CN113244225B - 土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，属于医药生物技术领域。其中抗血小板为抗胶原诱导的血小板聚集或抗凝血酶诱导的血小板血块回缩，通过光学比浊法检测结果表明，土槿皮乙酸对胶原诱导人血小板聚集和对凝血酶诱导的血小板血块回缩有显著抑制作用，土槿皮乙酸不限定于抑制胶原诱导的血小板聚集，可用于其与其它血小板激活剂(胶原、花生四烯酸、ADP、肾上腺素、瑞斯托霉等)对血小板的作用及相关功能的影响，还可以用于监测现有的抗血小板治疗。

Description

土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用。

技术背景

冠状动脉不稳定斑块破裂、糜烂基础上继发血小板聚集、血管痉挛收缩、血栓形成导致的心肌梗死是美国等发达工业化国家首要死因，在中国，冠心病等心血管病死亡占居民疾病死亡构成40％以上。血小板在动脉血栓形成中发挥重要作用，经典的抗血小板药物阿司匹林以及新型阻断αIIbβ3与纤维蛋白原结合的药物阿昔单抗等均发挥了重要的临床治疗作用，但也存在胃肠道反应和出血等潜在的风险。研发安全性和有效性更佳的抗血小板药物，具有重要的临床及社会价值。

血管内皮细胞受损或斑块破裂，内皮下胶原暴露启动急性血栓形成。胶原与血小板表面糖蛋白VI和整合素-α2β1共同作用下，激活整合素αⅡbβ3活化途径，引起血小板活化及聚集。血小板活化过程中释放的凝血酶等活化物质又进一步促进血小板聚集，最终导致血栓的形成。目前临床中尚未有血小板表面糖蛋白VI抑制剂的使用。

土槿皮乙酸，亦称作“土荆皮乙酸”，是中药土槿皮的主要生物活性成分之一。土槿皮乙酸具有广泛的抗肿瘤作用，其机制与抑制细胞增殖，促进凋亡，抑制细胞侵袭和转移等机制相关。目前现有技术中未见有土槿皮乙酸在抗血小板及血栓方面的活性报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供土槿皮乙酸在制备抗血小板及血栓的药物中的应用。本发明所涉及的土槿皮乙酸，是中药土槿皮的主要生物活性成分之一。实验显示，土槿皮乙酸显著抑制胶原诱导的血小板聚集。土槿皮乙酸对凝血酶诱导的血小板血块回缩也具有显著的抑制作用。因此，土槿皮乙酸可用于抗血小板药物。土槿皮乙酸也可与药学上可接受的一种或多种载体组成的组合物组合，用于抗血小板抗血栓药物的制备。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述抗血小板为抗胶原诱导的血小板聚集或抗凝血酶诱导的血小板血块回缩。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述抗血小板药物由土槿皮乙酸与药学上可接受的一种或多种载体组成的组合物制备而成。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述土槿皮乙酸通过胶原诱导人血小板聚集和对凝血酶诱导的血小板血块回缩的显著抑制作用达到抗血小板聚集作用。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述土槿皮乙酸10mM能明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述土槿皮乙酸能明显抑制胶原诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。

根据所述的土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，其中所述土槿皮乙酸能作为血小板膜糖蛋白VI靶点的抑制剂。

本发明另外还提供了土槿皮乙酸在制备血小板膜糖蛋白VI抑制剂中的应用。

本发明的土槿皮乙酸用作为药物时，可直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物中含有0.1-99％的土槿皮乙酸化合物，优选为0.5-90％的有效成分土槿皮乙酸，其余为药物学和药剂学上可接受的，对人和动物无毒的药用辅料或载体。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

与现有技术相比，本发明优益性在于：

1、本发明对土槿皮乙酸发掘了新的医疗用途，临床现有药物尚未有血小板膜糖蛋白VI的抑制剂，土槿皮乙酸能作为这个靶点的抑制剂，开拓了一个新的应用领域。

2、本发明的产品土槿皮乙酸来源丰富、价廉、未见毒副作用，制备工艺简单，并可做成口服剂型、注射剂型、片剂等，使用方便。

3、本发明的产品土槿皮乙酸10mM可明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。能有效地抑制血小板聚集作用，能有效地作为抗血小板药物使用。

4、本发明的产品土槿皮乙酸可明显抑制胶原诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。能有效地抑制血小板聚集作用，能有效地作为抗血小板药物使用。

附图说明

图1为土槿皮乙酸对胶原诱导的血小板聚集的影响的曲线图；

图2为土槿皮乙酸对胶原诱导的血小板聚集的影响的柱状图；

图3为土槿皮乙酸对凝血酶诱导的血小板血块回缩的影响。

具体实施方式

下面结合附图，用下述实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明。但并不以此来限定本发明。

实施例1

土槿皮乙酸体外抑制胶原诱导的人血小板聚集。

(1)实验人血小板来源健康志愿者签署献血知情同意书并给与一定的营养补助。采集静脉全血，经昆明市血液中心分离出单采血小板，于昆明医科大学附一院血液科收集单采血小板。

(2)具体实施方式如下：

步骤一，采用DMSO溶解并调整土槿皮乙酸浓度为1.5mM和1M。

步骤二，洗涤血小板。取1mL 25℃恒温震荡储存的人单采血小板于1.5mL离心管中，加入终浓度为5mM的EDTA及0.1U/mL的Apyrase(生理盐水配制，防止离心过程中血小板聚集)，400g室温下离心10分钟；离心后的人单采血小板弃上清，在细胞沉淀中加入1mLTyrode’s Buffer B(137mM NaCl,27mM KCl,1mM MgCl₂，0.42mM NaH₂PO₄,5.5mM Glucose,5.55mM HEPES,0.25％Bovine Serum Albumin,pH 6.5)，5mM EDTA，0.1U/mL Apyrase轻吹匀，400g室温下再次离心10分钟；用Tyrode’s Buffer A(137mMNaCl,27mM KCl,1mM MgCl₂,0.42mM NaH₂PO₄，5.5mM Glucose,5.55mM HEPES，0.25％Bovine Serum Albumin，pH 7.4)重悬离心后的血小板，将血小板计数调整为150-250×10⁹/L。70rpm，25℃震荡储存，洗涤后的血小板在1小时内使用。

步骤三，吸取400μL洗涤血小板重悬液37℃下预热5min。在实验组中加入终浓度为0.75mM和10mM的土槿皮乙酸，阳性对照组(Vehicle)中加入等体积的DMSO，于37℃孵育20min。打开血小板聚集仪，按要求设置好参数，在孵育好的洗涤血小板中放入磁力棒，将带有磁力搅拌棒的血小板反应杯插入机器的检测孔中，将其置于血小板聚集仪测试区调零后加入胶原，在37℃、1200rpm条件下观察土槿皮乙酸对激活剂引起的血小板聚集的影响，共观察5-10min。根据血小板聚集仪记录的血小板聚集曲线绘制相应的条状图和柱状图。实验数据用GraphPadPrism 8.0软件进行统计学分析。利用Student’s t-test统计学方法进行组与组之间的比较。p<0.05则认为差异具有统计学意义。

如说明书附图1所示：人洗涤血小板在37℃下与不同浓度土槿皮乙酸或DMSO孵育20分钟，加入胶原(5μg/mL)活化血小板，使用血小板聚集仪，描绘并记录血小板聚集曲线。横坐标为聚集曲线描绘的时间，纵坐标为血小板聚集仪描绘的血小板实时聚集率。图1中呈现的是聚集实验中具有代表性的血小板聚集率曲线。聚集实验开始时，血小板聚集率为0％，随即加入胶原，在实验进行到第1min时阳性对照组(Vehicle)实验组的血小板开始聚集。在聚集实验进行到第3分钟左右时，Vehicle组聚集率达峰值约为80％，0.75mM土槿皮乙酸实验组聚集率达峰值约为40％，1mM土槿皮乙酸实验组聚集率约为5％。说明书附图2所示：Vehicle和不同浓度的土槿皮乙酸(0.75mM，1mM)组的血小板聚集峰值的比较的散点图。Vehicle和不同浓度的土槿皮乙酸(0.75mM，1mM)每组重复实验六次，血小板聚集峰值以均数±标准误表示，图中*代表差异有统计学意义，其中****代表与Vehicle组比较p≤0.0001。由图1及图2可知：土槿皮乙酸可明显抑制胶原诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性。

实施例2

土槿皮乙酸抑制血小板血块回缩。

(1)实验人血小板来源同实施例1。

(2)具体实施方式如下：

富血小板血浆用Tyrode’s Buffer A稀释并定量为500×10⁹/L，取200μL富血小板血浆置入硅化的透明玻璃管，37℃下孵20分钟。使用DMSO溶解土槿皮乙酸，调整浓度为1M。实验分组为：阳性对照组(Thrombin 0.2U/mL)，阴性对照组(Control)和土槿皮乙酸实验组。在实验组中加入终浓度为10mM的土槿皮乙酸，在阳性对照组，阴性对照组中加入和实验组等体积的DMSO，37℃孵育20分钟。孵育后在阳性对照组和土槿皮乙酸实验管中加入终浓度为0.2U/mL凝血酶，混匀后静置于37℃，每5分钟拍照一次。观察每个实验组与对照组血块回缩的速度及血块的大小差异。以上检测组每组均重复3次。

如说明书附图3所示：在实验监测的100分钟内，Control组血小板悬液在没有凝血酶刺激的情况下，并没有产生血块及血块回缩现象。阳性对照组(Thrombin 0.2U/mL)中，血小板悬液凝固为血块，并在实验进行的第20分钟开始回缩，在80分钟时回缩到最小。10mM土槿皮乙酸的实验组中，血小板悬液未凝固为血块，在实验进行的35分钟内均未见明显回缩。图3为重复实验中具有代表性的图片，3次实验得到类似的实验结果。因此，10mM土槿皮乙酸可明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩。

实施例3：

片剂：土槿皮乙酸10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将土槿皮乙酸、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例4：

安瓿剂：土槿皮乙酸化合物西曲瑞克，或实施例2-5所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将土槿皮乙酸和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

注射用冻干剂：土槿皮乙酸10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入土槿皮乙酸，超声处理使溶解，用1N盐酸调节pH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例6：

胶囊剂：土槿皮乙酸10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将土槿皮乙酸与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (2)

1.土槿皮乙酸在制备抗血小板药物中的应用，所述抗血小板为抗胶原诱导的血小板聚集或抗凝血酶诱导的血小板血块回缩；所述抗血小板药物由土槿皮乙酸与药学上可接受的一种或多种载体组成的组合物制备而成；所述土槿皮乙酸通过胶原诱导人血小板聚集和对凝血酶诱导的血小板血块回缩的显著抑制作用达到抗血小板聚集作用；所述土槿皮乙酸10mM能明显抑制0.2U/mL凝血酶诱导的血块回缩；所述土槿皮乙酸能明显抑制胶原诱导的血小板聚集，并且其抑制效率呈剂量依赖性；所述土槿皮乙酸能作为血小板膜糖蛋白VI靶点的抑制剂。

2.土槿皮乙酸在制备血小板膜糖蛋白VI抑制剂中的应用。

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