PT91524B

PT91524B - Processo de preparacao de um medicamento a base de fraccoes e/ou fragmentos de heparina

Info

Publication number: PT91524B
Application number: PT91524A
Authority: PT
Inventors: Henricus Carl J Ottenheijm; Franciscus C Den Hollander; Erik Desire A De Clercq
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1995-07-18
Also published as: CA1330305C; ZA896231B; PT91524A; EP0355905A1; ES2053953T3; ATE84217T1; DK416089D0; IE61565B1; IE892565L; DK416089A; AU617850B2; EP0355905B1; AU4001289A; JPH02108624A; DE68904264D1; NZ230394A; KR0143084B1; DE68904264T2; KR900002788A

Description

MEMÕRIA DESCRITIVA

Q presente invento refere-se ao processo de preparaçao de um medicamento que inibe ou previne a replicação do virus da imuno deficiência humana (HIV), compreendendo o dito medicamento fracçoes de heparina e/ou fragmentos de heparina.

Sabe-se que a heparina, mas também outros mucορo 1issacaridos, tal como o sulfato de dextrana, têm in vitro um efeito antiviral sobre o virus da imunodeficiência humana (HIV). Estas substâncias conferem uma redução apreciável na citopatogenicidade do HIV para as células MT-4 e Molt-4 (M. Ito et a 1 , Antiviral Research, 7_ (1987), 361-7). As substâncias deste tipo podiam ser agentes quimi_o terapêuticos efectivos contra o HIV e podiam assim servir para com_ bater a SIDA (síndroma da imunodeficiência adquirida) e o ARC (com plexo relacionado com a SIDA). A vantagem dos referidos mucopolissacaridos sobre os nucleotidos tais como o 3'- azido- 2’, 3'- didesoxitimidina (AZT, Retrovir ^{k J}) é a sua baixa citotoxicidade, de forma que eles podem servir como inibidores selectivos para a repli. caçao do HIV. Contudo uma grande desvantagem que esta associada com a utilização de heparina e do sulfato de dextrana para a prevenção da replicação do HIV e a característica (dos glicosaminoglicanos sulfatados) para causar a hemorragia e/ou para interferir com o pro. cesso de coagulaçao do sangue, que dificulta obviamente a sua utilji dade pratica como drogas anti-SIDA.

Verificou-se agora que os fragmentos de heparina mais peque, nos e a heparina de baixa afinidade, dos quais se sabe que os riscos de hemorragia e/ou acçao anti-coagulante sao baixos, conservam uma actividade apreciável como um inibidor para a replicação do HIV

Em dose baixa eles exibem uma forte actividade contra o HIV 1 assim como contra o HIV-2, e com respeito ao HIV-2 eles sao muito mais activos que a heparina padrao.

Verificou-se que todos os tipos de fragmentos de heparina exibem esta actividade anti-HIV, independentemente do peso molecular e processo de degradaçao. 0 critério no qual estas substâncias sao escolhidas esta dirigido para as características hemorrágicas e coa

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-3gulantes. Quando os fragmentos de heparina ou fracções de heparina sao escolhidos, os quais têm uma actividade anti-trombina inferior a 50 U/mg, e de preferência inferior a 20 U/mg, os riscos de hemor ragia e acçao anti-coagulante sao baixos. As substâncias com uma actividade anti-trombina minima inferior a 1 U/mg sao particularmen te interessantes porque a actividade anti-HIV nao tinha diminuído, mas os efeitos secundários sao negligenciavelmente pequenos.

Verificou-se que o novo produto nao possui características mutagénicas e toxicas, mesmo em dosagens altas (ate 400 mg/Kg/dia).

A fracçao e os fragmentos de heparina podem ser obtidos de maneiras variadas. 0 tecido de mamífero, tal como pulmões, pâncreas, fígado, intestinos e, em particular, a mucosídade intestinal, podem servir como a matéria prima. 0 produto e primeiro disprendido do te_ eido de mamífero por autólise ou com a ajuda de enzimas proteolfticas (por exemplo enzimas do pâncreas de porcos, ou enzimas bacteria_ nas, tais como proteases do Bacillus subtilis).

produto e então isolado por precipitação com solventes or_ gânicos, normalmente com solventes misciveis em agua, tais como álcoois, por exemplo metanol. Outros processos de isolamento sao base ados na ligaçao a uma base alifatica de amonioquaternário ou a um permutador de ioes básicos. A purificação posterior do produto pode ocorrer por precipitação fraccionada. A heparina pode depois ser s_e parada numa fracçao de alta afinidade e de baixa afinidade, por exem pio por separaçao através de uma coluna AT-III-Sepharose . A fracçao de baixa afinidade pode ser utilizada como tal ou pode ser posteriormente degradada.

A fracçao de alta afinidade pode ser degradade e os fragmen tos assim obtidos podem depois ser outra vez separados em fracções de alta e baixa afinidade, das quais a fracçao de baixa afinidade po_ de ser utilizada como um medicamento anti-HIV.

A degradaçao pode também ser realizada com a heparina nao se parada através da ΑΤ-III. Os fragmentos de heparina degradados podem ser utilizados como tal ou podem ainda ser separados através de uma coluna AT-III-Sepharose numa fracçao de alta e baixa afinidade.

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-4Uma característica comum dos fragmentos e fracções de heparina e a de que eles sao oligomeros ou polímeros de unidades periódicas que consistem nos dissacaridos acido e<-D- (l-> 4)-g 1 uco sami na4 )-glucur onico e/ou acido o(-D-( l-> 4 )-glucosamina-A-L-( l-> 4)-idurónico. Os vários grupos hidroxi e amino podem ser sulfatados.

Os grupos amino podem também ser acetilados. No caso dos fragmentos, dependendo do processo de degradaçao escolhido, uma unidade final nao-redutora pode conter uma dupla ligaçao e/ou uma unidade final de glucosamina redutora pode ser convertida numa anidromanose .

Os processos de degradaçao que podem ser utilizados sao todos processos conhecidos na química da heparina, tais como:

- degradaçao	do	nitrito
- degradaçao	do	periodato
- radiaçao í
- degradaçao	do	ácido ascorbico
- degradaçao	da	heparinase

A heparina degradada com periodato e a heparina de baixa afi^ nidade degradada com nitrito sao particularmenté adequadas por causa do seu index terapêutico favoravel.

A degradaçao da heparina com pe r i od a t o po d e p. e. ser realj. zada pelo processo como descrito por Fransson e Lewis (FEBS Lett., (1), (1979), 119). Sao preferidos os fragmentos degradados com pe_ riodato com um peso molecular entre cerca de 2500 e 6500 D.

A acçao destas fracções e fragmentos de heparina nao e conhecida com certeza, mas e suposto ocorrer uma interaçao especifica entre a heparina e os linfócitos-T, da qual resulta ser inibida a ligaçao entre o virus e o linfocito. Isto explicaria porque o peso molecular e a composição especifica das fracções e fragmentos de he. parina sao de menor importância.

Os fragmentos e fracções podem ser processados numa forma de dosagem farmacêutica da maneira usual para a heparina, por exemplo dissolvendo em agua adequada para o fim de injecção, a qual, se dese jado, podem também ser adicionados auxiliares farmaeeuticamente acey taveis (preservantes, certos sais). A utilização clínica e de preferência efectuada por injecção subcutânea ou intravenossa (possi69 794 OA/2329-49 1

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-5velmente nao continua) ou por meio de infusão. Ê também possivel a utilização como um depot ou como uma preparaçao com desprendimen to prolongado. Sao também possíveis outros meios de dosagem, tais como administraçao intrapulmonar via inalaçao por pulverização ou admistraçao por meio de um supositorio.

As substâncias deste invento podem ser utilizadas numa la_r ga gama de dosagem. As dosagens normais sao entre 0,1 e 400 mg/Kg/cba; é preferida uma dosagem entre 0,5 e 150 mg/Kg/dia.

invento sera ilustrado pelos exemplos e testes seguintes, nao tendo estes um caracter restritivo.

EXEMPLO 1

Tratamento com o periodato g de heparina foram dissolvidos em 40 ml de agua e foram adicionados 40 ml de NalO^ 0,2M. A mistura foi incubada a temperatura ambiente com a exclusão da luz, durante 6 horas a pH 7 e a 37°C. 2 ml de etileno-glicol foram então adicionados e a mistura foi dialisada com agua desionizada corrente e depois seca por congelação.

g do po obtido foi dissolvido em 10 ml de agua e a solução foi aquecida a 50°C. 4 ml de uma solução de NaBH^ 0,5M foram e_n tao adicionados e a mistura foi incubada durante 2 horas a 50°C. 0 pH da solução foi então trazido até 3,4 com ácido acético 2N. Passados 5 minutos, a solução foi neutralizada ate pH 7,1 com NaOH IN.

A mistura foi dialisada com agua desionizada corrente e seca por con gelaçao .

Peso molecular 6420 (HPLC com respeito aos padrões de hepa_ r i na ) .

Teor de acido uronico 90,4% (com respeito a heparina)

EXEMPLO 2

Tratamento com a heparinase

A heparina (2% p/v) foi dissolvida em acetato de amonio 0,25 M com acetato de cálcio 0,025M a pH 5,8 e incubada a 30°C com heparinase (5 IU/g heparina). A um 0D 23^ adicionado um permutador anionico básico forte a uma mistura (5g IW Μ P500A por

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-6g heparina) e após absorçao durante 2 horas o permutador de ioes foi eluido com 5 volumes de leito de solução de cloreto de sodio a 57o.

A fracção principal foi depois obtida por eluição com 5 volumes de leito de solução de cloreto de sodio a 15% e precipitação com 4 volumes de metanol a 100%. 0 precipitado foi trabalhado e seco sob vacuo .

Peso molecular 2500 (HPLC com respeito aos padrões de heparina)

Teor de ácido urónico 98,6% (com respeito á heparina). EXEMPLO 3

Tratamento com o nitrito

A heparina (0,05% p/v) foi dissolvida em tampao de ácido citrico 0,lM a pH 3,0. Foi depois adicionada uma solução de nitrito de sódio 1M (1 ml/10 mg heparina).

Passados 15 minutos, a mistura foi cautelosamente neutralizada com sulfamato de amonio a 12,5% (p/v) (2 ml/10 mg heparina).

A mistura foi agitada durante uma meia hora mais e, depois deixada assentar durante 1 hora. A solução foi concentrada, neutralizada com alcali ate pH 7,0 _+ 0,2 e introduzida em cima de um permutador de anioes básicos (5 ml LKB DEAE-Zetaprep/ 10 mg heparina). Apos a pre-eluiçao com agua, a fracçao principal foi obtida por eluição com solução de cloreto de sodio 3M. As fracçoes recolhidas foram precipitadas por adiçao de 3 volumes de metanol a 100%. 0 precipitado foi trabalhado e seco sob vacuo.

Peso molecular 4800, 4400, 3900, 3500 ( 4 picos em HPLC com respeito aos padrões de heparina).

Teor de acido uronico 96,4% (com respeito a heparina)

EXEMPLO 4

Separaçao com a AT-III

A fracçao de heparina de baixo peso molecular (BM) otida no Exemplo 3 foi introduzida a 4°C numa coluna de afinidade AT-III (10 mg heparina-BM/ 130 ml AT-III-MAAM-si1ica). A fracçao de baixa afinidade foi obtida por eluição com 1,5 volumes de leito de solução de cloreto de sodio 0,4M em acetato de amónio 0,05M a pH 7,5.

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-7Α heparina ΒΜ de baixa afinidade foi recolhida a temperatg ra ambiente e introduzida em cima de um permutador de ioes básicos. Após lavagem com agua, o permutador de ioes foi eluido com solução de cloreto de sodio 3M. As fracções recolhidas foram precipitadas com 3 volumes de matenol a 100!?. 0 precipitado foi trabalhado e seco sob vacuo.

Peso molecular 4400, 3900 (2 picos em HPLC com respeito aos padrões de heparina)

Teor de acido uronico 110,6% (com respeito a heparina).

EXEMPLO 5

Actividade hemorrágica

Teste da hemorragia capilar em ratazanas

Placebo ou produto a ser testado foi doseado via a veia dorsal do penis de ratazanas anestesiadas. Passado um minuto uma tira de pele foi arrancada a nao do abdómen barbeado ao longo de duas incisões previamente feitas. A ferida foi coberta com uma ligadu_ ra de gaze e a tira de pele foi reposta sobra a gaze. Passados 10 minutos a gaze foi removida e o sangue contido nela extraido com 20 ml de agua. A concentração de hemoglobina na agua foi medida espec_ trofotometricamente e utilizada como um parâmetro para a perda de sangue. (Ver Thrombos. Haemostas. 42, 466, 1979).

Substância	Dosagem mg/Hg	Hemorragia %
Placebo		100
Heparina	8	222
Produto do ex. 1	8	111
Produto do ex. 3	5	147
Produto do ex . 3	25	135

EXEMPLO 6

Actividade anti-HIV

A determinação da actividade antiviral das substâncias con-

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-8tra a replicação do HIV foi realizada por meio da inibição da cito_ patogenicidade induzida por virus, tal como e medida com o brometo de 3'- (4,5 - dimeti11iazo 1- 2-il)-2,5 - difeni11etrazo 1io (MTT), processo que é descrito por Pauwels et al (J. Virol. Methods, 20, (1988), 309-321). Com este processo as células MT-4 sao infectadas com HIV a 1000 CCID_5Q/ ml.

Apos a adsorçao do vírus, as células infectadas sao lavadas e suspendidas num meio de cultura. 0 número de células MT-4 foi aumentado ate 3x10^ celulas/ml. Elas sao depois introduzidas em c_i ma de uma placa de microtitulação plastica que continha concentrações variadas da substância a ser investigada. Após incubaçao duraji te 5 dias a 37°C o número de células viáveis foi determinado pelo processo MTT. A actividade anti- HIV-1 dos compostos foi também d£ terminada controlando por monitor a expressão antigenica virai nas células HUT-78 ao 12^e. dia após injecção, utilizando a imunofluores cência indirecta e a citofluorografia de fluxo laser como descrita por Baba et a1 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85,(1988). 6132.

A dosagem efectiva antiviral a 50% (Εϋ^θ) no HIV-1 e HIV-2, a dosagem citotóxica a 50% (CDç-θ) e a actividade anti-trombina sao mostradas na tabela.

Substância	Act. anti-trombina (E/ml)	HIV-1 (ED₅₀) (jvg/ml)	HIV-2 (ED50) (jAg/ml)	^cd50 (^g/ml)
Heparina	170	0,4	17,0	>500
Produto do ex. 1	0,6	0,2	1,3	>500
Produto do ex. 2	0,5	35,0	1,0	>625
Produto do ex. 3	39	2,5	2,0	>625
Produto do ex. 4	17	1,8	N.T.	>625

N.T. nao testada

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparaçao de um medicamento que inibe ou previne a replicaçao do virus da imunodeficiência humana (HIV), compreendendo o dito medicamento fracções de heparina e/ou fragmeji tos de heparina com uma actividade anti-trombina inferior a 50 U/mg, caracterizado por as fracções e fragmentos de heparina serem obtidos por autolise ou proteolise de matérias primas a partir de teci, do de mamífero, cujo(s) produto(s) e(sao) isolado(s) por precipita, çao, ligaçao a uma base alifática de amónio quaternário, ou ligaçao a um permutador de ioes básicos, opcionalmente seguido por pre cipitaçao, e/ou separaçao em fracções de alta afinidade e de baixa afinidade, e/ou degradaçao em fragmentos menores, apos o que os fragmentos ou fracções de heparina sao processados numa forma de do. sagem farmacêutica.
2 - Processo de acordo com a reivindicação por as fracções de heparina e/ou os fragmentos de uma actividade anti-trombina inferior a 20 U/mg.

1 , caracterizado heparina terem
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as fracções de heparina e/ou fragmentos de heparina terem uma actividade anti-trombina inferior a 1 'U/mg.
4 - Processo de acordo com as reivindicações 1-3, caracteri zado por os fragmentos de heparina de baixa afinidade serem obtidos por degradaçao e, se necassário, separaçao com o auxilio da anti-trombina III (AT III) ligada a um veiculo solido.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por os fragmentos de heparina serem obtidos por degradaçao com per i o d a t o .
6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caraterizado por os fragmentos de heparina serem obtidos por degradaçao com nj^ t r i t o .