9、1mMトリス塩酸緩衝
液、0.1mM EDTA）に溶解し、500μｌの２×HBS（50mM
HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.12）を加
えた。次いで50μｌの2.5M CaCl2を滴下し室温に10分
間放置した。 一方、10％（v/v）FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレ
プトマイシン（米国、フローラボラトリー社製、カタロ
グ番号16−700−49）を含有するHam′sF−12培地（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号10−421−2
0）を用いて直径6cmの組織培養用プレートにプレート１
枚当たり細胞数約５×102程度播種したCHO−KI株（ATCC
CCLD 61）を１夜培養し、培地を新鮮な培地に交換
し、更に３時間培養した。このCHO−KIに前述のCaCl2を
滴下したプラスミドDNA溶液を重層し、37℃で約８時間
培養した。5mlのPBS（−）（米国、フローラボラトリー
社製、カタログ番号28−103−05）を用いて２回洗浄
し、さらに、5mlの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を
加えて約16時間さらに培養した。 プレートに付着した細胞を0.25％トリプシン、0.02％
EDTA溶液を用いてはがし、直径10cmの組織培養プレート
４枚に広げて培養した。24時間後、培地を選択培地に交
換した。選択培地の組成は前述の培地に400μg/mlにな
る様にジェネティシンＣ−418（GIBCO社製、米国、カタ
ログ番号860−1811）を添加したものである。３〜４日
おきに培地交換を行いながら約２週間培養して、トラン
スフォームした細胞をクローニングした。 この操作で得られた細胞のクローンをそれぞれ直径10
cmの組織培養プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。途中、培地のFCS濃度を10％から１％に減らし
た培地に切り換えて培養した。このFCS含有選択培地で
培養した培養液50μｌをとり、これを用いて参考例１に
記載した方法でプロテインＣ活性化を促進する作用を測
定したところ、強いプロテインＣ活性化促進作用が認め
られた。一方、コントロールとして用いたプラスミドpS
V2−neoだけでトランスフォームした細胞では本活性は
検出されなかった。 実施例８ （プラスミドpSV2TMD4によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD4によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例９ （プラスミドpSV2TMD2によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例10 （プラスミドpSV2TMD1によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD1によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例11 （プラスミドpSV2TMJ2によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） 約４μｇのプラスミドpSV−２−neo（ATCC 37150）
及び約20μｇの実施例１で作成したプラスミドpSV2TMJ2
を混合してエタノール沈殿した。沈殿物を風乾後、450
μｌのTE（pH7.9、1mMトリス塩酸緩衝液、0.1mM EDT
A）に溶解し、500μｌの２×HBS（50mM HEPES、280mM
NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.12）を加えた。次いで50
μｌの2.5M CaCl2を滴下し室温に10分間放置した。 一方、10％（v/v）FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレ
プトマイシン（米国、フローラボラトリー社製、カタロ
グ番号16−700−49）を含有するHam′sF−12培地（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号10−421−2
0）を用いて直径6cmの組織培養用プレートにプレート１
枚当たり細胞数約５×102程度播種したCHO−KI株（ATCC
CCLD 61）を１夜培養し、培地を新鮮な培地に交換
し、更に３時間培養した。このCHO−KIに前述のCaCl2を
滴下したプラスミドDNA溶液を重層し、37℃で約８時間
培養した。5mlのPBS（−）（米国、フローラボラトリー
社製、カタログ番号28−103−05）を用いて２回洗浄
し、さらに、5mlの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を
加えて約16時間さらに培養した。 プレートに付着した細胞を0.25％トリプシン、0.02％
EDTA溶液を用いてはがし、直径10cmの組織培養プレート
４枚に広げて培養した。24時間後、培地を選択培地に交
換した。選択培地の組成は前述の培地に400μg/mlにな
る様にジェネティシンＣ−418（米国GIBCO社製、カタロ
グ番号860−1811）を添加したものである。３〜４日お
きに培地交換を行いながら約２週間培養して、トランス
フォームした細胞をクローニングした。この操作で得ら
れた細胞のクローンをそれぞれ直径10cmの組織培養プレ
ートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、培
地のFCS濃度を10％から１％に減らした培地に切り換え
て培養した。 プラスミドpSV2TMJ2によって形質転換された細胞の産
生するペプチドのロンビンによるプロテインＣ活性化の
促進作用を細胞ペレットを試料として用いて測定したと
ころ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドpSV2−neoだ
けで形質転換した細胞及びその培養上澄液では本活性は
検出されなかった。 実施例12 （プラスミドpSV2TMD5によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（５）で作成したプラスミドpSV2TMD5をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD5のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD5−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD5
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約1,700bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
5−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアス（L.Covasrub
ias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981年）
に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプラス
ミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化して得た約2,96
0bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD5−１をBamH I及びH
ind IIIで完全消化して得た約2,600bpのDNA断片を挿入
してプラスミドpBRTMD5−１を得た。このプラスミドpBR
TMD5−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミドpB
PV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全消
化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD5−１を得た。以上
の工程を第15（ａ）図〜第15（ｂ）図に示す。 次に、実施例７に記載の方法に準じてpdBPVTMD5−１
でC127I細胞（ATCC CRL1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液５μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例13 （プラスミドpSV2TMD4によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（４）で作成したプラスミドpSV2TMD4をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD4のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD4−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD4
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約2,100bpの断
片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH I
で完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD4
−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら（L.Covasr
ubias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981
年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプ
ラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化して得た約
2,960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD4−１をBamH I
及びHind IIIで完全消化して得た約3,000bpのDNA断片を
挿入してプラスミドpBRTMD4−１を得た。このプラスミ
ドpBRTMD4−１をHind IIIで完全消化したものとプラス
ミドpBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで
完全消化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継い
で、C127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD4−１を得
た。以上の工程を第16（ａ）図〜第16（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD4−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
1700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cm
の組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して
培養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをと
り、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイン
Ｃ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認め
られた。一方、コントロールとして用いたプラスミドpB
PV−（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本
活性は検出されなかった。 実施例14 （プラスミドpSV2TMD2によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（３）で作成したプラスミドpSV2TMD2をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD2のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD2−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD2
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約2,200bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
2−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら（L.Covasr
ubias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981
年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプ
ラスミドpBR327をBamH IおよびHind IIIで消化して得た
約2,960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD2−１をBamH
I及びHind IIIで完全消化して得た約3,070bpのDNA断片
を挿入して、プラスミドpBRTMD2−１を得た。このプラ
スミドpBRTMD2−１をHind IIIで完全消化したものとプ
ラスミドpBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind II
Iで完全消化して得た断片とT4DNAリガーゼを用いて、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD2−１を得た。以上
の工程を第17（ａ）図〜第17（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD2−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBPV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例15 （プラスミドpSV2TMD1によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（２）で作成したプラスミドpSV2TMD1をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD1のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD1−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD1
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約3,100bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
1−１を得た。一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）
からコバスルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら
（L.Covasrubias et al）、ジーン（Gene）、13、2
5、（1981年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。
得られたプラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化
して得た約2,960bpのDNA断片にラスミドpUCTMD1−１をB
amH I及びHind IIIで完全消化して得たDNA断片を挿入し
てプラスミドpBRTMD1−１を得た。このプラスミドpBRTM
D1−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミドpBPV
−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全消化
して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C127
細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD1−１を得た。以上の
工程を第18（ａ）図〜第18（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD1−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBPV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例16 （プラスミドpSV2TMJ2によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（１）で作成したプラスミドpSV2TMJ2をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMJ2のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMJ2−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMJ2
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約4,100bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMJ
2−１を得た。一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）
からコバスルビアスらの方法〔エル コバスルビアス
（L.Covasrubias et al）、ジーン（Gene）、13、2
5、（1981年）に従ってプラスミドpBR327を作成した。
得られたプラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化
して得た約2960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMJ2−１
をBamH I及びHind IIIで完全消化して得たDNA断片を挿
入してプラスミドpBRTMJ2−１を得た。このプラスミドp
BRTMJ2−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミド
pBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全
消化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMJ2−１を得る。以上
の工程を第19（ａ）図〜第19（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMJ2−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び１（v/v％）ペニシリン−ストレプトマ
イシン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号
16−700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10
cmの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換し
て培養した。この培地で１日培養した後、培養した細胞
のペレットをかきとり、これを用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強い活性が認められた。一方、コントロールとして用
いたプラスミドpBPV−１（９−１）だけでトランスフォ
ームした細胞では本活性は検出されなかった。 実施例17 （本発明のペプチドの精製） 実施例７に記載した方法で培養したプラスミドpSV2−
neo及びプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームしたCHO
細胞を直径10cmの組織培養用プレート25枚で培養した。
培地は１日おきに４回新鮮な培地と交換した。この培養
液をすべて集め（約100ml）、pH7.5に調製した後DIP−
トロンビン−アガロースのカラムクロマトグラフィーに
かけて調製した。 即ち、エヌ エル エスモン（N.L.Esmon）ら〔ザ
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biol.Chem）、257巻、859頁（1982年）〕の方法に準じ
て作製したDIP−トロンビン〔ジイソプロピルホスホロ
トロンビン（diisopropylphosphoro−thrombin）を、ピ
ー クオトレカサス（P.Cuatrecasas）の方法〔ザ ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Bi
ol.Chem）、245巻、359頁（1970年）〕に準じてブロム
シアン化したアガロースに結合させてDIP−トロンビン
−アガロースを作製した。 次にDIP−トロンビン−アガロースを2.5cmφ×10cmの
大きさのカラムに充填してDIP−トロンビン−アガロー
スカラムを作製して室温で0.1M NaCl,0.5mM CaCl2、1
mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PX（半井
化学薬品社製、日本）を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（p
H7.5）でカラムを平衡化した。次いで上記の上澄液をカ
ラムに供した。カラムを0.3M NaCl、0.5mM CaCl2、1m
Mベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PXを含む
0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した後、1M Na
Cl、0.1mM EDTA、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/
v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
で溶出して2.0mlずつフラクションを集めた。溶出によ
って得られる各フラクションについて前記の方法でプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定した。同時に島津製作
所（日本）製スペクトロフォトメーターUV−240を用い
て各フラクションの波長280nmにおける吸光度（A280）
を測定した。活性のある画分を回収し、0.1M NaCl、0.
5mM CaCl2、0.5％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透析液を
２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマト
グラフィーに供した。 即ち、透析液を1.5cmφ×10cmの大きさのDIP−トロン
ビン−アガロースカラムに通し、0.4M NaCl、0.5mM C
aCl2、0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）で洗浄後、さらに0.4M NaCl、0.1mM
EDTA、0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス緩衝
液（pH7.5）で洗浄し、次いで1M NaCl、0.5mM EDTA、
0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）で溶出した。活性画分を回収し、精製品を−8
0℃で凍結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般
的な蛋白質の分子吸光係数にならない10.0（Ｅ１％ 1cm
・280nm＝10.0）と規定して、それに基づき精製品の量
を計算したところ約4.7μｇであった。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例18 プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約4.5μｇで
あった。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例19 プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇであ
った。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例20 プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇであ
った。 尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５−10％の
グラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ
単一のバンドのみ確認された。 実施例21 実施例11に記載した方法でプラスミドpSV2TMJ2及びプ
ラスミドpSV2−neoで形質転換したCHO細胞を直径10cmの
組織培養用プレート25枚を用いて培養した。培養後、培
養物を800rpmで10分間遠心分離にかけて細胞を集めた。
得られた細胞ペレットに、0.5％（v/v）トリトンＸ−10
0、0.25M庶糖、1mM、ベンズアミジン塩酸、0.5mM CaCl
2を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸濁
し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分間、５回
ホモジナイズして細胞抽出物を得た。得られた抽出物を
35,000g、10℃で60分間遠心分離にかけて上澄液を集め
た。この上澄液から実施例17に準じた操作により本発明
のペプチドの精製品を得た。この精製品を用い、波長28
0nmにおける吸光度を測定した。この精製品の分子吸光
係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならない10.0
（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、それに基づき
精製品の量を計算したところ約３μｇであった。 尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５−10％の
グラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ
単一のバンドのみ確認された。 実施例22 （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認） 精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促
進作用を次の方法にて評価した。即ち、0.1M NaCl、3.
6mM CaCl2、10mg/mlウシ血清アルブミンを含む0.02Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）に50μg/mlのプロテインＣ、5
nMのトロンビン及び5nMの精製した本発明のペプチドを
加えて37℃で反応させた。反応物に300μg/mlのアンチ
トロンビンIII（米国シグマ社製）および5mM EDTAを加
えて反応を停止して、生成した活性型プロテインＣの量
を前述の合成基質を用いる方法で測定した。結果を第30
図〜第34図に示すが、本発明のペプチドを無添加の場合
（Ｂ）では活性化プロテインＣの生成は認められなかっ
た（点線）が、本発明のペプチドを添加した場合（Ａ）
には、反応時間と共に生成した活性化プロテインＣの量
が増加した（実線）。 実施例23 （抗血液凝固作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲ
ンのフィブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に
阻害することはハインリッヒ アメルング社（独国）製
のコアギュロメーターKC−10を用いて血液凝固時間を測
定することによって調べた。即ち、5mM CaCl2、0.1M
NaClを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に3.0μｇ
のフィブリノーゲン（米国シグナル社製、フラクション
Ｉ）を加え、これに０−50nMの精製した本発明のペプチ
ドを加え、次いで、全量が0.4mlになるように10nMのト
ロンビンを加えて凝固時間を測定した。結果を第35図〜
第39図に示す。トロンビンにくらべ、添加した精製ペプ
チドの量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長
されることが確認された。 実施例24 （血小板凝集抑制作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実
質的に阻害することはSIENCO社（米国）製のプレートレ
ットアグリゴメーターを用いて評価した。即ち、30万ce
lls/μｌの血小板液（Platelet Rich Plasma、P.R.
P.）250μｌに１単位のトロンビン（約0.4μｇ）を加え
ると血小板が凝集するが、トロンビンを加える前にその
加えるトロンビンと等モル以上の精製した本発明のペプ
チドを加えておくと血小板の凝集が起きなかった。 〔適用例〕 以下に上記の各実施例で得られた種々の可溶性のペプ
チドの適用例を応用例をもって説明するが、本発明はそ
れら応用例により何ら限定されるものではない。 応用例１ 精製した本発明のペプチド 10 mg 精製ゼラチン 20 mg マンニトール 100 mg 塩化ナトリウム 7.8mg リン酸（１及び２）ナトリウム 15.4mg 上記成分を注射用蒸留水2mlに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−35℃で２時間予備凍
結し、−35℃で真空度0.075Torrで35時間一次乾燥し、
次いで30℃、真空度0.03Torrで５時間二次乾燥して、注
射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前
に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液500mlに溶解さ
れ、その溶解度は、点滴静注するのに用いられる。 応用例２ 精製した本発明のペプチド 2.5 mg アルブミン ５ mg マンニトール 25 mg 塩化ナトリウム 1.95mg リン酸（１及び２）ナトリウム 3.85mg 上記成分を注射用蒸留水2mlに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解度を、無菌バイアルに入れ、−35℃で２時間予備凍
結し、−35℃で真空度0.075Torrで35時間一次乾燥し、
次いで30℃、真空度0.03Torrで５時間二次乾燥して、注
射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前
に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液500mlに溶解さ
れ、その溶解液は、点滴静注するのに用いられる。 〔発明の効果〕 本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、血小板凝集抑
制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の少ない循環器
系疾患などの治療用薬として極めて有用な物質である。
また、本発明のペプチドは、このような医薬用途以外
に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテーテルなどの
医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防止する薬剤
といて用いることができる。
インＣ活性化を促進する作用を有する新規なペプチドに
関する。更に詳しくは、本発明は血栓溶解作用、抗血液
凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有し、したがって、
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として、循環器系の疾患の治療に有
用なペプチドに関する。本発明は、また、その新規なペ
プチドをコードするデオキシリボ核酸（以下“DNA"と称
する）、該DNAを含有する複製可能な組換え体DNA、該組
換えDNAで形質転換された微生物または細胞及び組換えD
NA技術による該ペプチドの製造方法に関連する。本発明
は、また、該ペプチドを含有する医薬組成物、詳しくは
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として有用な医薬組成物に関連す
る。 本明細書において、アミノ酸及びペプチドは下記に示
すIUPAC−IUB生化学命名委員会（CBN）で採用された略
号を用いて表される。なお、アミノ酸などに関し光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。更に、特に明示しない限りペプチドのアミ
ノ酸配列の左端及び右端はそれぞれＮ末端およびＣ末端
である。 Gln:グルタミン残基 Asp:アスパラギン酸残基 Pro:プロリン残基 Tyr:チロシン残基 Val:バリン残基 Lys:リジン残基 Glu:クルタミン酸残基 Ala:アラニン残基 Asn:アスパラギン残基 Leu:ロイシン残基 Phe:フェニルアラニン残基 Gly:グリシン残基 His:ヒスチジン残基 Ser:セリン残基 Thr:スレオニン残基 Ile:イソロイシン残基 Trp:トリプトファン残基 Arg:アルギニン残基 Met:メチオニン残基 Cys:システイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチドは下記の如き略号で表されるデオキシリボヌ
クレオチドの配列により表記する。 A:2′−デオキシアデニル酸残基 C:2′−デオキシシチジル酸残基 G:2′−デオキシグアニル酸残基 T:チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の
左端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。 〔従来の技術〕 現在、血栓溶解剤として用いられるものには、ストレ
プトキナーゼやウロキナーゼがある。また、抗血液凝固
剤としてはヘパリンやワーファリンが用いられている。
さらに、血小板凝集抑制剤としてはアスピリン、スルフ
ィンピラゾン、ジリダモール等が使われている。これら
の血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は、それぞれ別個に、あるいは併用して、例えば、心筋
梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬
化症、血管内血液凝固症候群（DIC）、狭心症、一過性
脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患の治療及び予防に用い
られている。しかしながら、これらの血栓溶解剤、抗血
液凝固剤および血小板凝集抑制剤は非常に複雑な機構か
ら成り立つ血液の凝固線溶系の極く一部に作用するにす
ぎない。そこで、血液の凝固線溶系に広く作用し、優れ
た血液凝固抑制作用を示す薬剤が要望されていた。 ところで、血液凝固機構において重要な役割を演じて
いるビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテインＣが知
られている。近年、そのプロテインＣの活性化を促進
し、トロンビンの作用による血小板の活性化とフィブリ
ン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの肺、ヒト
の肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬剤に比べ
て優れた血液凝固抑制作用を有することが報告されてい
る。ウサギ肺に存在する物質については、例えば、シー
ティー エスモン（C.T.Esmon）ら、プロシーディン
グ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、78巻、22
49頁（1981年）；エヌ エル エスモン（N.L.Esmon）
ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、257巻、859頁（1982年）；シー
ティー エスモン（C.T.Esmon）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、257巻、7944頁（1982年）；エヌ エル エスモ
ン（N.L.Esmon）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258巻、12238
頁（1982年）を参照することができる。 ウシの肺に存在する物質については、例えば楠本ら、
生化学、56巻、890頁（1984年）を参照することができ
る。また、ヒト胎盤に存在する物質については、例えば
特開昭60−199819;黒沢ら、日本血液学会誌、47巻、632
頁（1984年）；エッチ エッチ サーレム（H.H.Sale
m）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、259巻、12246頁（1984年）；エ
ス．クロサワ（S.Kurosawa）ら、トロンボシス リサー
チ（Thrombosis Research）、37巻、353頁（1985年）
を参照することができる。また、ヒト肺に存在する物質
については、例えば楠本ら、生化学、57巻、1102頁（19
85年）を参照することができる。 上記の先行技術文献には上記物質の一般的性質が記載
されているが、その物質の構造、例えばアミノ酸配列な
どは解明されておらず、未だにその物質は同定されてい
ない。従って、上記の先行技術文献に報告されている物
質が単一物質であるか否か、また、これらの先行技術文
献の記載にしたがって同一の物質が繰返し得られるか否
かについては全く不明である。さらにまた、上記の先行
技術文献に報告されている物質は、細胞膜上に存在する
ものであり、界面活性剤の非存在下では不溶性であっ
て、循環器疾患の治療などの医薬組成物として用いる場
合にはそのままでは投与量を多くすることができないも
のであり、そもそも生体由来であることから十分な量が
確保できず、その物質が本当に医薬として使用できるも
のであるか否かの検討さえも出来ない状態であった。 また注射剤とする場合に不溶物が存在することは、循
環器疾患を有する患者において致命的であることから、
界面活性剤の添加を必須とするが、上記の問題を有する
患者にとって界面活性剤の添加は予想外の問題を引き起
こす可能性は否定できず、好ましいものではない。ま
た、一部には細胞膜上に存在する以外の形態、例えば尿
中に存在する旨の開示があるが、その活性や作用、性質
の検討が不十分であり、ましてやアミノ酸配列等の構造
についての解析は全くなく、いずれにしてもそもそも医
薬として使用できる硬化と安全性を有し、しかも医薬と
して常に安定的に供給され得る物質との位置づけをする
ことはできないものであった。 〔発明が解決しようとする課題〕 従来より、血液凝固を制御するための、または血小板
凝集を制御するためのさらに有用なペプチドの提供が求
められていた。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、上述の技術的背景にあって、血液の凝
固線溶系の一因子であるプロテインＣを活性化して血液
凝固を抑制するだけでなく、線溶作用を増進する物質を
見出すべく鋭意研究を重ねた結果、意外にも、後述する
ように特定のアミノ酸配列を有するペプチドが、従来知
られていない新規物質であって、トロンビンに結合し、
且つトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進して血
液凝固を制御することができるだけでなく、線溶を促進
することができ、血液凝固を制御する薬剤、即ち、血液
凝固を制御するための、または血小板凝集を制御するた
めの医薬組成物として有用であることを見出した。また
該ペプチドをコードするDNAを単離し、更にまた、その
ペプチドが、組換えDNA技術によって、好ましくは他の
ヒト由来蛋白をまったく含まない純粋な形態で、大量に
かつ容易に製造でき、しかも該ペプチドが可溶性であっ
て、医薬組成物自体やその製造において顕著に好ましい
性質を有することを見出した。本発明は、これらの知見
に基づいて完成したものである。 即ち本発明によれば、少なくともアミノ酸配列とし
て、配列番号３の１−498のアミノ酸配列からなるトロ
ンビンに結合し、トロンビンによるプロティンＣの活性
化を促進する作用を有するペプチドが提供される。 本発明のペプチドがトロンビンに結合することは、例
えば、本明細書実施例に記載されているように、DIP−
トロンビン〔ジイソプロピルホスフォロトロンビン（di
isopropylphosphoro−thrombin）、またはDIP−トロン
ビン−アガロースに結合することにより確認される。ま
た、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
活性を有することも、本明細書実施例に記載されている
通りである。 本発明のペプチドは、トロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する活性物質として検知され、回収され
る。通常本活性は、試料を0.15M食塩、2.5mM塩化カルシ
ウム、1mg/ml血清アルブミンを含有するpH7.4の20mMト
リス塩酸緩衝液中にトロンビン及びプロテインＣの存在
下添加し、生成される活性化プロテインＣの量を定量し
評価される。従って、本発明のペプチドは、上記緩衝液
中に少なくとも検知され得る濃度まで可溶性であるし、
界面活性剤の非存在下でそれ以上の十分に濃い濃度の注
射用水溶液となり得る性質を有する可溶性ペプチドであ
る。このように可溶性であるペプチドを用いると、医薬
組成物として極めて有用であることは既に述べた通りで
あるが、例えば、従来の物質においては、界面活性剤の
非存在下では不溶性であり、不溶物が存在する注射剤と
しないために界面活性剤の添加を必須とするが、種々の
問題を有する循環器疾患の患者において、この界面活性
剤の添加は予想外の問題を引き起こす可能性は否定でき
ないし、また界面活性剤の添加量との兼ね合いもあっ
て、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤が調製できない
可能性もあることが考えられるが、これに対し、本発明
のペプチドは、可溶性であるが故に、これらの問題にこ
とごとく解決されるものである。また、医薬組成物を製
造する場合においても、本発明の可溶性であるペプチド
が極めて有利であることは当然のことであって、例え
ば、精製が容易であること、製剤にするときに凍結乾燥
等が容易であること等が挙げられる。 本発明のペプチドは、トロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、
界面活性剤の非存在下で可溶性であるが、類似のペプチ
ドを挙げると以下の通りである。例えば、配列番号１の
１−118のアミノ酸配列、即ち、下記式（Ｉ）： で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、最も好
ましい例であって、上記の活性に程度の差があっても、
上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）で表される
アミノ酸配列に拘泥する必要はない。即ち、これらのペ
プチドは実質的に前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
から成っていてもよいし、また、その作用と機能を阻害
しない限り若干の欠損、置換等があっても、式（Ｉ）で
表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端に結
合した少なくとも１種の他のペプチドのアミノ酸配列を
更に含有してもよい。 因みに、これらの更に具体的なペプチドの例として
は、（１）上記式（Ｉ）のペプチドの他、下記のペプチ
ドの（２）〜（５）が挙げられる（但し、配列番号３の
１−498のアミノ酸配列である）。 （２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端に下記
のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−236
のアミノ酸配列）。 （３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ
末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−172
のアミノ酸配列）。 （４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ
末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−498
のアミノ酸配列）。 （５）配列番号14の１−462のアミノ酸配列、即ち、 からなるペプチドである。 本発明のペプチドは少なくとも１個の糖残基を含有し
ていてもよいし、含有していなくてもよい。即ち、本発
明では少なくともアミノ酸配列として、本明細書に説明
された配列であることを示すものであって、特に糖残基
により限定されるものではない。 本発明のペプチドを製造するに当たっては、例えば、
以下の方法により遺伝子操作技術を用いることが好まし
い。この遺伝子操作技術に用いる遺伝子としては、本明
細書に開示されるペプチドを製造することができれば特
に限定されず、本明細書で開示されたペプチドをコード
する遺伝子を用いればよい。この場合に、提供される好
ましい本発明のペプチドは、実質的に他のヒト成分を含
まない精製された組換ペプチドであることを特徴とする
ペプチドである。 本発明における好ましい遺伝子を例示すれば、配列番
号５の１−1494の塩基配列、または遺伝暗号の縮重に基
づき少なくとも１個の塩基が置換されている塩基配列が
挙げられる。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子の
塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置
換することができる。従って、本発明のDNAはまた、遺
伝略号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前に
定義したアミノ酸配列と一致する。 また前述の類似するペプチドに関する塩基配列を参考
のために挙げれば以下の通りである。 例えば、次式（II）（即ち、配列番号４の１−354の
塩基配列）： で表される塩基配列を含有するDNAである。 また、このDNAは前記式（II）で表される塩基配列
と、その５′末端および／または３′末端に結合した少
なくとも１種の他の塩基配列とを含有していてもよい。
式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種の他の塩
基配列とを含有するDNAの例としては下記のDNA（１）〜
（５）が挙げられる（なお、配列番号５の１−1494の塩
基配列は本発明の塩基配列である）。 （１）上記式（II）で表されるDNA（即ち、配列番号４
の１−354の塩基配列）。 （２）式（II）で表される塩基配列とその５′末端に結
合した次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号９の１−708の塩基配列）。 （３）式（II）で表される塩基配列の５′末端および
３′末端に夫々次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号11の１−816の塩基配列）。 （４）式（II）で表される塩基配列の５′末端および
３′末端に夫々次式： で表される塩基配列が結合してなるDNA（即ち、配列番
号５の１−1494の塩基配列）。 （５）配列番号15の１−1386の塩基配列、即ち、 からなるDNAである。 本発明のDNAは、例えば、以下のようにして得ること
ができる。 （１）トロンビンのプロテインＣ活性化を促進すること
のできるヒト肺由来のペプチドに特異的な、ウサギから
得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製したcDNAライブ
ラリーからその抗体と結合するペプチドをコードするcD
NA断片を単離し、単離したcDNA断片の塩基配列を分析す
る。得られたcDNA断片はトロンビンのプロテインＣ活性
化を促進することのできるヒト肺由来のペプチドの一部
分をコードしている。その部分はそのペプチドのＣ末端
を含むがＮ末端を含まない。 （２）上述のように、得られたcDNA断片はヒト肺由来の
ペプチドの全アミノ酸配列をコードしておらず、そのペ
プチドのＮ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列を欠い
ているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコードするcDNA断片
を上記工程（１）で得られるcDNA断片を利用して通常の
公知のプライマーエクステンション法により以下のよう
にして得る。 まず、上記工程（１）で得られたcDNA断片のコードす
るペプチドのＮ末端側のアミノ酸配列に対応するcDNA断
片の一部分を有機化学合成する。次に、合成したDNAを
プライマーとして用いて通常の公知のプライマーエクス
テンション法によりヒトさい帯内皮細胞より調製したポ
リ（Ａ）+RNAから上記工程（１）で得られるcDNA断片の
５′末端の上流の塩基配列を有するcDNA断片を得る。上
記プライマーエクステンションを繰り返すことによりヒ
ト肺由来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードする
cDNA断片を得る。 （３）次に、前記工程（１）及び（２）で得られたcDNA
断片を適宜結合することにより、開始コドンから始まる
1725塩基対（以下“bp"と略する）のオープンリーディ
ングフレームを含有するcDNA（以下“cDNA−A"と略す
る）を得る。このオープンリーディングフレームの塩基
配列は、配列番号10の１−1725の塩基配列である。また
リーダー配列をコードする塩基配列を除外し、ヒト肺由
来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列からの塩基配列とす
れば、配列番号12の１−1671の塩基配列となる。 このcDNA−Ａから、前述のDNA（１）〜（５）の塩基
配列と実質的に同等の塩基配列を有するcDNAは、以下の
部分を位置特異的変異法で削除することによって得るこ
とができる。 （ｉ）DNA（４）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するに当たっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて1549番目から1725
番目の塩基までの部分である。 （ii）DNA（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて1441番目から1725
番目の塩基である。 （iii）DNA（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から732番
目および1549番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 （iv）DNA（２）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から732番
目および1441番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 （ｖ）DNA（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列
を含有するcDNAを調製するにあたっては、削除する部分
としては、前記のオープンリーディングフレームにおけ
る開始コドンの最初の塩基から数えて55番目から1086番
目および1441番目から1725番目の塩基までの部分であ
る。 このようにして得られた各cDNAの塩基配列は公知の方
法で分析して、DNA（１）〜（５）の塩基配列とそれぞ
れ一致することを確認する。 上記本発明のDNAは有機化学合成することによっても
得ることができる。また、本発明のDNAは前述のプライ
マーエクステンションを行うことなく、前駆体DNAから
調製することもできる。前駆体DNAは、前記工程（１）
で得られるDNA断片またはそのDNA断片の塩基配列に基づ
いて調製した合成DNAをプローブとして用いる通常のハ
イブリダイゼーション法によってヒト染色体DNAライブ
ラリーから得ることができる。 前述の如く、式（II）の塩基配列を含有する本発明の
DNAは次式： で表されるようなリーダー配列をコードする塩基配列を
５′末端塩基配列として含有していてもよく、通常細胞
等での発現においてこのリーダー配列の全部又は一部は
削除され得る。 本発明によれば、上記DNAと相補的なDNAもまた提供さ
れる。本発明によれば、上記DNAとそれに相補的なDNAが
互いに相補的に結合して２重鎖DNAを形成していてもよ
い。 遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子の
塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置
換することができる。従って、本発明のDNAはまた、遺
伝略号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列
を含有することも可能である。この場合、上記置換によ
り得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前に
定義したアミノ酸配列と一致する。すなわち、本発明は
前述の種々のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA
またはその相補的DNAである。 更にまた、本発明によれば、前記の本発明のDNAと複
製可能な発現ベクターとからなる複製可能な組換え体DN
Aが提供される。該組換え体DNAは、それによって形質転
換された微生物または細胞中で、本発明のペプチドを発
現することができる。適したベクターの例としては、プ
ラスミドpBR322、pBR327、YRp7、pSV2−dhfr（ATCC 37
146）、pBPV−１（９−１）（ATCC 37111）などが挙げ
られる。尚、発現ベクターは宿主として使用する微生物
または細胞に適したものを選択する必要がある。 更に本発明はまた、上述の複製可能な組換え体DNAで
形質転換された微生物または細胞に関する。微生物の例
としては、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）
の菌株、例えばイー コリ（E.coli）K12株294（ATCC
31446）、イー コリ（E.coli）Ｂ、イー コリ（E.col
i）X1776（ATCC 31537）、イー コリ（E.coli）C600
およびイー コリ（E.coli）C600hfl並びにイー コリ
（E.coli）W3110（Ｆ−、λ−、プロトトロフィック、A
TCC 27375）；バチラス サブチリス（Bacillus subt
ilis）の如きバチラス（Bacillus）属の菌株；サルモネ
ラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）また
はセラチア マーセサンス（Serratia marcesans）等
の大腸菌以外の腸内菌；シュードモーナス（Pseudomona
s）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられる。
細胞の例としては、VERO（ATCC CCL−81）細胞、HeLa
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、W13
8、BHK、COS−７およびMDCK細胞膜等の動物細胞が挙げ
られる。 前述の配列番号７の１−575のアミノ酸配列をコード
する遺伝子は、生体内では、血管内皮細胞膜上に次式の
一次構造（即ち、配列番号13の１−557のアミノ酸配
列）で発現される。 また上記遺伝子をCOS細胞、CHO細胞またはC127細胞で
遺伝子工学的に発現させた場合も、同様にそれら細胞膜
上に発現・濃縮され、培養液中には活性が検知されない
ので、トリトンＸ−100等の界面活性剤の存在下調製す
るが、本発明のペプチドは、分泌され得る形態で培養液
中に可溶物として検知・回収できる。勿論、界面活性剤
の存在下で精製することも可能であり、本発明の実施例
に示される通り、界面活性剤の存在下で精製し、界面活
性剤を含有するペプチドを取得することもできる。 本発明のペプチドを製造する方法は、例えば以下の方
法が好ましい例として挙げられるが、他の方法によるこ
とも本発明が達成される限り特に限定されない。 （ａ）前述のペプチドをコードするDNAと複製可能な発
現ベクターに連結して、該DNAと該複製可能な発現ベク
ターとからなる複製可能な組換え体DNAを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体DNAで微生物または細胞を
形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該DNA
を発現させて該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離する。 本発明の方法によれば、前述の本発明のDNAが正しく
転写し、それによって得られるmRNAからの翻訳が正しく
行われるように本発明のDNAを複製可能な発現ベクター
のプロモーターなどのDNA領域の下流に組入れて該DNAを
有する複製可能な組換え体DNAを得、得られた該組換え
体DNAで微生物または細胞を形質転換させて該組換え体D
NAを含有する形質転換体を得る。得られた形質転換体
は、該組換え体DNAに与えられた表現型によって微生物
または培養細胞の親細胞から単離される。得られた形質
転換体を培養して前記DNAの有する遺伝情報を発現させ
て本発明のペプチドを製造する。 尚、本発明のDNA及び組換え体DNAを構築するために必
要なDNA配列、例えばプロモーターや複製起源等をクロ
ーニングするためには原核細胞を宿主として用いる宿主
−ベクター系を使用するのが好ましい。原核細胞の例と
してはエシェリヒア コリ（Escherichia coli）の菌
株、例えばイー コリ（E.coli）K12株294（ATCC 3144
6）、イー コリ（E.coli）Ｂ、イー コリ（E.coli）X
1776（ATCC 31537）、イー コリ（E.coli）C600およ
びイー コリ（E.coli）C600hfl並びにイー コリ（E.c
oli）W3110（Ｆ−、λ−、プロトトロフィック、ATCC
27375）；バチラス サブチリス（Bacillus subtili
s）の如きバチラス（Bacillus）属の菌株；サルモネラ
チフィムリウム（Salmonella typhimuriumu）または
セラチア マーセサンス（Serratia marcesans）等の
大腸菌以外の腸内細菌；シュードモナス（Pseudomona
s）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）などが挙げられる。 これらの細菌のうち、エシェリヒア コリ（E.coli）
K12株294が最も好ましい。上記微生物を宿主として使用
する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが
組換え体DNAの複製可能な発現ベクターとして一般に用
いられる。例えば大腸菌を形質転換するためのプラスミ
ドベクターとしてはプラスミドpBR322やpBR327などを用
いることができる。プラスミドベクターは通常複製起
源、プロモーター、および組換え体DNAで形質転換した
細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体DNAに与え
るマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例と
しては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ
ー、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マー
カー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテ
トラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。 一方、本発明のDNAを発現して本発明のペプチドを製
造するためには、上記の原核細胞を宿主として用いる宿
主−ベクター系および脊椎動物の細胞などの真核生物の
細胞を宿主細胞として用いる宿主−ベクター系を使用す
ることができる。真核細胞の例としては前述の動物の細
胞株などの細胞が挙げられる。本発明のDNAを前述の真
核細胞で発現させるために、本発明の組換え体DNAは一
般に遺伝子発現を制御するための機能配列、例えば、複
製起源、本発明のDNAの上流に位置すべきプロモータ
ー、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位や転写終
止配列を含有している。本発明のDNAを真核細胞内で発
現させるのに用いることのできるそのような機能配列は
ウィルスやウィルス性物質から得ることができる。 例えば、本発明で用いることのできるプロモーター
は、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、シミアン
ウィルス40（SV40）などから得ることができる。特に、
アデノウィルス２の主後期プロモーターやSV40の初期お
よび後期プロモーターが好ましい。また、トロンビンの
プロテインＣ活性化を促進する作用を有するヒト肺由来
のペプチドをコードする遺伝子の上流の位置に本来存在
するプロモーターも、上述の宿主−ベクター系で使用す
るのに適しているならば使用することができる。 複製起源については、外来性の起源、例えば、アデノ
ウィルス、ポリオーマ、SV40、水痘性口内炎ウィルス
（VSV）、ウシ乳頭腫ウィルス（BPV）等のウィルス由来
の複製起源を用いることができる。また、発現ベクター
として宿主染色体に組み込まれるような性質を有するベ
クターを用いる場合、宿主染色体の複製起源を利用する
ことができる。 本発明の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微
生物または細胞は、前述のとおり、組換え体DNAに与え
られた少なくとも１種の表現型によって形質転換されず
に残った親細胞から選別される。表現型は少なくとも１
種のマーカー遺伝子を組換え体DNAに挿入することによ
って与えることができる。また複製可能な発現ベクター
が本来有しているマーカー遺伝子を利用することもでき
る。マーカー遺伝子の例としては、例えば、ネオマイシ
ン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（以下“DHFR"と称する）をコードする遺伝子などが
挙げられる。これに関し、DHFR遺伝子をマーカー遺伝子
として用いる場合、DHFRには様々のタイプがあるため、
その使用するマーカー遺伝子のコードしているDHFRのタ
イプによって用いるべき宿主を選択しなければならな
い。例えば、マーカー遺伝子として野生型DHFRをコード
する遺伝子を用いる場合、宿主としてはDHFR欠損株を用
いるのが好ましい。DHFR欠損株はヒポキサンチン、グリ
シン及びチミジンを要求するので、ヒポキサンチン、グ
リシン及びチミジンを含まない培地中では成育できな
い。 しかしながら、DHFR欠損株をDHFR遺伝子を含有する組
換え体DNAで形質転換すると、その株はもはやヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンを要求しなくなり、ヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを含まない培地中で
も成育することができる。従って、形質転換細胞は、ヒ
ポキサンチン、グリシン及びチミジンについての栄養要
求性を判断基準にして形質転換されないで残った細胞か
ら容易に選択することができる。 一方、メトトレキセート（MTX）に対する親和性の低
い変異体DHFRをコードする遺伝子（以下“MTX耐性DHFR
遺伝子”と称する）をマーカー遺伝子として用いる場合
には、宿主細胞は正常なDHFRをコードする遺伝子を有し
ていればよくDHFRを欠損している必要はない。その理由
は以下のとおりである。正常DHFRはMTXによって阻害さ
れるため、正常DHFRをコードする遺伝子を含有する宿主
細胞はMTXの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及び
チミジンを要求する。しかしながら、その宿主細胞がMT
X耐性DHFR遺伝子を含有する組換え体DNAで形質転換する
と形質転換細胞はMTX存在下においてももはやヒポキサ
ンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従って、
形質転換細胞は、MTX存在下におけるヒポキサンチン、
グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準
として用いて形質転換されていない細胞から選択するこ
とができる。これに関し、真核細胞の大多数がMTX感受
性であるのでMTX耐性DHFR遺伝子はマーカー遺伝子とし
て用いるのに好都合である。 サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerev
isiae）などの酵母も本発明のDNAを発現するための宿主
として用いることができる。酵母で本発明のDNAを発現
するためには複製可能な発現ベクターとして例えばプラ
スミドYRp7を用いることができる。プラスミドYRp7はtr
p1遺伝子を含有しており、このtrp1遺伝子をマーカー遺
伝子として利用することができる。 酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例として
は、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの解糖系に
関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファ
ターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース及びラク
トースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
が挙げられる。これらのうち、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒
素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びラク
トースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロモーター
は、これらのプロモーターによる転写を宿主の培養条件
を変えることによって制御することができるので有利で
ある。 酵母細胞中における転写や翻訳を制御するための複製
起源や終止コドンおよびその他のDNA配列としては、酵
母細胞に適している通常の公知のDNA配列を用いること
ができる。形質転換した微生物または細胞は通常の栄養
培地を用いて通常の公知の方法で培養することにより本
発明のペプチドをコードするDNAを発現して本発明のペ
プチドを製造することができる。培養後、本発明のペプ
チドは形質転換体の培養物から通常の公知の方法、例え
ばカラムクロマトグラフィーなどを用いて単離すること
ができ、本明細書の記載に従って、本発明の医薬組成物
として使用できる程度に実質的に精製されることが通常
行われる。このようにして得られたペプチドは、アミノ
酸配列が同一であるのであれば、様々な種類と長さの糖
鎖を少なくとも１種含有していてもよいし、また勿論、
類似する他のペプチドとの混合物として用いてもよい。
得られたペプチドが糖鎖を含有しているか否かは用いる
宿主細胞の種類によって異なる。また、ペプチドが糖鎖
を含有している場合の糖鎖の種類や長さも用いる宿主細
胞の種類によって異なる。 一般に翻訳開始シグナルのATGから翻訳されたペプチ
ドは宿主細胞から分泌されるときにプロセッシングを受
けて成熟蛋白になることが知られている。本発明のペプ
チドの場合もそのようなプロセッシングを受けることが
ある。ペプチドがプロセッシングを受ける部位は、宿主
により、または培養条件により変化する場合がある。例
えば、本発明のペプチドが、式（Ｉ）で表されるペプチ
ドとＮ末端アミノ酸配列として前述の18個のアミノ酸か
らなるリーダー配列とを含むプロセッシングを受けてい
ない未成熟形で形質転換細胞中で産生される場合、その
未成熟形ペプチドはプロセッシングを受けてリーダー配
列が削除されて成熟形となることがある。しかしなが
ら、前述のように未成熟形ペプチドのプロセッシングを
受ける位置は使用する宿主の種類や宿主の培養条件によ
り変化するので必ずしも上記のようなプロセッシングが
起きるとは限らない。 前述のとおり、本発明のトロンビンによるプロテイン
Ｃの活性化を促進する作用を有するペプチドは組換えDN
A技術を用いる方法により製造することができる。ま
た、本発明のペプチドは通常の公知の方法により、例え
ば市販の自動ペプチド合成装置などを用いて有機合成に
より製造することもできる。本発明のペプチドはトロン
ビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用を有す
る。プロテインＣは血液凝固線溶機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロ
ンビンの作用により活性化される。活性型プロテインＣ
は、生体内で血液凝固系補酵素の活性型第Ｖ因子、およ
び活性型第VIII因子を失活させ、また血栓溶解作用を有
するプラスミノーゲンアクチベーターの産生に関与して
いることが知られている。〔鈴木宏治、医学の歩み、第
125巻、901頁（1983年）〕。本発明のペプチドは、この
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血
液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを
大量に産生せしめるものである。従って、本発明のペプ
チドは生体における抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄
与するものである。 前述のように、本発明の医薬組成物は抗血液凝固作用
と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有するので、
血液凝固を制御するための、または血小板凝集を制御す
るための医薬組成物として用いることが可能であり、具
体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血
管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群
（DIC）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の
疾患の治療及び予防に用いることができる。 本発明の医薬組成物となすに際しては、本発明のペプ
チドと、薬剤として使用可能な担体とを混合すればよ
い。即ち、上記の疾患を治療または予防するのに有効な
量の本発明のペプチドを適当な量の担体と混ぜて、患者
に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調製するこ
とができる。薬剤として使用可能な担体としては、例え
ば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースな
どが例示される。また本発明の医薬組成物としては、凍
結乾燥された製剤となすことが好ましい。また本発明の
医薬組成物は注射用製剤として用いることが好ましい。
さらには、点滴静注用製剤とすることが好ましい。注射
剤として用いる場合に、上記の担体は、薬剤として投与
可能であり、且つ注射可能な溶液となり得る担体である
ことが好ましく、この担体としては、ショ糖、精製ゼラ
チン、アルブミン、マンニトール、ブドウ糖および塩化
ナトリウムからなる群より選ばれた１種以上が例示さ
れ、また各種無機塩のpH調整剤などを添加することも好
ましい例として挙げられるが、その場合には医薬組成物
全体として可溶性であり、且つ綺麗に凍結乾燥が可能で
あって、好ましい。また本発明においては、上記担体
が、グリセリンであることもまた好ましい。上記の担体
は、製剤を調製する際に添加することが好ましいが、用
時に溶解された際において添加されることも許されるも
のである。 本発明のペプチドの成人１回当たりの投与量は年齢、
性別、体重、症状等により異なるが、一般に約0.1〜200
mgであり、一日当たり一回または必要に応じて数回、注
射、好ましくは点滴静注により投与する。本発明者ら
は、本発明のペプチドが副作用の少ない極めて有用なも
のであることを確認しており、例えば、動物実験でラッ
トiv投与において約3mg/Kgで全く死亡例や害を生ずるこ
とがなく、有効な作用も認められることから、ヒトの体
重を約60〜70Kgと考えて上記の投与量が妥当なものとし
て提示される。 〔実施例〕 本発明をより詳細に記述するために参考例及び実施例
により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例にの
み限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定） 本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の
測定は、合成基質Boc−Leu−Ser−Thr−Arg−MCA（Boc
及びMCAはそれぞれｔ−ブトキシカルボニル基及び４−
メチルクマリル−７−アミドの略称である）を用いる公
知のプロテインＣ測定法〔ワイ オーノ（Y.Ohno）ら、
ザ ジャーナル オブ バイオケミストリー（J.Bioche
m.）90巻、1387頁（1981年）〕に従って行なった。すな
わち、プロテインＣ（最終濃度0.5μＭ）およびトロン
ビン（最終濃度80nM）を含有する水溶液５μｌに本発明
のペプチドを含む水溶液５μｌ（０〜0.01 A280/ml）
を加え、これにNaCl、CaCl2、血清アルブミン及びトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.4）をそれぞれ最終濃度が0.15M、2.
5mM、1mg/ml及び20mMになるように、そして全量が30μ
ｌとなるように加えた。 得られた混合物を37℃で15分間反応させてプロテイン
Ｃを活性化した後に２μＭのアンチトロンビンIIIを10
μｌ及び10単位/mlのヘパリンを含有する水溶液を10μ
ｌ加えて37℃で15分間加温して反応を停止させた。得ら
れた反応混合物に、前述の合成基質Boc−Leu−Ser−Thr
−Arg−MCA〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会
（Peptide Institute）製、日本〕200μＭを含む20mM
トリス塩酸緩衝液（pH7.4）250μｌを加え、37℃で10分
間反応させた後、20％酢酸0.5mlを加えて反応を停止さ
せ、遊離してきたAMC（７−アミノ−７−メチル−クマ
リン）の濃度を励起波長380nm、発光波長440nmで蛍光分
光光度計RF−540型（島津製作所製、日本）により測定
した。得られた蛍光強度を既知濃度のAMCの蛍光強度と
比較して、遊離したAMC量を求めた。値は１分間当りに
生成するAMC量で表わす。このAMC量から本発明のペプチ
ドを含まない水溶液を加えたときのAMC量を引いた値が
サンプルのトロンビンによるプロテインＣ活性香を促進
する強さを示す。 ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木らの方法
〔鈴木（Suzuki）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）、258巻、1914
頁（1983年等）〕で精製した。 また、ヒトトロンビンはランドブラッド（Lundblad）
らの方法〔ランドブラッド（Lundblad）ら、バイオケミ
カル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーション（Biochem.Biophys.Res.Commun.）66巻、482
頁（1975年）〕で精製した。 参考例２ （１）：ヒト肺cDNAライブラリーの入手 ヒトの肺のポリ（Ａ）+RNAより調製したバクテリオフ
ァージλgt11cDNAライブラリーは、米国、クローンテッ
ク社（Clontech Laboratories,Inc.、922 Industria
l,Ave.Palo Alto,CA94303）より購入した（カタログ番
号HL1004）。 （２）：トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進す
る作用のあるグリコペプチドの精製 プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプ
チドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公
立病院より提供されたヒト肺標本約800gを鋏で約1cm四
方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に1mM
のDFP（Diisopropyl fluorophosphate）を含む４℃に
冷却した500mlの生理食塩水を加え、ワーリングブレン
ダーとしてAce Homogenizer AM−１型（日本精器会社
製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズした。
ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。次に
混合物を更に４℃で５分間、ホモジナイズし氷中で５分
間冷却した。上記のホモジナイズ及び冷却操作を更に３
回くり換した。得られたホモジェネートを12,000gで４
℃において30分間遠心分離にかけて上澄液とペレットに
分け、ペレットを集める。これに0.5％（v/v）トリトン
Ｘ−100、0.25M庶糖、1mMベンズアミジン塩酸、0.5mM
CaCl2を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸
濁し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分間、５
回ホモジナイズして細胞抽出物を得た。 得られた抽出物を35,000g、10℃で60分間遠心分離に
かけて上澄液を集めた。エヌ エル エスモン（N.L.Es
mon）ら〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、257巻、859頁（1982
年）〕の方法に従って作成したDIP−トロンビン〔ジイ
ソプロピルホスフォロトロンビン（diisopropylphospho
ro−thrombin）をピー クオトレカサス（P.Cuatrecasa
s）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.Biol.Chem.）、245巻、3059頁（1970
年）〕に従ってブロムシアン化したアガロースに結合さ
せて、DIP−トロンビン−アガロースを作成した。 次に、DIP−トロンビン−アガロースを2.5cmφ×10cm
の大きさのカラムに充填してDIP−トロンビン−アガロ
ースカラムを作成し、室温で0.1M NaCl、0.5mM CaC
l2、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PX
（半井科学薬品製、日本）を含む0.02Mトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）でカラムを平衡化した。次いで上記の抽出
上澄液をカラムに供した。カラムを0.3M NaCl、0.5mM
CaCl2、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol
PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した
後、1M NaCl、0.1mM EDTA、1mMベンズアミジン塩酸0.
5％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（p
H7.5）で溶出して2.0mlずつフラクシヨンを集めた。溶
出によって得られる各フラクションについて前記の方法
でトロンビンのプロテインＣの活性化促進能を測定し
た。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォトメー
ターUV−240を用いて各フラクションの波長280nmにおけ
る吸光度（A280）を測定した。 プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、0.1M Na
Cl、0.5mM CaCl2、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.0
2Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透
析液を２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を1.5cmφ×1
0cmの大きさのDIP−トロンビン−アガロースカラムに供
し、0.4M NaCl、0.5mM CaCl2、0.1％（v/v）Lubrol
PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄後、さ
らに0.4M NaCl、0.1mM EDTA、0.1％（v/v）Lubrol P
Xを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄し、次
いで1M NaCl、0.5mM EDTA、0.1％（v/v）Lubrol PX
を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で溶出した。 プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、さらに0.
1M NaCl、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透析液を３
回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマトグ
ラフィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶
出条件は２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラム
クロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。
なお、溶出して得られるフラクションは2mlずつ集め
た。プロテインＣ活性化能のある画分を回収し、0.1M
NaCl、0.05％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）で透析した後、0.9cmφ×8cmの大きさ
の４回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマ
トグラフィーに供した。0.35M NaCl、0.5mM CaCl2、
0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトルス塩酸緩衝液
（pH7.5）で洗浄後、1M NaCl、0.5mM EDTA、0.1％（v
/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
で溶出した。溶出して得られたフラクションは1.9mlず
つ集めた。 この第４回目のDIP−トロンビン−アガロースカラム
クロマトグラフィーの溶出パターンを第１図に示す。フ
ラクションナンバー48番目から56番目までを回収した。 このようにして精製されたフラクションの吸光度か
ら、得られた精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の
分子吸光係数にならない10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.
0）と規定してそれに基づき本精製品の量を計算したと
ころ約500μｇであった。なお、得られた精製画分をポ
リアクリルアミドゲル濃度５〜10％のグラジェントを用
いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を50Vの電圧
で２時間行ない、銀染色によってバンドを観察したとこ
ろ単一バンドのみ確認された。 また、この精製タンパク約10μｇを200mMのNaClおよ
び0.1％（v/v）Lubrol PXを含む50mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したConAセフ
ァロース（ファルマシア社製、カタログ番号17−0440）
のカラム（樹脂量約1ml）に供し、同じ緩衝液で充分洗
浄したところ、このタンパクはConAセファロースに吸着
して洗浄液中には溶出されなかった。 次いで、0.5Mのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
（Methyl−α−Ｄ−mannopyranoside）（米国Sigma社
製、カタログ番号Ｍ−6882）を含む以外は上記と同じ緩
衝液を通したところ、このタンパク質は溶出した。従っ
て、このタンパク質は糖を含むいわゆるグリコペプチド
であることがわかった。 （３）：トロンビンのプロテインＣ活性化を促進するグ
リコペプチドのアミノ酸配列分析 このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして
分析した。 精製したグリコペプチドを0.1％（v/v）ラウリル硫酸
ナトリウム（SDS）水溶液で室温で16時間透析してアミ
ノ酸配列分析用試料とする。アプライドバイオシステム
ズ社（米国）製アミノ酸シークエンシングアナライザー
（モデル470A）を用い、アール エム ヘウイック（R.
M.Hewick）らの方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）256巻、7990頁
（1981年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン分析
を行なった。遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（SP8100）および米国デュ
ポン社製ゾルバックスODSカラムを用いて分析を行な
い、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ酸配列
の一部が明らかになり、Ｎ末端より11個目までは下記ア
ミノ酸配列を有するものであることがわかった。 Ala−Pro−Ala−Glu−Pro−Gln−Pro−Gly−Gly−Ser−
Gln （４）:N末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブの
作成 トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリ
コペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Nucleic Acid Res.）、９巻、R43頁（1981年）〕、
Ｎ末端からのアミノ酸配列をコードする塩基配列とし
て、５′CTGGG AGCCG CCGGG CTGGG GCTCG GCGGGGG
C3′の33merを、また大塚ら〔イー オーツカ エト
アール（E.Ohtsuka,et al.）、ザ ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）第26
0巻、2605頁（1985年）〕に従って、デオキシイノシン
（“I"で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端から
のアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′GCICC IGCIG AACCI CAGCC IGG3′ （２）５′GCICC IGCIG AGCCI CAACC IGG3′ （３）５′GCICC IGCIG AGCCI CAGCC IGG3′ （４）５′GCICC IGCIG AACCI CAACC IGG3′ の４種類の23merを米国アプライド バイオシステズ（A
pplied Biosystems）社製の380A型DNA合成機で合成
し、メーカーマニュアルに従って精製し、実験書〔イー
エフ マニアティスら（Maniatis E.F.,et al）、
モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、12
2頁（1982年）〕の記載にしたがって、T4DNAキナーゼ、
およびγ−32P−ATPを用いてラベル化した。 （５）：トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進す
る作用のあるグリコペプチドの抗体 トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のあ
るグリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のように
して精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促
進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用い
て、成書〔エル ハドソンら（L.hudson et al.）、
プラクティカル イムノロジー（Practical Immunolog
y）、９頁（1976年）、ブラックウェル サイエンティ
フィック パブリケーションズ（Blackwell Scientifi
c Publications）〕に従って作製した。 この抗体がトロンビンによるプロテインＣ活性化を促
進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドと反応す
ることを以下の様にして確認した。すなわち、参考例２
−（２）に記載の方法で得た精製タンパクの約10ngをニ
トロセルロースのフィルターにスポットする。よく風乾
した後、この抗体を一次抗体としてニトロセルロースフ
ィルター上のタンパクと反応させ、次いでヤギで調製し
たビオチン化抗ウサギIgG（ザイメット ラボラトリー
社製、米国、カタログ番号62−1840）を二次抗体として
反応させた後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由
来パーオキシダーゼ（アマシャムジャパン社製、日本、
カタログ番号RPN.1051）を作用させる方法で発色させる
と黒褐色のスポットを与えた。 （６）：ヒトさい帯内皮細胞の採集及び培養 ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼII（合同酒精社
製、日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Y.Ma
no,et al.）、エクスペリンエンシア（Experienti
a）、第39巻、第1144頁（1983年）〕にしたがって、私
立病院より提供された新鮮なヒトさい帯から得た静脈よ
り採集し培養した。 参考例３ （組換え体DNAの取得） （１）：ポリ（Ａ）+RNAの調製 ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Chirgwin,J.M.et al.）、バイオケミス
トリー（Biochemistry）、第18巻、5294頁（1979年）〕
に従ってポリ（Ａ）+RNAを調製した。 （２）：ヒト肺cDNAライブラリーよりのスクリーニング ヒト肺のポリ（Ａ）+RNAより調製したcDNAをバクテリ
オファージλgt11に組み込んだcDNAライブラリー（クロ
ーンテック社製、米国）をそのマニュアルに従ってイー
コリ（E.coli）Y1090（クローンテック社製、米国）
に感染させたものをLB培地プレート上に15cm径プレート
１枚当り約10万プラーク程度になる様に移植した。42℃
で3.5時間培養後、あらかじめ10mMのIPTG（isopropyl−
β−Ｄ−thiogalactopyranoside）に浸してから乾燥さ
せたニトロセルロースフィルター（BA85メンブランフィ
ルター、シュライヒャー アンド シェル社製、独国）
をプレートの上に載せ、37℃で3.5時間インキュベート
して、ペプチドをIPTGで誘導発現させてニトロセルロー
スフィルター上にうつしとる。 このニトロセルロースフィルターに、マニュアルに従
って、ウサギで調製したトロンビンのプロテインＣ活性
化を促進する作用を有する参考例２−（５）で得られた
グリコペプチドに対する抗体を一次抗体として反応さ
せ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギIgG（ザ
イメッド ラボラトリー社製、米国、カタログ番号62−
1840）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビオ
チン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマーシ
ャム ジャパン社製、日本、カタログ番号RPN.1051）で
発色させて、陽性のクローンを単離した。この陽性クロ
ーンの保有する組換え体cDNA/λgt11に含まれるcDNA断
片をTM13と称した。 （３）:N末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブと
のハイブリダイゼーション 参考例３−（２）で得られたDNA断片TMI3が参考例２
−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードするDN
Aプローブとハイブリダイズするか否かを実験書〔シル
ハービイ（Silhavy）ら、エクスペリメンツ ウイズ
ジーン フュージョンズ（Experiments With Gene F
usions）、191頁（1984年）コールド スプリングハー
バー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborato
ry）〕に従って実施した。DNA断片TM13はいずれのＮ末
端アミノ酸配列をコードするDNAプローブともハイブリ
ダイズしないことがわかった。 （４）:TM13の塩基配列 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するDNA
断片TM13の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー エ
フ ら（Sanger,F.et al.）、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエ
スエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、74巻、5463頁（19
77年）にしたがって決定した。結果を第２（ａ）図〜第
２（ｂ）図に示す。 （５）:DNA断片TM13をプローブとしたヒト肺cDNAライブ
ラリーのスクリーニング DNA断片TM13を制限酵素Kpn IおよびPvu IIで消化して
約440塩基対のDNA断片を得、これをニックトランスレー
ション法で32Pで標識した。このDNA断片をプローブとし
てヒト肺cDNAライブラリーよりプラークハイブリダイゼ
ーションを行なって陽性のクローンをスクリーニングし
た。すなわち、常法に従ってクローンTM13のDNAをKpn I
およびPvu IIで消化してポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離し、抽出、精製して約440bpの精製断片約500ng
を得た。このDNAをアマーシャム ジャパン（日本）社
製のニックトランスレーション キット（カタログ番号
N.5000）を用い、それに添付のユーザー マニュアルに
従ってα−32P−dCTPを用いて標識した。 この32Pで標識したDNA断片をプローブとして実験書
〔マニアティス（Maniatis）ら、モレキユラー クロー
ニング（Molecular Cloning）、320頁、1982年、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Sp
ring Harbor Laboratory）〕に従ってヒト肺cDNAライ
ブラリーのプラークハイブリダイゼーションを行なっ
た。 陽性のクローンを単離し、そのクローンが含有する組
換え体を各種制限酵素で解析したところ、得られた組換
え体にはTM13よりも前記ペプチドのＮ末端側の塩基配列
をコードしていると思われる約2400bpのDNA断片が組み
込まれていることがわかった。このDNA断片をTM137と称
した。 （６）:DNA断片TM137の塩基配列 前記（５）で得られたDNA断片TM137の塩基配列を参考
例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結果を第
３（ａ）図〜第３（ｄ）図に示す。 この結果より、DNA断片TM137は、参考例２−（３）に
記載したＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列を含
まないことがわかった。 （７）：プライマー エクステンション 参考例３−（４）で得られたDNA断片の塩基配列のう
ち、DNA断片TM13のＮ末端側の配列を基に３種類の合成D
NAを参考例２−（４）に記載と同様にして作成し、HTM1
31、HTM132、HTM133と命名した。なお、合成DNAの設計
に当っては、ヒトさい帯内皮細胞より調製したmRNAとハ
イブリダイズする側の塩基配列を利用した。各合成DNA
の塩基配列は、以下のとおりであり、それらの合成DNA
が対応するDNA断片TM13での位置を第２（ａ）図に、ま
たTM137での位置を第３（ａ）図に示す。 HTM131: ５′GACGCAGAGGTAGCTAGTTT ３′（20mer） HTM132: ５′AACATCTGGCACCTG ３′ （15mer） HTM133: ５′GACAGGCAGTCTGGTTGCAA ３′（20mer） 次に、このHTM133をプライマーとして参考例３−
（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内皮細胞より調
製したポリ（Ａ）+RNAを用いて、いわゆるプライマー
エクステンション（Primer Extension）法を行なっ
て、DNA断片TM137のさらに５′上流部分を合成した。 すなわち、約１μg/μｌのポリ（Ａ）+RNA5μｌに約2
7ng/μｌのHTM133溶液20μｌを加え65℃で20分間加熱
後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以降は、
cDNA合成システム（アマシャム ジャパン社、日本、カ
タログ番号RPN1256）を用いて、そのマニュアルに従っ
てcDNAを合成した。但し、cDNA合成システムに入ってい
るオリゴ（dT）プライマーのかわりにHTM133を用いて実
施した。 合成されたcDNAは実験書〔マニアティス（Maniatis）
ら、モレキュラー クローニング（Molecular Clonin
g）、241頁、1982年、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）〕に従って両末端にＣテールをつけ、両末端にＧテ
ールをつけたpBR322（ATCC 37017）と混合し、65℃、
５分間加熱後57℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温
に戻した後、大腸菌K12MC1061（ベックマン シティ
オブ ホープ メディカルインスティテュート、米国よ
り入手）を形質転換した。詳しくは、大腸菌K12MC1061
株のコロニーをLB培地を用いて、550nmにおける吸光度
が0.3になるまで培養した。該培養物50mlを集め、25ml
の10mM RbClを含む10mM ３−（Ｎ−モルホリノ）プロ
パン−スルホン酸（MOPS）（pH7.0）溶液で洗浄し、次
いで、50mM CaCl2、10mM RbClを含む25mlの0.1M MOP
S（pH6.5）に再び懸濁した。 得られた懸濁液を30分間氷冷し、遠心後、上澄を除去
した。30μｌのDMSOおよび50mM CaCl2と10mM RbClを
含む2.0mlの0.1M MOPS（pH6.5）の混合液中に懸濁させ
た。懸濁液を200μｌずつ分注し、前述のプラスミドDNA
溶液10μｌをそれぞれに加えた。 該混合液を30分間氷冷した後、44℃で60秒ヒートショ
ックを与え、ただちに、あらかじめ37℃に温めておいた
5mlのLB培地を加えた。この溶液を37℃で１時間培養し
た後、それぞれの溶液を遠心し、上澄を除去し、細胞ペ
レットを得た。該細胞ペレットにLB培地を加え、撹拌し
た後、懸濁液とした。該懸濁液を５μg/mlのテトラサイ
クリンを含むLB寒天プレートにまき37℃で１夜培養を行
なった。このようにして得られるcDNAバンクより、参考
例２−（４）に記載した方法に従って５′末端を32Pで
標識したHTM131及びHTM132をそれぞれプローブとして、
コロニーハイブリダイゼーションを参考例３−（３）と
同様の方法で実施した。 コロニハイブダイゼーションで約70,000個の形質転換
体をスクリーニングしてHTM131及びHTM132の両者のプロ
ーブと反応するコロニーが６クローン得られた。この６
クローンから、実験書〔マニアティス（Maniatis）ら、
モレキュラー クローニング（Molecular Cloning）、
366頁、1982年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）〕に
従ってプラスミドDNA（これを“pTMP5"と称する）を調
製し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析
したところ、６クローンから得られたプラスミドDNAは
全て同一であり、約900bpの大きさのDNA断片とベクター
からなることがわかった。このDNA断片をTMP5と命名し
た。 （８）:DNA断片TMP5とＮ末端アミノ酸配列をコードする
DNAプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5がＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブ
とハイブリダイズするか否かを調べた。 DNA断片TMP5はいずれのＮ末端DNAプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。 （９）:DNA断片TMP5の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5の塩基配列を決定した。結果を第４（ａ）図〜第
４（ｂ）図に示す。 （10）：第２回目のプライマー エクステンション 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP5の塩基配列を基にしてHTM134、HTM135、HTM136の
３本の20merの合成DNAを作成する。これらの合成DNAと
対応するDNA断片TMP5における位置を第４（ａ）図に示
す。 参考例３−（７）に記載の方法と同様にしてプライマ
ー エクステンションをHTM136をプライマーとし、HTM1
34、及びHTM135をプローブとして実施した。約50,000個
の形質転換体から、HTM134、及びHTM135とハイブリダイ
ズする形質転換体が一種類得られた。この形質転換体が
保有する組換え体に含まれているDNA断片をTMP26と命名
した。 （11）:DNA断片TMP26とＮ末端アミノ酸配列をコードす
るDNAプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてDNA断片T
MP26がＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブと
ハイブリダイズするか否かを調べた。 その結果、DNA断片TMP26は参考例２−（４）で合成し
た33merのＮ末端アミノ酸配列をコードするDNAプローブ
及び４種の25merのプローブのミックスプローブとハイ
ブリダイズした。つまり、DNA断片TMP26はＮ末端アミノ
酸配列部分をコードしていることが分かった。 （12）:DNA断片TMP26の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、DNA断
片TMP26の塩基配列を決定した。DNA断片TMP26のカルボ
キシル末端からの約540塩基の塩基配列を第５図に示
す。 （13）:DNA断片TMP26、TMP5及びTMP137の接合 参考例３−（１）〜（12）で得られ、塩基配列を決定
した４本のDNA断片（TM13、TM137、TMP5及びTMP26）の
その塩基配列における対応関係および簡単な制限酵素地
図を第６図に示した。第６図に示すようにDNA断片TMP26
に含まれるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列の
上流にある最初のATGよりオープンリーディングフレー
ムを組むとDNA断片TMP26、TMP5を通過してTM137の途中
まで続く1725bpからなることが分かった。この各DNA断
片にわたるオープンリーディングフレームをコードする
DNA断片を得るためにDNA断片TMP26、TMP5及びTM137を次
のようにして常法に従って継ぎあわせた。 （13−１）:DNA断片TM137とTMP5の継ぎあわせ まず、λgt11のEcoR Iサイトに挿入されているDNA断
片TM137を単離し、プラスミドpUC18（ファルマシア社
製、スウェーデン、カタログ番号27−4949−01）のEcoR
Iサイトに挿入してプラスミドpUC18TM137を得た。 次に、プラスミドpUC18TM137を制限酵素Hinc II、Eco
R Iで消化して４％（v/v）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
MAX−YIELDR）を用いて約2,300bpのDNA断片を回収し、
エタノール沈殿を行なって精製した。 一方、参考例３−（７）で得られたTMP5をプラスミド
pBR322に組み込んだプラスミドpTMP5をDde Iで完全に消
化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラーゼ（Kleno
w Pol I断片）を用いて平滑末端にして約800bpのDNA断
片を回収し、このDNA断片をpUC18のSma Iサイトに挿入
してプラスミドpUC18TMP5を得た。次にこのプラスミドp
UC18TMP5を制限酵素BamH IおよびHinc IIで完全消化し
て約600bpのBamH I−Hinc II断片を得た。 以上の様にしてプラスミドpUC18TM137より調製した約
2,300bpのDNAの断片及びプラスミドpUC18TMP5より調製
した約600bpのDNA断片プラスミドpUC18のBamH IおよびE
coR Iで消化して調製したベクターに挿入してプラスミ
ドpUC18TMJ1を得た。この工程を第７図に示した。 （13−２）:DNA断片TMJ1とTMP26の継ぎあわせ プラスミドpUC18TMJ1を制限酵素Dde I、Kpn I及びBam
H Iで完全消化し、約950bp及び薬1500bpの断片を回収し
た。 一方、DNA断片TMP26をプラスミドpUC13（ファルマシ
ア社製、スウェーデン、カタログ番号27−4954−01）の
制限酵素Pst Iサイトに挿入してプラスミドpUC13TMP26
を得た。これをBbe Iで完全消化した後、切断末端をT4D
NAポリメラーゼを用いて平滑末端にし、さらに制限酵素
Bgl IIで完全消化して約170bpのDNA断片を得た。 さらに別に、プラスミドpUC13TMP26をBgl II及びDde
Iで完全消化して約280bpのDNA断片を得た。 次に、上記の約170bp、約280bp、約950bpのDNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、制限酵素Kpn Iで消
化した後、50Vの電圧で４℃で２時間、1.3％低融点アガ
ロースゲル電気泳動にかけて精製単離し、約1400bpのDN
A断片を得た。 また別途、プラスミドpUC18をSph Iで完全に消化した
後、E.coli DNAポリメラーゼで切断末端を平滑末端に
した後、BamH Iで完全消化してベクターを調製した。こ
のベクターに上述の約1,400bp及び約1,500bpのDNA断片
をT4DNAリガーゼを用いて挿入して、プラスミドpUC18TM
J2を得た。この工程を第８図に示す。 参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング） ヒト染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリー
ニングは以下のようにして実施した。 λファージのベクターEMBL−３に入ったヒト染色体ラ
イブラリーは米国クローンテック社（Clontech Labora
tries,Inc.922 Industrial Ave.Palo Alto,CA9430
3）より購入した（カタログ番号HL1006）。このライブ
ラリーより参考例３−（２）で得られたDNA断片TM13を
プローブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法で
スクリーニングを行なったところ、約２万bpインサート
を含有する染色体クローンが１種類得られた。この染色
体クローンを制限酵素BamH Iで完全消化して1.0％アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、実験書〔マニアティス
（Mantiatis）ら、モレキュラー クローニング（Molec
ular Cloning）、382頁、1982年、コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）〕に従ってサザン ブロット ハイブリダ
イゼーションを同じプーロブを用いて実施した。 その結果、約4,000bpのDNA断片に強い陽性のバンドを
得たのでその断片を常法に従って単離し、プラスミドpU
C18のBamH Iサイトにサブクローニングした。この約4,0
00bpのDNAの塩基配列を決定したところ、参考例３−（1
3−２）で作製したプラスミドpUC18TMJ2に挿入されてい
るDNA断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。 実施例１ （プラスミドpSV2TMJ2、pSV2TMD1、pSV2TMD2、pSV2TMD4
及び、pSV2TMD5の作製） （１）プラスミドpSV2TMJ2の構築 プラスミドpSV2−dhfr（ATCC37146）をHind III及びB
gl IIで完全消化してSV40の初期転写プロモーター及びS
V40の転写ターミネータを有するベクターを得た。次に
参考例２−（13−２）で作成したプラスミドpUC18TMJ2
をHind IIIで部分消化した後BamH Iで完全消化して約2,
900bpのDNA断片を単離した。このDNA断片をTMJ2と称し
た。この2,900bpのDNA断片と上記の如く調製したベクタ
ーとをT4DNAリガーゼを用いて継ぎ合わせ、プラスミドp
SV2TMJ2を得た。プラスミドpSV2TMJ2を構築する工程を
第９図に示す。 得られたプラスミドpSV2TMJ2についてはブタペスト条
約の規定に基き、アメリカン タイプ カルチャー コ
レクション（ATCC）に寄託番号第67283号として寄託さ
れている。 （２）プラスミドpSV2TMD1の構築 （ａ）DNA断片TMD1の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドpSV2TMJ2をNc
o Iで完全消化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラ
ーゼを用いて平滑末端にした。次いでHind IIIで完全消
化して約1,900bpのDNA断片を得た。得られたDNA断片をT
MJ3と称した。一方、ファージＭ−13mp19（宝酒造社
製、日本、カタログ番号3119）をHind III及びHinc II
で消化してベクターを調製した。このベクターにDNA断
片TMD3を挿入して組換え体プラスミドＭ−13mp19TMJ3を
得た。 また別途、下記の塩基配列を有する削除用DNAプロー
ブ〔以下“ディリーター（deleter）”と称する〕を有
機合成した： ５′−GGAGGCCGCTCAGCCCGAATGCACG−３′（25mer）。合
成ディリーターをTMDと称した。 このようにして作成したディリーターTMDを用い、メ
ソッド イン エンザイモロジー（Method in Enzymo
logy）、第100巻、468頁（1983年）、アカデミック プ
レス（Academic Press）に記載の方法に従って部位特
異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体プラスミ
ドＭ−13mp19TMJ13の177塩基からなる部分の削除を行っ
た。 即ち、25pmolのディリーターTMDおよび10pmolのM13プ
ライマーM3（ユニバーサルプライマー、宝酒造社製、日
本、カタログ番号3831）の５′末端をT4キナーゼを用い
てリン酸化した後、0.5pmolの組換え体プラスミドM13mp
19TMJ3のシングルストランドDNAを加え、95℃で５分間
加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位のE.coli
DNAポリメラーゼ１（Klenow Fragment）、及び10単位
のT4DNAリガーゼを混合物に加えて37℃で30分間インキ
ュベートして混合物中に組換え体プラスミドを生成させ
た。 得られた混合物をイー コリ（E.coli）JM105（ファ
ルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号27−1550）
に加えた。それによって、このイー コリを組換え体プ
ラスミドでトランスフェクションした。37℃で一夜培養
して生じた寒天培地上のプラークをニトロセルロースフ
ィルターに移しとり、80℃で２時間加熱後、プレハイブ
リダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーショ
ンは６×SET〔0.9M NaCl、180mMトリス緩衝液（pH8.
0）、6mM EDTA〕、５×Denharts′〔0.1％（w/v）フィ
コール（Ficoll）、0.1％（w/v）ポリビニルピロリド
ン、0.1％（w/v）、ウシ血清アルブミン（BSA）〕、0.1
％SDS,100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で55℃、
２時間加温することにより実施した。 次いで上記の溶液中の変性サケ精子DNAのかわりに32P
でラベルしたTMDを加えた溶液を用いてハイブリダイゼ
ーション反応を55℃、２時間実施した。次いで６×SSC
（0.9M食塩、0.09Mクエン酸三ナトリウムの水溶液）を
用いてニトロセルロースフィルターを洗浄した。洗浄は
室温で、５分間、２回洗った後、55℃、65℃、75℃、と
段階的に温度を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ
洗った。Ｘ線フィルムXAR−５（イーストマン コダッ
ク社製、米国）を得られたニトロセルロースフィルター
に密着させて−80℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィ
ルム上に強く露光した黒いスポットが数10個検出され
た。各スポットは組換え体プラスミドで感染したクロー
ンに対応するものである。 そのうち、６クローンを選択し、各クローンの組換え
体プラスミドを単離して制限酵素解析、及び塩基配列の
解析を行ったところ、これらのクローンの保有する組換
え体プラスミドは制限部位と塩基配列がそれぞれ同一で
あることがわかった。得られた組換え体プラスミドをM1
3−TMD1と称した。さらにこの組換え体プラスミドM13−
TMD1は、開始コドン（ATG）と、その下流に498個のアミ
ノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配列を
含む塩基配列を含有するDNA断片を有することがわかっ
た。この組換え体プラスミドM13−TMD1に含まれるDNA断
片をTMD1と称した。第10図に組換え体プラスミドＭ−13
mp19TMJ3とディリーターTMDとがハイブリダイズし、DNA
断片TMJ3に対応するDNA領域の一部が削除されるところ
を示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD1の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD1をHind IIIおよびBamH Iで完全消化してT
MD1の約1,900bp DNA断片を単離した。一方、プラスミ
ドpSV2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで
完全消化してベクターを得た。このベクターとDNA断片T
MD1とをT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミド
pSV2TMD1を得た。 （３）プラスミドpSV2TMD2の構築 （ａ）DNA断片TMD2の作製 下記の塩基配列： ５′−CTCCACGCTGCAGGGGAACCCCAGG−３′（25mer）を有
するディリーターTMd2をディリーターTMDの代わりに削
除用DNAプローブとして用いる以外は実施例１−（２）
−（ａ）と実質的に同様の方法を繰り返して、TMD2と称
するDNA断片を含む組換え体プラスミドM13−TMD2を得
た。DNA断片TMD2は実施例１−（２）−（ａ）で得られ
たDNA断片TMD1の５′末端から678bpのDNAが削除された
構造を有する。このDNA断片TMD2は開始コドン（ATG）
と、その下流に272個のアミノ酸からなる本発明のペプ
チドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。第11図に組換え体プラスミドM13−TMD1とディリー
ターTMd2とがハイブリダイズし、DNA断片TMD1に対応す
るDNA領域の一部が削除されるところを示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD2の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD2をHind IIIおよびBamH Iで完全消化してT
MD2の約1200bpDNA断片を単離した。一方、プラスミドpS
V2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD2
とをT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミドpSV
2TMD2を得た。 （４）プラスミドpSV2TMD4の作製 （ａ）DNA断片TMD3の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドpSV2TMJ2をNc
o Iで完全消化した後、切断末端をE.coli DNAポリメラ
ーゼを用いて平滑末端にした。次いでHind IIIで完全消
化して約1,900bpのDNA断片を得た。得られたDNA断片をT
MJ3と称した。一方、ファージＭ−13mp19（宝酒造社
製、日本、カタログ番号3119）のHind III及びHinc II
で消化してベクターを調製した。このベクターにDNA断
片TMJ3を挿入して組換え体プラスミドＭ−13mpTMJ3を得
た。 また別途、下記の塩基配列を有するディリーターを有
機合成した： ５′−GGAGGCCGCTCAACAGTCGGTGCCA−３′（25mer）。合
成ディリーターをTMd3と称した。 このようにして作製したディリーターをTMd3用い、メ
ソッド イン エンザイモロジー（Method in Enzymo
logy）、第100巻、468頁（1983年）、アカデミック プ
レス（Academic Press）に記載の方法にしたがって部
位特異的変異の手法で前記の如く得られた組換え体プラ
スミドＭ−13mp19TMJ3の285bpからなる部分の削除を行
った。即ち、25pmolのディリーターTMd3及び10pmolのM1
3プライマーM3（ユニバーサルプライマー、宝酒造社
製、日本、カタログ番号3831）の５′末端をT4キナーゼ
を用いてリン酸化した後、0.5pmolの組換えプラスミドM
13mp19TMJ3のシングルストランドDNAを加え、95℃で５
分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位のE.co
li DNAポリメラーゼ１（Klenow Fragment）、及び10
単位のT4DNAリガーゼを混合物に加えて37℃で30分間イ
ンキュベートして混合物中に組換え体プラスミドを生成
させた。 得られた混合物をイー コリ（E.coli）JM105（ファ
ルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号27−1550）
に加えた。それによりイー コリを組換え体プラスミド
でトランスフェクションした。37℃で一夜培養して生じ
た寒天培地上のプラークをニトロセルロースフィルター
に移しとり、80℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼ
ーションを行った。プレハイブリダイゼーションは、６
×SET〔0.9M NaCl、180mMトリス緩衝液（pH8.0）、6mM
EDTA〕、５×Denharts′〔0.1％（w/v）フィコール
（Ficoll）、0.1％（w/v）ポリビニルピロリドン、0.1
％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）〕、0.1％SDS,100
μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で55℃、２時間加
温することにより実施した。 次いで、上記の溶液中の変性サケ精子DNAのかわりに
32PでラベルしたTMd3を加えた溶液を用いてハイブリダ
イゼーション反応を55℃、２時間実施した。次いで６×
SSC（0.9M食塩、0.09Mクエン酸三ナトリウムの水溶液）
を用いてニトロセルロースフィルターを洗浄した。洗浄
は室温で、５分間、２回洗った後、55℃、65℃、75℃、
と段階的に温度を上げていって、それぞれ５分間２回ず
つ洗った。Ｘ線フィルムXAR−５（イーストマン コダ
ック社製、米国）を得られたニトロセルロースフィルタ
ーに密着させて−80℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フ
ィルム上に強く露光した黒いスポットが数10個検出され
た。各スポットは組換え体プラスミドで感染したクロー
ンに対応するものである。そのうち、６クローンを選択
し、各クローンの組換え体プラスミドを単離して制限酵
素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、これらの
クローンの保有する組換え体プラスミドは制限部位と塩
基配列がそれぞれ同一であることがわかった。得られた
組換え体プラスミドをM13−TMD3と称した。更にこの組
換え体プラスミドM13−TMD3は、開始コドン（ATG）と、
その下流に462個のアミノ酸からなるペプチドをコード
する塩基配列を含有する（すなわち、配列番号15の１−
1386の塩基配列）DNA断片を有することがわかった。こ
の組換え体プラスミドM13−TMD3に含まれるDNA断片をTM
D3と称した。第12図に組換え体プラスミドＭ−13mp19TM
J3とディリーターTMd3とがハイブリダイズし、DNA断片T
MJ3に対応するDNA領域の一部が削除されるところを示
す。 （ｂ）DNA断片TMD4の作製 部位異特異的変異の手法を用いてディリーターTMd3の
代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリー
ターTMd2を用いる以外は実施例１−（４）−（ａ）と実
質的に同様の方法で、上述の如く得られた組換え体プラ
スミドM13−TMD3の一部を削除して、TMD4と称するDNA断
片を含む組換え体プラスミドM13−TMD4を得た。DNA断片
TMD4は、実施例１−（４）−（ａ）で得られたDNA断片T
MD3の５′末端から678bpのDNAが削除された構造を有す
る。このDNA断片TMD4は開始コドン（ATG）と、その下流
に236個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコード
する塩基配列を含む塩基配列を有していた。第13図に組
換え体プラスミドM13−TMD3とディリーターTMd2とがハ
イブリダイズし、DNA断片TMD3に対応するDNA領域の一部
が削除されるところを示す。 （ｃ）プラスミドpSV2TMD4の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD4をHind III及びBamH Iで完全消化してTMD
4の約1,100bpDNA断片を単離した。一方、プラスミドpSV
2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD4と
をT4DNAリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラスミドpSV2T
MD4を得た。 （５）プラスミドpSV2TMD5の構築 （ａ）DNA断片TMD5の作製 下記の塩基配列： ５′−CACGGGCTCCACGGGGAACCCCAGG−３′（25mer）を有
するディリーターTMd4をディリーターTMd2の代わりに削
除用DNAプローブとして用いる以外は実施例１−（４）
−（ｂ）と実質的に同様の方法を繰り返して、TMD5と称
するDNA断片を含む組換え体プラスミドM13−TMD5を得
た。DNA断片TMD5を実施例１−（４）−（ａ）で得られ
たDNA断片TMD3の５′末端から1032bpのDNAが削除された
構造を有する。このDNA断片TMD5は開始コドン（ATG）
と、その下流に118個のアミノ酸からなる本発明のペプ
チドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。第14図に組換え体プラスミドM13−TMD3とディリー
ターTMd4とがハイブリダイズし、DNA断片TMD3に対応す
るDNA領域の一部が削除されるところを示す。 （ｂ）プラスミドpSV2TMD5の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラス
ミドM13−TMD5をHind III及びBamH Iで完全消化してTMD
5の約740bp DNA断片を単離した。一方、プラスミドpSV
2−dhfr（ATCC 37146）をHind III及びBgl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとDNA断片TMD5と
をT4DNAリガーゼを用いて継ぎあせ、プラスミドpSV2TMD
5を得た。 実施例２ （プラスミドpSV2TMD5によるCOS−１細胞の形質転換） COS−１細胞（ATCC CRL1650）を培養器中に入れた10
％（v/v）のウシ胎児血清（以下“FCS"と略する）を加
えたダルベッコの最小必須培地（以下“MEM"と略する）
〔米国、フローラボラトリ（Flow Laboratories）社
製、カタログ番号10−331）を用いて、37℃で５％炭酸
ガスインキューベーター中で対数増殖期になるまで培養
し、0.1％トリプシン及び0.02％EDTAを用いて培養器に
付着増殖した細胞を培養器よりはがして、ハンクス平衡
塩類溶液〔米国、フローラボラトリー（Flow Laborato
ries）社製、カタログ番号17−101−22〕に約１×107個
/mlの濃度になるように懸濁した。 実施例１−（５）で得られたプラスミドpSV2TMD5を約
２μg/μｌになるように1mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）
に懸濁した。約10μｇのプラスミドpSV2TMD5を含む得ら
れたプラスミド懸濁液５μｌを1.5ml容量のエッペンド
ルフ型試験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得
られたCOS−１細胞の細胞懸濁液200μｌを入れて、０℃
で10分間放置した。試験管内の懸濁液を米国D.E.P.SYST
EM社製細胞融合装置FPH1001型のキュベットに移し、1.2
kVで40μ秒の条件で２回電気パルスを与えた。その後懸
濁液を再び元のエッペンドルフ型試験管に移し、０℃で
５分間放置した後、10％（v/v）FCSを加えたダルベッコ
のMEM10mlを以下のように用いて直径10cmの組織培養用
プレートに移した。即ち、少量の10％（v/v）FCSを含む
ダルベッコのMEMを懸濁液に加えてその混合物を組織培
養用プレートに移した。次いで、試験管を残りのダルベ
ッコのMEMで数回洗浄して洗浄液を同じプレートに加え
た。その後、プレートは５％CO2存在下37℃で24時間培
養した。 （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認） 培養終了後、プレートの培地をFCSを含まないダルベ
ッコのMEMに交換し、48時間培養した。培養上澄液を５
μｌ採取し、これを試料として参考例１に記載した方法
で、プロテインＣ活性化の促進作用を測定した。 更に、直径10cmの組織培養用プレート１枚分の細胞を
米国コースター（Coaster）社製セルスクレイパー（Cel
l Scraper）（カタログ番号3010）を用いて掻き取って
集め、800rpm、10分間の条件で遠心分離して集める。こ
のペレットを試料として用いて参考例１に記載した方法
でプロテインＣの活性化を促進する作用を測定した。ま
たコントロールとしてはプラスミドpSV2−dhfrでトラン
スフォームしたCOS−１細胞の培養上澄液及び細胞ペレ
ットを試料として用いた。結果を第１表に示した。表中
に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織培養用プレー
ト１枚分に換算したものである。 実施例３ （プラスミドpSV2TMD4によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD4によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第２表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例４ （プラスミドpSV2TMD2によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第３表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例５ （プラスミドpSV2TMD1によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD1によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果を第４表に
示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組織
培養用プレート１枚分に換算したものである。 実施例６ （プラスミドpSV2TMJ2によるCOS−１細胞の形質転換お
よび形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによ
るプロテインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMJ2を用いる以外は実施例２と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMJ2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定した。その結果、細胞ペレ
ットの試料が強いプロテインＣ活性化促進作用を示し、
生成したプロテインＣの量は約300ngであった。一方、
コントロールとして用いたプラスミドpSV2−dhfrでトラ
ンスフォームした細胞ではこの活性は検出されなかっ
た。 実施例７ （プラスミドpSV2TMD5によるCHO細胞の形質転換と形質
転換細胞における発現） 約４μｇのプラスミドpSV−２−neo（ATCC 3715
0）、及び約20μｇの実施例１−（５）で作成したプラ
スミドpSV2TMD5を混合してエタノール沈殿した。沈殿物
を風乾後、450μｌのTE（pH7.9、1mMトリス塩酸緩衝
液、0.1mM EDTA）に溶解し、500μｌの２×HBS（50mM
HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.12）を加
えた。次いで50μｌの2.5M CaCl2を滴下し室温に10分
間放置した。 一方、10％（v/v）FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレ
プトマイシン（米国、フローラボラトリー社製、カタロ
グ番号16−700−49）を含有するHam′sF−12培地（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号10−421−2
0）を用いて直径6cmの組織培養用プレートにプレート１
枚当たり細胞数約５×102程度播種したCHO−KI株（ATCC
CCLD 61）を１夜培養し、培地を新鮮な培地に交換
し、更に３時間培養した。このCHO−KIに前述のCaCl2を
滴下したプラスミドDNA溶液を重層し、37℃で約８時間
培養した。5mlのPBS（−）（米国、フローラボラトリー
社製、カタログ番号28−103−05）を用いて２回洗浄
し、さらに、5mlの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を
加えて約16時間さらに培養した。 プレートに付着した細胞を0.25％トリプシン、0.02％
EDTA溶液を用いてはがし、直径10cmの組織培養プレート
４枚に広げて培養した。24時間後、培地を選択培地に交
換した。選択培地の組成は前述の培地に400μg/mlにな
る様にジェネティシンＣ−418（GIBCO社製、米国、カタ
ログ番号860−1811）を添加したものである。３〜４日
おきに培地交換を行いながら約２週間培養して、トラン
スフォームした細胞をクローニングした。 この操作で得られた細胞のクローンをそれぞれ直径10
cmの組織培養プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。途中、培地のFCS濃度を10％から１％に減らし
た培地に切り換えて培養した。このFCS含有選択培地で
培養した培養液50μｌをとり、これを用いて参考例１に
記載した方法でプロテインＣ活性化を促進する作用を測
定したところ、強いプロテインＣ活性化促進作用が認め
られた。一方、コントロールとして用いたプラスミドpS
V2−neoだけでトランスフォームした細胞では本活性は
検出されなかった。 実施例８ （プラスミドpSV2TMD4によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD4によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例９ （プラスミドpSV2TMD2によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD2によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例10 （プラスミドpSV2TMD1によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドpSV2TMD1によって形質転換され
た細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプロテイン
Ｃ活性化促進作用が認められた。一方、コントロールと
して用いたプラスミドpSV2−neoだけでトランスフォー
ムした細胞では、本活性は検出されなかった。 実施例11 （プラスミドpSV2TMJ2によるCHO細胞の形質転換及び形
質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによるプロ
テインＣ活性化の促進作用の測定） 約４μｇのプラスミドpSV−２−neo（ATCC 37150）
及び約20μｇの実施例１で作成したプラスミドpSV2TMJ2
を混合してエタノール沈殿した。沈殿物を風乾後、450
μｌのTE（pH7.9、1mMトリス塩酸緩衝液、0.1mM EDT
A）に溶解し、500μｌの２×HBS（50mM HEPES、280mM
NaCl、1.5mM Na2HPO4、pH7.12）を加えた。次いで50
μｌの2.5M CaCl2を滴下し室温に10分間放置した。 一方、10％（v/v）FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレ
プトマイシン（米国、フローラボラトリー社製、カタロ
グ番号16−700−49）を含有するHam′sF−12培地（米
国、フローラボラトリー社製、カタログ番号10−421−2
0）を用いて直径6cmの組織培養用プレートにプレート１
枚当たり細胞数約５×102程度播種したCHO−KI株（ATCC
CCLD 61）を１夜培養し、培地を新鮮な培地に交換
し、更に３時間培養した。このCHO−KIに前述のCaCl2を
滴下したプラスミドDNA溶液を重層し、37℃で約８時間
培養した。5mlのPBS（−）（米国、フローラボラトリー
社製、カタログ番号28−103−05）を用いて２回洗浄
し、さらに、5mlの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を
加えて約16時間さらに培養した。 プレートに付着した細胞を0.25％トリプシン、0.02％
EDTA溶液を用いてはがし、直径10cmの組織培養プレート
４枚に広げて培養した。24時間後、培地を選択培地に交
換した。選択培地の組成は前述の培地に400μg/mlにな
る様にジェネティシンＣ−418（米国GIBCO社製、カタロ
グ番号860−1811）を添加したものである。３〜４日お
きに培地交換を行いながら約２週間培養して、トランス
フォームした細胞をクローニングした。この操作で得ら
れた細胞のクローンをそれぞれ直径10cmの組織培養プレ
ートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、培
地のFCS濃度を10％から１％に減らした培地に切り換え
て培養した。 プラスミドpSV2TMJ2によって形質転換された細胞の産
生するペプチドのロンビンによるプロテインＣ活性化の
促進作用を細胞ペレットを試料として用いて測定したと
ころ強いプロテインＣ活性化促進作用が認められた。一
方、コントロールとして用いたプラスミドpSV2−neoだ
けで形質転換した細胞及びその培養上澄液では本活性は
検出されなかった。 実施例12 （プラスミドpSV2TMD5によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（５）で作成したプラスミドpSV2TMD5をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD5のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD5−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD5
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約1,700bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
5−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアス（L.Covasrub
ias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981年）
に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプラス
ミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化して得た約2,96
0bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD5−１をBamH I及びH
ind IIIで完全消化して得た約2,600bpのDNA断片を挿入
してプラスミドpBRTMD5−１を得た。このプラスミドpBR
TMD5−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミドpB
PV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全消
化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD5−１を得た。以上
の工程を第15（ａ）図〜第15（ｂ）図に示す。 次に、実施例７に記載の方法に準じてpdBPVTMD5−１
でC127I細胞（ATCC CRL1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液５μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例13 （プラスミドpSV2TMD4によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（４）で作成したプラスミドpSV2TMD4をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD4のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD4−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD4
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約2,100bpの断
片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH I
で完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD4
−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら（L.Covasr
ubias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981
年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプ
ラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化して得た約
2,960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD4−１をBamH I
及びHind IIIで完全消化して得た約3,000bpのDNA断片を
挿入してプラスミドpBRTMD4−１を得た。このプラスミ
ドpBRTMD4−１をHind IIIで完全消化したものとプラス
ミドpBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで
完全消化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継い
で、C127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD4−１を得
た。以上の工程を第16（ａ）図〜第16（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD4−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
1700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養した
ところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたので
それぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cm
の組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して
培養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをと
り、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイン
Ｃ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認め
られた。一方、コントロールとして用いたプラスミドpB
PV−（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本
活性は検出されなかった。 実施例14 （プラスミドpSV2TMD2によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（３）で作成したプラスミドpSV2TMD2をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD2のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD2−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD2
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約2,200bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
2−１を得た。 一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）からコバス
ルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら（L.Covasr
ubias et al）、ジーン（Gene）、13、25、（1981
年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。得られたプ
ラスミドpBR327をBamH IおよびHind IIIで消化して得た
約2,960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMD2−１をBamH
I及びHind IIIで完全消化して得た約3,070bpのDNA断片
を挿入して、プラスミドpBRTMD2−１を得た。このプラ
スミドpBRTMD2−１をHind IIIで完全消化したものとプ
ラスミドpBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind II
Iで完全消化して得た断片とT4DNAリガーゼを用いて、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD2−１を得た。以上
の工程を第17（ａ）図〜第17（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD2−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBPV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例15 （プラスミドpSV2TMD1によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（２）で作成したプラスミドpSV2TMD1をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMD1のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMD1−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMD1
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約3,100bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMD
1−１を得た。一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）
からコバスルビアスらの方法〔エル コバスルビアスら
（L.Covasrubias et al）、ジーン（Gene）、13、2
5、（1981年）に従ってプラスミドpBR327を作製した。
得られたプラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化
して得た約2,960bpのDNA断片にラスミドpUCTMD1−１をB
amH I及びHind IIIで完全消化して得たDNA断片を挿入し
てプラスミドpBRTMD1−１を得た。このプラスミドpBRTM
D1−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミドpBPV
−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全消化
して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C127
細胞発現用のプラスミドpdBPVTMD1−１を得た。以上の
工程を第18（ａ）図〜第18（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMD1−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び1v/v％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号16−
700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10cmの
組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生育さ
せた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換して培
養した。この培地で１日培養した培養液50μｌをとり、
これを用いて参考例１に記載した方法でプロテインＣ活
性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認められ
た。一方、コントロールとして用いたプラスミドpBPV−
１（９−１）だけでトランスフォームした細胞では本活
性は検出されなかった。 実施例16 （プラスミドpSV2TMJ2によるC127I細胞の形質転換およ
び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用の測定） 実施例１−（１）で作成したプラスミドpSV2TMJ2をHi
nd IIIで完全消化した後、切断末端をDNAポリメラーゼ
を用いて平滑末端にし、T4DNAリガーゼを作用させ、プ
ラスミドpSV2TMJ2のHind IIIサイトを欠失したプラスミ
ドpSV2TMJ2−１を得た。次いでこのプラスミドpSV2TMJ2
−１をPvu II及びBamH Iで完全消化して約4,100bpのDNA
断片を得た。これをプラスミドpUC18のHinc II及びBamH
Iで完全消化したベクターに挿入してプラスミドpUCTMJ
2−１を得た。一方、プラスミドpBR322（ATCC 37017）
からコバスルビアスらの方法〔エル コバスルビアス
（L.Covasrubias et al）、ジーン（Gene）、13、2
5、（1981年）に従ってプラスミドpBR327を作成した。
得られたプラスミドpBR327をBamH I及びHind IIIで消化
して得た約2960bpのDNA断片に、プラスミドpUCTMJ2−１
をBamH I及びHind IIIで完全消化して得たDNA断片を挿
入してプラスミドpBRTMJ2−１を得た。このプラスミドp
BRTMJ2−１をHind IIIで完全消化したものとプラスミド
pBPV−１（９−１）（ATCC 37111）をHind IIIで完全
消化して得た断片とをT4DNAリガーゼを用いて継いで、C
127細胞発現用のプラスミドpdBPVTMJ2−１を得る。以上
の工程を第19（ａ）図〜第19（ｂ）図に示す。 次に、pdBPVTMJ2−１で実施例７に記載の方法に準じ
てC127I細胞（ATCC CRL 1616）をトランスフォームし
た。10％FCS及び１（v/v％）ペニシリン−ストレプトマ
イシン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号
16−700−49）を含むダルベッコのMEMで約３週間培養し
たところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたの
でそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径10
cmの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をFCSを含まない培地に置換し
て培養した。この培地で１日培養した後、培養した細胞
のペレットをかきとり、これを用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定したとこ
ろ強い活性が認められた。一方、コントロールとして用
いたプラスミドpBPV−１（９−１）だけでトランスフォ
ームした細胞では本活性は検出されなかった。 実施例17 （本発明のペプチドの精製） 実施例７に記載した方法で培養したプラスミドpSV2−
neo及びプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームしたCHO
細胞を直径10cmの組織培養用プレート25枚で培養した。
培地は１日おきに４回新鮮な培地と交換した。この培養
液をすべて集め（約100ml）、pH7.5に調製した後DIP−
トロンビン−アガロースのカラムクロマトグラフィーに
かけて調製した。 即ち、エヌ エル エスモン（N.L.Esmon）ら〔ザ
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biol.Chem）、257巻、859頁（1982年）〕の方法に準じ
て作製したDIP−トロンビン〔ジイソプロピルホスホロ
トロンビン（diisopropylphosphoro−thrombin）を、ピ
ー クオトレカサス（P.Cuatrecasas）の方法〔ザ ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Bi
ol.Chem）、245巻、359頁（1970年）〕に準じてブロム
シアン化したアガロースに結合させてDIP−トロンビン
−アガロースを作製した。 次にDIP−トロンビン−アガロースを2.5cmφ×10cmの
大きさのカラムに充填してDIP−トロンビン−アガロー
スカラムを作製して室温で0.1M NaCl,0.5mM CaCl2、1
mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PX（半井
化学薬品社製、日本）を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（p
H7.5）でカラムを平衡化した。次いで上記の上澄液をカ
ラムに供した。カラムを0.3M NaCl、0.5mM CaCl2、1m
Mベンズアミジン塩酸、0.5％（v/v）Lubrol PXを含む
0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で洗浄した後、1M Na
Cl、0.1mM EDTA、1mMベンズアミジン塩酸、0.5％（v/
v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
で溶出して2.0mlずつフラクションを集めた。溶出によ
って得られる各フラクションについて前記の方法でプロ
テインＣ活性化の促進作用を測定した。同時に島津製作
所（日本）製スペクトロフォトメーターUV−240を用い
て各フラクションの波長280nmにおける吸光度（A280）
を測定した。活性のある画分を回収し、0.1M NaCl、0.
5mM CaCl2、0.5％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）で透析した。得られた透析液を
２回目のDIP−トロンビン−アガロースカラムクロマト
グラフィーに供した。 即ち、透析液を1.5cmφ×10cmの大きさのDIP−トロン
ビン−アガロースカラムに通し、0.4M NaCl、0.5mM C
aCl2、0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）で洗浄後、さらに0.4M NaCl、0.1mM
EDTA、0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス緩衝
液（pH7.5）で洗浄し、次いで1M NaCl、0.5mM EDTA、
0.1％（v/v）Lubrol PXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）で溶出した。活性画分を回収し、精製品を−8
0℃で凍結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般
的な蛋白質の分子吸光係数にならない10.0（Ｅ１％ 1cm
・280nm＝10.0）と規定して、それに基づき精製品の量
を計算したところ約4.7μｇであった。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例18 プラスミドpSV2TMD4を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約4.5μｇで
あった。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例19 プラスミドpSV2TMD2を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約４μｇであ
った。 尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−10
％のグラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したと
ころ単一のバンドのみ確認された。 実施例20 プラスミドpSV2TMD1を用いる以外は実施例17と同様の
操作を行い本発明のペプチドの精製品を得た。この精製
品を用い、波長280nmにおける吸光度を測定した。この
精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数
にならい10.0（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、
それに基づき精製品の量を計算したところ約３μｇであ
った。 尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５−10％の
グラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ
単一のバンドのみ確認された。 実施例21 実施例11に記載した方法でプラスミドpSV2TMJ2及びプ
ラスミドpSV2−neoで形質転換したCHO細胞を直径10cmの
組織培養用プレート25枚を用いて培養した。培養後、培
養物を800rpmで10分間遠心分離にかけて細胞を集めた。
得られた細胞ペレットに、0.5％（v/v）トリトンＸ−10
0、0.25M庶糖、1mM、ベンズアミジン塩酸、0.5mM CaCl
2を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸濁
し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分間、５回
ホモジナイズして細胞抽出物を得た。得られた抽出物を
35,000g、10℃で60分間遠心分離にかけて上澄液を集め
た。この上澄液から実施例17に準じた操作により本発明
のペプチドの精製品を得た。この精製品を用い、波長28
0nmにおける吸光度を測定した。この精製品の分子吸光
係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数にならない10.0
（Ｅ１％ 1cm・280nm＝10.0）と規定して、それに基づき
精製品の量を計算したところ約３μｇであった。 尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度５−10％の
グラジェントを用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ
単一のバンドのみ確認された。 実施例22 （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認） 精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性化の促
進作用を次の方法にて評価した。即ち、0.1M NaCl、3.
6mM CaCl2、10mg/mlウシ血清アルブミンを含む0.02Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）に50μg/mlのプロテインＣ、5
nMのトロンビン及び5nMの精製した本発明のペプチドを
加えて37℃で反応させた。反応物に300μg/mlのアンチ
トロンビンIII（米国シグマ社製）および5mM EDTAを加
えて反応を停止して、生成した活性型プロテインＣの量
を前述の合成基質を用いる方法で測定した。結果を第30
図〜第34図に示すが、本発明のペプチドを無添加の場合
（Ｂ）では活性化プロテインＣの生成は認められなかっ
た（点線）が、本発明のペプチドを添加した場合（Ａ）
には、反応時間と共に生成した活性化プロテインＣの量
が増加した（実線）。 実施例23 （抗血液凝固作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンによるフィブリノーゲ
ンのフィブリンへの変換を阻害し、血液凝固を実質的に
阻害することはハインリッヒ アメルング社（独国）製
のコアギュロメーターKC−10を用いて血液凝固時間を測
定することによって調べた。即ち、5mM CaCl2、0.1M
NaClを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に3.0μｇ
のフィブリノーゲン（米国シグナル社製、フラクション
Ｉ）を加え、これに０−50nMの精製した本発明のペプチ
ドを加え、次いで、全量が0.4mlになるように10nMのト
ロンビンを加えて凝固時間を測定した。結果を第35図〜
第39図に示す。トロンビンにくらべ、添加した精製ペプ
チドの量が多くなるにしたがって、血液凝固時間が延長
されることが確認された。 実施例24 （血小板凝集抑制作用の確認） 本発明のペプチドがトロンビンの血小板凝集作用を実
質的に阻害することはSIENCO社（米国）製のプレートレ
ットアグリゴメーターを用いて評価した。即ち、30万ce
lls/μｌの血小板液（Platelet Rich Plasma、P.R.
P.）250μｌに１単位のトロンビン（約0.4μｇ）を加え
ると血小板が凝集するが、トロンビンを加える前にその
加えるトロンビンと等モル以上の精製した本発明のペプ
チドを加えておくと血小板の凝集が起きなかった。 〔適用例〕 以下に上記の各実施例で得られた種々の可溶性のペプ
チドの適用例を応用例をもって説明するが、本発明はそ
れら応用例により何ら限定されるものではない。 応用例１ 精製した本発明のペプチド 10 mg 精製ゼラチン 20 mg マンニトール 100 mg 塩化ナトリウム 7.8mg リン酸（１及び２）ナトリウム 15.4mg 上記成分を注射用蒸留水2mlに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解液を、無菌バイアルに入れ、−35℃で２時間予備凍
結し、−35℃で真空度0.075Torrで35時間一次乾燥し、
次いで30℃、真空度0.03Torrで５時間二次乾燥して、注
射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前
に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液500mlに溶解さ
れ、その溶解度は、点滴静注するのに用いられる。 応用例２ 精製した本発明のペプチド 2.5 mg アルブミン ５ mg マンニトール 25 mg 塩化ナトリウム 1.95mg リン酸（１及び２）ナトリウム 3.85mg 上記成分を注射用蒸留水2mlに溶解し、通常の製剤条
件により中性付近の注射用製剤を調製した。即ち、前記
溶解度を、無菌バイアルに入れ、−35℃で２時間予備凍
結し、−35℃で真空度0.075Torrで35時間一次乾燥し、
次いで30℃、真空度0.03Torrで５時間二次乾燥して、注
射用バイアルを製造した。得られた組成物は、投与直前
に生理食塩水もしくはブドウ糖注射液500mlに溶解さ
れ、その溶解液は、点滴静注するのに用いられる。 〔発明の効果〕 本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、血小板凝集抑
制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の少ない循環器
系疾患などの治療用薬として極めて有用な物質である。
また、本発明のペプチドは、このような医薬用途以外
に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテーテルなどの
医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防止する薬剤
といて用いることができる。
配列番号:1 配列の長さ:118 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:2 配列の長さ:59 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:3 配列の長さ:498 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:4 配列の長さ:354 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:1494 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:236 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:7 配列の長さ:575 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:8 配列の長さ:272 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:9 配列の長さ:708 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:1725 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:11 配列の長さ:816 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:1671 配列の型：塩基配列 配列の種類:DNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:557 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 配列番号:14 配列の長さ:462 配列の型：アミノ酸 配列 配列番号:15 配列の長さ:1386 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列
第１図はヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のDIP−トロンビン−アガロ
ースカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグラ
フである。 第２（ａ）〜第２（ｂ）図は参考例３−（２）で得られ
るDNA断片TM13の塩基配列を示すものである。 第３（ａ）図〜第３（ｄ）図は参考例３−（５）で得ら
れるDNA断片TM137の塩基配列を示すものである。 第４（ａ）図〜第４（ｂ）図は参考例３−（７）で得ら
れるDNA断片TMP5の塩基配列を示すものである。 第５図は参考例３−（10）で得られるDNA断片TMP26の塩
基配列を示すものである。 第６図は上記DNA断片TMP13、TM137、TMP5およびTMP26と
参考例３−（13−１）及び３−（13−２）で得られるDN
A断片TMJ1とTMJ2の各制限酵素地図と、これらのDNA断片
の有する塩基配列における対応関係を示すものであり、
縦方向にみて各DNA断片の互いに重なる部分は共通の塩
基配列を有することを示す。図中DNA断片TMJ2の制限酵
素地図の斜視部分は斜交線部分とを含む部分は考えられ
るオープンリーディングフレームであり、斜交線部分に
本発明の塩基配列が存在するものである。 第７図はTMJ1とそれに結合したTMP5を含有するプラスミ
ドpUC18TMJ1の構築を示すフローチャートである。 第８図はTMJ1とそれに結合したTMP26を含有するプラス
ミドpUC18TML2の構築を示すフローチャートである。 第９図はTMJ2を動物細胞宿主用発現ベクターに挿入する
ことによりプラスミドpSV2TMJ2の構築を示すフローチャ
ートである。 第10図は実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドＭ−13mp19TMJ3にディリーターTMDが相補的
にハイブリダイズしたところを示すものであり、ディリ
ーターがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周
辺の塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸
配列を示すものである。 第11図は実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え体
プラスミドpSV2TMD1にディリーターTMd2が相補的にハイ
ブリダイズしたところを示すものであり、ディリーター
がプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の塩
基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列を
示すものである。 第12図は実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドＭ−13mp19TMJ3にディリーターTMd3が相補的
にハイブリダイズしたところを示すものであり、ディリ
ーターがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周
辺の塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸
配列を示すものである。 第13図は実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドM13−TMD3にディリーターTMd2が相補的にハ
イブリダイズしたところを示すものであり、ディリータ
ーがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の
塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列
を示すものである。 第14図は実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドM13−TMD3にディリーターTMd4が相補的にハ
イブリダイズしたところを示すものであり、ディリータ
ーがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の
塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列
を示すものである。 第15（ａ）図〜第15（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD5−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第16（ａ）図〜第16（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD4−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第17（ａ）図〜第17（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD2−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第18（ａ）図〜第18（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD1−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第19（ａ）図〜第19（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMJ2−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第20図はプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第21図はプラスミドpSV2TMD4でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第22図はプラスミドpSV2TMD2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第23図はプラスミドpSV2TMD1でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第24図はプラスミドpSV2TMJ2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第25図はプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第26図はプラスミドpSV2TMD4でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第27図はプラスミドpSV2TMD2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第28図はプラスミドpSV2TMD1でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第29図はプラスミドpSV2TMJ2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のDIP−トロンビン−アガロ
ースカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグラ
フである。 第２（ａ）〜第２（ｂ）図は参考例３−（２）で得られ
るDNA断片TM13の塩基配列を示すものである。 第３（ａ）図〜第３（ｄ）図は参考例３−（５）で得ら
れるDNA断片TM137の塩基配列を示すものである。 第４（ａ）図〜第４（ｂ）図は参考例３−（７）で得ら
れるDNA断片TMP5の塩基配列を示すものである。 第５図は参考例３−（10）で得られるDNA断片TMP26の塩
基配列を示すものである。 第６図は上記DNA断片TMP13、TM137、TMP5およびTMP26と
参考例３−（13−１）及び３−（13−２）で得られるDN
A断片TMJ1とTMJ2の各制限酵素地図と、これらのDNA断片
の有する塩基配列における対応関係を示すものであり、
縦方向にみて各DNA断片の互いに重なる部分は共通の塩
基配列を有することを示す。図中DNA断片TMJ2の制限酵
素地図の斜視部分は斜交線部分とを含む部分は考えられ
るオープンリーディングフレームであり、斜交線部分に
本発明の塩基配列が存在するものである。 第７図はTMJ1とそれに結合したTMP5を含有するプラスミ
ドpUC18TMJ1の構築を示すフローチャートである。 第８図はTMJ1とそれに結合したTMP26を含有するプラス
ミドpUC18TML2の構築を示すフローチャートである。 第９図はTMJ2を動物細胞宿主用発現ベクターに挿入する
ことによりプラスミドpSV2TMJ2の構築を示すフローチャ
ートである。 第10図は実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドＭ−13mp19TMJ3にディリーターTMDが相補的
にハイブリダイズしたところを示すものであり、ディリ
ーターがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周
辺の塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸
配列を示すものである。 第11図は実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え体
プラスミドpSV2TMD1にディリーターTMd2が相補的にハイ
ブリダイズしたところを示すものであり、ディリーター
がプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の塩
基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列を
示すものである。 第12図は実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドＭ−13mp19TMJ3にディリーターTMd3が相補的
にハイブリダイズしたところを示すものであり、ディリ
ーターがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周
辺の塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸
配列を示すものである。 第13図は実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドM13−TMD3にディリーターTMd2が相補的にハ
イブリダイズしたところを示すものであり、ディリータ
ーがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の
塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列
を示すものである。 第14図は実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え体
プラスミドM13−TMD3にディリーターTMd4が相補的にハ
イブリダイズしたところを示すものであり、ディリータ
ーがプラスミドにハイブリダイズしている部分の周辺の
塩基配列とそれによってコードされているアミノ酸配列
を示すものである。 第15（ａ）図〜第15（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD5−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第16（ａ）図〜第16（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD4−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第17（ａ）図〜第17（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD2−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第18（ａ）図〜第18（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMD1−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第19（ａ）図〜第19（ｂ）図は本発明の複製可能な組換
え体DNAであるプラスミドpdBPVTMJ2−１の構築を示すフ
ローチャートである。 第20図はプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第21図はプラスミドpSV2TMD4でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第22図はプラスミドpSV2TMD2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第23図はプラスミドpSV2TMD1でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第24図はプラスミドpSV2TMJ2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在下及び非存
在下における、プロテインＣとトロンビンとの反応によ
って生成した活性化プロテインＣの量と反応時間との関
係を示すグラフである。 第25図はプラスミドpSV2TMD5でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第26図はプラスミドpSV2TMD4でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第27図はプラスミドpSV2TMD2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第28図はプラスミドpSV2TMD1でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。 第29図はプラスミドpSV2TMJ2でトランスフォームした細
胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加した血液の
凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加量との関係
を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願昭62−305876 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305877 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305878 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
Claims (4)
- 【請求項１】少なくともアミノ酸配列として、次式 で表される１−498のアミノ酸配列からなるトロンビン
に結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有するペプチド。 - 【請求項２】該ペプチドが、実質的に他のヒト成分を含
まない精製された組換ペプチドであることを特徴とする
請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項３】該ペプチドが糖鎖が付いた、または糖鎖が
付かないペプチドである請求項１または２に記載のペプ
チド。 - 【請求項４】該ペプチドが、界面活性剤を含有する請求
項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
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Applications Claiming Priority (13)
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| JP106687 | 1987-01-08 | ||
| JP106587 | 1987-01-08 | ||
| JP14408187 | 1987-06-11 | ||
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| JP62-305878 | 1987-12-04 | ||
| JP62-1066 | 1987-12-04 | ||
| JP30587887 | 1987-12-04 | ||
| JP30587787 | 1987-12-04 | ||
| JP62-144081 | 1987-12-04 | ||
| JP62-305877 | 1987-12-04 | ||
| JP30587687 | 1987-12-04 | ||
| JP62-1065 | 1987-12-04 | ||
| JP63002027A JP2738428B2 (ja) | 1987-01-08 | 1988-01-08 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチド |
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| JP6119200A Division JP2824392B2 (ja) | 1994-05-31 | 1994-05-31 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する培養上澄液 |
| JP6119199A Division JP2766779B2 (ja) | 1994-05-31 | 1994-05-31 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドをコードするｄｎａ |
| JP8138587A Division JP2824418B2 (ja) | 1987-01-08 | 1996-05-31 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する医薬組成物 |
| JP8138589A Division JP2899561B2 (ja) | 1987-01-08 | 1996-05-31 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチドのシグナル配列 |
| JP8138588A Division JP2766473B2 (ja) | 1987-01-08 | 1996-05-31 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS646219A JPS646219A (en) | 1989-01-10 |
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Family
ID=27563108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63002027A Expired - Lifetime JP2738428B2 (ja) | 1987-01-08 | 1988-01-08 | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチド |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1988
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 生化学第５７巻 第８号（１９８５）Ｐ．１１０２ |
Also Published As
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