CN100525777C - 一种解聚海参糖胺聚糖组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解聚海参糖胺聚糖组合物，其含有90-99.89%重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖，其制备方法是：1)从海参中提取海参多糖；2)降解提取出的海参多糖；3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。解聚海参糖胺聚糖组合物能安全、有效地预防和治疗心脑血管疾病，尤其是用于预防和治疗凝血性和血栓性疾病。制备解聚海参糖胺聚糖组合物的原料为海洋生物，资源丰富、价格低廉，通过本发明明确了有效药物成分并减少了不必要的无效成分，因此更容易控制生产成本和产品质量。

Description

一种解聚海参糖胺聚糖组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种分子量为8000Da至12000Da解聚海参糖胺聚糖组合物及其制备方法，以及含有该聚海参糖胺聚糖组合物的药物及其在预防和治疗心脑血管疾病方面的应用。

背景技术

随着人口老龄化程度的提高，心脑血管疾病已经成为人类健康的最大威胁。据报道心脑血管疾病是老年人三大主要死因之一，目前因心脑血管疾病死亡者占总死亡人数的34％，在存活中越3/4左右的患者有不同程度的劳动能力和生活自理能力的丧失。而缺血性中风是心脑血管中最常见的一种疾病，占脑血管病的43-65％，该疾病发病病率高、病死率高、致残率高、复发率高，严重的危害着人类生存和生活质量。中风病世界人口标化发病率为239.4/10万，其中缺血性中风占53.6％。随着人口老龄化和人类生活方式的变化，其发病率还有逐年增长的趋势。心脑血管疾病已成为人类死亡的头等原因，因此积极开展预防该疾病的药物研制和开发迫在眉睫。

目前，临床中用于抗凝作用的药物主要以下几类：

1、肝素(UFH)

肝素是一种常用的抗凝剂，用于预防和治疗血栓疾病已有十几年的历史。肝素在体内和体外均具有抗凝作用，其通过与血浆中的抗凝血酶III(AT-III)结合成复合物来抑制凝血酶的凝血作用，但肝素本身并不能溶解已经形成了的血栓。另外，静脉注射肝素时还可以使脂蛋白质酶释放和稳定，可以降低血浆甘油三酯。但是，肝素不是理想的抗凝剂，临床应用上有很多局限性。肝素可产生一个威胁生命的并发症，即肝素诱导的II型血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia-II，简称为HIT)，可以导致血栓栓塞性并发症。如果，心脏手术后出现HIT，51％的病人可出现血栓栓塞性并发症，死亡率为37％。

2、肝素(LMWH)

肝素是80年代初从标准肝素(Standard heparin，SH)或成为组分肝素(Unfractionated heparin)中分离出来的分子量较小的肝素片断，分子量的范围一般为4000-7000。肝素虽然抗凝作用起效快，但是半衰期仅为1.5小时，且只能注射给药，故仅用于心脑血管疾病的第一期治疗。

3、纤溶酶类药物(PA)

纤溶酶类药物主要通过溶解血栓而广泛应用于心脑血管血栓性疾病。但是由于纤溶酶原激活可导致脑血管基质降解和神经毒性的作用，使PA类药物的应用受到了挑战。

4、水蛭素(Hirudin)

天然水蛭素是水蛭口腔腺体分泌物中含有的抗凝血物质。它不需要辅助因子，不依赖于AT-III，能够阻滞与血凝块结合的凝血酶的活性。但是目前临床上还没有直接对抗其作用的拮抗剂，而且临床用量大(250mg/支)，价格昂贵，加重了患者的负担。

5、前列腺素E1(PGE1)

PGE1可减少单核细胞的组织因子表达及活性血小板表面凝血因子的表达，因而可作为一种抑制外源性凝血途径的抗凝血酶药物使用，但是PGE1应用的一个主要问题是其血管舒张效应，有可能导致血压明显下降。

除了以上已经投入药用的物质，人们也很关注提取自海参的糖胺聚糖及其衍生物的抗凝血作用。中国专利申请CN1440985A公开了可提取自海参的多糖的制备方法，制备出的海参多糖合物中的多糖分子量大，而且还难以将糖胺聚糖中混有的海参岩藻糖除去，质量难以达到药用标准。为此，中国专利申请CN1579415A和Hideki Nagase等人(可参见Thromb Res；2003，112(1-2)：83-91；Kidney Int.，2003，63(4)：1548-55；Thromb Haemost.，1997，77(6)：1148-53；Thromb Haemost.，1997，77(2)：399-402；Thromb Res.，1996，15；84(2)：111-20；Thromb Res.，1996，83(3)：253-64；J Biochem(Tokyo).，1996，119(1)：63-9；Blood.，1995，85(6)：1527-34，这些文献的全文均纳入本文参考)分别通过进一步解聚来自海参的糖胺聚糖来获得分子量分布在10000Da至15000Da范围内的解聚海参糖胺聚糖组合物，这样的组合物可以在一些体内或体外实验中起到替代肝素等药物的抗凝血作用，然而这些文献没有充分的实验证据表明这些组合物的药用安全性，更没有提示平均分子量更低的解聚海参糖胺聚糖组合物作为抗凝血药物预防和治疗的安全性和有效性。另外，目前努力中的分子量大的海参糖胺聚糖药物还存在着容易引起血小板聚集等副作用有待于解决。

发明内容

本发明为解决背景技术中存在的上述技术问题，而提供一种、疗效确切且出血副作用小的分子量为8000Da至12000Da解聚海参糖胺聚糖组合物及其制备方法，以及含有该解聚海参糖胺聚糖组合物的心脑血管疾病的药物。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种解聚海参糖胺聚糖组合物，其含有90—99.89％重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖。

一种制备上述的解聚海参糖胺聚糖组合物的方法，包括如下步骤：

1)从海参中提取海参多糖；

2)降解提取出的海参多糖；

3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。

其中步骤1)中的海参选自花刺参、梅花参、绿刺参、玉足海参和黑海参，优选为黑海参。

其中步骤1)从海参中提取海参多糖的步骤包括对海参进行绞碎、酶解并沉淀获得海参多糖粗品，然后对海参多糖粗品纯化、脱色，得到海参多糖。

其中步骤1)中的酶解是用碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；对海参多糖粗品纯化是用DEAE-纤维素柱进行纯化。

其中步骤2)降解提取出的海参多糖的步骤包括在5％双氧水的条件下，将提取的海参多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。

其中步骤3)是用凝胶过柱来收集解聚海参糖胺聚糖组合物。

其中步骤3)收集的解聚海参糖胺聚糖组合物的多分散度小于2，优选小于1.5，更优选小于1.4。

其中步骤3)后还包括冷冻干燥的步骤。

一种的药物组合物，其包括解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体。

其中药物组合物为注射剂时低分子解聚海参糖胺聚糖组合物的含量为0.03-2.5％(重量)，优选为1％(重量)；药物组合物为口服制剂时每片含低分子解聚海参糖胺聚糖组合物50-200mg，优选为100mg。

其中药物组合物为冻干粉针剂时，药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种；药物组合物为口服制剂时，药学上可接受的载体选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、交联PVP和羧甲基淀粉钠中的一种或几种。

药物组合物在预防和/或治疗心脑血管疾病中的应用。其中心脑血管疾病是凝血性和血栓性疾病，优选是缺血性脑血管疾病或血栓性疾病，更优选是缺血性脑中风。

发明人将传统中药的特点和优势与现代医学技术相结合，在现有技术的提示之外，获得了一种制备解聚海参糖胺聚糖组合物的方法，并由此获得了一种重均分子量介于8000Da至12000Da之间(相应地，数均分子量更低)的解聚海参糖胺聚糖组合物。经大量实验研究表明，该组合物能安全、有效地预防和治疗心脑血管疾病，尤其是用于预防和治疗凝血性和血栓性疾病。具体而言，其抗凝效应可以被硫酸鱼精蛋白(PS)所纠正，所以更能确保其使用中的安全性。此外，相对于肝素等当前临床应用的药物，本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物的原料为海洋生物，资源丰富、价格低廉，解聚海参糖胺聚糖纯度高；而且，其药效突出，抗凝活性强，小剂量即可有效；抗凝机制不同于肝素，抗凝效应与剂量明显相关，抗凝机理及安全性方面更优，可以作用于凝血瀑布多个环节，阻断凝血瀑布的发展，在有效抗血栓形成同时而无显著的出血副作用；另外，通过本发明明确了有效药物成分并减少了不必要的无效成分，因此更容易控制生产成本和产品质量，作用机理明确，制剂稳定性高。

附图说明

图1本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物的纯度图。

图2本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物的分子量分布图谱。

具体实施方式

海参是棘皮动物门海参纲动物，传统上已经认识到其具有滋阴养血、温经通络、补生益精等功效。海参体壁内包含多糖物质，包括海参糖胺聚糖(Sea cucumber glycosaminoglycan，简称为SC-GAG)和海参岩藻多糖(Holothurian Fucan，简称为HF)，其中海参糖胺聚糖具有抗癌、提高免疫力、促进纤溶、降低血粘度、调节血脂、抗凝等多种生理活性，而且在抗凝方面海参糖胺聚糖较海参岩藻多糖具有更强的活性。优选本发明的海参选自花刺参、梅花参、绿刺参、玉足海参、糙海参和黑海参，尤其优选为黑海参。其中，黑海参产于我国南海海域，分布广、资源量大、价格便宜、而且含糖量高，是最理想的原材料。

本发明中所称的“解聚海参糖胺聚糖组合物”指的就是提取自海参的含有海参糖胺聚糖的提取物，也就是指由海参多糖降解而产生的、包含解聚了的糖胺聚糖的组合物，从海参体壁提取海参多糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如韩慧敏等(海参多糖提取工艺研究。湖南中医杂志，16(1)：56-57)报道了制备海参多糖的方法，可以获得高分子量的海参糖胺聚糖。为了克服血小板聚集等副作用并取得良好疗效，本发明将海参多糖降解成为的解聚海参糖胺聚糖(depolymerized holothurianglycosaminoglycan，简称为DHG)组合物。而且该组合物中解聚海参糖胺聚糖占总组合物重量的90％以上。优选解聚海参糖胺聚糖组合物中解聚海参糖胺聚糖占95％以上，为了达到理想的药用效果，更优选占98％以上，更优选占99％以上，在本发明的一个具体实施方式中，解聚海参糖胺聚糖的纯度达到了99.89％。本发明的解聚海参糖胺聚糖组合物中含有一种或一种以上分子量的海参解聚海参糖胺聚糖，其中所含有的海参解聚海参糖胺聚糖的重均分子量介于8000Da至12000Da之间。本文中的“重均分子量”是本领域技术人员所熟知的术语，指的是对高分子聚合物(对于本发明而言，尤其是解聚海参糖胺聚糖)中不同分子量进行个数和重量加权平均后得到的聚合物分子量的表征值。本发明的海参解聚海参糖胺聚糖组合物中所含有的海参解聚海参糖胺聚糖的重均分子量介于8000Da至12000Da之间，优选介于9000Da至11000Da之间，更优选介于9500Da至10500Da之间，在本发明的一个具体实施方式中，获得的重均分子量为10000Da。要获得符合分子量要求的解聚海参糖胺聚糖组合物可以通过收集相应分子量的解聚海参糖胺聚糖来实现，例如，可以通过严格地控制降解海参多糖的条件使解聚海参糖胺聚糖的分子量基本介于8000Da至12000Da之间，收集全部解聚海参糖胺聚糖；或者，可以在降解后只收集分子量基本介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖；也可以综合使用以上两种方式。

本发明解聚海参糖胺聚糖制备方法中步骤(1)可以包括，对海参进行绞碎、酶解并沉淀获得海参多糖粗品，然后对海参多糖粗品纯化、脱色，得到海参多糖。其中，酶解优选是用碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解。双酶解法不但能提取组织中多糖成分，而且所得的多糖纯度高，工艺条件缓和，废弃物易处理。酶解提取液中，糖胺聚糖与蛋白质断开，但溶液中仍然存在部分未被蛋白酶水解的蛋白质，可以根据蛋白质在等电点溶解度最小的特性，选择适当的pH值，可以将部分蛋白质从溶液中沉淀出。动物组织中一般酸性蛋白远多于碱性蛋白，调节溶液的pH至酸性，可以除去较多杂蛋白。沉淀可以通过有机溶剂进行沉淀，其中有机溶剂优选为乙醇。从海参体壁提取海参多糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如韩慧敏等(海参多糖提取工艺研究.湖南中医杂志，16(1)：56-57)报道了通过绞碎、酶解、沉淀和纯化、脱色来制备海参多糖，其全文纳入本文参考。在本发明中为更有效地收集分子量介于100000Da至120000Da之间的高分子量的海参糖胺聚糖以方便后续步骤进行，优选对海参多糖粗品纯化是用DEAE-纤维素柱进行纯化。脱色可以采用活性碳吸附脱色或双氧化脱色，在本发明的具体实施方案中，优选采用双氧化脱色，即使用3％双氧水脱色除热源。

本发明解聚海参糖胺聚糖制备方法中步骤(2)包括，在5％双氧水的条件下，将步骤(2)提取的海参多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。例如，可以向步骤(1)提取的海参多糖加入高浓度双氧水使最终双氧水的浓度达到5％，在这种条件下，控制降解的温度和时间，使解聚海参糖胺聚糖组合物中解聚海参糖胺聚糖的重均分子量达到8000Da至12000Da之间。最终产物的重均分子量可以通过色谱分析来确定，收集重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖。降解的温度和时间可以根据具体情况，如海参的种类、步骤(1)制得的海参多糖含量及分子量大小，通过设置不同温度和时间的预实验来获得，通常温度为20至60摄氏度，优选为35至50度；时间为6至72小时，优选为12至48小时。在本发明的具体实施方案中，对从黑海参中提取的海参多糖可以在45摄氏度下降解24小时。

本发明解聚海参糖胺聚糖制备方法中，其中步骤(3)是用能分离不同分子量的技术来收集解聚海参糖胺聚糖组合物，优选是用凝胶过滤色谱来收集解聚海参糖胺聚糖组合物。本领域技术人员可以通过购买已经商品化的凝胶过滤色谱产品(如Sephadex-G75柱)来进行收集。收集的解聚海参糖胺聚糖组合物中的解聚海参糖胺聚糖的多分散度小于2，优选介于1.1至2之间，优选小于1.5，优选介于1.2至1.5之间，更优选小于1.4，更优选介于1.3至1.4之间。多分散度(polydispersity)是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布宽度指数，是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw/Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw/Mn等于1，随着分子量分布变宽，Mw/Mn值逐渐变大。在本发明的优选实施方案中，制备得到的解聚海参糖胺聚糖组合物中的解聚海参糖胺聚糖多分散指数为1.36。通过多分散度的值可以将重均分子量换算为数均分子量，如本发明的优选实施方案中的重均分子量为10000Da的解聚海参糖胺聚糖，其数均分子量仅仅为7352Da，远远小于Hideki Nagase等人报道的数值。步骤(3)后还可以包括进一步处理的步骤，如冷冻干燥的步骤，从而方便保存、运输和/或进一步应用。

上述解聚海参糖胺聚糖组合物可以通过上述的制备方法制备得到，或可以将多次采用本发明上述的制备方法制备得到的提取自不同海参种类和/或不同分子量分布的组合物混合而得到，优选就是直接由上述的制备方法制备得到。

在本发明的制备解聚海参糖胺聚糖组合物一个优选实施方案中，为了获得适合于静脉注射的高纯度解聚黑海参糖胺聚糖组合物，可以依次将干燥的黑海参体壁绞碎，经酶解后离心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物①；将该沉淀物①加水溶解后，加入氯化钙，离心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物②；将沉淀物②加水溶解后，加入醋酸钾，取上清液，加乙醇沉淀，干燥得海参多糖粗品；将海参多糖粗品过DEAE-纤维素柱，用乙醇醇沉，加入双氧水脱色处热源，可得分子量为100000-120000的海参多糖；将该海参多糖在5％双氧水条件下控制解聚，然后用乙醇沉淀，沉淀物加水溶解后，过Sephadex-G75柱，冷冻干燥。由此可得到纯度高达98％以上的解聚海参糖胺聚糖，其重均分子量介于8000-12000之间，多分散度小于1.5。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备药物组合物对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物组合物包含一种或多种解聚海参糖胺聚糖组合物作为活性成分，将该解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂、等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药方式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。优选本发明的药物制剂为注射剂、冻干粉针剂或口服制剂。载体、赋形剂、稀释剂是药学上可接受的并与活性成分相容。可以选用的合适的赋形剂优选但不仅限于水、生理盐水、葡萄糖，甘油、乙醇或其类似物及其组合。当本发明的药物制剂为冻干粉针剂时，优选其中药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种。而当本发明的药物制剂为口服制剂时，优选其中药学上可接受的载体选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、交联PVP和羧甲基淀粉钠中的一种或几种。本发明的药物组合物中活性成分的含量可以根据具体剂型、给药方式以及给药对象的情况而定，如，优选注射剂中解聚海参糖胺聚糖组合物的含量为0.03-2.5％(重量)，优选为1％(重量)；又如，口服制剂每片含解聚海参糖胺聚糖组合物50-200mg，优选为100mg。

本发明还提供了该药物组合物的制备方法，其包括将本发明解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体混合的过程。药物的制备方式可以采用本专业的一般技术人员所公知的方法从而制备成合适的制剂。例如，可包括将解聚海参糖胺聚糖组合物稀释成注射剂的过程。更具体地，可以取解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体，用注射用水溶解，向溶解产物加入针用活性炭，搅拌，过滤。在一个具体实施方案中，取解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体，用注射用水溶解，向溶解产物加入针用活性炭，搅拌5分钟，用孔径为0.45μm的过滤膜过滤，然后将滤液通过0.22μm微孔滤膜除菌过滤，接着无菌分装，冷冻干燥，如果要进行冷冻干燥，还可以包括冷冻干燥的步骤，最后轧盖、包装，即得相应药品。在另一个具体实施方案中，本发明还提供了口服制剂的具体方法，即将解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体，混合制软材，制粒，干燥，整粒，压片，包衣，可得到相应的片剂药品。

本发明提供了本发明的药物组合物在预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的应用。优选其中心脑血管疾病是凝血性和血栓性疾病，优选是缺血性脑血管疾病或血栓性疾病，更优选是缺血性脑中风。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，以解聚海参糖胺聚糖计，给药的剂量为0.01～100mg/kg患者体重，优选为0.05～10mg/kg，优选为0.1～1mg/kg。给药形式根据各种药物制剂的剂型及其生物利用度来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选注射给药。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

实施例1

1.1 海参多糖的提取

取干燥的黑海参(Holothuria atra)体壁1000g，加水浸泡，洗净淋干，绞碎，补水至8kg，用氢氧化钠调节pH值为8.0，加入碱性蛋白酶(无锡市酶制剂厂)20ml，60℃进行酶解，酶解结束后，再加入胰酶(四川德阳酶制剂厂)2g进行二次酶解，将该酶解产物室温离心，取上清液。用盐酸调节pH值为2.5，离心去除酸性蛋白沉淀。加入0.8倍体积乙醇，4℃离心，其上清液，得到沉淀物。将该沉淀物加10倍重量的水溶解，加热至90℃，加入氯化钙使氯化钙的浓度为2％，保温20min，冷却，离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调节pH为11.0，离心，收集上清液，用盐酸调节pH为6，加入0.8倍体积乙醇醇沉，收集沉淀物。将该沉淀物加2倍重量的水溶解，加入醋酸钾使其最终浓度为2mol/L使该溶液沉淀，4℃离心，上清液加0.6倍体积的乙醇醇沉，4℃离心，收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，离心收集沉淀物，干燥得到海参多糖粗品。将该粗品溶于醋酸-醋酸钠的缓冲溶液中，过DEAE纤维素柱(上海恒信化学试剂有限公司)，用1mol/L的氯化钠和醋酸-醋酸钠的缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，加入等倍量体积的乙醇进行醇沉，离心，收集沉淀，干燥得白色固体。将该固体溶于水中，在pH值为11，温度为60℃的条件下，加入3％的双氧水进行脱色除热源，等体积量的乙醇醇沉，静置，4℃离心，得海参多糖纯品。

1.2 解聚海参糖胺聚糖的制备

以下将描述降解海参多糖并收集符合要求的解聚海参糖胺聚糖的步骤。

首先，将上述海参多糖纯品用5％醋酸配成1％的溶液，加入30％的双氧水使溶液中双氧水的浓度为5％，45℃进行控制解聚24小时。将该溶液用0.001mol/L的氢氧化钠中和至中性，加入5倍体积量的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。

将该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过Sephadex-G75柱，用0.5mol/L的氯化钠进行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥即得12g解聚海参糖胺聚糖，其分子量都在8000-12000，D值<1.5，纯度达98％以上。

该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经蒸发光散射分析仪(ELSD200蒸发光检测器，美国澳泰公司生产)可得到纯度为99.89％的纯品(图谱见图1)。经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSKgel G4000PW_XL，日本TOSOH公司)色谱分析知该产品的均重分子量为10000，D值为1.36(图谱见图2，相应参数见表A)。

表A 色谱分析得到的样品分子量及多分散性

 

样品名称	Mn(Da)	Mw(Da)	多分散性
				解聚海参糖胺聚糖	7352	10000	1.360025

1.3 注射用含有解聚海参糖胺聚糖的药物组合物的制备

以上10g解聚海参糖胺聚糖加入注射用水，配成1％的溶液，再加入甘露醇20g溶解，精滤，灌装，冷冻干燥，得到1000支注射用解聚海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。

1.4 含有解聚海参糖胺聚糖的药物组合物的片剂的制备

可制成1000片解聚海参糖胺聚糖片剂的配方如下：

其制法如下：

1)将解聚海参糖胺聚糖与乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠分别粉碎，过80目筛，备用；

2)上述粉碎后，主药及辅料混合均匀，用3％PVP80％乙醇溶液制软材，20亩筛制粒，湿颗粒在60-70℃干燥2小时，20目筛整粒，加入硬脂酸镁混匀，压片，包薄膜衣，即得。

实施例2 解聚海参糖胺聚糖的药效学试验

1、实验材料

1.1 动物：SD品系大白鼠，♂性，体重250-320g，质量合格证：陕医动证字08-005号；新西兰品系大白兔，♀♂各半，体重1.8-2.2kg，质量合格证：陕医动证字08-18号。

1.2 药物：注射用解聚海参糖胺聚糖

规格：10mg/支(以有效成分——解聚海参糖胺聚糖计)

阳性对照药物：血塞通注射液(规格：2ml/100mg/支)

(一)注射用解聚海参糖胺聚糖对局灶性脑缺血大鼠的影响

(1)实验方法

取SD品系，雄雌各半，体重280-320g大鼠足量，适应实验室7天后开始称重，编号，随机分为6组，每组多于10只。每组给药的药物均以药物的有效成分计算(下同)，具体分组如下：

①假手术对照组(生理盐水5mg/kg)；

②脑缺血模型组；

③阳性药血塞通注射组(41.2mg/kg)；

④注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(4mg/kg)；

⑤注射用解聚海参糖胺聚糖中剂量组(2mg/kg)；

⑥注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(1mg/kg)；

术前，各组动物按预设剂量静脉注射1次·d^-1，给药体积均为5ml/kg，连续一周；脑缺血手术后12h，各组动物再给药一次。

采用大脑中动脉阻断MCAO法致大鼠持续性脑缺血法。假手术对照组动物，使中动脉可见后，对其不做电凝烧灼，其他手术操作仍按照MCAO法进行操作。

术后，选用表现有霍纳(Horner)综合症(同侧瞳孔缩小，眼球内陷，眼裂变小)和拖尾时左前肢曲内收着方列为合格的实验研究对象。Horner模型具有较高死亡率，最终应确保每组10例合格动物数。

(2)观察

观察试药对动物神经行为、脑梗死体积、脑指数的影响。

于脑缺血手术后24h，根据Bederson评分标准，对实验动物进行神经行为学平分。动物的行为障碍越严重，Bederson评分分值越高。

随后断头处死各组大鼠，迅速取出鼠脑并称脑重，随后除嗅球，小脑和低位脑干，置于冰盐水中10min，冠状切成五片2mm厚脑片，迅速将脑片置于2％氯四氮唑(TTC)磷酸缓冲溶液中，37℃避光温孵染色30min，其间每隔7-8min翻动一次。温孵完毕后用数码相机拍照双侧脑片，输入计算机并采用美国Scion Corporation的Scion Image Beta4·0·2图像处理软件测量梗塞面积，获取每鼠脑片总梗塞面积值，与脑片总面积值，按照下面的公式分别计算出脑梗塞体积、脑指数。

V_s(单片体积)＝A_si(单片面积值)×2(厚度，mm)

S＝0，1i＝1，2，3，4，5

j＝1

其中N：全脑重；W：大鼠体重

结果：注射用解聚海参糖胺聚糖对脑缺血大鼠神经行为障碍有改善作用，与模型组比较，大剂量P<0.01，中剂量组P<0.05；可降低脑缺血大鼠梗塞体积，与模型组比较，大剂量均P<0.01；对脑缺血大脑指数无影响。与模型组比较，三个用药组均P>0.05。结果见表1-表3

表1注射用解聚海参糖胺聚糖对脑缺血大枢神经行为的影响(X±5，n＝10)

与模型组^※P<0.05^※※P<0.01；与阳性药组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

表2注射用解聚海参糖胺聚糖对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响(X±s，n＝10)

组别　　　　　　剂量(mg/kg)　　　　　　　脑梗塞体积比率(％)

假手术对照组                                0

脑缺血模型组                                41.69±6.16

血塞通注射液组                41.2          25.05±3.96^※※

解聚海参糖胺聚糖大剂量组      4             19.93±3.86^※※

解聚海参糖胺聚糖中剂量组      2             25.86±5.34^※※

解聚海参糖胺聚糖小剂量组      1             44.74±5.53

与模型组^※P<0.05^※※P<0.01；与阳性药组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

表3 注射用解聚海参糖胺聚糖对大脑缺血脑指数的影响(x±s，n＝10)

与模型组^※P<0.05^※※P<0.01；与阳性药组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

(二)注射用解聚海参糖胺聚糖对数血液流变学的影响

试验方法：取经实验室适应5天后健康SD品系大鼠60只，体重196.51±10.3g，随机分为10组。

①假手术对照组(生理盐水5mg/kg)；

②脑缺血模型组；

③阳性药血塞通注射组(41.2mg/kg)；

④注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(4mg/kg)；

⑤注射用解聚海参糖胺聚糖中剂量组(2mg/kg)；

⑥注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(1mg/kg)；

以上动物，除①②组外的其余动物连续静脉注射给药一周，容量为5ml/kg。动物取血前一天，采取正常动物组外，其余动物皮下注射Adr0.08ml/100g，一天两次，间隔4h，第一次注射后2小时将大鼠浸入冰水内5min做血瘀模型后，禁食不禁水。次日早晨将大鼠断头取血2.7ml，其中1.5ml血迅速注入肝素抗凝管中摇匀后，置入35℃的恒温水浴箱中备用，1.2ml血迅速注入柠檬酸钠抗凝管，摇匀备用。

取1ml肝素抗凝血注入粘度计转筒内，转换高切变率，低切变率开关，记录高切率，低切率粘度标度值(高切：200s^-1；低切：40s^-1)将其输入计算机，求得全血高切变率及低切变率粘度值。

取底端平整的毛细管，扦入刚混匀的肝素抗凝血中，待血进入毛细管内4/5处，封住下端口，下端扦入橡皮泥中，垂直竖立，并计时1h后，用血沉压积板读出血沉值(温氏法)。

将上述毛细离心管，用3F-3型高速微量离心机离心5min，转速12000rpm，再用压积板读出红细胞压积值。

将测定压积的毛细离心管在温度为56±1℃的水浴中水浴5min，然后用同样离心机离心5min，转速仍为12000rpm，取出后用读数显微镜测量毛细管内血浆长度和纤维蛋白原长度，按下列公式计算纤维蛋白原含量(热沉淀法)。

将做完全血粘度的血吸回原抗凝管，用80-2型离心机离心血浆，转速为3000rpm，时间为15min，取1ml，按上述测全血切粘度的方法测血浆粘度。

全血还原粘度由计算机根据全血高切变率粘度值和红细胞压积计算，软件由中科院传感技术公司提供。

取1ml柠檬酸钠抗凝血加入容量为5ml的长颈圆形玻璃瓶中，将其置于血小板粘附仪转盘上，以5rpm的转速旋转15min后取上，再用定量取血管分别吸取20μl旋转前和旋转后的抗凝血注入1％0.4ml的草酸铵稀释剂中测定旋转前后血中的血小板数，然后按照下列公式计算：

以上实验结果，给药组与模型组比较，经间经统计学T检验处理，结果见表4

表4 注射用解聚海参糖胺聚糖对大鼠血液粘度的影响(X±s，n＝10)

 

项目	正常组	模型组	阳性组	大剂量组	中剂量组	小剂量组
							高切变率粘度(mPa·s)	5.31±0.41	6.83±0.56<sup>▲▲</sup>	5.47±0.46<sup>※※</sup>	5.38±0.44	5.60±0.46	6.20±0.40<sup>※※</sup>
低切变率粘度(mPa·s)	8.79±0.68	12.22±0.86<sup>▲▲</sup>	9.65±0.70<sup>＊＊</sup>	9.23±0.67<sup>※※</sup>	9.86±1.32<sup>※※</sup>	11.17±1.11<sup>※</sup>
							血浆粘度(mPa·s)	3.87±0.27	4.89±0.37<sup>▲▲</sup>	3.98±0.30<sup>※※</sup>	3.95±0.31<sup>※※</sup>	4.05±0.31<sup>※※</sup>	4.48±0.28<sup>※</sup>
还原粘度(mPa·s)	10.17±1.40	14.32±1.38	10.67±1.19<sup>※※</sup>	10.08±0.88<sup>○※</sup>	10.80±1.02<sup>※※</sup>	12.53±1.26
							血沉(mm/h)	1.30±0.58	1.35±0.78	1.60±1.34	1.85±1.73	1.55±0.99	1.35±0.59

 

红细胞压积(％)	42.75±3.49	42.4±1.93	43.85±1.17	41.86±2.64	42.45±1.96	41.76±2.83
							纤维蛋白原(g/l)	2.25±0.30	3.08±0.55<sup>▲▲</sup>	2.26±0.62<sup>※※</sup>	2.04±0.47<sup>※※</sup>	2.17±0.31<sup>※※</sup>	2.30±0.45<sup>※※</sup>
血小板粘附率(％)	21.95±7.11	30.68±5.43<sup>▲▲</sup>	23.10±4.01<sup>※※</sup>	23.15±6.08<sup>※※</sup>	23.21±3.42<sup>※※</sup>	25.75±3.21<sup>※※</sup>

模型组与正常组比较：^▲P<0.05^▲▲P<0.01

用药组与模型组比较：^※P<0.05^※※P<0.01

表4结果显示：

1)模型组与正常组比较，全血高切变率粘度、低切变率粘度、血浆粘度、纤维蛋白原等指标均增高且非常显著(^※※P<0.01)；血小板总数、血小板粘附率、血沉、PBC压积无显著变化，血瘀模型复制成功。

2)阳性药组与模型组比较，全血高切变率粘度、低切变率粘度、高切还原粘度、纤维蛋白原降低均有显著性(^※※P<0.01)。9项指标中有5项改变，说明阳性药物有效。

3)注射用解聚海参糖胺聚糖给药组与模型组比较。大剂量组全血高切变率粘度、低切变率粘度、血浆粘度、高切还原粘度、纤维蛋白原5项指标均降低，且非常显著(^※※P<0.01)。其余4项指标均无明显变化。中、小剂量组的纤维蛋白原、血沉变化非常显著(^※※P<0.01)，其余指标无明显改变。

结论：解聚海参糖胺聚糖可以降低血浆粘度，从而改善大鼠血液循环。

(三)注射用解聚海参糖胺聚糖对大鼠血栓形成的影响

取健康的SD大鼠50只，♀♂兼用，体重190-240g，每组10只，适应实验室5天后称重，编号，随机均衡分为5组，①生理盐水对照组5mg/kg；②阳性药血塞通注射组(41.2mg/kg)；③注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(4mg/kg)；④注射用解聚海参糖胺聚糖中剂量组(2mg/kg)；⑤注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组(1mg/kg)。

以上动物静脉注射给药5ml/kg，每天一次，连续一周，末次给药40分钟后，用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉1ml/kg后仰卧固定在大鼠手术台上，分离右颈总动脉及左颈外静脉，用事先准备好的聚乙烯插管(聚乙烯管内径1mm，长5cm，内径2mm，长8cm，在三段管中放入一根5cm长的4号手术线，用50μg/ml肝素葡萄糖溶液充满聚乙烯管后夹住管壁)，当管的一端插入左颈外静脉后，将管的另一端插入右颈总动脉，手术后5min开放血流，开放血流15min中断血流迅速取出丝线称血栓湿重(全重-线重＝血栓湿重)，各给药组与生理盐水组，经间T检验处理结果见表5

表5 注射用解聚海参糖胺聚糖对大鼠体外血栓形成的影响

组别                       剂量      动物数       血栓湿重           抑制率

                           (mg/g)     (只)         (mg)               (％)

对照组                     102.70±16.87

血塞通注射液组             41.2      10           71.50±11.96^※※   30.38

解聚海参糖胺聚糖大剂量组   4         10           68.20±14.17^※※   33.69

解聚海参糖胺聚糖中剂量组   2         10           81.90±15.55^※※   20.25

解聚海参糖胺聚糖小剂量组   1         10           84.95±12.28^※     17.28

各给药组与生理盐水组比较：^※P<0.05，^※※P<0.01

实验结果表明，注射用解聚海参糖胺聚糖各剂量组对大鼠体外血栓形成的湿重有明显的减轻作用，结果与血塞通注射液组相似(^※P<0.05，^※※P<0.01)，说明注射用解聚海参糖胺聚糖具有溶血栓作用。注射用解聚海参糖胺聚糖大、中剂量组可明显抑制大鼠血栓形成，减轻血栓湿重(^※P<0.05)，注射用解聚海参糖胺聚糖大剂量组与血塞通注射液组作用相似(抑制率33.69％)，并可明显抑制其血栓的长度和湿重。

(四)注射用解聚海参糖胺聚糖对家兔眼结膜微血管循环的影响

对家兔分别注射大、中、小剂量的解聚海参糖胺聚糖以及生理盐水和阳性药品，观察解聚海参糖胺聚糖对家兔眼结膜微血管循环的影响。试验结果见表6。

表6注射用解聚海参糖胺聚糖对家兔眼结膜微循环的影响

组别          动物  微血管血液流速(μ              血管网交点数

              数    m)                            (条)

                     给药前       给药后          给药前      给药后

对照组        8      16.65±1.7   16.6±1.96      3.78±1.71  4.01±0.93

阳性组        8      15.4±1.49　 18.1±1.41^※※  4.0±0.9    5.25±0.71^※※

大剂量        8      15.4±1.64   18.3±2.14      4.0±0.84   5.4±1.33^※

组

中剂量　　　　1　 　 5.8±1.39    17.4±1.47^※    3.75±0.89  5.13±1.13^※

组

小剂量　　　　8　　　15.9±1.31   17.2±1.46      3.88±0.83  4.75±1.04^※

组

各组与给药前比较：^※P<0.05，^※※P<0.01

结果：以上各项试验结果显示，注射用解聚海参糖胺聚糖对脑缺血大鼠神经行为障碍有改善作用；可降低脑缺血大鼠梗塞体积；对脑缺血大树脑指数无影响；可减轻大鼠血栓的重量；注射用解聚海参糖胺聚糖大、中、小各剂量组大鼠血液流变学指标，全血高切变率粘度、低切变率粘度、血浆粘度、高切还原粘度、纤维蛋白原5项指标均降低，且非常显著。其余4项指标均无明显变化。小剂量组对纤维蛋白原、血沉变化非常显著；对家兔验结膜微循环的影响结果显示，注射用解聚海参糖胺聚糖大中小剂量均可增加毛细血管管径、毛细血管的流速，作用非常显著。

试验结果显示：注射用解聚海参糖胺聚糖具有明显的溶血栓，降低血浆粘度和改善血液循环的作用。

Claims (20)

1、一种解聚海参糖胺聚糖组合物，其含有90—99.89％重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖。

2、一种制备权利要求1所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的方法，包括如下步骤：

1)从海参中提取海参多糖；

2)降解提取出的海参多糖；

3)收集重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。

3、根据权利要求2所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤1)中的海参选自花刺参、梅花参、绿刺参、玉足海参和黑海参。

4、根据权利要求3所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤1)中的海参为黑海参。

5、根据权利要求3所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤1)从海参中提取海参多糖的步骤包括对海参进行绞碎、酶解并沉淀获得海参多糖粗品，然后对海参多糖粗品纯化、脱色，得到海参多糖。

6、根据权利要求5所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤1)中的酶解是用碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；对海参多糖粗品纯化是用DEAE-纤维素柱进行纯化。

7、根据项权利要求2至6任一权利要求所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤2)降解提取出的海参多糖的步骤包括在5％双氧水的条件下，将提取的海参多糖降解成重均分子量介于8000Da至12000Da之间的解聚海参糖胺聚糖组合物。

8、根据权利要求7所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤3)是用凝胶过柱来收集解聚海参糖胺聚糖组合物。

9、根据权利要求8所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤3)收集的解聚海参糖胺聚糖组合物的多分散度小于2。

10、根据权利要求9所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤3)收集的解聚海参糖胺聚糖组合物的多分散度小于1.5。

11、根据权利要求10所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤3)收集的解聚海参糖胺聚糖组合物的多分散度小于1.4。

12、根据权利要求7所述的解聚海参糖胺聚糖组合物的制备方法，其中步骤3)后还包括冷冻干燥的步骤。

13、一种药物组合物，其包括权利要求1所述的解聚海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体。

14、根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物为注射剂时低分子解聚海参糖胺聚糖组合物的含量为0.03-2.5％(重量)；或，药物组合物为口服制剂时每片含低分子解聚海参糖胺聚糖组合物50-200mg。

15、根据权利要求14所述的药物组合物，其中药物组合物为注射剂时低分子解聚海参糖胺聚糖组合物的含量为1％(重量)；或，药物组合物为口服制剂时每片含低分子解聚海参糖胺聚糖组合物为100mg。

16、根据权利要求13所述的药物组合物，其中药物组合物为冻干粉针剂时，药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种；或，药物组合物为口服制剂时，药学上可接受的载体选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、交联PVP和羧甲基淀粉钠中的一种或几种。

17、权利要求13所述的药物组合物在预防和/或治疗心脑血管疾病中的应用。

18、根据权利要求17所述的应用，其中心脑血管疾病是凝血性和血栓性疾病

19、根据权利要求17所述的应用，其中心脑血管疾病是缺血性脑血管疾病或血栓性疾病。

20、根据权利要求17所述的应用，其中心脑血管疾病是缺血性脑中风。

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