JP2899561B2 - トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチドのシグナル配列 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トロンビンに結合
し、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用を
有するペプチドの製造に有利なシグナル配列をコードす
るＤＮＡ、およびそのシグナル配列をコードするＤＮＡ
を用いた、トロンビンに結合し、トロンビンのプロテイ
ンＣ活性化を促進する作用を有するペプチドの製造法に
関する。本発明の製造法の目的とするペプチドは、血栓
溶解作用、抗血液凝固作用及び血小板凝集抑制作用を有
し、したがって、血液凝固を制御するための、または血
小板凝集を制御するための医薬組成物として、循環器系
の疾患の治療に有用なペプチドである。

【０００２】本明細書において、アミノ酸及びペプチド
は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃ
ＢＮ）で採用された略号を用いて表される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。更に、特に明示しな
い限りペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞ
れＮ末端およびＣ末端である。

【０００３】Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ：プロリン残基 Ｔｙｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌｙｓ：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙ：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基 Ｔｈｒ：スレオニン残基 Ｉｌｅ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：トリプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃｙｓ：システイン残基

【０００４】また、ポリデオキシリボヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチドは下記の如き略号で表されるデオ
キシリボヌクレオチドの配列により表記する。 Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 特に明示しない限りデオキシリボヌクレオチド配列の左
端及び右端はそれぞれ５′末端及び３′末端である。

【０００５】

【従来の技術】現在、血栓溶解剤として用いられるもの
には、ストレプトキナーゼやウロキナーゼがある。ま
た、抗血液凝固剤としてはヘパリンやワーファリンが用
いられている。さらに、血小板凝集抑制剤としてはアス
ピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール等が使わ
れている。これらの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血
小板凝集抑制剤は、それぞれ別個に、あるいは併用し
て、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓症、末梢血管閉塞
症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症等の疾患
の治療及び予防に用いられている。しかしながら、これ
らの血栓溶解剤、抗血液凝固剤および血小板凝集抑制剤
は非常に複雑な機構から成り立つ血液の凝固線溶系の極
く一部に作用するにすぎない。そこで、血液の凝固線溶
系に広く作用し、優れた血液凝固抑制作用を示す薬剤が
要望されていた。

【０００６】ところで、血液凝固機構において重要な役
割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質としてプロテ
インＣが知られている。近年、そのプロテインＣの活性
化を促進し、トロンビンの作用による血小板の活性化と
フィブリン形成を抑制する物質が、ウサギの肺、ウシの
肺、ヒトの肺やヒト胎盤などに存在し、それが前述の薬
剤に比べて優れた血液凝固抑制作用を有することが報告
されている。

【０００７】ウサギ肺に存在する物質については、例え
ばシー ティー エスモン（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、
プロシーディング オブ ナショナル アカデミー オ
ブサイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７８巻、２２４９頁（１９
８１年）；エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏ
ｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８
５９頁（１９８２年）；シー ティー エスモン（Ｃ．
Ｔ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、
２５７巻、７９４４頁（１９８２年）；エヌ エル エ
スモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら、ザ ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）、２５８巻、１２２３８頁（１９８２年）を
参照することができる。

【０００８】ウシの肺に存在する物質については、例え
ば楠本ら、生化学、５６巻、８９０頁（１９８４年）を
参照することができる。また、ヒト胎盤に存在する物質
については、例えば特開昭６０−１９９８１９；黒沢
ら、日本血液学会誌、４７巻、６３２頁（１９８４
年）；エッチ エッチ サーレム（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅ
ｍ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５９巻、１２２
４６頁（１９８４年）；エス．クロサワ（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｓａｗａ）ら、トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３７巻、３５３頁（１
９８５年）を参照することができる。また、ヒト肺に存
在する物質については、例えば楠本ら、生化学、５７
巻、１１０２頁（１９８５年）を参照することができ
る。

【０００９】上記の先行技術文献には上記物質の一般的
性質が記載されている。しかしながら、その物質の構
造、例えばアミノ酸配列などは解明されておらず、未だ
にその物質は同定されていない。従って、上記の先行技
術文献に報告されている物質が単一物質であるか否か、
また、これらの先行技術文献の記載にしたがって同一の
物質が繰返し得られるか否かについては全く不明であ
る。また、これらの物質のアミノ酸配列の長さを始め、
その物質をコードするＤＮＡの塩基配列やその制限酵素
サイトについての情報など全く手掛かりのない状態であ
って、遺伝子操作による技術も適用することが困難な状
況であった。さらに、先行技術の上記物質は、ヒトの組
織や器官を取得源としており、大量に調製するには困難
なものであった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】これらの物質を、単一
物質として、安定的に、大量に提供できる方法が求めら
れていた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の技
術的背景にあって、トロンビンに結合し、トロンビンに
よるプロテインＣ活性化を促進するペプチドを、安定的
に、大量に取得する方法の検討に着手し、先ず、該ペプ
チドの遺伝子を見出すべく鋭意研究を重ねた。本発明の
ペプチド全長を含むヒト由来のｃＤＮＡの取得は困難を
極め、本発明の参考例や実施例に詳細に示される通り、
最初に行ったヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからのクロー
ニングにおいて、何度実施しても結局、全長ｃＤＮＡを
含むクローンの取得が不可能であった。

【００１２】即ち、ここで最終的に得られたＴＭ１３７
の５’末端側の塩基配列情報を参考に、さらに５’末端
側へ延長されたクローンの取得を何度も試みたが、これ
以上５’末端側へ延長したクローンは取得できず、結
局、該ペプチドのＮ末端をコードするクローンが取得で
きないばかりか、結果的に確認されたことだが、該ペプ
チドのコード領域の塩基配列において半分程度しか取得
できない結果と終わった。これは、該ペプチド全長を含
むｍＲＮＡが、かなり大きいものであり、都合よくペプ
チド全長をコードする部分をｃＤＮＡとして逆転写でき
なかった、あるいは配列的な特徴により逆転写しにくい
構造をとっていたものと理解されるが、いずれにしても
この状況においては、ｃＤＮＡ断片の繋ぎ合わせにより
全長ｃＤＮＡを作成することさえも不可能であった。

【００１３】そこで本発明者らは、ヒトさい帯内皮細胞
からｃＤＮＡライブラリーを調製し、このｃＤＮＡライ
ブラリーにおいて、先に得られた５’末端側の塩基配列
情報を参考にして、クローンの選択を行った結果、ＴＭ
Ｐ５、さらにＴＭＰ２６を取得することに成功し、これ
らを繋ぎ合わせて該ペプチドの全長ｃＤＮＡを調製する
に至った。従来より、しばしば経験されることである
が、全長ｃＤＮＡの取得は、採用するｃＤＮＡライブラ
リーの種類や、目的とする配列の特徴により、成功する
こともあれば不可能であることもあり、これは即ち、ｃ
ＤＮＡライブラリーを調製するに当たって使用するｍＲ
ＮＡをいずれの組織から取得するかまたはその時に使用
する試薬や手法等により左右されるものでもある。

【００１４】このＤＮＡは、十分な洞察と経験と試行錯
誤の結果取得することができるに至ったものであり、従
来なし得なかった貴重な技術をこの分野に提供するもの
と位置づけられる。取得された該ＤＮＡの細部を詳細に
検討したところ、トロンビンに結合し、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進するペプチドをコードする
塩基配列の５’末端に、新規な構造を有する特定のアミ
ノ酸配列からなるリーダー配列（以下、シグナル配列と
もいう）をコードする塩基配列を見い出した。そして、
このシグナル配列をコードする塩基配列を用いて、トロ
ンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣ活性化
を促進する種々のペプチドをコードするＤＮＡにおける
遺伝情報の発現を検討した結果、それらの種々のペプチ
ドが十分に分泌発現されていることを確認し、本発明の
製造法を確立するに至った。

【００１５】本発明に関する先行技術文献にて、トロン
ビンによるプロテインＣ活性化を促進する性質を有する
公知のペプチド自体が仮に、物質として開示されていた
としても、その情報から、シグナル配列の具体的な情報
が判明する訳ではなく、シグナル配列が関与していると
の明確かつ具体的な証拠となる訳でもなく、トロンビン
によるプロテインＣ活性化を促進するペプチドの製造に
おいて、本発明が、極めて高い貢献をなしたことは十分
に理解される。

【００１６】本発明の製造方法により製造目的のペプチ
ドはトロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイン
Ｃ活性化を促進して血液凝固を制御することが確認され
た。また、組換えＤＮＡ技術によって他のヒト由来蛋白
をまったく含まない純粋な形態で、大量にかつ容易に製
造でき、医薬として利用しやすいことを確認した。本発
明の製造法によれば、トロンビンに結合し、トロンビン
によるプロテインＣ活性化を促進する性質を有する各種
のペプチドを安定的に、大量に製造することができ、本
発明の利益は莫大なものである。特に、培養上澄液に分
泌せしめた特徴点を有する本発明の態様は、精製等に極
めて大きなメリツトを有することは明らかである。

【００１７】即ち本発明は、次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる
ＤＮＡである。上記のＤＮＡとしては、上記式のアミノ
酸配列をコードすれば特に限定されないが、より具体的
には、配列番号１５の１−５４の塩基配列が好ましい例
として挙げられる。これらのＤＮＡは、後述する通り、
トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの
活性化を促進する作用を有するペプチドのシグナル配列
用の塩基配列として有用な典型的な例である。

【００１８】また本発明は、トロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
するペプチドの製造方法にして、 （ａ）トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイ
ンＣの活性化を促進する作用を有するペプチドをコード
する塩基配列の５’末端に、前記ペプチドを分泌し得る
シグナル配列をコードする塩基配列を配置せしめた構造
を含有するＤＮＡを、複製可能な発現ベクターと結合し
て、該ＤＮＡと該複製可能な発現ベクターとを含有する
複製可能な組換え体ＤＮＡを得、但し、ここで、ペプチ
ドを分泌し得るシグナル配列は、 （ｉ）次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表される
アミノ酸配列をコードする塩基配列、又は、 （ｉｉ）前記（ｉ）に記載のアミノ酸配列の１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、後記のトロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
ペプチドを分泌し得るシグナル配列をコードする塩基配
列、のいずれかであり、またトロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
するペプチドをコードする塩基配列は、 （ｉｉｉ）配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列、又は、 （ｉｖ）前記配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列の
アミノ酸残基の削除、付加、または置換を施すことによ
り得られるアミノ酸配列を有し、トロンビンに結合し、
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
を有するペプチドをコードする塩基配列、のいずれかで
ある、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて、該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離するこ
とを特徴とする該ペプチドの製造方法である。

【００１９】本発明のトロンビンに結合し、トロンビン
によるプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペ
プチド（以下、単にペプチドということもある）は、ト
ロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活
性化を促進する作用を有するペプチドであれば、特に限
定されることはないが、後述の通り、好ましい例とし
て、例えば該形質転換体の培養上澄液に界面活性剤の非
存在下で可溶性であることが挙げられる。また、他の例
としては界面活性剤の非存在下で可溶性でないものも挙
げられる。

【００２０】本発明の製造法のペプチドが、トロンビン
に結合することは、例えば、本明細書の実施例に記載さ
れているように、ＤＩＰ−トロンビン〔ジイソプロピル
ホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、またはＤＩＰ−ト
ロンビン−アガロースに結合することにより確認され
る。また、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する活性を有することも、本明細書の実施例に記載さ
れている通りに確認できる。本発明の製造法のペプチド
の構造は、本発明のシグナル配列をコードする塩基配列
の３’末端に配置する、トロンビンに結合し、トロンビ
ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
ペプチドをコードする塩基配列により規定され、種々の
塩基配列を用いることができる。

【００２１】本発明の製造法のペプチドとしては、例え
ば、配列番号１３の１−５５７のアミノ酸配列からなる
ペプチドを挙げることができる。従来種々のペプチドに
おいては多型性と呼ばれる自然の変異も存在することが
知られている。そして、自然の変異によりまたは人工の
変異により、ペプチドの活性および可溶性に重大な変化
を与えることなく、ペプチドの構造の一部を変化させる
ことが可能である。本発明の目的ペプチドは、トロンビ
ンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を
促進する作用を有する限り、前記アミノ酸配列を有する
ペプチドの相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒ
ｉａｎｔ）に相当する構造を有するペプチドも包含す
る。

【００２２】本発明のシグナル配列をコードする塩基配
列の３’末端に、トロンビンに結合し、トロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチ
ドをコードする塩基配列を配置せしめた構造を含有する
ＤＮＡを調製するに当たっては、勿論、本発明のシグナ
ル配列をコードする塩基配列とペプチドをコードする塩
基配列をそれぞれを分離して取得した上で結合したり、
またはシグナル配列をコードする塩基配列と目的ペプチ
ドをコードする塩基配列が本発明の要求通りに配置され
たＤＮＡを直接全合成して調製することもできるが、通
常、本発明の参考例および実施例に準じて取得した全長
ｃＤＮＡ自体を用いることも好ましい。図４０の制限酵
素地図に示された制限酵素サイトを有することを特徴と
する塩基配列のＤＮＡ（図１１の一部分を示す）や、特
に斜線部と斜交線部を合わせた部分のＤＮＡが挙げられ
る。

【００２３】なお、図４０の制限酵素地図における開始
コドンの最初の塩基から終始コドンの直前の塩基までの
長さは１７２５ｂｐの長さであり、斜線部は本発明のシ
グナル配列をコードする塩基配列を示し、斜交線部はヒ
ト本来のアミノ酸配列の、トロンビンに結合し、トロン
ビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有す
るペプチドをコードする塩基配列を示す。これらのＤＮ
Ａを、後述の方法にて、複製可能な発現ベクターと結合
して、該ＤＮＡと該複製可能な発現ベクターとを含有す
る複製可能な組換え体ＤＮＡを得、次いで、上記の
（ｂ）〜（ｅ）の工程を順次行えばよい。

【００２４】例えば、実施例の動物細胞で、本発明のシ
グナル配列をコードする塩基配列を用い、全長ｃＤＮＡ
の遺伝情報を発現した場合には、このヒト由来のペプチ
ドは細胞膜上に分泌発現・濃縮され、培養液中には活性
が検知されないので、トリトンＸ−１００等の界面活性
剤の存在下調製する。また本発明で、最も好ましい性質
を与えるペプチドとしては、トロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
する他に、該形質転換体の培養上澄液に界面活性剤の非
存在下で存在する可溶性を有するペプチドが挙げられ
る。

【００２５】このように、ペプチドが可溶性である場合
には、本発明のシグナル配列の存在は最大の効果を示
す。即ち、形質転換体が産生する可溶性のペプチドは分
泌されて培養上澄液に溶解し、該培養上澄液から界面活
性剤の非存在下で、可溶性のペプチドを採取することが
可能であり、操作が簡単であるばかりでなく、そのペプ
チドを医薬組成物として使用するに際しても、やっかい
な混入タンパクを最小限にできるという極めて有用な面
が指摘できる。勿論、ペプチドが可溶性であることは、
それ自体で極めて好ましいことである。

【００２６】例えば、従来のペプチドは、界面活性剤の
非存在下では不溶性であり、不溶物が存在する注射剤と
しないために界面活性剤の添加を必須とするが、種々の
問題を有する循環器疾患の患者において、この界面活性
剤の添加は予想外の問題を引き起こす可能性は否定でき
ないし、また界面活性剤の添加量との兼ね合いもあっ
て、必ずしも十分に高い含有濃度の製剤が調製できない
可能性もあることが考えられる。これに対し、本発明の
製造方法で製造し得る可溶性のペプチドは、可溶性であ
るが故に、これらの問題はことごとく解決されるもので
ある。また、医薬組成物を製造をする場合においても、
本発明の可溶性であるペプチドが極めて有利であること
は当然のことであって、例えば、精製が容易であるこ
と、製剤にするときに凍結乾燥等が容易であること等が
挙げられる。

【００２７】可溶性の本発明のペプチドを製造する方法
は以下の通りである。即ち、本発明は、トロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有し、且つ培養上澄液に溶解する性質を有する
ペプチドの製造方法にして、 （ａ）トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイ
ンＣの活性化を促進する作用を有し、且つ培養上澄液に
溶解する性質を有するペプチドをコードする塩基配列の
５’末端に、前記ペプチドを分泌し得るシグナル配列を
コードする塩基配列を配置せしめた構造を含有するＤＮ
Ａを、複製可能な発現ベクターと結合して、該ＤＮＡと
該複製可能な発現ベクターとを含有する複製可能な組換
え体ＤＮＡを得、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
Ａを発現させて、該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを、該形質転換体の培養上澄液から単
離することを特徴とする該ペプチドの製造方法である。
本発明において、トロンビンに結合し、トロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチ
ド、好ましくはさらに培養上澄液に溶解する性質を有す
るペプチドを分泌し得るシグナル配列をコードする塩基
配列は、特に限定されず、典型的な例としては、（ｉ）
次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌ
ｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏのアミノ酸
配列が挙げられる。この典型的なシグナル配列をコード
する塩基配列に代えて、同様の効果を示すシグナル配列
をコードする塩基配列（すなわち、上記（ｉ）に記載の
アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、トロンビン
に結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促
進する作用を有するペプチドを分泌し得るシグナル配列
をコードする塩基として表記される）を用いることがで
きることは、当業者には容易に理解され、実行し、検討
を行うことができる。

【００２８】本発明の目的ペプチドは、実質的に精製さ
れた下記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）〜（ｆ）に規定される
ペプチド、又はさらに好ましくは下記（ａ）〜（ｆ）に
規定される可溶性ペプチドである。（ａ）トロンビンに
結合し、該（可溶性）ペプチドがＤＩＰ−トロンビン−
アガロースカラムに結合せしめたときに、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩
酸、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノールを含む０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により溶出できる。 （ｂ）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用を有する、 （ｃ）少なくとも界面活性剤の非存在下で可溶性であ
る、 （ｄ）トロンビンによる凝固時間を延長する、 （ｅ）トロンビンによる血小板凝集を抑制する、 （ｆ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にて、銀染色
が可能である。 また、本発明のペプチドが、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．
５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．５％（ｖ／ｖ）ポリドカノー
ルを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
より平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラム
に、該緩衝液にて該可溶性ペプチドを溶解せしめた溶液
を接触せしめた場合に、該可溶性ペプチドが前記カラム
に結合せしめることができる性質を有する場合も好まし
い。また、本発明のペプチドが、少なくとも、Ａｌａ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎのアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とする場合も好ましい。本発明の目的ペプ
チドの最も好ましい具体例としては、例えば、配列番号
１の１−１１８のアミノ酸配列、即ち、下記式（Ｉ）： Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｃ
ｙｓ Ｐｈｅ ＡｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｎ ＰｒｏＬｅｕ Ａ
ｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｃｙ
ｓ ＶａｌＣｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｉｌｅ ＰｒｏＨｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒ
ｏ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｐｈｅ
Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ ＡｓｐＣｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ ＣｙｓＧｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅ
ｕ ＡｓｐＡｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ ＡｓｐＧｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ ＴｈｒＰｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ ＳｅｒＡｌａ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ ＡｓｐＣｙｓ で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドが例示され
る。勿論、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、最も好
ましい例であって、上記の活性に程度の差があっても、
上記の活性が認められる限り、特に式（Ｉ）で表される
アミノ酸配列に拘泥する必要はない。

【００２９】即ち、本発明のペプチドは実質的に前記式
（Ｉ）で表されるアミノ酸配列から成っていてもよい
し、また、その作用と機能を阻害しない限り若干の欠
損、挿入、置換等があっても、その相同変異体のアミノ
酸配列であってもよく、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配
列のＮ末端及び／またはＣ末端に結合した少なくとも１
種の他のペプチドのアミノ酸配列を更に含有してもよ
い。

【００３０】また、可溶性の本発明のペプチドとして
は、例えば、配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列の
全配列又はその部分配列からなり、トロンビンに結合
し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
作用を有するペプチドであることも好ましい。また、ペ
プチドが、配列番号８の１−２７２のアミノ酸配列、ま
たはその部分配列からなり、トロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
するペプチドであることも好ましい。また、ペプチド
が、配列番号６の１−２３６のアミノ酸配列、またはそ
の部分配列からなり、トロンビンに結合し、トロンビン
によるプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペ
プチドであることも好ましい。

【００３１】ちなみに、これらの可溶性の本発明のペプ
チドのさらに具体的な例としては、 （１）上記の式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチド
の他、下記のペプチドの（２）〜（５）が挙げられる。 （２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のＮ末端に下記
のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号６の１−２３
６のアミノ酸配列）。

【００３２】（３）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号８の１−２７
２のアミノ酸配列）。

【００３３】（４）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列の
Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ下記のアミノ酸配列： Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ 及び Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ が結合してなるペプチド（即ち、配列番号３の１−４９
８のアミノ酸配列）。

【００３４】（５）配列番号１６の１−４６２のアミノ
酸配列からなるペプチド。 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys

【００３５】従来、種々のペプチドにおいては多型性と
呼ばれる自然の変異も存在することが知られている。そ
して、自然の変異によりまたは人工の変異により、ペプ
チドの活性および可溶性に重大な変化を与えることな
く、ペプチドの構造の一部を変化させることが可能であ
る。本発明のペプチドは、トロンビンに結合し、トロン
ビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有す
る限り、前記アミノ酸配列を有するペプチドの相同変異
体（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｖａｒｉａｎｔ）に相当する
構造を有するペプチドも包含する。また、シグナル配列
についても、同様のことが言える。本発明において、ト
ロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活
性化を促進する作用を有し、且つ培養上澄液に溶解する
性質を有するペプチドをコードする塩基配列が、 （ｉ）配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列をコード
する塩基配列、又は、 （ii）前記配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列のア
ミノ酸残基の削除、付加または置換を施すことにより得
られるアミノ酸配列を有し、トロンビンに結合し、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
し、且つ培養上澄液に溶解する性質を有するペプチドを
コードする塩基配列、のいずれかが好ましい例として挙
げられる。

【００３６】本発明のペプチドは少なくとも１個の糖残
基を含有していてもよいし、含有していなくてもよい。
即ち、本発明では少なくともアミノ酸配列として、本明
細書に説明された配列であることを示すものであって、
特に糖残基により限定されるものではない。

【００３７】上記のシグナル配列をコードする塩基配列
の３’末端に配置せしめるべき、トロンビンに結合し、
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
を有し、且つ培養上澄液に溶解する性質を有するペプチ
ドをコードする塩基配列としては、例えば、上述の各種
のアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列や、その他
適宜のアミノ酸配列をコードする塩基配列等、特に、配
列番号１の１−１１８、配列番号３の１−４９８、配列
番号６の１−２３６、配列番号８の１−２７２および配
列番号１６の１−４６２からなる群より選ばれたアミノ
酸配列のいずれかをコードする塩基配列が例示される。
また、さらに可溶性の本発明のペプチドをコードする塩
基配列における好ましい例を示すとすれば、以下の例が
挙げられる。

【００３８】例えば、次式（II）（即ち、配列番号４の
１−３５４の塩基配列）： ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧ ＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧ ＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣ ＡＡＣＴＧＣＧＡＧＴ ＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡ ＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣ ＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴ ＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴ ＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧ ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＣ ＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ ＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣ ＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡ ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡ ＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ ＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣ ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧ ＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧ ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧ ＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧ ＣＡＣＧＧＡＣＡＴＣ ＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧ ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣ ＡＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣ ＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＡ ＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴ ＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡ ＴＴＧＧＣＡＣＣＧＡ ＣＴＧＴ で表される塩基配列を含有するＤＮＡである。

【００３９】遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくその
遺伝子の塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の
塩基に置換することができる。本発明のＤＮＡはまた、
遺伝略号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配
列を含有することも可能である。この場合、上記置換に
より得られた塩基配列から演繹されるアミノ酸配列は前
に定義したアミノ酸配列と一致する。

【００４０】本発明のＤＮＡは前記式（II）で表される
塩基配列と、その５′末端および／または３′末端に結
合した少なくとも１種の他の塩基配列とを含有していて
もよい。式（II）で表される塩基配列と少なくとも１種
の他の塩基配列とを含有するＤＮＡの例としては下記の
ＤＮＡ（１）〜（５）が挙げられる。（１）上記式（I
I）で表されるＤＮＡ（即ち、配列番号４の１−３５４
の塩基配列）。

【００４１】（２）式（II）で表される塩基配列とその
５′末端に結合した次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号９の１−７０８の塩基配列）。

【００４２】（３）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧ ＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＧＣＧＴＧＣＡＡＴＧ ＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧ ＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣ ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧ ＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴ ＧＣＡＡＣＧＡＣＣＴ ＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡ ＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣ ＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧ ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡ ＣＣＧＧＴＧＣＧＡＧ ＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣ ＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴ ＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣ ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡ ＧＴＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号１１の１−８１６の塩基配列）。

【００４３】（４）式（II）で表される塩基配列の５′
末端および３′末端に夫々次式： ＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧ ＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＴＧＣＧＴＣＧ ＡＧＣＡＣＧＡＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣ ＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣ ＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴ ＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴ ＧＣＧＡＣＧＧＡＣＴ ＧＣＧＧＧＧＣＣＡＣ ＣＴＡＡＴＧＡＣＡＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣ ＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣ ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ ＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴ ＧＡＡＣＧＧＣＧＡＣ ＧＧＣＧＧＣＧＴＴＧ ＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＣＡＣＣＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣ ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣ ＣＡＧＴＧＧＧＴＴＡ ＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ ＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ ＴＡＴＡＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴ ＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴ ＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣ ＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣ ＧＴＴＧＴＧＣＧＴＣ ＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧ ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣ ＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣ ＡＧＣＧＡＧＣＣＧＡ ＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧ ＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴ ＣＣＴＣＴＧＣＧＡＧ ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧ ＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣ ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＴＣＧＡＴＣＡ ＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣ ＣＣＣＧＴＴＣＧＣＧ ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＧ ＣＧＧＡＣＴＴＣＣＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧ ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴ ＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴ ＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣ ＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣ ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＧＡＧＣＧＧＴＣＣ ＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧ ＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧ ＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧ ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧ ＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣ ＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣ ＡＡＣＧＡＣＣＴＣＴ ＧＣＧＡＧＣＡＣＴＴ ＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣ ＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣ ＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＧＧＴＧＣＧＡＧＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣ ＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧ ＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣ ＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡ ＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧ ＴＧＧＣＴＴＣＧＡＧ ＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴ ＡＣＣＣＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧ ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴ ＧＴ 及び ＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡ ＡＧＧＴＧＧＡＣＧＧ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＣ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣ ＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ ＡＴＴＣＧＧＧＣ で表される塩基配列が結合してなるＤＮＡ（即ち、配列
番号５の１−１４９４の塩基配列）。

【００４４】配列番号１７の１−１３８６の塩基配列か
らなるＤＮＡ。 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC GACTGT

【００４５】上記の可溶性の本発明のペプチドをコード
する塩基配列の好ましい例をさらに挙げれば、図４０の
制限酵素地図において、斜交線部分の塩基配列から、少
なくとも、下記のアミノ酸配列： Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ をコードする塩基配列を削除することにより調製できる
塩基配列が挙げられる。

【００４６】本発明のペプチドをコードする塩基配列の
ＤＮＡは、例えば、以下のようにして得ることができ
る。なお、この方法においては、シグナル配列をコード
する塩基配列の３’末端は、本発明の目的ペプチドをコ
ードする塩基配列が配置されており、本発明でいうシグ
ナル配列をコードする塩基配列の３’末端に、本発明の
可溶性のペプチドをコードする塩基配列を配置せしめた
構造を含有するＤＮＡの調製法としての位置づけもでき
る。

【００４７】（１）トロンビンのプロテインＣ活性化を
促進することのできるヒト肺由来のペプチドに特異的
な、ウサギから得られる抗体を用いて、ヒト肺から調製
したｃＤＮＡライブラリーからその抗体と結合するペプ
チドをコードするｃＤＮＡ断片を単離し、単離したｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列を分析する。得られたｃＤＮＡ断片
はトロンビンのプロテインＣ活性化を促進することので
きるヒト肺由来のペプチドの一部分をコードしている。
その部分はそのペプチドのＣ末端を含むがＮ末端を含ま
ない。

【００４８】（２）上述のように、得られたｃＤＮＡ断
片はヒト肺由来のペプチドの全アミノ酸配列をコードし
ておらず、そのペプチドのＮ末端アミノ酸配列に対応す
る塩基配列を欠いているので、Ｎ末端アミノ酸配列をコ
ードするｃＤＮＡ断片を上記工程（１）で得られるｃＤ
ＮＡ断片を利用して通常の公知のプライマー エクステ
ンション法により以下のようにして得る。まず、上記工
程（１）で得られたｃＤＮＡ断片のコードするペプチド
のＮ末端側のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ断片の一
部分を有機化学合成する。次に、合成したＤＮＡをプラ
イマーとして用いて通常の公知のプライマーエクステン
ション法によりヒトさい帯内皮細胞より調製したポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡから上記工程（１）で得られるｃＤＮＡ
断片の５′末端の上流の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片
を得る。上記プライマーエクステンションを繰り返すこ
とによりヒト肺由来のペプチドのＮ末端アミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡ断片を得る。

【００４９】（３）次に、前記工程（１）及び（２）で
得られたｃＤＮＡ断片を適宜結合することにより、開始
コドンから始まる１７２５塩基対（以下“ｂｐ”と略す
る）のオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮ
Ａ（以下“ｃＤＮＡ−Ａ”と略する）を得る。このオー
プンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１０
の１−１７２５の塩基配列である。またリーダー配列を
コードする塩基配列を除外し、ヒト肺由来のペプチドの
Ｎ末端アミノ酸配列からの塩基配列とすれば、配列番号
１２の１−１６７１の塩基配列となる。

【００５０】このｃＤＮＡ−Ａから、前述のＤＮＡ
（１）〜（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配列を
有するｃＤＮＡは、以下の部分を位置特異的変異法で削
除することによって得らることができる。 （ｉ）ＤＮＡ（４）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１５４９番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 （ii）ＤＮＡ（５）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて１４４１番
目から１７２５番目の塩基までの部分である。 （iii)ＤＮＡ（３）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら７３２番目および１５４９番目から１７２５番目の塩
基までの部分である。

【００５１】（iv）ＤＮＡ（２）の塩基配列と実質的に
同等の塩基配列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっ
ては、削除する部分としては、前記のオープンリーディ
ングフレームにおける開始コドンの最初の塩基から数え
て５５番目から７３２番目および１４４１番目から１７
２５番目の塩基までの部分である。 (ｖ）ＤＮＡ（１）の塩基配列と実質的に同等の塩基配
列を含有するｃＤＮＡを調製するに当たっては、削除す
る部分としては、前記のオープンリーディングフレーム
における開始コドンの最初の塩基から数えて５５番目か
ら１０８６番目および１４４１番目から１７２５番目の
塩基までの部分である。このようにして得られた各ｃＤ
ＮＡの塩基配列は公知の方法で分析して、ＤＮＡ（１）
〜（５）の塩基配列とそれぞれ一致することを確認す
る。

【００５２】上記の本発明のシグナル配列をコードする
塩基配列の３’末端に、本発明の可溶性のペプチドをコ
ードする塩基配列を配置せしめた構造を含有するＤＮＡ
は、有機化学合成することによっても得ることができ
る。また、該ＤＮＡは前述のプライマー エクステンシ
ョンを行うことなく、前駆体ＤＮＡから調製することも
できる。前駆体ＤＮＡは、前記工程（１）で得られるＤ
ＮＡ断片またはそのＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて調
製した合成ＤＮＡをプローブとして用いる通常のハイブ
リダイゼーション法によってヒト染色体ＤＮＡライブラ
リーから得ることができる。

【００５３】本発明の該ＤＮＡは、それに相補的なＤＮ
Ａを調製することもでき、上記ＤＮＡとそれに相補的な
ＤＮＡが互いに相補的に結合して２重鎖ＤＮＡを形成さ
せていてもよい。次いで、前記の本発明のＤＮＡと複製
可能な発現ベクターとを結合させ、複製可能な組換え体
ＤＮＡを調製する。該組換え体ＤＮＡは、それによって
形質転換された微生物または細胞中で、本発明のペプチ
ドを発現することができる。適したベクターの例として
は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７、ＹＲｐ
７、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐ
ＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）などが
挙げられる。尚、発現ベクターは宿主として使用する微
生物または細胞に適したものを選択する必要がある。

【００５４】次いで、上述の複製可能な組換え体ＤＮＡ
で微生物または細胞を形質転換せしめる。微生物の例と
しては、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、イー コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ
１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、イー コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３
１１０（Ｆ−、λ−、プロトトロフィック、ＡＴＣＣ２
７３７５）；バチラス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属の菌株；サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチ
ア マーセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａ
ｎｓ）等の大腸菌以外の腸内菌；シュードモーナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の菌株；およびサッカ
ロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられる。細胞の例とし
ては、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）細胞、Ｈｅ
Ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞
株等の動物細胞が挙げられる。特に、ＣＯＳ−１細胞、
ＣＨＯ細胞またはＣ₁₂₇ Ｉ細胞が好ましい例として挙げ
られる。

【００５５】尚、本発明のＤＮＡ及び組換え体ＤＮＡを
構築するために必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター
や複製起源等をクローニングするためには原核細胞を宿
主として用いる宿主−ベクター系を使用するのが好まし
い。原核細胞の例としてはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、例えばイーコリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４
６）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、イー コリー
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３
７）、イー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００およびイ
ー コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００ｈｆｌ並びにイー
コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（Ｆ−、λ− 、
プロトトロフィック、ＡＴＣＣ ２７３７５）；バチラ
ス サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の如きバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株；サ
ルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア マーセサンス
（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌
以外の腸内細菌；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属の種々の菌株；およびサッカロミセス セレビ
シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）などが挙げられる。

【００５６】これらの細菌のうちエシェリヒア コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株２９４が最も好ましい。上記
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適し
たプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発
現ベクターとして一般に用いられる。例えば大腸菌を形
質転換するためのプラスミドベクターとしてはプラスミ
ドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができ
る。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモータ
ー、および組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別す
るのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー
遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、β
−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター、トリプト
ファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の
例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリ
ン耐性遺伝子が挙げられる。

【００５７】一方、本発明のＤＮＡを分泌発現して本発
明の目的ペプチドを製造するためには、上記の原核細胞
を宿主として用いる宿主−ベクター系および脊椎動物の
細胞などの真核生物の細胞を宿主細胞として用いる宿主
−ベクター系を使用することができる。真核細胞の例と
しては前述の動物の細胞株などの細胞が挙げられる。本
発明のＤＮＡを前述の真核細胞で発現させるために、本
発明の組換え体ＤＮＡは一般に遺伝子発現を制御するた
めの機能配列、例えば、複製起源、本発明のＤＮＡの上
流に位置すべきプロモーター、リボゾーム結合部位、ポ
リアデニル化部位や転写終止配列を含有している。本発
明のＤＮＡを真核細胞内で発現させるのに用いることの
できるそのような機能配列はウィルスやウィルス性物質
から得ることができる。

【００５８】例えば、本発明で用いることのできるプロ
モーターは、アデノウィルス２、ポリオーマウィルス、
シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などから得ることが
できる。特に、アデノウィルス２の主後期プロモーター
やＳＶ４０の初期および後期プロモーターが好ましい。
また、トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用
を有するヒト肺由来のペプチドをコードする遺伝子の上
流の位置に本来存在するプロモーターも、上述の宿主−
ベクター系で使用するのに適しているならば使用するこ
とができる。

【００５９】複製起源については、外来性の起源、例え
ば、アデノウィルス、ポリオーマ、ＳＶ４０、水疱性口
内炎ウィルス（ＶＳＶ）、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）等のウィルス由来の複製起源を用いることができ
る。また、発現ベクターとして宿主染色体に組み込まれ
るような性質を有するベクターを用いる場合、宿主染色
体の複製起源を利用することができる。

【００６０】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡで形質
転換された微生物または細胞は、前述のとおり、組換え
体ＤＮＡに与えられた少なくとも１種の表現型によって
形質転換されずに残った親細胞から選別される。表現型
は少なくとも１種のマーカー遺伝子を組換え体ＤＮＡに
挿入することによって与えることができる。また複製可
能な発現ベクターが本来有しているマーカー遺伝子を利
用することもできる。マーカー遺伝子の例としては、例
えば、ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子やジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（以下“ＤＨＦＲ”と称する）をコ
ードする遺伝子などが挙げられる。これに関し、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をマーカー遺伝子として用いる場合、ＤＨＦＲ
には様々のタイプがあるため、その使用するマーカー遺
伝子のコードしているＤＨＦＲのタイプによって用いる
べき宿主を選択しなければならない。

【００６１】例えば、マーカー遺伝子として野生型ＤＨ
ＦＲをコードする遺伝子を用いる場合、宿主としてはＤ
ＨＦＲ欠損株を用いるのが好ましい。ＤＨＦＲ欠損株は
ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを要求するの
で、ヒポキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
培地中では成育できない。しかしながら、ＤＨＦＲ欠損
株をＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転
換すると、その株はもはやヒポキサンチン、グリシン及
びチミジンを要求しなくなり、ヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンを含まない培地中でも成育することがで
きる。従って、形質転換細胞はヒポキサンチン、グリシ
ン及びチミジンについての栄養要求性を判断基準にして
形質転換されないで残った細胞から容易に選択すること
ができる。

【００６２】一方、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対す
る親和性の低い変異体ＤＨＦＲをコードする遺伝子（以
下“ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子”と称する）をマーカー
遺伝子として用いる場合には、宿主細胞は正常なＤＨＦ
Ｒをコードする遺伝子を有していればよくＤＨＦＲを欠
損している必要はない。その理由は以下のとおりであ
る。正常ＤＨＦＲはＭＴＸによって阻害されるため、正
常ＤＨＦＲをコードする遺伝子を含有する宿主細胞はＭ
ＴＸの存在下ではヒポキサンチン、グリシン及びチミジ
ンを要求する。

【００６３】しかしながら、その宿主細胞がＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲ遺伝子を含有する組換え体ＤＮＡで形質転換す
ると形質転換細胞はＭＴＸ存在下においてももはやヒポ
キサンチン、グリシン及びチミジンを要求しない。従っ
て、形質転換細胞は、ＭＴＸ存在下におけるヒポキサン
チン、グリシン及びチミジンについての栄養要求性を判
断基準として用いて形質転換されていない細胞から選択
することができる。これに関し、真核細胞の大多数がＭ
ＴＸ感受性であるのでＭＴＸ耐性ＤＨＦＲ遺伝子はマー
カー遺伝子として用いるのに好都合である。

【００６４】サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母
も本発明のＤＮＡを発現するための宿主として用いるこ
とができる。酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには
複製可能な発現ベクターとして例えばプラスミドＹＲｐ
７を用いることができる。プラスミドＹＲｐ７はｔｒｐ
ｌ遺伝子を含有しており、このｔｒｐｌ遺伝子をマーカ
ー遺伝子として利用することができる。

【００６５】酵母細胞用の発現ベクターのプロモーター
の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボ
キシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６
−ホスフェートイソメラーゼ、グルコキナーゼ、などの
解糖系に関与する酵素類の遺伝子のプロモーターやアル
コールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性
ホスファターゼ、窒素代謝に関与する酵素、マルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターが挙げられる。これらのうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素代謝に関与する酵素類、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース
及びラクトースの利用に関与する酵素類の遺伝子のプロ
モーターは、これらのプロモーターによる転写を宿主の
培養条件を変えることによって制御することができるの
で有利である。

【００６６】酵母細胞中における転写や翻訳を制御する
ための複製起源や終止コドンおよびその他のＤＮＡ配列
としては、酵母細胞に適している通常の公知のＤＮＡ配
列を用いることができる。形質転換した微生物または細
胞は通常の栄養培地を用いて通常の公知の方法で培養す
ることにより本発明のＤＮＡを発現して本発明の目的ペ
プチドを製造することができる。培養後、本発明のペプ
チドは形質転換体の培養物から通常の公知の方法、例え
ばカラムクロマトグラフィーなどを用いて単離すること
ができ、本明細書の記載に従って、本発明の医薬組成物
として使用できる程度に実質的に精製されることが通常
行われる。

【００６７】このようにして得られたペプチドは、本発
明の作用と、好ましくは可溶性を有する限り、様々な種
類と長さの糖鎖を少なくとも１種含有していてもよい
し、また複数のアミノ酸配列からなるペプチドの混合物
であってもよい。得られたペプチドが糖鎖を含有してい
るか否かは用いる宿主細胞の種類によって異なる。ま
た、ペプチドが糖鎖を含有している場合の糖鎖の種類や
長さも用いる宿主細胞の種類によって異なる。

【００６８】一般に翻訳開始シグナルのＡＴＧから翻訳
されたシグナル配列を有するペプチドは宿主細胞から分
泌されるときにプロセッシングを受けて成熟蛋白になる
ことが知られている。本発明のペプチドの場合もそのよ
うなプロセッシングを受けることがある。ペプチドがプ
ロセッシングを受ける部位は、宿主により、または培養
条件により変化する場合がある。例えば、本発明のペプ
チドが、式（Ｉ）で表されるペプチドとＮ末端アミノ酸
配列として前述の１８個のアミノ酸からなるシグナル配
列とを含むプロセッシングを受けていない未成熟形で形
質転換細胞中で産生される場合、その未成熟形ペプチド
はプロセッシングを受けてシグナル配列が削除されて成
熟形となることがある。

【００６９】しかしながら、前述にように未成熟形ペプ
チドのプロセッシングを受ける位置は使用する宿主の種
類や宿主の培養条件により変化するので必ずしも上記の
ようなプロセッシングが起きるとは限らない。したがっ
て、使用する宿主の種類や宿主に培養条件により、プロ
セッシングのされ方が変化することから、本発明で、例
えば、前述の１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を
シグナル配列と呼称していても、どんな場合にも前述の
１８個のアミノ酸からなる全アミノ酸配列が、一括され
て削除されることにはならない。シグナル配列がプロセ
ッシングされる際、シグナル配列そのものあるいは発現
させる蛋白のＮ末端の配列の特徴により、複数の位置で
切断される可能性も考えられる。本発明のトロンビンに
よるプロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプ
チドにもそれは当然予想されることである。したがっ
て、本発明の製造方法においては、最終的に取得するペ
プチドのアミノ酸配列と、製造において使用する「トロ
ンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性
化を促進する作用を有するペプチドをコードする塩基配
列」のコードするアミノ酸配列とは常に完全に一致する
訳ではないと理解される。本来のシグナル配列以外のシ
グナル配列を用いることも可能であるが、それは蛋白の
Ｎ末端側に本来ないアミノ酸が付加されたり、本来ある
べきアミノ酸が削除されたりする可能性もあり、抗原性
の問題や、活性への影響を引き起こす可能性がある。そ
の点本来のシグナル配列を用いれば製造のコントロール
が簡単であって、抗原性等の安全性の観点からも有用で
ある。

【００７０】本発明では、１８個のアミノ酸の内、使用
する宿主の種類や宿主の培養条件により適宜選択するこ
とは可能であり、本発明はこれらの態様を含むものであ
る。本発明の開示するところによれば、トロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する
作用を有するペプチドを、初めて遺伝子操作により製造
でき、さらに分泌発現をせしめることにより、さらに効
果の高い製造法を提供するものであって、その製造され
た目的ペプチドは、実質的に他のヒト由来の成分を含有
しない精製されたペプチドとして取得が可能である。

【００７１】本発明の目的ペプチドは、トロンビンに結
合し、トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する
作用を有する。プロテインＣは血液凝固線溶機構におい
て重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質で
あり、トロンビンの作用により活性化される。活性型プ
ロテインＣは、生体内で血液凝固系補酵素の活性型第Ｖ
因子、および活性型第VII 因子を失活させ、また血栓溶
解作用を有するプラスミノーゲンアクチベーターの産生
に関与していることが知られている。〔鈴木宏治、医学
の歩み、第１２５巻、９０１頁、（１９８３年）〕。

【００７２】本発明のペプチドは、このトロンビンによ
るプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と血
栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に産生せし
めるものである。従って、本発明のペプチドは生体にお
ける抗血液凝固及び血栓溶解に大きく寄与するものであ
る。

【００７３】前述のように、本発明のペプチドは抗血液
凝固作用と血小板凝集抑制作用及び血栓溶解作用を有す
るので、血液凝固を制御するための、または血小板凝集
を制御するための医薬組成物として用いることが可能で
あり、具体的には、例えば、心筋梗塞、血栓症、塞栓
症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管内血液凝
固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠
中毒症等の疾患の治療及び予防に用いることができる。

【００７４】医薬組成物となすに際しては、本発明のペ
プチドと、薬剤として使用可能な担体とを混合すればよ
い。即ち、上記の疾患を治療または予防するのに有効な
量の本発明のペプチドを適当な量の担体と混ぜて、患者
に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調製するこ
とができる。薬剤として使用可能な担体としては、例え
ば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースな
どが例示される。また本発明の医薬組成物としては、凍
結乾燥された製剤となすことが好ましい。また本発明の
医薬組成物は注射用製剤として用いることが好ましい。
さらには、点滴静注用製剤とすることが好ましい。

【００７５】注射剤として用いる場合に、上記の担体
は、薬剤として投与可能であり、且つ注射可能な溶液と
なり得る担体であることが好ましく、この担体として
は、ショ糖、精製ゼラチン、アルブミン、マンニトー
ル、ブドウ糖および塩化ナトリウムからなる群より選ば
れた１種以上が例示され、また各種無機塩のｐＨ調整剤
などを添加することも好ましい例として挙げられるが、
その場合には本発明の可溶性ペプチドとの組み合わせに
おいて、医薬組成物全体として可溶性であり、且つ綺麗
に凍結乾燥が可能であって、好ましい。また本発明にお
いては、上記担体が、グリセリンであることもまた好ま
しい。上記の担体は、製剤を調製する際に添加すること
が好ましいが、用時に溶解された際において添加される
ことも許されるものである。

【００７６】本発明のペプチドの成人１回当たりの投与
量は年齢、性別、体重、症状等により異なるが、一般に
約０．１〜２００ｍｇであり、一日当たり一回または必
要に応じて数回、注射、好ましくは点滴静注により投与
する。本発明者等は、本発明のペプチドが副作用の少な
い極めて有用なものであることを確認しており、例え
ば、動物実験でラットｉｖ投与において約３ｍｇ／Ｋｇ
で全く死亡例や害を生ずることがなく、有効な作用も認
められることから、ヒトの体重を約６０〜７０Ｋｇと考
えて上記の投与量が妥当なものとして提示される。

【００７７】本発明をより詳細に記述するために参考例
及び実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらの
実施例にのみ限定されるものではない。 参考例１ （プロテインＣ活性化を促進する作用の測定）本発明の
ペプチドのプロテインＣ活性化の促進作用の測定は、合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣ
Ａ（Ｂｏｃ及びＭＣＡはそれぞれｔ−ブトキシカルボニ
ル基及び４−メチルクマリル−７−アミドの略称であ
る）を用いる公知のプロテインＣ測定法〔ワイ オーノ
（Ｙ．Ｏｈｎｏ）ら、ザ ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９０巻、１３８７
頁（１９８１年）〕に従って行なった。すなわち、プロ
テインＣ（最終濃度０．５μＭ）およびトロンビン（最
終濃度８０ｎＭ）を含有する水溶液５μｌに本発明のペ
プチドを含む水溶液５μｌ（０〜０．０１ Ａ₂₈₀ ／ｍ
ｌ）を加え、これにＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂ 、血清アルブ
ミン及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をそれぞれ最
終濃度が０．１５Ｍ、２．５ｍＭ、１ｍｇ／ｍｌ及び２
０ｍＭになるように、そして全量が３０μｌとなるよう
に加えた。

【００７８】得られた混合物を３７℃で１５分間反応さ
せてプロテインＣを活性化した後に２μＭのアンチトロ
ンビンIII を１０μｌ及び１０単位／ｍｌのヘパリンを
含有する水溶液を１０μｌ加えて３７℃で１５分間加温
して反応を停止させた。得られた反応混合物に、前述の
合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ〔財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究会（Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（日本）製〕２００
μＭを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）２
５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、２０
％酢酸０．５ｍｌを加えて反応を停止させ、遊離してき
たＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）の濃度
を励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光分光
光度計ＲＦ−５４０型（島津製作所製、日本）により測
定した。

【００７９】得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍
光強度と比較して、遊離したＡＭＣ量を求めた。値は１
分間当りに生成するＡＭＣ量で表わす。このＡＭＣ量か
ら本発明のペプチドを含まない水溶液を加えたときのＡ
ＭＣ量を引いた値がサンプルのトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進する強さを示す。

【００８０】ここで、プロテインＣはヒト血漿から鈴木
らの方法〔鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、ザ ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）、２５８巻、１９１４頁（１９８３年
等）〕で精製した。また、ヒトトロンビンはランドブラ
ッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）らの方法〔ランドブラッド
（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）ら、バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．）６６巻、４８２頁（１９７５年）〕で精製した。

【００８１】参考例２ （１）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーの入手 ヒトの肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したバクテリオ
ファージλｇｔ₁₁ｃＤＮＡライブラリーは、米国、クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．、９２２ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ａ
ｖｅ．ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入し
た（カタログ番号ＨＬ１００４）。

【００８２】（２）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの精製 プロテインＣ活性化を促進する作用のあるグリコペプチ
ドは、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立
病院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを鋏で約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。

【００８３】次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナ
イズし氷中で５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び
冷却操作を更に３回くり返した。得られたホモジェネー
トを１２，０００ｇで４℃において３０分間遠心分離に
かけて上澄液とペレットに分け、ペレットを集める。こ
れに０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５
Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂ を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダーを用い
て４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得
た。

【００８４】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。エヌ エ
ル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら〔ザ ジャーナ
ルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７巻、８５９頁（１９８２
年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ−トロンビン〔ジ
イソプロピルホスフォロトロンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピ
ー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）の
方法〔（ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４５巻、３
０５９頁（１９７０年）〕に従ってブロムシアン化した
アガロースに結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロ
ースを作成した。

【００８５】次に、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨンを集
めた。溶出によって得られる各フラクションについて前
記の方法でトロンビンのプロテインＣの活性化促進能を
測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロフォ
トメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの波長
２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ₂₈₀ ）を測定した。

【００８６】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂ 、０．
０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた
透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラ
ムクロマトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５
ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄
後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次い
で１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。

【００８７】プロテインＣ活性化能のある画分を回収
し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）
Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液を３回目の
ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロマトグラフ
ィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件および溶出条
件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行なった。な
お、溶出して得られるフラクションは２ｍｌずつ集め
た。

【００８８】次にプロテインＣ活性化能のある画分を回
収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕ
ｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃｍの大き
さの４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムク
ロマトグラフィーに供した。０．３５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒ
ｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶
出して得られたフラクションは１．９ｍｌずつ集めた。

【００８９】この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを図１
に示す。フラクションナンバー４８番目から５６番目ま
でを回収した。このようにして精製されたフラクション
の吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的
な蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm
・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本精
製品の量を計算したところ約５００μｇであった。な
お、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５
〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀
染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確
認された。

【００９０】また、この精製タンパク約１０μｇを２０
０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析後、同じ緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファ
ロース（ファルマシア社製、カタログ番号１７−０４４
０）のカラム（樹脂量約１ｍｌ）に供し、同じ緩衝液で
充分洗浄したところ、このタンパクはＣｏｎＡセファロ
ースに吸着して洗浄液中には溶出されなかった。次いで
０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍｅｔ
ｈｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
（米国Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ−６８８２）を
含む以外は上記と同じ緩衝液を通したところ、このタン
パク質は溶出した。従って、このタンパク質は糖を含む
いわゆるグリコペプチドであることがわかった。

【００９１】（３）：トロンビンのプロテインＣ活性化
を促進するグリコペプチドのアミノ酸配列分析 このグリコペプチドのアミノ酸配列は以下の様にして分
析した。精製したグリコペプチドを０．１％（ｖ／ｖ）
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液で室温で１６
時間透析してアミノ酸配列分析用試料とする。アプライ
ドバイオシステムズ社（米国）製アミノ酸シークエンシ
ングアナライザー（モデル４７０Ａ）を用い、アール
エム ヘウイック（Ｒ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ）らの方法
〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５６巻、７９９０頁
（１９８１年）〕に準じて、Ｎ末端側より順次エドマン
分析を行なった。

【００９２】遊離してくるフェニルチオヒダントイン
アミノ酸を、スペクトロフイジクス社（米国）製高速液
体クロマトグラフィー用装置（ＳＰ８１００）および米
国デュポン社製ゾルバックスＯＤＳカラムを用いて分析
を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、アミノ
酸配列の一部が明らかになり、Ｎ末端より１１個目まで
は下記アミノ酸配列を有するものであることがわかっ
た。Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ

【００９３】（４）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブの作成 トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進するグリコ
ペプチドのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプロ
ーブは、前述のＮ末端アミノ酸配列より、ヒト由来遺伝
子においてアミノ酸をコードする塩基配列の塩基の使用
頻度を考慮して〔ニュークリック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、９巻、Ｒ４
３頁（１９８１年）〕、Ｎ末端からのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列として、５′ＣＴＧＧＧ ＡＧＣＣＧ
ＣＣＧＧＧ ＣＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧ ＧＣＧＧＧＧ
ＧＣ３′の３３ｍｅｒを、また大塚ら〔イー オーツカ
エト アール（Ｅ．Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ．）、
ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６０巻、２６０５頁
（１９８５年）〕に従って、デオキシイノシン（“Ｉ”
で示す）をチミジル酸の代りに用いてＮ末端からのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列として、 （１）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （２）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ （３）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＧＣＣＩ ＣＡＧＣＣ ＩＧＧ３′ （４）５′ＧＣＩＣＣ ＩＧＣＩＧ ＡＡＣＣＩ ＣＡＡＣＣ ＩＧＧ３′ の４種類の２３ｍｅｒを米国アプライド バイオシステ
ムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の３
８０Ａ型ＤＮＡ合成機で合成し、メーカーマニュアルに
従って精製し、実験書〔イー エフ マニアティスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｅ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ）、モレキ
ュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、１２２頁（１９８２年）の記載にしたがって、Ｔ
₄ ＤＮＡキナーゼ、およびγ−³²Ｐ−ＡＴＰを用いてラ
ベル化した。

【００９４】（５）：トロンビンによるプロテインＣ活
性化を促進する作用のあるグリコペプチドの抗体 トロンビンのプロテインＣ活性化を促進する作用のある
グリコペプチドに対するウサギ抗体は、前述のようにし
て精製したトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進
する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチドを用いて、
成書〔エル ハドソンら（Ｌ．ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、プラクティカル イムノロジー（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、９頁（１９７６
年）、ブラックウェル サイエンティフィック パブリ
ケーションズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〕に従って作製した。

【００９５】この抗体がトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する作用のあるヒト肺由来のグリコペプチ
ドと反応することを以下の様にして確認した。すなわ
ち、参考例２−（２）に記載の方法で得た精製タンパク
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ット ラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１
８４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビ
オチン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシ
ャムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。

【００９６】（６）：ヒトさい帯内皮細胞の採集及び培
養 ヒトさい帯内皮細胞はディスパーゼＩＩ（合同酒精製、
日本）を用いるマノらの方法〔ワイ マノら（Ｙ．Ｍａ
ｎｏ，ｅｔ ａｌ．）、エクスペリンエンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｅｎｔｉａ）、第３９巻、第１１４４頁（１９８
３年）〕にしたがって、私立病院より提供された新鮮な
ヒトさい帯から得た静脈より採集し培養した。

【００９７】参考例３ （組換え体ＤＮＡの取得） （１）：ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの調製 ヒト内皮細胞よりチャーギンらの方法〔ジェイ エム
チャーギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４頁（１９７９年）〕に従って
ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製した。

【００９８】（２）：ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーより
のスクリーニング ヒト肺のポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡより調製したｃＤＮＡをバ
クテリオファージλｇｔ１１に組み込んだｃＤＮＡライ
ブラリー（クローンテック社製、米国）をそのマニュア
ルに従ってイー コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ク
ローンテック社製、米国）に感染させたものをＬＢ培地
プレート上に１５ｃｍ径プレート１枚当り約１０万プラ
ーク程度になる様に移植した。４２℃で３．５時間培養
後、あらかじめ１０ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙ
ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅ）に浸してから乾燥させたニトロセルロースフィル
ター（ＢＡ８５メンブランフィルター、シュライヒャー
アンド シェル社製、独国）をプレートの上に載せ、
３７℃で３．５時間インキュベートして、ペプチドをＩ
ＰＴＧで誘導発現させてニトロセルロースフィルター上
にうつしとる。

【００９９】このニトロセルロースフィルターに、マニ
ュアルに従って、ウサギで調製したトロンビンのプロテ
インＣ活性化を促進する作用を有する参考例２−（５）
で得られたグリコペプチドに対する抗体を一次抗体とし
て反応させ、次いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギ
ＩｇＧ（ザイメッド ラボラトリー社製、米国 カタロ
グ番号６２−１８４０）を二次抗体として反応させた
後、アビジン・ビオチン化した西洋ワサビ由来パーオキ
シダーゼ（アマーシャム ジャパン社製、日本、カタロ
グ番号ＲＰＮ．１０５１）で発色させて、陽性のクロー
ンを単離した。この陽性クローンの保有する組換え体ｃ
ＤＮＡ／λｇｔ１１に含まれるｃＤＮＡ断片をＴＭ１３
と称した。

【０１００】（３）：Ｎ末端アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション 参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＩ３が参考
例２−（４）で調製したＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブとハイブリダイズするか否かを実験書
〔シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、エクスペリメン
ツ ウイズ ジーン フュージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）、１
９１頁（１９８４年）コールド スプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って実施した。ＤＮＡ
断片ＴＭ１３はいずれのＮ末端アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡプローブともハイブリダイズしないことがわか
った。

【０１０１】（４）：ＴＭ１３の塩基配列 参考例３−（２）で得られるクローンが含有するＤＮＡ
断片ＴＭ１３の塩基配列をサンガーらの方法（サンガー
エフ ら（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，ｅｔ ａｌ．）、プロ
シーディング オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４巻、５４６３頁（１９７
７年）にしたがって決定した。結果を図２〜図３に示
す。

【０１０２】（５）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３をプローブと
したヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ＤＮＡ断片ＴＭ１３を制限酵素ＫｐｎＩおよびＰｖｕII
で消化して約４４０塩基対のＤＮＡ断片を得、これをニ
ックトランスレーション法で³²Ｐで標識した。このＤＮ
Ａ断片をプローブとしてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーよ
りプラークハイブリダイゼーションを行なって陽性のク
ローンをスクリーニングした。すなわち、常法に従って
クローンＴＭ１３のＤＮＡをＫｐｎＩおよびＰｖｕIIで
消化してポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抽
出、精製して約４４０ｂｐの精製断片約５００ｎｇを得
た。このＤＮＡをアマーシャム ジャパン（日本）社製
のニックトランスレーション キット（カタログ番号
Ｎ．５０００）を用い、それに添付のユーザー マニュ
アルに従ってα−³²Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識した。

【０１０３】この³²Ｐで標識したＤＮＡ断片をプローブ
として実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
モレキユラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、３２０頁、１９８２年、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従
ってヒト肺ｃＤＮＡライブラリーのプラークハィブリダ
イゼーションを行なった。陽性のクローンを単離し、そ
のクローンが含有する組換え体を各種制限酵素で解析し
たところ、得られた組換え体にはＴＭ１３よりも前記ペ
プチドのＮ末端側の塩基配列をコードしていると思われ
る約２４００ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれていること
がわかった。このＤＮＡ断片をＴＭ１３７と称した。

【０１０４】（６）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列 前記（５）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列
を参考例３−（４）に記載の方法と同様に決定した。結
果を図４〜図７に示す。この結果より、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７は、参考例２−（３）に記載したＮ末端アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含まないことがわかった。

【０１０５】（７）：プライマー エクステンション 参考例３−（４）で得られたＤＮＡ断片の塩基配列のう
ち、ＤＮＡ断片ＴＭ１３のＮ末端側の配列を基に３種類
の合成ＤＮＡを参考例２−（４）に記載と同様にして作
成し、ＨＴＭ１３１、ＨＴＭ１３２、ＨＴＭ１３３と命
名した。なお、合成ＤＮＡの設計に当っては、ヒトさい
帯内皮細胞より調製したｍＲＮＡとハイブリダイズする
側の塩基配列を利用した。各合成ＤＮＡの塩基配列は以
下のとおりであり、それらの合成ＤＮＡが対応するＤＮ
Ａ断片ＴＭ１３での位置を図２に、またＴＭ１３７での
位置を図４に示す。

【０１０６】 ＨＴＭ１３１： ５′ＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３′（２０ｍｅｒ） ＨＴＭ１３２： ５′ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧ ３′ （１５ｍｅｒ） ＨＴＭ１３３： ５′ＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡ ３′（２０ｍｅｒ）

【０１０７】次に、このＨＴＭ１３３をプライマーとし
て参考例３−（１）に記載した方法で得たヒトさい帯内
皮細胞より調製したポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを用いて、いわ
ゆるプライマー エクステンション（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ）法を行なって、ＤＮＡ断片ＴＭ１３
７のさらに５′上流部分を合成した。すなわち、約１μ
ｇ／μｌのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ５μｌに約２７ｎｇ／μ
ｌのＨＴＭ１３３溶液２０μｌを加え６５℃で２０分間
加熱後、室温にまで約１時間かけて冷却した。それ以降
は、ｃＤＮＡ合成システム（アマシャム ジャパン社、
日本、カタログ番号ＲＰＮ１２５６）を用いて、そのマ
ニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。但し、ｃＤＮＡ
合成システムに入っているオリゴ（ｄＴ）プライマーの
かわりにＨＴＭ１３３を用いて実施した。

【０１０８】合成されたｃＤＮＡは実験書〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、２４１
頁、１９８２年、コールド スプリング ハーバー ラ
ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従って両末端にＣテールを
つけ、両末端にＧテールをつけたｐＢＲ３２２（ＡＴＣ
Ｃ３７０１７）と混合し、６５℃、５分間加熱後５７
℃、２時間加熱した後、ゆっくりと室温に戻した後大腸
菌Ｋ１２ＭＣ１０６１（ベックマン シティ オブ ホ
ープ メディカルインスティテュート、米国より入手）
を形質転換した。

【０１０９】詳しくは、大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１株の
コロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍにおける吸光
度が０．３になるまで培養した。該培養物５０ｍｌを集
め、２５ｍｌの１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む１０ｍＭ ３
−（Ｎーモルホリノ）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、次いで、５０ｍＭＣ
ａＣｌ₂、１０ｍＭ ＲｂＣｌを含む２５ｍｌの０．１
Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）に再び懸濁した。得られた
懸濁液を３０分間氷冷し、遠心後、上澄を除去し、３０
μｌのＤＭＳＯおよび５０ｍＭ ＣａＣｌ₂と１０ｍＭ
ＲｂＣｌを含む２．０ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐ
Ｈ６．５）の混合液中に懸濁させた。懸濁液を２００μ
ｌずつ分注し、前述のプラスミドＤＮＡ溶液１０μｌを
それぞれに加えた。

【０１１０】該混合液を３０分間氷冷した後、４４℃で
６０秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３
７℃に温めておいた５ｍｌのＬＢ培地を加えた。この溶
液を３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心
し、上澄を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ペレッ
トにＬＢ培地を加え、撹拌した後、懸濁液とした。該懸
濁液を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天
プレートにまき３７℃で１夜培養を行なった。このよう
にして得られるｃＤＮＡバンクより、参考例２−（４）
に記載した方法に従って５′末端を³²Ｐで標識したＨＴ
Ｍ１３１及びＨＴＭ１３２をそれぞれプローブとして、
コロニーハイブリダイゼーションを参考例３−（３）と
同様の方法で実施した。

【０１１１】コロニハイブリダイゼーションで約７０，
０００個の形質転換体をスクリーニングしてＨＴＭ１３
１及びＨＴＭ１３２の両者のプローブと反応するコロニ
ーが６クローン得られた。この６クローンから、実験書
〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、３６６頁、１９８２年、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従ってプラス
ミドＤＮＡ（これを“ｐＴＭＰ５”と称する）を調製
し、各種の制限酵素を用いて切断し、電気泳動で解析し
たところ、６クローンから得られたプラスミドＤＮＡは
全て同一であり、約９００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片と
ベクターからなることがわかった。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＰ５と命名した。

【０１１２】（８）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５とＮ末端アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイ
ゼーション 参考例３−（３）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５はいずれのＮ末端ＤＮＡプローブともハイブ
リダイズしない、つまりＮ末端アミノ酸配列部分をコー
ドしていないことが分かった。

【０１１３】（９）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ５の塩基配列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を決定した。結果を図８〜図９に
示す。

【０１１４】（１０）：第２回目のプライマー エクス
テンション 参考例３−（７）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ５の塩基配列を基にしてＨＴＭ１３４、ＨＴＭ
１３５、ＨＴＭ１３６の３本の２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作成する。これらの合成ＤＮＡと対応するＤＮＡ断片
ＴＭＰ５における位置を図８に示す。参考例３−（７）
に記載の方法と同様にしてプライマー エクステンショ
ンをＨＴＭ１３６をプライマーとし、ＨＴＭ１３４、及
びＨＴＭ１３５をプローブとして実施した。約５０，０
００個の形質転換体から、ＨＴＭ１３４、及びＨＴＭ１
３５とハイブリダイズする形質転換体が一種類得られ
た。この形質転換体が保有する組換え体に含まれている
ＤＮＡ断片をＴＭＰ２６と命名した。

【０１１５】（１１）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６とＮ末端
アミノ酸配列をコードするＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーシヨン 参考例３−（３）に記載の方法と同様にしてＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６がＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズするか否かを調べた。その結
果、ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６は参考例２−（４）で合成し
た３３ｍｅｒのＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ
プローブ及び４種の２５ｍｅｒのプローブのミックスプ
ローブとハイブリダイズした。つまり、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ２６はＮ末端アミノ酸配列部分をコードしていること
が分かった。

【０１１６】（１２）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６の塩基配
列 参考例３−（４）に記載の方法と同様にして、ＤＮＡ断
片ＴＭＰ２６の塩基配列を決定した。ＤＮＡ断片ＴＭＰ
２６のカルボキシル末端からの約５４０塩基の塩基配列
を図１０に示す。

【０１１７】（１３）：ＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ１３７の接合 参考例３−（１）〜（１２）で得られ、塩基配列を決定
した４本のＤＮＡ断片（ＴＭ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５及びＴＭＰ２６）のその塩基配列における対応関係お
よび簡単な制限酵素地図を図１１に示した。図１１に示
すようにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６に含まれるＮ末端アミノ
酸配列をコードする塩基配列の上流にある最初のＡＴＧ
よりオープンリーディングフレームを組むとＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６、ＴＭＰ５を通過してＴＭ１３７の途中まで
続く１７２５ｂｐからなることが分かった。この各ＤＮ
Ａ断片にわたるオープンリーディングフレームをコード
するＤＮＡ断片を得るためにＤＮＡ断片ＴＭＰ２６、Ｔ
ＭＰ５及びＴＭ１３７を次のようにして常法に従って継
ぎあわせた。

【０１１８】（１３−１）：ＤＮＡ断片ＴＭ１３７とＴ
ＭＰ５の継ぎあわせ まず、λｇｔ１１のＥｃｏＲＩサイトに挿入されている
ＤＮＡ断片ＴＭ１３７を単離し、プラスミドｐＵＣ１８
（ファルマシア社製、スウェーデン、カタログ番号２７
−４９４９−０１）のＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラ
スミドｐＵＣ１８ＴＭ１３７を得た。次にプラスミドｐ
ＵＣ１８ＴＭ１３７を制限酵素ＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩ
で消化して４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、電気泳動抽出装置（日本、アート社製、
ＭＡＸ−ＹＩＥＬＤＲ）を用いて約２，３００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿を行なって精製し
た。

【０１１９】一方、参考例３−（７）で得られたＴＭＰ
５をプラスミドｐＢＲ３２２に組み込んだプラスミドｐ
ＴＭＰ５をＤｄｅＩで完全に消化した後、切断末端を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐ
ｏｌＩ断片）を用いて平滑末端にして約８００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＳｍ
ａＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を
得た。次にこのプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５を制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃIIで完全消化して約６００
ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｃII断片を得た。

【０１２０】以上の様にしてプラスミドｐＵＣ１８ＴＭ
１３７より調製した約２，３００ｂｐのＤＮＡの断片及
びプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＰ５より調製した約６００
ｂｐのＤＮＡ断片プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩで消化して調製したベクターに挿入して
プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を得た。この工程を図１
２に示した。

【０１２１】（１３−２）：ＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭ
Ｐ２６の継ぎあわせ プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１を制限酵素ＤｄｅＩ、Ｋ
ｐｎＩ及びＢａｍＨＩで完全消化し、約９５０ｂｐ及び
約１５００ｂｐの断片を回収した。一方、ＤＮＡ断片Ｔ
ＭＰ２６をプラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製、
スウェーデン、カタログ番号２７−４９５４−０１）の
制限酵素ＰｓｔＩサイトに挿入してプラスミドｐＵＣ１
３ＴＭＰ２６を得た。これをＢｂｅＩで完全消化した
後、切断末端をＴ₄ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末
端にし、さらに制限酵素Ｂｇ1 IIで完全消化して約１７
０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。さらに別に、プラスミドｐ
ＵＣ１３ＴＭＰ２６をＢｇ1 II及びＤｄｅＩで完全消化
して約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【０１２２】次に上記の約１７０ｂｐ、約２８０ｂｐ、
約９５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用い
て継ぎあわせ、制限酵素ＫｐｎＩで消化した後、５０Ｖ
の電圧で４℃で２時間、１．３％低融点アガロースゲル
電気泳動にかけて精製単離し、約１４００ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。また別途プラスミドｐＵＣ１８をＳｐｈＩ
で完全に消化した後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ
で切断末端を平滑末端にした後、ＢａｍＨＩで完全消化
してベクターを調製した。このベクターに上述の約１，
４００ｂｐ及び約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＵＣ１８
ＴＭＪ２を得た。この工程を図１３に示す。

【０１２３】参考例４ （ヒト染色体からの目的遺伝子のスクリーニング）ヒト
染色体ライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニング
は以下のようにして実施した。λファージのベクターＥ
ＭＢＬ−３に入ったヒト染色体ライブラリーは米国クロ
ーンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．９２２Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｖｅ．
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）より購入した
（カタログ番号ＨＬ１００６）。このライブラリーより
参考例３−（２）で得られたＤＮＡ断片ＴＭ１３をプロ
ーブとして用いて参考例３−（５）と同様の方法でスク
リーニングを行なったところ、約２万ｂｐインサートを
含有する染色体クローンが１種類得られた。

【０１２４】この染色体クローンを制限酵素ＢａｍＨＩ
で完全消化して１．０％アガロースゲル電気泳動を行な
い、実験書〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モ
レキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）、３８２頁、１９８２年、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）〕に従っ
てサザン ブロットハイブリダイゼーションを同じプー
ロブを用いて実施した。

【０１２５】その結果、約４，０００ｂｐのＤＮＡ断片
に強い陽性のバンドを得たのでその断片を常法に従って
単離し、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトにサ
ブクローニングした。この約４，０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、参考例３−（１３−２）で
作製したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２に挿入されてい
るＤＮＡ断片の塩基配列と完全に一致することが分かっ
た。

【０１２６】実施例１ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ１、ｐＳ
Ｖ２ＴＭＤ２、ｐＳＶ２ＴＭＤ４及び、ｐＳＶ２ＴＭＤ
５の作製 （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化してＳＶ４０の
初期転写プロモーター及びＳＶ４０の転写ターミネータ
を有するベクターを得た。次に参考例２−（１３−２）
で作成したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２をＨｉｎｄII
I で部分消化した後ＢａｍＨＩで完全消化して約２，９
００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＴ
ＭＪ２と称した。この２，９００ｂｐのＤＮＡ断片と上
記の如く調製したベクターとをＴ ₄ＤＮＡリガーゼを用
いて継ぎ合わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を得た。
プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を構築する工程を図１４に
示す。得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２については
ブダペスト条約の規定に基き、アメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号第６７
２８３号として寄託されている。

【０１２７】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ１の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次い
でＨｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称し
た。一方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日
本、カタログ番号３１１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎ
ｃIIで消化してベクターを調製した。このベクターにＤ
ＮＡ断片ＴＭＤ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１
３ｍｐ１９ＴＭＪ３を得た。

【０１２８】また別途、下記の塩基配列を有する削除用
ＤＮＡプローブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌｅｔｅ
ｒ）”と称する〕を有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭＤと称した。このようにして作
成したディリーターＴＭＤを用い、メソッド イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３年）、ア
カデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に
記載の方法に従って部位特異的変異の手法で前記の如く
得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ１
３の１７７塩基からなる部分の削除を行った。

【０１２９】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭＤ
および１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１
９ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃
で５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。

【０１３０】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによって、
このイー コリを組換え体プラスミドでトランスフェク
ションした。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上の
プラークをニトロセルロースフィルターに移しとり、８
０℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行
った。プレハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ〔０．
９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’
〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、
０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％
（ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１
％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む
溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施した。

【０１３１】次いで上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮＡ
のかわりに³²ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用い
てハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施し
た。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍクエ
ン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロース
フィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回洗
った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を上
げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フィ
ルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米国）
を得られたニトロセルロースフィルターに密着させて−
８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に強く
露光した黒いスポットが数１０個検出された。

【０１３２】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制限酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは、制
限部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかっ
た。得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ１と
称した。さらにこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ
１は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４９８個の
アミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩基配
列を含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することが
わかった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１に
含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ１と称した。図１５に組換
え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリータ
−ＴＭＤとがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＪ３に
対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１３３】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１の構築 実施例１−（２）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ１をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ１の約１，９００ｂｐ ＤＮＡ断片
を単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ａ
ＴＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完
全消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片
ＴＭＤ１とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、
プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を得た。

【０１３４】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ２の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ₂ をディリーターＴＭＤの代わりに削除用ＤＮＡプロ
ーブとして用いる以外は、実施例１−（２）−（ａ）と
実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ２と称するＤ
ＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ２を
得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ２は実施例１−（２）−（ａ）
で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ１の５′末端から６７８ｂ
ｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤＮＡ断片
ＴＭＤ２は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に２７２
個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコードする塩
基配列を含む塩基配列を有していた。図１６に組換え体
プラスミドＭ１３−ＴＭＤ１とディリーターＴＭｄ₂と
がハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ１に対応するＤ
ＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１３５】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２の構築 実施例１−（３）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ２をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩで
完全消化してＴＭＤ２の約１，２００ｂｐＤＮＡ断片を
単離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴ
ＣＣ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全
消化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片Ｔ
ＭＤ２とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を得た。

【０１３６】（４）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の作製 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ３の作製 前記の工程（１）で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ
２をＮｃｏＩで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。次い
でＨｉｎｄIII で完全消化して約１，９００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称し
た。一方、ファージＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造社製、日
本、カタログ番号３１１９）のＨｉｎｄIII 及びＨｉｎ
ｃIIで消化してベクターを調製した。このベクターにＤ
ＮＡ断片ＴＭＪ３を挿入して組換え体プラスミドＭ−１
３ｍｐ１９ＴＭＪ３を得た。

【０１３７】また別途、下記の塩基配列を有するディリ
ーターを有機合成した： ５′−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡ−３′(25 mer)。 合成ディリーターをＴＭｄ₃と称した。このようにして
作製したディリーターをＴＭｄ₃ 用い、メソッド イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１９８３
年）、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ）に記載の方法にしたがって部位特異的変異の手
法で前記の如く得られた組換え体プラスミドＭ−１３ｍ
ｐ１９ＴＭＪ３の２８５ｂｐからなる部分の削除を行っ
た。

【０１３８】即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭｄ
₃ 及び１０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバー
サルプライマー、宝酒造社製、日本、カタログ番号３８
３１）の５′末端をＴ₄ キナーゼを用いてリン酸化した
後、０．５ｐｍｏｌの組換えプラスミドＭ１３ｍｐ１９
ＴＭＪ３のシングルストランドＤＮＡを加え、９５℃で
５分間加熱後、室温にまで冷却した。次いで５単位の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び１０単位のＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼを混合物に加えて３７℃で３０分間インキュベートし
て混合物中に組換え体プラスミドを生成させた。

【０１３９】得られた混合物をイー コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデン、カ
タログ番号２７−１５５０）に加えた。それによりイー
コリを組換え体プラスミドでトランスフェクションし
た。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上のプラーク
をニトロセルロースフィルターに移しとり、８０℃で２
時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを行った。プ
レハイブリダイゼーションは、６×ＳＥＴ〔０．９Ｍ
ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、６
ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔｓ’〔０．１％
（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％（ｗ
／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、０．１％ＳＤＳ，１００
μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５５℃、
２時間加温することにより実施した。

【０１４０】次いで、上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮ
Ａのかわりに³²ＰでラベルしたＴＭｄ₃ を加えた溶液を
用いてハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実
施した。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍ
クエン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロ
ースフィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２
回洗った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度
を上げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線
フィルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米
国）を得られたニトロセルロースフィルターに密着させ
て−８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フィルム上に
強く露光した黒いスポットが数１０個検出された。

【０１４１】各スポットは組換え体プラスミドで感染し
たクローンに対応するものである。そのうち、６クロー
ンを選択し、各クローンの組換え体プラスミドを単離し
て制御酵素解析、及び塩基配列の解析を行ったところ、
これらのクローンの保有する組換え体プラスミドは、制
限部位と塩基配列がそれぞれ同一であることがわかっ
た。得られた組換え体プラスミドをＭ１３−ＴＭＤ３と
称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３
は、開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流に４６２個のア
ミノ酸からなるペプチドをコードする配列番号１７の１
−１３８６の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有するこ
とがわかった。この組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ
３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ３と称した。図１７に
組換え体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３とディリ
ーターＴＭｄ₃ とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｊ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを
示す。

【０１４２】（ｂ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ４の作製 部位特異的変異の手法を用いて、ディリーターＴＭｄ₃
の代わりに実施例１−（３）−（ａ）で得られたディリ
ーターＴＭｄ₂ を用いる以外は、実施例１−（４）−
（ａ）と実質的に同様の方法で、上述の如く得られた組
換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３の一部を削除して、
ＴＭＤ４と称するＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミド
Ｍ１３−ＴＭＤ４を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ４は実施例
１−（４）−（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の
５′末端から６７８ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有
する。このＤＮＡ断片ＴＭＤ４は開始コドン（ＡＴＧ）
と、その下流に２３６個のアミノ酸からなる本発明のペ
プチドをコードする塩基配列を含む塩基配列を有してい
た。図１８に組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とデ
ィリーターＴＭｄ₂ とがハイブリダイスし、ＤＮＡ断片
ＴＭＤ３に対応するＤＮＡ領域の一部が削除されるとと
ころを示す。

【０１４３】（ｃ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４の構築 実施例１−（４）−（ｂ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ４をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ４の約１，１００ｂｐＤＮＡ断片を単
離した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消
化してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭ
Ｄ４とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を得た。

【０１４４】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 （ａ）ＤＮＡ断片ＴＭＤ５の作製 下記の塩基配列： ５′−ＣＡＣＧＧＧＣＴＣＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣ
ＡＧＧ−３′（２５ｍｅｒ）を有するディリーターＴＭ
ｄ₄ をディリーターＴＭｄ₂ の代わりに削除用ＤＮＡプ
ローブとして用いる以外は、実施例１−（４）−（ｂ）
と実質的に同様の方法を繰り返して、ＴＭＤ５と称する
ＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ５
を得た。ＤＮＡ断片ＴＭＤ５を実施例１−（４）−
（ａ）で得られたＤＮＡ断片ＴＭＤ３の５′末端から１
０３２ｂｐのＤＮＡが削除された構造を有する。このＤ
ＮＡ断片ＴＭＤ５は開始コドン（ＡＴＧ）と、その下流
に１１８個のアミノ酸からなる本発明のペプチドをコー
ドする塩基配列を含む塩基配列を有していた。図１９に
組換え体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３とディリーターＴ
Ｍｄ₄ とがハイブリダイズし、ＤＮＡ断片ＴＭＤ３に対
応するＤＮＡ領域の一部が削除されるところを示す。

【０１４５】（ｂ）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５の構築 実施例１−（５）−（ａ）で作製した組換え体プラスミ
ドＭ１３−ＴＭＤ５をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで完
全消化してＴＭＤ５の約７４０ｂｐ ＤＮＡ断片を単離
した。一方、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）をＨｉｎｄIII 及びＢｇl IIで完全消化
してベクターを得た。このベクターとＤＮＡ断片ＴＭＤ
５とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわせ、プラス
ミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を得た。

【０１４６】実施例２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換）ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
０）を培養器中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血
清（以下“ＦＣＳ”と略する）を加えたダルベッコの最
小必須培地（以下“ＭＥＭ”と略する）〔フローラボラ
トリ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米
国、カタログ番号１０−３３１）〕を用いて、３７℃で
５％炭酸ガスインキューベーター中で対数増殖期になる
まで培養し、０．１％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴ
Ａを用いて培養器に付着増殖した細胞を培養器よりはが
して、ハンクス平衡塩類溶液〔フローラボラトリー（Ｆ
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、米国、カタ
ログ番号１７−１０１−２２〕に約１×１０⁷ 個／ｍｌ
の濃度になるように懸濁した。

【０１４７】実施例１−（５）で得られたプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を約２μｇ／μｌになるように１ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。約１０μｇ
のプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を含む得られたプラスミ
ド懸濁液５μｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ型試
験管に入れ、次いでこの試験管に上述の如く得られたＣ
ＯＳ−１細胞の細胞懸濁液２００μｌを入れて、０℃で
１０分間放置した。試験管内の懸濁液を米国Ｄ．Ｅ．
Ｐ．ＳＹＳＴＥＭ社製細胞融合装置ＦＰＨ１００１型の
キュベットに移し、１．２ｋＶで４０μ秒の条件で２回
電気パルスを与えた。その後懸濁液を再び元のエッペン
ドルフ型試験管に移し、０℃で５分間放置した後、１０
％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを加えたダルベッコのＭＥＭ１０ｍ
ｌを以下のように用いて直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ートに移した。即ち、少量の１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを
含むダルベッコのＭＥＭを懸濁液に加えてその混合物を
組織培養用プレートに移した。次いで、試験管を残りの
ダルベッコのＭＥＭで数回洗浄して洗浄液を同じプレー
トに加えた。その後、プレートは５％ＣＯ₂ 存在下３７
℃で２４時間培養した。

【０１４８】（トロンビンによるプロテインＣ活性化を
促進する作用の確認）培養終了後、プレートの培地をＦ
ＣＳを含まないダルベッコのＭＥＭに交換し、４８時間
培養した。培養上澄液を５μｌ採取し、これを試料とし
て参考例１に記載した方法で、プロテインＣ活性化の促
進作用を測定した。更に、直径１０ｃｍの組織培養用プ
レート１枚分の細胞を米国コースター（Ｃｏａｓｔｅ
ｒ）社製セル スクレイパー（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒａｐｅ
ｒ）（カタログ番号３０１０）を用いて掻き取って集
め、８００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心分離して集め
る。このペレットを試料として用いて参考例１に記載し
た方法でプロテインＣの活性化を促進する作用を測定し
た。またコントロールとしてはプラスミドｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒでトランスフォームしたＣＯＳ−１細胞の培養上
澄液及び細胞ペレットを試料として用いた。結果を表１
に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸光度を組
織培養用プレート１枚分に換算したものである。

【０１４９】

【表１】

【０１５０】実施例３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表２に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸
光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５１】

【表２】

【０１５２】実施例４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表３に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸
光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５３】

【表３】

【０１５４】実施例５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例２と同
様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によって
形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンに
よるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その結
果を表４に示した。表中に示す吸光度の数値は試料の吸
光度を組織培養用プレート１枚分に換算したものであ
る。

【０１５５】

【表４】

【０１５６】実施例６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＯＳ−１細胞の
形質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロ
ンビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プ
ラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を用いる以外は、実施例２と
同様の操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によっ
て形質転換された細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。その
結果、細胞ペレットの試料が強いプロテインＣ活性化促
進作用を示し、生成したプロテインＣの量は約３００ｎ
ｇであった。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＳＶ２−ｄｈｆｒでトランスフォームした細胞では
この活性は検出されなかった。

【０１５７】実施例７ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣＨＯ細胞の形質
転換と形質転換細胞における発現）約４μｇのプラスミ
ドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５０）、及び
約２０μｇの実施例１−（５）で作成したプラスミドｐ
ＳＶ２ＴＭＤ５を混合してエタノール沈殿した。沈殿物
を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５０
０μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄、ｐＨ７．
１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ
₂ を滴下し室温に１０分間放置した。

【０１５８】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。プレートに付着した細胞を０．２
５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはが
し、直径１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養
した。２４時間後、培地を選択培地に交換した。

【０１５９】選択培地の組成は、前述の培地に４００μ
ｇ／ｍｌになる様にジェネティシンＣ−４１８（ＧＩＢ
ＣＯ社製、米国、カタログ番号８６０−１８１１）を添
加したものである。３〜４日おきに培地交換を行いなが
ら約２週間培養して、トランスフォームした細胞をクロ
ーニングした。この操作で得られた細胞のクローンをそ
れぞれ直径１０ｃｍの組織培養プレートでコンフルエン
トになるまで生育させた。途中、培地のＦＣＳ濃度を１
０％から１％に減らした培地に切り換えて培養した。こ
のＦＣＳ含有選択培地で培養した培養液５０μｌをと
り、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイン
Ｃ活性化を促進する作用を測定したところ、強いプロテ
インＣ活性化促進作用が認められた。一方、コントロー
ルとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけでトラ
ンスフォームした細胞では本活性は検出されなかった。

【０１６０】実施例８ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は、実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプ
ロテインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コント
ロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで
トランスフォームした細胞では、本活性は検出されなか
った。

【０１６１】実施例９ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は、実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプ
ロテインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コント
ロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで
トランスフォームした細胞では、本活性は検出されなか
った。

【０１６２】実施例１０ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）プラスミ
ドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は、実施例７と同様の
操作を行い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を測定したところ強いプ
ロテインＣ活性化促進作用が認められた。一方、コント
ロールとして用いたプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで
トランスフォームした細胞では、本活性は検出されなか
った。

【０１６３】実施例１１ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣＨＯ細胞の形質
転換及び形質転換細胞の産生するペプチドのトロンビン
によるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）約４μｇ
のプラスミドｐＳＶ−２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１５
０）、及び約２０μｇの実施例１で作成したプラスミド
ｐＳＶ２ＴＭＪ２を混合してエタノール沈殿した。沈殿
物を風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭト
リス塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５
００μｌの２×ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０
ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ
７．１２）を加えた。次いで５０μｌの２．５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ₂ を滴下し室温に１０分間放置した。

【０１６４】一方、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１ｖ／
ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラボラト
リー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４９）を
含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地（フローラボラトリー
社製、米国、カタログ番号１０−４２１−２０）を用い
て直径６ｃｍの組織培養用プレートにプレート１枚当た
り細胞数約５×１０² 程度播種したＣＨＯ−ＫＩ株（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬＤ ６１）を１夜培養し、培地を新鮮な
培地に交換し、更に３時間培養した。このＣＨＯ−ＫＩ
に前述のＣａＣｌ₂ を滴下したプラスミドＤＮＡ溶液を
重層し、３７℃で約８時間培養した。５ｍｌのＰＢＳ
（−）（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号
２８−１０３−０５）を用いて２回洗浄し、さらに、５
ｍｌの前述の培地で洗浄後、新鮮な培地を加えて約１６
時間さらに培養した。

【０１６５】プレートに付着した細胞を０．２５％トリ
プシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、直径
１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養した。２
４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地の組成
は前述の培地に４００μｇ／ｍｌになる様にジェネティ
シンＣ−４１８（米国ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号８
６０−１８１１）を添加したものである。３〜４日おき
に培地交換を行いながら約２週間培養して、トランスフ
ォームした細胞をクローニングした。この操作で得られ
た細胞のクローンをそれぞれ直径１０ｃｍの組織培養プ
レートでコンフルエントになるまで生育させた。途中、
培地のＦＣＳ濃度を１０％から１％に減らした培地に切
り換えて培養した。

【０１６６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によって形質
転換された細胞の産生するペプチドのトロンビンによる
プロテインＣ活性化の促進作用を細胞ペレットを試料と
して用いて測定したところ強いプロテインＣ活性化促進
作用が認められた。一方、コントロールとして用いたプ
ラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏだけで形質転換した細胞及び
その培養上澄液では本活性は検出されなかった。

【０１６７】実施例１２ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（５）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約１，７００ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉ
ｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入し
てプラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１を得た。

【０１６８】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２，９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ５−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約２，６００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１を得
た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ５−１をＨｉｎｄIII
で完全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消
化して得た断片とをＴ₄ＤＮＡリガーゼを用いて継い
で、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５
−１を得た。以上の工程を図２０〜図２１に示す。

【０１６９】次に、実施例７に記載の方法に準じてｐｄ
ＢＰＶＴＭＤ５−１でＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フローラ
ボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が、６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１７０】実施例１３ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（４）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２１００ｂｐの断
片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃII及
びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入してプラス
ミドｐＵＣＴＭＤ４−１を得た。

【０１７１】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）にしたがってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。
得られたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片
に、プラスミドｐＵＣＴＭＤ４−１をＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIII で完全消化して得た約３，０００ｂｐのＤＮ
Ａ断片を挿入してプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１を得
た。このプラスミドｐＢＲＴＭＤ４−１をＨｉｎｄIII
で完全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−
１）（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消
化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて継い
で、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４
−１を得た。以上の工程を図２２〜図２３に示す。

【０１７２】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１７３】実施例１４ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（３）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約２, ２００ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉ
ｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入し
てプラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１を得た。

【０１７４】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄIII で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得た約３，０７０ｂｐのＤＮＡ断
片を挿入して、プラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１を得た。
このプラスミドｐＢＲＴＭＤ２−１をＨｉｎｄIII で完
全消化したものとプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）
（ＡＴＣＣ ３７１１１）をＨｉｎｄIII で完全消化し
て得た断片とＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｃ₁₂₇細胞
発現用のプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１を得た。以
上の工程を図２４〜図２５に示す。

【０１７５】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及び
１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマインシ（米国、フ
ローラボラトリー社製、カタログ番号１６−７００−４
９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したとこ
ろ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそれ
ぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃｍ
の組織培養用プレートでコンフルエントになるまで生育
させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換し
て培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌを
とり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテイ
ンＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が認
められた。一方、コントロールとして用いたプラスミド
ｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした細
胞では本活性は検出されなかった。

【０１７６】実施例１５ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１によるＣ₁₂₇Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（２）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約３, １００ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉ
ｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入し
てプラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１を得た。

【０１７７】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアスら（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ
ａｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２, ９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、
プラスミドｐＵＣＴＭＤ１−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラス
ミドｐＢＲＴＭＤ１−１を得た。このプラスミドｐＢＲ
ＴＭＤ１−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラ
スミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ ３７１１
１）をＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラ
スミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１を得た。以上の工程を図
２６〜図２７に示す。

【０１７８】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳ及
び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシン（フロー
ラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−７００−
４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培養したと
ころ、フォーカスを形成する細胞が６個得られたのでそ
れぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直径１０ｃ
ｍの組織細胞用プレートでコンフルエントになるまで生
育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培地に置換
して培養した。この培地で１日培養した培養液５０μｌ
をとり、これを用いて参考例１に記載した方法でプロテ
インＣ活性化の促進作用を測定したところ、強い活性が
認められた。一方、コントロールとして用いたプラスミ
ドｐＢＰＶ−１（９−１）だけでトランスフォームした
細胞では本活性は検出されなかった。

【０１７９】実施例１６ （プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２によるＣ₁₂₇ Ｉ細胞の形
質転換および形質転換細胞の産生するペプチドのトロン
ビンによるプロテインＣ活性化の促進作用の測定）実施
例１−（１）で作成したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を
ＨｉｎｄIII で完全消化した後、切断末端をＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端にし、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２のＨｉｎｄIII
サイトを欠失したプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１を得
た。次いでこのプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２−１をＰｖ
ｕII及びＢａｍＨＩで完全消化して約４, １００ｂｐの
ＤＮＡ断片を得た。これをプラスミドｐＵＣ１８のＨｉ
ｎｃII及びＢａｍＨＩで完全消化したベクターに挿入し
てプラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１を得た。

【０１８０】一方、プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
３７０１７）からコバスルビアスらの方法〔エル コ
バスルビアス（Ｌ．Ｃｏｖａｓｒｕｂｉａｓ ｅｔ ａ
ｌ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３、２５、（１９８１
年）に従ってプラスミドｐＢＲ３２７を作製した。得ら
れたプラスミドｐＢＲ３２７をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で消化して得た約２９６０ｂｐのＤＮＡ断片に、プ
ラスミドｐＵＣＴＭＪ２−１をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
III で完全消化して得たＤＮＡ断片を挿入してプラスミ
ドｐＢＲＴＭＪ２−１を得た。このプラスミドｐＢＲＴ
ＭＪ２−１をＨｉｎｄIII で完全消化したものとプラス
ミドｐＢＰＶ−１（９−１）（ＡＴＣＣ３７１１１）を
ＨｉｎｄIII で完全消化して得た断片とをＴ₄ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて継いで、Ｃ₁₂₇細胞発現用のプラスミド
ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１を得る。以上の工程を図２８〜
図２９に示す。

【０１８１】次に、ｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１で実施例７
に記載の方法に準じてＣ₁₂₇Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）をトランスフォームした。１０％ＦＣＳお
よび１（ｖ／ｖ％）ペニシリン−ストレプトマイシン
（フローラボラトリー社製、米国、カタログ番号１６−
７００−４９）を含むダルベッコのＭＥＭで約３週間培
養したところ、フォーカスを形成する細胞が６個得られ
たのでそれぞれの細胞をクローニングして、それぞれ直
径１０ｃｍの組織細胞用プレートでコノフルエントにな
るまで生育させた。その後、培地をＦＣＳを含まない培
地に置換して培養した。この培地で１日培養した後、培
養した細胞のペレットをかきとり、これを用いて参考例
１に記載した方法でプロテインＣ活性化の促進作用を測
定したところ、強い活性が認められた。一方、コントロ
ールとして用いたプラスミドｐＢＰＶ−１（９−１）だ
けでトランスフォームした細胞では本活性は検出されな
かった。

【０１８２】 実施例１７ （本発明の培養液からのトロンビンによるプロテインＣ
の活性化を促進する作用を有するペプチドの精製） 実施例７に記載した方法で培養したプラスミドｐＳＶ２
−ｎｅｏ及びプラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフ
ォームしたＣＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレ
ート２５枚で培養した。培地は１日おきに４回新鮮な培
地と交換した。この培養液をすべて集め（約１００ｍ
ｌ）、ｐＨ７．５に調製した後ＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースのカラムクロマトグラフィーにかけて調製し
た。すなわち、エヌ エル エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍ
ｏｎ）ら〔ザ ジャーナルオブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５７巻、８５
９頁（１９８２年）〕の方法に準じて作製したＤＩＰ−
トロンビン〔ジイソプロピルホスホロトロンビン（ｄｉ
ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｒｏｍｂｉ
ｎ）を、ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａ
ｓａｓ）の方法〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２４５
巻、３５９頁（１９７０年）〕にしたがってブロムシア
ン化したアガロースに結合させてＤＩＰ−トロンビン−
アガロースを作製した。

【０１８３】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作製して室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の上澄液をカラムに供した。カラムを０．３
Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１ｍＭベンズ
アミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸ
を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗
浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏ
ｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクションを集めた。
溶出によって得られる各フラクションについて前記の方
法でプロテインＣ活性化の促進作用を測定した。

【０１８４】同時に島津製作所（日本）製スペクトロフ
ォトメーターＵＶ−２４０を用いて、各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ₂₈₀）を測定した。
活性のある画分を回収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５
ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井化学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液
を２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロ
マトグラフィーに供した。即ち、透析液を１．５ｃｍφ
×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロンビン−アガロース
カラムに通し、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂ 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む
０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、
さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１％（ｖ／ｖ）ＬｕｂｒｏｌＰＸを含む０．０２Ｍ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出した。

【０１８５】活性画分を回収し、精製品を−８０℃で凍
結保存した。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白
質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm・２８
０ｎｍ＝１０．０）と規定して、それに基づき精製品の
量を計算したところ約４．７μｇであった。尚、この精
製品をポリアクリルアミドゲル濃度５−１０％のグラジ
ェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、銀染色によってバンドを観察したところ単一
のバンドのみ確認された。

【０１８６】 実施例１８ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い、本発明のペプチドの精製品を得、
波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品
の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数になら
い１０．０（Ｅ^1% _1cm・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定
して、それに基づき精製品の量を計算したところ約４．
５μｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミド
ゲル濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によって
バンドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８７】 実施例１９ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い、本発明のペプチドの精製品を得、
波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品
の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数になら
い１０．０（Ｅ^1% _1cm・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定
して、それに基づき精製品の量を計算したところ約４μ
ｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミドゲル
濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバン
ドを観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８８】 実施例２０ プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１を用いる以外は実施例１７
と同様の操作を行い、本発明のペプチドの精製品を得、
波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。この精製品
の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子吸光係数になら
い１０．０（Ｅ^1% _1cm ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定
して、それに基づき精製品の量を計算したところ約３μ
ｇであった。尚、この精製品をポリアクリルアミド濃度
５−１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色によってバンドを
観察したところ単一のバンドのみ確認された。

【０１８９】 実施例２１ 実施例１１に記載した方法で、プラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｊ２及びプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで形質転換したＣ
ＨＯ細胞を直径１０ｃｍの組織培養用プレート２５枚を
用いて培養した。培養後、培養上澄液を８００ｒｐｍで
１０分間遠心分離にかけて細胞を集めた。得られた細胞
ペレットに、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、
０．２５Ｍ庶糖、１ｍＭベンズアミジン塩酸、０．５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）１００ｍｌに懸濁し、ワーリングブレンダー
を用いて４℃で５分間、５回ホモジナイズして細胞抽出
物を得た。得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃で
６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。この上澄液
から、実施例１７と同様の操作により本発明のペプチド
の精製品を得、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。この精製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の分子
吸光係数にならない１０．０（Ｅ^1% _1cm・２８０ｎｍ＝
１０．０）と規定して、それに基づき精製品の量を計算
したところ約３μｇであった。尚、この精製品をポリア
クリルアミド濃度５−１０％のグラジェントを用いるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色
によってバンドを観察したところ単一のバンドのみ確認
された。

【０１９０】実施例２２ （トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用
の確認）精製した本発明のペプチドのプロテインＣ活性
化の促進作用を次の方法にて評価した。即ち、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、３．６ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１０ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に５０μｇ／ｍｌのプロテインＣ、５ｎ
Ｍのトロンビン及び５ｎＭの精製した本発明のペプチド
を加えて３７℃で反応させた。反応物に３００μｇ／ｍ
ｌのアンチトロンビンIII （米国シグマ社製）および５
ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止して、生成した活性
型プロテインＣの量を前述の合成基質を用いる方法で測
定した。結果を図３０図〜図３４に示すが、本発明のペ
プチドを無添加の場合（Ｂ）では活性化プロテインＣの
生成は認められなかった（点線）が、本発明のペプチド
を添加した場合（Ａ）には、反応時間と共に生成した活
性化プロテインＣの量が増加した（実線）。

【０１９１】実施例２３ （抗血液凝固作用の確認）本発明のペプチドがトロンビ
ンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を阻害
し、血液凝固を実質的に阻害することはハインリッヒ
アメルング社（独国）製のコアギュロメーターＫＣ−１
０を用いて血液凝固時間を測定することによって調べ
た。即ち、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に３．
０μｇのフィブリノーゲン（米国シグマ社製、フラクシ
ョンＩ）を加え、これに０−５０ｎＭの精製した本発明
のペプチドを加え、次いで、全量が０．４ｍｌになるよ
うに１０ｎＭのトロンビンを加えて凝固時間を測定し
た。結果を図３５〜図３９図に示す。トロンビンにくら
べ、添加した精製ペプチドの量が多くなるにしたがっ
て、血液凝固時間が延長されることが確認された。

【０１９２】実施例２４ （血小板凝集抑制作用の確認）本発明のペプチドがトロ
ンビンの血小板凝集作用を実質的に阻害することはＳＩ
ＥＮＣＯ社（米国）製のプレートレットアグリゴメータ
ーを用いて評価した。即ち、３０万ｃｅｌｌｓ／μｌの
血小板液（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍ
ａ、Ｐ．Ｒ．Ｐ．）２５０μｌに１単位のトロンビン
（約０．４μｇ）を加えると血小板が凝集するが、トロ
ンビンを加える前にその加えるトロンビンと等モル以上
の精製した本発明のペプチドを加えておくと血小板の凝
集が起きなかった。

【０１９３】

【発明の効果】本発明のペプチドは、抗血液凝固作用、
血小板凝集抑制作用、血栓溶解作用を併せ持ち副作用の
少ない循環器系疾患などの治療用薬として極めて有用な
物質である。また、本発明のペプチドは、このような医
薬用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器、カテー
テルなどの医用人工材料に結合させて、血栓の形成を防
止する薬剤として用いることができる。

【０１９４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115

【０１９５】配列番号：２ 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala Arg Ala 20 25 30 Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val Leu Gln 35 40 45 His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 50 55

【０１９６】配列番号：３ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly

【０１９７】配列番号：４ 配列の長さ：３５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC 48 CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC 96 GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG 144 ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG 192 TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC 240 GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC 288 CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC 336 CAC ATT GGC ACC GAC TGT 354

【０１９８】配列番号：５ 配列の長さ：１４９４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC 1494

【０１９９】配列番号：６ 配列の長さ：２３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 225 230 235

【０２００】配列番号：７ 配列の長さ：５７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu 515 520 525 Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly 530 535 540 Ala Ala Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu 545 550 555 560 Val Val Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 565 570 575

【０２０１】配列番号：８ 配列の長さ：２７２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ala Asp 20 25 30 Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu Cys 35 40 45 Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys 50 55 60 Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg Cys Glu 65 70 75 80 Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys 85 90 95 Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp 100 105 110 Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala 115 120 125 Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys 130 135 140 Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys 145 150 155 160 Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn 165 170 175 Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 180 185 190 Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser 195 200 205 Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro 210 215 220 Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser Gly Lys 225 230 235 240 Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser Pro Thr 245 250 255 Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His Ser Gly 260 265 270

【０２０２】配列番号：９ 配列の長さ：７０８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 708

【０２０３】配列番号：１０ 配列の長さ：１７２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG 96 CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC 144 AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC 192 TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC 240 GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC 288 GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG 336 GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT 384 GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG 432 GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG 480 AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG 528 CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC 576 TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG 624 GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC 672 ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG 720 GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC 768 AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC 816 CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC 864 AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC 912 TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA 960 CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT 1008 CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC 1056 CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG 1104 TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT 1152 AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG 1200 CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC 1248 TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC 1296 CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC 1344 GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC 1392 ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT 1440 GAC TCC GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG 1488 CCC AGC CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC 1536 GTG CAT TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG 1584 GTG GTG GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC 1632 GCC GCC AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG 1680 GTA GTG CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1725

【０２０４】配列番号：１１ 配列の長さ：８１６ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG ATC CCT 48 GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG GCA GAC 96 GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC CTC TGC 144 GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC TCG TGC 192 ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG TGC GAG 240 GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG CGC TGT 288 GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC TAC GAC 336 CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC AGA GCC 384 AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC CTC TGC 432 GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC AGG TGC 480 CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC CCC AAC 528 ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC GAC GGT 576 TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC TGC TCC 624 GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC GGG CCC 672 GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC GGC AAG 720 GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC CCG ACG 768 CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT TCG GGC 816

【０２０５】配列番号：１２ 配列の長さ：１６７１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC GTC GAG CAC GAC 48 TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC AAT GCC AGT CAG 96 ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG CGC TCC TCG GTG 144 GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC GGC GGC GTT GGC 192 CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC GGC TGC GGC GAC 240 CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG GTT ACG GGA GAC 288 AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC CTC AAT GGG GCT 336 CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT GCT GAG GCC ACT 384 GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC GAA GTG AAG GCC 432 GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC TGC AGG CCA CTG 480 GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG ATC ACC TAC GGC 528 ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG CTG CCG GTG GGC 576 AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA ATG TGC ACC GCG 624 CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG GCG CCG GGC GCT 672 TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC GCG TGC AAT GCG 720 ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC GCC GCC CTG CAG 768 GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG TCC TGC AAC GAC 816 CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG CCG GGC TCC TAC 864 TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC GAC CAA CAC CGG 912 TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT CCG TGT CCG CAG 960 CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC TGC TAC CCT AAC 1008 TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG GAC CCG TGC TTC 1056 AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC CAA ACT AGC TAC 1104 CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC CAC GAG CCG CAC 1152 AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA GCC GAC TGC GAC 1200 CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC TAC ATC CTG GAC 1248 GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA AAC GGC GGC TTC 1296 TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC GAG TGC ATC TGC 1344 GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC GAC TGT GAC TCC 1392 GGC AAG GTG GAC GGT GGC GAC AGC GGC TCT GGC GAG CCC CCG CCC AGC 1440 CCG ACG CCC GGC TCC ACC TTG ACT CCT CCG GCC GTG GGG CTC GTG CAT 1488 TCG GGC TTG CTC ATA GGC ATC TCC ATC GCG AGC CTG TGC CTG GTG GTG 1536 GCG CTT TTG GCG CTC CTC TGC CAC CTG CGC AAG AAG CAG GGC GCC GCC 1584 AGG GCC AAG ATG GAG TAC AAG TGC GCG GCC CCT TCC AAG GAG GTA GTG 1632 CTG CAG CAC GTG CGG ACC GAG CGG ACG CCG CAG AGA CTC 1671

【０２０６】配列番号：１３ 配列の長さ：５５７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Tyr Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555

【０２０７】配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro

【０２０８】配列番号：１５ 配列の長さ：５４ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC CTG GGG 48 TTC CCC 54

【０２０９】配列番号：１６ 配列の長さ：４６２ 配列の型：アミノ酸 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 1 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 450 455 460

【０２１０】配列番号：１７ 配列の長さ：１３８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGT 1386

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト肺から精製して得られる、トロンビンによ
るプロテインＣ活性化を促進する作用を有するペプチド
を参考例２において４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガ
ロ−スカラムクロマトグラフィーに供した結果を示すグ
ラフである。

【図２】参考例３−（２）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３の塩基配列を示すものである。

【図３】図２に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３の塩基配列を示
すものである。

【図４】参考例３−（５）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
１３７の塩基配列を示すものである。

【図５】図４に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図６】図５に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図７】図６に続くＤＮＡ断片ＴＭ１３７の塩基配列を
示すものである。

【図８】参考例３−（７）で得られる、ＤＮＡ断片ＴＭ
Ｐ５の塩基配列を示すものである。

【図９】図８に続くＤＮＡ断片ＴＰＭ５の塩基配列を示
すものである。

【図１０】参考例３−（１０）で得られる、ＤＮＡ断片
ＴＭＰ２６の塩基配列を示すものである。

【図１１】ＤＮＡ断片ＴＭＰ１３、ＴＭ１３７、ＴＭＰ
５およびＴＭＰ２６と参考例３−（１３−１）及び３−
（１３−２）で得られるＤＮＡ断片ＴＭＪ１とＴＭＪ２
の各制限酵素地図と、これらのＤＮＡ断片の有する塩基
配列における対応関係を示すものであり、縦方向にみて
各ＤＮＡ断片の互いに重なる部分は共通の塩基配列を有
することを示す。

【図１２】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ５を含有す
るプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図１３】ＴＭＪ１とそれに結合したＴＭＰ２６を含有
するプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＪ２の構築を示すフロー
チャートである。

【図１４】ＴＭＪ２を動物細胞宿主用発現ベクターに挿
入することによりプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２の構築を
示すフローチャートである。

【図１５】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭＤが相補的にハイブリダイズしたところを示すもの
であり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズし
ている部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされ
ているアミノ酸配列を示すものである。

【図１６】実施例１−（２）−（ｂ）で得られた組換え
体プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１７】実施例１−（２）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ−１３ｍｐ１９ＴＭＪ３にディリーター
ＴＭｄ₃が相補的にハイブリダイズしたところを示すも
のであり、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズ
している部分の周辺の塩基配列とそれによってコードさ
れているアミノ酸配列を示すものである。

【図１８】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₂
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図１９】実施例１−（４）−（ａ）で得られた組換え
体プラスミドＭ１３−ＴＭＤ３にディリーターＴＭｄ₄
が相補的にハイブリダイズしたところを示すものであ
り、ディリーターがプラスミドにハイブリダイズしてい
る部分の周辺の塩基配列とそれによってコードされてい
るアミノ酸配列を示すものである。

【図２０】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２１】図２０に続く複製可能可能な組換え体ＤＮＡ
であるプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ５−１の構築を示す
フローチャートである。

【図２２】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２３】図２２に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ４−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２４】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２５】図２４に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２６】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２７】図２６に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＤ１−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図２８】本発明の複製可能な組換え体ＤＮＡであるプ
ラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフローチ
ャートである。

【図２９】図２８に続く複製可能な組換え体ＤＮＡであ
るプラスミドｐｄＢＰＶＴＭＪ２−１の構築を示すフロ
ーチャートである。

【図３０】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３１】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３２】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３３】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３４】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドの存在
下及び非存在下における、プロテインＣとトロンビンと
の反応によって生成した活性化プロテインＣの量と反応
時間との関係を示すグラフである。

【図３５】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ５でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３６】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ４でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３７】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３８】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図３９】プラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２でトランスフォ
ームした細胞を培養・精製し、得られたペプチドを添加
した血液の凝固時間と精製した本発明のペプチドの添加
量との関係を示すグラフである。

【図４０】ＤＮＡ断片ＴＭＪ２の制限酵素地図である。
図中、斜線部分と斜交線部分とを含む部分は考えられる
オープンリーディングフレームであり、斜交線部分に本
発明のペプチドをコードする塩基配列が存在するもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭62−305876 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305877 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−305878 (32)優先日 昭62(1987)12月４日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌ
   ｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
   Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表される
   アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 該塩基配列が、配列番号１５の１−５４
   の塩基配列である請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 該塩基配列が、トロンビンに結合し、ト
   ロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を
   有するペプチドのシグナル配列用の塩基配列である請求
   項１または２に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 トロンビンに結合し、トロンビンによる
   プロテインＣの活性化を促進する作用を有するペプチド
   の製造方法にして、 （ａ）トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテイ
   ンＣの活性化を促進する作用を有するペプチドをコード
   する塩基配列の５’末端に、前記ペプチドを分泌し得る
   シグナル配列をコードする塩基配列を配置せしめた構造
   を含有するＤＮＡを、複製可能な発現ベクターと結合し
   て、該ＤＮＡと該複製可能な発現ベクターとを含有する
   複製可能な組換え体ＤＮＡを得、但し、ここで、ペプチドを分泌し得るシグナル配列は 、 （ｉ）次式： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌ
   ｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
   Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表される
   アミノ酸配列をコードする塩基配列、又は、 （ｉｉ）前記（ｉ）に記載のアミノ酸配列の１若しくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、後記のトロンビンに結合し、トロンビ
   ンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する
   ペプチドを分泌し得るシグナル配列をコードする塩基配
   列、のいずれかであり、またトロンビンに結合し、トロ
   ンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有
   するペプチドをコードする塩基配列は、 （ｉｉｉ）配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列、又 は、 （ｉｖ）前記配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列の
   アミノ酸残基の削除、付加、または置換を施すことによ
   り得られるアミノ酸配列を有し、トロンビンに結合し、
   トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用
   を有するペプチドをコードする塩基配列、のいずれかで
   ある、 （ｂ）該複製可能な組換え体ＤＮＡで微生物または細胞
   を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、 （ｃ）該形質転換体を該微生物または細胞の親細胞から
   選別し、 （ｄ）該形質転換体を培養して、該形質転換体に該ＤＮ
   Ａを発現させて、該ペプチドを産生せしめ、そして （ｅ）該ペプチドを培養した形質転換体から単離するこ
   とを特徴とする該ペプチの製造方法。
5. 【請求項５】 ペプチドを分泌し得るシグナル配列が、 （ｉ）次式、Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌ
   ｅｕ Ｇｌｙ ＡｌａＬｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ
   Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏで表される
   アミノ酸配列をコードする塩基配列であり 、トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの
   活性化を促進する作用を有するペプチドをコードする塩
   基配列が 、 （ｉｉ）配列番号３の１−４９８のアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列である請求項４に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 複製可能な組換え体ＤＮＡで形質転換さ
   せるに際して、ＣＯＳ−細胞、ＣＨＯ細胞又はＣ _１２７
   Ｉ細胞を用いること、および／またはトロンビンに結合
   し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する
   作用を有するペプチドが、培養上澄液に溶解し得る性質
   であることを特徴とする請求項４又は５のいずれかに記
   載の製造方法。