ES2224541T3 - Polisacaridos sulfatados nuevos del tipo heparinicos. - Google Patents
Polisacaridos sulfatados nuevos del tipo heparinicos.Info
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Classifications
-
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA DERIVADOS SULFATADOS DE POLISACARIDOS COMO EL ACIDO HIALURONICO Y LOS ESTERES DEL ACIDO HIALURONICO, QUE PRESENTAN UNA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE, ANTITROMBOTICA Y ANGIOGENICA, PARA UTILIZACION EN EL AREA BIOMEDICA. LA INVENCION PROPORCIONA ADEMAS IONES COMPLEJOS, OBJETOS BIOMEDICOS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN DICHOS DERIVADOS. SE DESCRIBE TAMBIEN LA UTILIZACION DE DICHOS DERIVADOS EN LA FABRICACION DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, OBJETOS BIOMEDICOS, BIOMATERIALES Y SISTEMAS DE LIBERACION CONTROLADA DE FARMACOS.
Description
Polisacáridos sulfatados nuevos del tipo
heparínico.
La presente invención se refiere a la sulfatación
homogénea de los polisacáridos y de sus derivados semisintéticos, en
particular de los glicosaminoglicanos tales como el ácido
hialurónico y sus ésteres y de sus sales tetraalquilamónicas, para
la preparación de nuevos biomateriales útiles en aplicaciones
biomédicas, del cuidado de la salud y farmacéuticas, y a tales
biomateriales en sí mismos. Tales derivados sulfatados
exhiben actividad antitrombótica, tal como se pone en evidencia por
la duración del tiempo de trombina y del tiempo total de coagulación
sanguínea. Además, la ausencia de hemólisis y el desarrollo y forma
de las células endoteliales puestas en contacto con tales derivados
sulfatados, indican que estos materiales son compuestos prometedores
de tipo heparínico.
Muchas moléculas de origen biológico son
polielectrolitos, y sus interacciones son muy importantes en una
amplia variedad de reacciones bioquímicas. En consecuencia,
polielectrólitos sintéticos y/o semisintéticos se han utilizado
desde hace algún tiempo. Estos polielectrolitros imitan las
características biológicas de los polielectrolitos naturales, y
pueden tener algunas características diferentes comparadas con el
material de partida.
Los polielectrolitos de origen biológico incluyen
polisacáridos sulfatados, y en particular, heparina y sus derivados
(D.A. Lane y U. Lindahl, Eds., Heparin -Chemical and Biological
Properties, Clinical Applications. Edward Arnold, London), que
juegan un papel importante en las interacciones
célula-sustrato, particularmente en el proceso de la
inhibición de la actividad vírica, en el proceso de la coagulación
sanguínea, en la eliminación de lípidos, etc.
La heparina es el miembro más reactivo
biológicamente de la familia de los glicosaminoglicanos sulfatados.
Se conoce bien por sus propiedades antitrombóticas y
anticoagulantes. De hecho, se utiliza ampliamente en el cuidado de
las enfermedades cardiovasculares y contribuye enormemente al éxito
de la cirugía cardíaca abierta. Sin embargo, la estructura de la
heparina no es sencilla, y, debido al número de variaciones, no se
conoce enteramente. La heparina comercial está formada por un
espectro de 21 heparinas (Nader y otros., (1974) Biochem.
Biophys. Res. Commun, 57:488) que van desde pesos moleculares de
3.000 a 37.000 en varias actividades anticoagulantes.
La actividad anticoagulante sanguínea de la
heparina se atribuye a características estructurales, por ejemplo
grado de sulfatación, grado de disociación, secuencias particulares
de grupos COO^{-} y SO_{3}, así como a la forma y tamaño
moleculares. Estos factores parecen estar relacionados con la
actividad biológica debido a su importancia en la capacidad de unión
iónica de la heparina (Stivala y otros (1967) Arch. Biochem
Biophys. 122: 40). Debido a su naturaleza altamente cargada
negativamente, la heparina posee una fuerte afinidad por los
cationes, y su actividad es pH dependiente.
La mayoría de los polisacáridos naturales
fácilmente disponibles se han sulfatado en un intento de obtener
análogos de la heparina (Hoffman y otros (1982) Carbohydrate
Res. 2:115: Kindness y otros (1980) Brit. J.Pharmac,
69:675; Horton y otros (1973) Carbohydrate Res. 30:349; Okada
y otros (1979) Makromol. Chem. 180: 813; Kikuchi y otros
(1979) Nippon Kagaku Kaishi 1:127; Manzac y otros (1981)
Proc. Third M.I.S.A.O 5:504), y recientemente, los grupos
sulfato, carboxílico, y sulfonato se unieron a polímeros sintéticos
tales como poliestireno (Kanmaugue y otros (1985)
Biomaterials 6:297) y poliuretano (Ito y otros (1992)
Biomaterials 13:131). Las actividades anticoagulantes de
estos materiales fueron mucho más bajas que las de la heparina, y
dependieron del tipo y unión de los sustituyentes, del grado de
substitución, y de las secuencias.
Son conocidas algunas reacciones químicas que
hacen posible sulfatar polisacáridos (WO 88/00211; EP 0 340 628;
Nagasawa y otros (1986) Carbohydrate Research
158:183-190), pero aún no se han podido obtener
polisacáridos sulfatados, los cuales, además de características
químicas y físico-químicas peculiares respecto a
tales polisacáridos, poseen también características nuevas, tales
como la actividad anticoagulante.
El documento
FR-A-2584728 da a conocer un
procedimiento para sulfatar un glicosaminoglucano en forma de una
sal que es soluble en un medio orgánico. El documento
FR-A-2584728 da a conocer que el
glicosaminoglucano se selecciona preferentemente del sulfato de
dermatano, de las condroitinas, del sulfato de condroitina o del
ácido hialurónico. Se da a conocer un grado de sulfatación del orden
de 2 a 4 para los glicosaminoglicanos sulfatados en general.
El documento
US-A-2599172 da a conocer ésteres
del ácido sulfúrico del ácido hialurónico y procedimientos para
preparar tales ésteres mediante esterificación con ácido
clorosulfónico y ácido sulfúrico fumante, particularmente a baja
temperatura.
El documento
WO-A-89/07932 da a conocer la
utilización de un azúcar sulfatado o de una sal o de su complejo
como un ingrediente en preparaciones tópicas para la profilaxis o el
tratamiento de enfermedades de los dientes o de las encías.
Preferentemente, el azúcar sulfatado es un azúcar persulfatado o
polisulfatado, por ejemplo, sucralfato (oktakis de sacarosa),
sulfato de hidrógeno (complejo de aluminio) o una sal de sodio y/o
potasio de oktakis de sacarosa (sulfato de hidrógeno). La
preparación puede estar en forma de una solución, suspensión,
pomada, pasta, polvo, gel, crema, fijador dental, implante
periodontal, chicle, pastilla masticable, pastilla efervescente o
tableta.
Esta forma de abordar el estudio de las
propiedades estructurales asociadas con las propiedades
anticoagulantes de los polisacáridos consistió primeramente en
seleccionar polímeros que poseían grupos químicos bien definidos
formados por unidades regulares repetitivas, y en segundo lugar,
modificar su estructura química.
Tales moléculas deben por tanto:
(1) Contener secuencias regulares de unidades
monoméricas y
(2) Ser químicamente modificables sin destruir su
estructura.
El ácido hialurónico, el componente más
importante de la matriz extracelular de los mamíferos, está formado
por unidades alternantes de N-acetilglucosamina y
residuos de ácido glucurónico, y por tanto parece una macromolécula
apropiada.
La sulfatación de los hidroxilos alcohólicos
presentes en la cadena polimérica de un polisacárido o de uno de sus
derivados semisintéticos, por la utilización de un agente sulfatante
apropiado, puede conducir a la formación de nuevos derivados con
características químico-físicas, pero con la mayoría
de todas las características biológicas, que son diferentes de las
del material de partida.
Los polielectrolitos polisacáridos que pueden
utilizarse como sustratos en la presente invención incluyen los
glicosaminoglicanos. Entre éstos, ante todo, está el ácido
hialurónico y sus derivados semisintéticos. Algunos derivados
semisintéticos particularmente importantes del ácido hialurónico son
sus ésteres con alcoholes de las series alifática, aralifática,
heterocíclica y cicloalifática, denominadas "HYAFF", que se
describen en las patentes USA 4.851.521, 4.965.353 y 5.202.431 y EP
0 216 453. La sulfatación de tales biomateriales procesados
constituye una nueva característica de la presente invención. En
este caso, la reacción de sulfatación no ocurre durante más tiempo
en la fase homogénea, sino más bien en la superficie del biomaterial
en la fase heterogénea, activando los grupos hidroxilos expuestos
contra el solvente de reacción.
El grado de sulfatación que puede obtenerse
directamente sobre el biomaterial es una característica importante y
necesita un cuidadoso control cinético. Para evitar la
solubilización del biomaterial, inducida por el aumento de la
naturaleza hidrofílica del polímero que constituye la matriz, el
número de grupos -SO_{3} por unidad dimérica no debe exceder un
cierto nivel, generalmente menor de 1,5-2,
dependiendo del grado de hidrofilicidad del biomaterial de partida.
Por ejemplo, en el caso de películas HYAFF 11, en las que todos los
carboxilos están implicados en uniones éster con grupos bencilo, el
grado máximo de sulfatación no debe exceder de 1,5.
Los reactivos utilizados habitualmente para la
sulfatación incluyen el complejo entre el trióxido de azufre y la
piridina (SO^{-3}-piridina).
La reacción se lleva a cabo añadiendo el reactivo
de sulfatación a una sal de tetrabutilamonio de un polisacárido en
solución, o a una solución de un éster polisacárido, el cual, en el
caso de ésteres parciales, contiene las funciones carboxilo
restantes en forma de sales de tetrabutilamonio, en solventes
apróticos tales como dimetilsulfóxido,
N,N'-dimetilformamida, y
N-metilpirrolidona en el intervalo de temperaturas
entre 0ºC y aproximadamente 60ºC.
Se obtienen distintos grados de sulfatación,
medida por el número de grupos sulfato por unidad de disacárido,
variando la cantidad de SO_{3}-piridina. La
relación entre moles de hidroxilos y moles de reactivo de
sulfatación puede variar entre 1:1 y 1:12.
Sorprendentemente, los inventores tuvieron éxito
en la sulfatación de la cadena polisacárida del ácido hialurónico y
de sus derivados semisintéticos de una forma homogénea y específica
sin causar pérdida de las características poliméricas, en particular
de su peso molecular, obteniendo así nuevos polímeros con
características biológicas y fisicoquímicas que el ácido hialurónico
y sus derivados semisintéticos no poseían previamente.
Mediante este procedimiento, es posible obtener
nuevos polímeros con distintos niveles de sulfatación, pero con
idéntico peso molecular. Polímeros con nuevas características
biológicas pueden obtenerse utilizando como materiales de partida
biopolímeros en los que los grupos carboxilos están salificados con
la sal tetrabutilamónica. Tales biopolímeros no son hemolíticos.
Una característica notable de estos polisacáridos
sulfatados es su capacidad para aumentar el tiempo de coagulación
sanguínea. El ensayo del tiempo de trombina se lleva a cabo midiendo
cuánto tiempo tarda el fibrinógeno en convertirse en fibrina una vez
que se ha añadido trombina a una muestra de sangre humana en
presencia del material del ensayo. El ensayo del tiempo de trombina
en la misma muestra sanguínea, pero en presencia del polímero
utilizado como material de partida, se toma como un valor de
referencia. El ensayo pierde significación a partir de los 240
segundos. El tiempo de coagulación se determina midiendo simplemente
el tiempo que una muestra de sangre humana tarda en coagularse en
presencia del material de prueba. Los tiempos que exceden de dos
horas no se consideran.
Utilizando los nuevos biopolímeros de la presente
invención, es posible desarrollar nuevos biomateriales para
utilizarlos en los campos biomédicos, del cuidado de la salud y
farmacéuticos. Los productos obtenidos poseen características
biocompatibles y biológicas tales como actividades antitrombóticas,
anticoagulantes y antivíricas. Por ejemplo, se ha mostrado que los
polianiones sulfatados exhiben actividad antivírica, que incluye la
inhibición del HIV. Los nuevos biopolímeros de la presente invención
pueden utilizarse también para favorecer los procedimientos de
crecimiento celular, en los sistemas de liberación controlada de
medicamentos, y más generalmente, en cirugía interna, en la
circulación extracorpórea del oxígeno, en la prevención de la
adhesión, en los implantes biodegradables y permanentes y en la
diálisis.
Por ejemplo, tal como en el caso de otros
polímeros sulfatados, tales como los dextranos, el ácido hialurónico
sulfatado que posee un peso molecular comprendido aproximadamente
entre 10.000 y 50.000 daltons, inhibe la producción del factor de
necrosis tumoral (TNF), que es la diana principal en la
proliferación de las células inflamatorias. El ácido hialurónico
sulfatado puede por tanto utilizarse como un agente antiinflamatorio
local en forma de biomateriales o composiciones basadas en el ácido
hialurónico.
Los nuevos polímeros pueden por tanto prepararse
en forma de geles, cremas, o pomadas, y pueden utilizarse para
producir biomateriales en forma de hilos, esponjas, gasas,
membranas, canales de guía, tejidos no tramados y microesferas,
según la utilización terapéutica que se intenta. Finalmente,
dependiendo del grado de sulfatación y del peso molecular del
polímero, es posible producir polímeros que presenten actividad
antivírica y/o que pueden utilizarse para intervenir en los diversos
estadios de las interacciones celulares. Estos biopolímeros pueden
también utilizarse en procedimientos de revestimiento, que
proporcionan nuevas propiedades biológicas a la superficie del
material de soporte, tales como objetos y dispositivos
biomédicos.
Tales biomateriales sulfatados pueden utilizarse
en aplicaciones en las que el producto se pone en contacto con la
sangre o tejidos muy vascularizados, por ejemplo, la utilización de
tubos biopoliméricos de diálisis o de membranas para cirugía interna
o externa, que son capaces de reducir la adhesión celular, etc. En
particular, los nuevos derivados sulfatados solubles de ácido
hialurónico de la presente invención pueden ser utilizados en una
amplia variedad de aplicaciones bien conocidas en esta técnica para
los biomateriales basados en ácido hialurónico.
Por ejemplo, si bien los derivados de ácido
hialurónico con un grado de sulfatación superior a 2,5 muestran
buena actividad anticoagulante, el peso molecular del polímero
inicial puede también ser significativo en la influencia de las
características de los nuevos biopolímeros sulfatados de la presente
invención.
En particular, como mínimo, cuatro derivados de
ácido hialurónico sulfatado son notables debido a su peso molecular
y grado de sulfatación. Son los siguientes:
1. Ácido hialurónico que tiene un peso molecular
comprendido entre 10.000 y 50.000 Daltons, y un grado de sulfatación
de 2,5, 3,0 ó 3, 5;
2. Ácido hialurónico que tiene un peso molecular
comprendido entre 50.000 y 250.000 Daltons, y con un grado de
sulfatación de 2,5, 3,0, ó 3,5;
3. Ácido hialurónico con un peso molecular
comprendido entre 250.000 y 750.000 Daltons, y un grado de
sulfatación de 2,5, 3,0, ó 3,5; y
4. Ácido hialurónico que tiene un peso molecular
comprendido entre 750.000 y 1.250.000 Daltons, y con un grado de
sulfatación de 2,5, 3,0, ó 3,5.
Las fracciones de ácido hialurónico que tienen
los pesos moleculares descritos anteriormente pueden ser obtenidas
por utilización de membranas con puntos específicos de corte de peso
molecular, tal como es conocido en esta técnica.
Entre los derivados éster semisintéticos del
ácido hialurónico, son particularmente interesantes las matrices
poliméricas de HYAFF 11 (éster bencílico al 100% del ácido
hialurónico) sulfatado hasta grados de 1,0 y 1,5, y la HYAFF 11p75
(éster bencílico al 75% del ácido hialurónico) sulfatado hasta
grados de 0,5 y 1,0.
Otra posibilidad de aplicación de la presente
invención se clarificará a partir de la descripción detallada y de
los dibujos que se proporcionan seguidamente.
Los objetivos anteriores y otros objetivos,
características y ventajas de la presente invención se entenderán
mejor a partir de las siguientes descripciones detalladas tomadas
conjuntamente con los dibujos que se acompañan, todos los cuales se
proporcionan sólo a modo ilustrativo, y que no limitan la presente
invención, en los cuales:
La figura 1 muestra el efecto del ácido
hialurónico sulfatado con 2,0, 2,5, 3,0 y 3,5 grupos SO_{3} por
unidad repetitiva con respecto al tiempo de coagulación de sangre
entera (WBCT) y del tiempo de trombina (T).
La figura 2 muestra el crecimiento de células
endoteliales de la vena umbilical humana en el medio de control
(\blacklozenge), en el medio que contiene ácido hialurónico
sulfatado (\blacksquare), y en el medio que contiene ácido
hialurónico (\blacktriangle), tal como se describe en el Ejemplo
14.
La figura 3 es una representación esquemática de
un disco preparado para el ensayo de
gelatina-agarosa que se describe en el Ejemplo 15.
Parte superior: una sección que muestra un pocillo central y dos
pocillos adyacentes que se localizan a 2 mm de él. El BACE se sitúa
en el pocillo central, y el material de ensayo y el control se
sitúan en los pocillos adyacentes. Parte inferior: disco preparado
para el ensayo. Un cuarto pocillo que contiene BACE se sitúa
aproximadamente a 2 cm de los tres pocillos alineados (las
proporciones de las distancias no se conservan en la figura). El
cuarto pocillo se elimina lejos de la influencia del material de
ensayo, y se utiliza como un control para asegurar que la migración
de BACE fuera del pocillo tiene lugar como un halo uniforme cuando
no se aplica tratamiento.
Las figuras 4A, 4B, 5A, 5B, 6A y 6B ilustran los
resultados de la evaluación de la inducción de la angiogénesis
in vitro descrita en el Ejemplo 15. Las figuras 4A y 4B
muestran la migración preferente de las células endoteliales hacia
el ácido hialurónico Cu(II)-sulfatado que con
respecto al ácido hialurónico sulfatado solo. Las figuras 5A y 5B
muestran la migración preferente de las células endoteliales hacia
la Cu(II)-heparina con respecto a la heparina
sola. Las figuras 6A y 6B muestran que no existe migración
preferente de las células endoteliales hacia al complejo
Cu(II)-Tris con respecto al medio solo.
La siguiente descripción detallada de la
invención se proporciona para ayudar a los expertos en la materia
para ponerla en práctica.
Se indicarán a continuación a efectos
ilustrativos algunos ejemplos de la preparación de los nuevos
polímeros sulfatados según la presente invención. Si bien esos
Ejemplos están dirigidos a ácido hialuónico y sus derivados
semisintéticos, tales como sales de tetrabutilamonio y ésteres, los
mismos métodos pueden ser aplicados a otros polisacáridos, tales
como otros glicosaminoglicanos, ácido algínico, gellan,
carboximetilcelulosa, carboximetilamida, y carboximetilquitina, así
como derivados semisintéticos de los mismos, tales como sus sales de
tetrabutilamonio y ésteres parciales con alcoholes alifáticos,
aralifáticos, heterocíclicos y cicloalifáticos, tal como se da a
conocer en las Patentes USA 4.851.521, 5.122.598, 5.300.493,
5.332.809, y 5.336.668; solicitud de Patente Europea No. 93917681.4;
EP 0 216 453, y EP 0 251 905, EP 0 342 557, EP 0 518 710, EP 0 603
264, y EP 0 605 478; así como los documentos WO 93/06136 y WO
94/03499.
0,250 gramos de la sal tetrabutilamónica del
ácido hialurónico se solubilizan en 10 ml de dimetilformamida
(DMF). 1,305 gramos de SO_{3}-piridina
solubilizada en 10 ml de DMF se añadieron a esta solución bajo una
corriente de nitrógeno. La solución se agitó durante una hora a una
temperatura de entre 4ºC y 0ºC. Se añadieron subsiguientemente
alrededor de 200 ml de agua purificada, enfriada a 0ºC. El pH de la
mezcla se llevó a un valor de entre 8,5 y 9,5 añadiendo hidróxido
sódico 1M. El derivado se precipitó entonces con 120 ml de alcohol
etílico. Se añadió acetato sódico hasta saturación, y se dejó
entonces sedimentar el precipitado entre 1 y 24 horas a una
temperatura comprendida entre 0º y 4ºC. El precipitado se separó
mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1.500 rpm,
se solubilizó en H_{2}O purificada, y se dializó entonces hasta
que todo el reactivo residual y los productos de la reacción se
eliminaron completamente. El grado de sulfatación se determinó
mediante resonancia magnética nuclear (NMR).
El tiempo de trombina y el tiempo de coagulación
en éste y en los ejemplos siguientes se determinaron tal como se
describe en el documento WO 92/11294. El producto así obtenido posee
un tiempo de trombina de 42,2 comparado con los 11,3 segundos del
polímero de partida, y un tiempo de coagulación de 2 horas comparado
con los 28 minutos medidos en la sangre de control.
0,250 gramos de la sal tetrabutilamónica del
ácido hialurónico se solubilizan en 10 ml de dimetilformamida
(DMF). 2,088 gramos de SO_{3}-piridina
solubilizada en 10 ml de DMF se añadieron a esta solución bajo una
corriente de nitrógeno. La solución se agitó por lo menos durante
una hora a una temperatura de entre 4ºC y 0ºC. Se añadieron
subsiguientemente alrededor de 200 ml de H_{2}O, enfriada a 0ºC.
El pH de la mezcla se llevó a un valor de entre 8,5 y 9,5 añadiendo
hidróxido sódico 1M. El derivado se precipitó entonces con 120 ml de
alcohol etílico. Se añadió acetato sódico hasta saturación, y
entonces se dejó reposar el precipitado entre 1 y 24 horas a una
temperatura entre 0º y 4ºC. El precipitado se separó mediante
centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1.500 rpm, se
solubilizó en H_{2}O purificada, y se dializó entonces hasta que
todo el reactivo residual y los productos de la reacción se
eliminaron completamente. El grado de sulfatación se determinó
mediante resonancia magnética nuclear (NMR).
El producto así obtenido posee un tiempo de
trombina infinito, comparado con los 11,3 segundos del polímero de
partida.
0,250 gramos de la sal de tetrabutilamonio del
etil éster parcial al 75% de ácido hialurónico
(HYAFF-7p75) se solubilizan en 10 ml de
dimetilformamida (DMF). Se añaden a esta solución en un flujo de
nitrógeno 1,305 gramos de SO_{3}-piridina
solubilizados en 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). La solución es
sometida a agitación durante una hora, como mínimo, a una
temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC. A continuación se añaden
aproximadamente 200 ml de H_{2}O, enfriada a 0ºC. El pH de la
mezcla es llevado a un valor comprendido entre 8,5 y 9,5 por adición
de hidróxido sódico 1M. El derivado es precipitado a continuación
con 120 ml de alcohol etílico. Se añade acetato sódico anhidro hasta
la saturación y el precipitado se deja depositar durante un tiempo
de 1 a 24 horas a una temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC. El
precipitado es separado por centrifugación, por ejemplo, durante 15
minutos a 1.500 rpm, solubilizado en H_{2}O purificada, y a
continuación es dializado hasta que todo reactivo residual y los
productos de la reacción han sido completamente eliminados. El grado
de sulfatación es determinado por NMR.
El producto obtenido de este modo tiene un tiempo
de trombina de 45 segundos en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y el tiempo de coagulación de más de 2 horas en
comparación con 28 minutos para la sangre de control.
0,250 gramos de la sal de tetrabutilamonio del
etil éster parcial al 50% de ácido hialurónico
(HYAFF-7p50), 50% de los grupos carboxi
esterificados con etanol) se solubilizan en 10 ml de
dimetilformamida (DMF). Se añaden a esta solución en un flujo de
nitrógeno 1,044 gramos de SO_{3}-piridina
solubilizada en 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). La solución es
agitada, como mínimo, durante una hora a una temperatura comprendida
entre 4ºC y 0ºC. A continuación, se añaden unos 200 ml de H_{2}O
enfriada a 0ºC. El pH de la mezcla es llevado a un valor comprendido
entre 8,5 y 9,5 por añadidura de hidróxido sódico 1M. El derivado es
precipitado a continuación con 120 ml de alcohol etílico. Se añade
acetato sódico anhidro hasta saturación y el precipitado se deja
depositar durante 1 a 24 horas a una temperatura comprendida entre
4ºC y 0ºC. El precipitado es separado por centrifugación, por
ejemplo, durante 15 minutos a 1.500 rpm, solubilizado en H_{2}O
purificada y, a continuación, dializado hasta que se han eliminado
por completo el reactivo residual y los productos de la reacción. El
grado de sulfatación se determina por NMR.
El producto obtenido de este modo tiene un tiempo
de trombina de 47 segundos, en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y un tiempo de coagulación de más de 2 horas, en
comparación con 28 minutos para la sangre de control.
0,250 gramos de la sal TBA de un etil éster
parcial de ácido hialurónico (HYAFF-7p25, 25% de los
grupos carboxi esterificados con etanol) son solubilizados en 10 ml
de dimetilformamida (DMF). 0,783 gramos de
SO_{3}-piridina solubilizada en 10 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) se añaden a esta solución en una corriente
de nitrógeno. La solución es sometida a agitación durante un mínimo
de una hora a una temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC. A
continuación se añaden unos 200 ml de H_{2}O enfriada a 0ºC. El pH
de la mezcla es llevado a un valor comprendido entre 8,5 y 9,5
mediante añadidura de hidróxido sódico 1M. El derivado es
precipitado a continuación con 120 ml de alcohol etílico. Se añade
acetato sódico anhidro hasta saturación, y el precipitado se deja
depositar durante un tiempo comprendido entre 1 y 24 horas a una
temperatura entre 4ºC y 0ºC. El precipitado es separado por
centrifugación, por ejemplo, durante 15 minutos a 1.500 rpm,
solubilizado en H_{2}O purificada y, a continuación, dializado
hasta que se eliminan por completo la totalidad del reactivo
residual y de los productos de la reacción. El grado de sulfatación
se determina por NMR.
El producto obtenido de este modo tiene tiempo de
trombina de 49 segundos en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y un tiempo de coagulación de más de 2 horas, en
comparación con 28 minutos para la sangre de control.
0,250 gramos de la sal de tretabutilamonio de un
etil éster parcial de ácido hialurónico
(HYAFF-11p75, 75% de los grupos carboxi
esterificados con alcohol bencílico) se solubilizan en 10 ml de
dimetilformamida (DMF). 2,088 gramos de
SO_{3}-piridina solubilizada en 10 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) se añaden a dicha solución bajo corriente de
nitrógeno. La solución es sometida a agitación durante un mínimo de
una hora a una temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC. A
continuación se añaden unos 200 ml de H_{2}O, enfriada a 0ºC. El
pH de la mezcla es llevado a un valor entre 8,5 y 9,5 por añadidura
de hidróxido sódico 1M. El derivado es precipitado a continuación
hasta 120 ml de alcohol etílico. Se añade acetato sódico anhidro
hasta saturación, y el precipitado se deja depositar durante un
tiempo de 1 a 24 horas a una temperatura comprendida entre 4ºC y
0ºC. El precipitado es separado por centrifugación, por ejemplo
durante 15 minutos a 1.500 rpm, solubilizado en H_{2}O purificada,
y a continuación dializado hasta que se eliminan por completo el
reactivo residual y los productos de la reacción. El grado de
sulfatación se determina por NMR.
El producto obtenido de esta manera tiene tiempo
de trombina de 44 segundos en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y un tiempo de coagulación de más de 2 horas, en
comparación con 28 minutos para la sangre de control
0,250 gramos de sal de tetrabutilamonio de un
etil éster parcial de ácido hialurónico
(HYAFF-11p50, 50% de los grupos carboxi
esterificados con alcohol bencílico) se solubilizan en 10 ml de
dimetilformamida (DMF). 1,305 gramos de
SO_{3}-piridina solubilizada en 10 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) se añaden a dicha solución bajo una
corriente de nitrógeno. La solución es sometida a agitación durante
un mínimo de una hora a una temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC.
A continuación se añaden unos 200 ml de H_{2}O, enfriada a 0ºC. El
pH de la mezcla es llevado a un valor comprendido entre 8,5 y 9,5
por añadidura de hidróxido sódico 1M. El derivado es precipitado a
continuación con 120 ml de alcohol etílico. Se añade acetato sódico
anhidro hasta saturación, y el precipitado se deja depositar durante
un tiempo comprendido entre 1 y 24 horas a una temperatura
comprendida entre 4ºC y 0ºC. El precipitado es separado por
centrifugación, por ejemplo, durante 15 minutos a 1.500 rpm,
solubilizado en H_{2}O, purificada y a continuación es dializado
hasta que se eliminan por completo todo el residuo del reactivo y
los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina por
NMR.
El producto obtenido de este modo tiene tiempo de
trombina de 46 segundos en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y un tiempo de coagulación de más de 2 horas, en
comparación con 28 minutos para la sangre de control.
0,250 gramos de la sal tetrabutilamonio de un
etil éster parcial de ácido hialurónico
(HYAFF-11p25, 25% de los grupos carboxi
esterificados con alcohol bencílico) se solubilizan en 10 ml de
dimetilformamida (DMF). 0,522 gramos de
SO_{3}-piridina solubilizada en 10 ml de
dimetilsulfóxido (DMSO) se añaden a dicha solución en corriente de
nitrógeno. La solución es sometida a agitación durante un mínimo de
una hora a una temperatura comprendida entre 4ºC y 0ºC. Unos 200 ml
de H_{2}O, enfriada a 0ºC, son añadidos a continuación. El pH de
la mezcla es llevado a un valor comprendido entre 8,5 y 9,5 por
añadidura de hidróxido sódico 1M. El derivado es precipitado a
continuación, con 120 ml de alcohol etílico. Se añade acetato sódico
anhidro hasta saturación, y el precipitado se deja depositar durante
un tiempo comprendido entre 1 y 24 horas a una temperatura
comprendida entre 4ºC y 0ºC. El precipitado es separado por
centrifugación, por ejemplo, durante 15 minutos a 1.500 rpm,
solubilizado en H_{2}O, y a continuación, dializado hasta que se
han eliminado por completo la totalidad de reactivos residuales y
productos de la reacción. El grado de sulfatación es determinado por
NMR.
El producto obtenido de este modo tiene un tiempo
de trombina de 48 segundos, en comparación con 11,3 segundos para el
polímero inicial, y un tiempo de coagulación de más de 2 horas en
comparación con 28 minutos para la sangre de control.
0,250 gramos de una película de HYAFF 11 se
sumergieron en un baño de 250 ml de una mezcla de
cloroformo:dimetilformamida en una relación 1:1. Se añadieron
entonces 50 ml de una solución obtenida solubilizando 3,4 gramos de
un complejo de piridina-SO_{3} en
dimetilformida.
Se dejó que se llevara a cabo la reacción durante
2 horas a temperatura ambiente, después de lo cual la película se
quitó y se sumergió en un baño de agua destilada (100 ml) y
finalmente en una solución de agua:etanol 50:50. La película se secó
entonces en una estufa durante 48 horas a 55ºC.
0,250 gramos de una película de HYAFF 11p75 se
sumergieron en un baño de 250 ml de una mezcla de
cloroformo:dimetilformamida en una relación 1:1. Se añadieron
entonces 50 ml de una solución obtenida solubilizando 2,3 gramos de
un complejo de piridina-SO_{3} en
dimetilformida.
Se dejó que se llevara a cabo la reacción durante
2 horas a temperatura ambiente, después de lo cual la película se
quitó y se sumergió en un baño de agua destilada (alrededor de 100
ml) y finalmente en una solución de agua:etanol 50:50. La película
se secó entonces en una estufa durante 48 horas a 55ºC.
Este ensayo se realizó sobre ácido hialurónico y
ácido hialurónico sulfatado utilizando sangre procedente de un
donador único. El control contenía solo sangre.
Para cada ensayo, se prepararon tres tubos de
ensayo cada uno conteniendo 5 ml de sangre. El primero constituía el
blanco, mientras que en el segundo y tercero, se solubilizaron 25 mg
de ácido hialurónico y 25 mg de ácido hialurónico sulfatado,
respectivamente.
Los resultados se muestran en la figura 1, en la
que puede apreciarse que el ácido hialurónico que posee 3,0 y 3,5
grupos SO_{3} por unidad repetitiva dio lugar a tiempos infinitos
de coagulación de la sangre total (WBCT). El tiempo de coagulación
para los controles de sangre total fue aproximadamente de 1,5
minutos. La sangre en presencia de ácido hialurónico se coaguló
después de 45 minutos.
El tiempo de trombina para el ácido hialurónico
que posee distintos grados de sulfatación se determinó utilizando un
dispositivo Elvi 820 Digiclot (Logos S.p.A, Milan, Italia). Este
dispositivos posee un conjunto de placas de incubación a una
temperatura de 37ºC, y reúne 32 tubos de ensayo y cuatro viales de
reactivo, dos de los cuales pueden ser magnéticamente agitados a 600
rpm. Contiene dos pocillos de medición termostática, provistos de un
agitador magnético a 300 rpm, y una tapadera a prueba de la luz. Una
pipeta magnética con volúmenes adaptables (0,1-0,2
ml) para la distribución de los reactivos activa el dispositivo, el
cual se detiene mediante las variaciones más ligeras en la densidad
óptica respecto a la formación del coágulo. La formación de éste se
monitoriza fotométricamente. Un rayo de luz procedente de una
lámpara atraviesa primero un filtro de interferencia de 525 nm, y
finalmente una célula de capacidad. Un fotodiodo mide las
variaciones en la densidad óptica del plasma al formarse el coágulo.
Un procesador de la señal fotométrica detiene el cronómetro digital
en la décima más cercana a un segundo. El ensayo del tiempo de
trombina se lleva a cabo utilizando el reactivo "Trombina"
(Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica).
El ensayo se realiza sobre todas las muestras
utilizando plasma obtenido mediante centrifugación de sangre de
varios donadores (conjunto de plasmas) que habían sido previamente
tratados con un anticoagulante (1 ml de una solución de citrato
sódico/9 ml de sangre). Las soluciones se prepararon a
concentraciones de 1 mg/ml de ácido hialurónico y de ácido
hialurónico sulfatado en solución tampón de fosfato.
Tal como se resume en la figura 1, el ácido
hialurónico que posee 2,5, 3,0 y 3,5 grupos SO_{3} por unidad
repetitiva prolonga el tiempo de trombina. El ácido hialurónico que
posee 2,0 grupos SO_{3} por unidad repetitiva no prolonga el
tiempo de trombina, es decir, éste igualó al de control, indicando
que este particular derivado ácido hialurónico sulfatado no posee
actividad anticoagulante como la heparina. El tiempo de trombina en
presencia de ácido hialurónico es similar al del control.
También se muestra en la figura 1 la cantidad de
heparina que corresponde a 1 mg del producto ácido hialurónico
sulfatado, determinado mediante una curva de calibración.
El tiempo de trombina se determinó también en
plasma en el cual los derivados sulfatados del ácido hialurónico
(peso molecular del ácido hialurónico = 200.000 daltons) es decir,
HYAFF 11 (éster bencílico al 100% del ácido hialurónico; grado de
sulfatación, 2,0), HYAFF 11p25 (éster bencílico al 25% del ácido
hialurónico; grado de sulfatación, 3,0) e HYAFF 11p75 (éster
bencílico al 75% del ácido hialurónico, grado de sulfatación 3,5),
se habían solubilizado.
En el caso del HYAFF 11 sulfatado, se investigó
la influencia de su concentración, y de la trombina, sobre el TT
(tiempo de trombina).
Los resultados para el HYAFF 11 sulfatado se
muestran en la tabla 1, en la que el ácido hialurónico se utilizó
como una referencia, ya que es soluble en el plasma, y en la que la
concentración de trombina se encuentra en Unidades Internacionales
(UI).
Estos resultados muestran un tiempo de trombina
más largo para el plasma en presencia de HYAFF 11 sulfatado que en
presencia de ácido hialurónico. La influencia de las concentraciones
de ácido hialurónico, ácido hialurónico sulfatado, y trombina, debe
tenerse en cuenta. El HYAFF 11 sulfatado (8 mg/ml) prolongó
significativamente el tiempo de trombina cuando ésta se utiliza,
bien a 6 UI ó a 0,6 UI, comparada con el ácido hialurónico.
Cantidades bajas (2 mg/ml) de HYAFF 11 sulfatado no dan lugar a
ninguna variación significativa en el tiempo de trombina.
La Tabla 2 muestra los resultados para HYAFF
11p25 sulfatado e HYAFF 11p75 sulfatado sobre el tiempo de
trombina.
Los datos en la Tabla 2 demuestran que ambos
HYAFF sulfatados, 11p25 y 11p75 prolongan el tiempo de trombina. El
tiempo de trombina más largo para el HYAFF 11p75 sulfatado
corresponde a 0,15 UI/ml aproximadamente de actividad de heparina.
El tiempo de trombina más largo para el HYAFF 11p25 sulfatado
corresponde a 0,25 UI/ml aproximadamente de actividad de
heparina.
La reptilasa es un enzima que se encuentra en el
veneno de Bothrox atrops que coagula el fibrinógeno
fragmentando su fibrinopéptido A.
El tiempo de reptilasa se determina disolviendo
ácido hialurónico sulfatado o un derivado del ácido hialurónico
sulfatado en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato 0,1 M, 0,3
ml de los cuales se añaden entonces a 0,3 ml de plasma humano. El
tiempo de reptilasa se determina incubando el plasma humano que
contiene el ácido hialurónico sulfatado o el derivado a 37ºC durante
2 minutos, añadiendo entonces Reactivo de Reptilasa (fracción de
extractos de trombina del veneno de Bothrox atrops,
Hemodiagnostica Diagnostica Stago, Boehringer Mannheim), y midiendo
el tiempo de coagulación automáticamente (Elvi Digiclot 2
Coagulometer, Logos S.p.A, Milan, Italia).
La Tabla 3 muestra los efectos del HYAFF 11
sulfatado, del HYAFF 11p25 sulfatado, y del HYAFF 11p75 sulfatado
sobre el tiempo de reptilasa.
Los datos en la Tabla 3 demuestran que ninguno de
los derivados del ácido hialurónico sulfatados tiene ningún efecto
significativo sobre el tiempo de reptilasa.
El ensayo de hemólisis mide la interacción
directa de sustancias con la membrana plasmática de los
hematíes.
25 mg de ácido hialurónico sulfatado se
disolvieron en 0,5 ml de citrato de sodio. El tubo de ensayo se
rellenó entonces con 5 ml de sangre humana fresca. El control
contenía sólo sangre citritada. El ensayo de hemólisis se llevó a
cabo tal como se describe en Albanese y otros (1994) Biomaterials
15:129.
Los resultados obtenidos con ácido hialurónico
sulfatado muestran que este material no presenta ninguna actividad
hemolítica.
El ensayo del tiempo de trombina se realizó sobre
rodajas de películas insolubles de ésteres de ácido hialurónico
sulfatado utilizadas para forrar cubetas, tal como se describe
esencialmente en el Ejemplo 11 para el ácido hialurónico sulfatado
con distintos grados de sulfatación. Se añadieron 1,2 ml de plasma a
cada cubeta, la cual se incubó entonces junto con los círculos de
película durante 10 minutos. Se añadieron entonces 0,2 ml del
reactivo trombina, y se monitorizó el tiempo de coagulación. El peso
molecular del ácido hialurónico y el grado de sulfatación de los
ésteres fueron como en el Ejemplo 11.
Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Los datos en la Tabla 4 revelan que no existen
variaciones significativas en los tiempos de trombina del plasma
puesto en contacto con películas de ésteres de ácido hialurónico
sulfatado.
Se aislaron células endoteliales de las venas
umbilicales humanas a partir del cordón umbilical mediante digestión
por colagenasa según un protocolo estándar. Se conservaron las
células en una atmósfera de CO_{2} al 5% a 37ºC en Medio 199
(GIBCO Laboratories) con un suero fetal de ternera al 20%,
L-glutamina y gentamicina.
Las células endoteliales se identificaron como
tales por su morfología poligonal. Para experimentos de
proliferación, las células se utilizaron cuando los cultivos
alcanzaron la confluencia. Se disolvió el ácido hialurónico en Medio
199 hasta que se obtuvo una concentración de 5 mg/ml. El ensayo se
planeó con objeto de permitir períodos de contacto de 24, 48 y 72
horas entre el material y las células. Cada 24 horas el medio se
eliminó de los pocillos y la película se enjuagó con una solución de
PBS estéril para eliminar las células no unidas. Las células se
analizaron con un microscopio de inversión (DIAPHOT TMD Nikon) y se
tomaron fotografías con una cámara Nikon. Las células se separaron
entonces con tripsina y se contaron en una cámara Burker. Se utilizó
el azul de tripán para distinguir entre células vivas y muertas.
La figura 2 muestra las curvas de crecimiento de
las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC).
El número de células endoteliales en el medio que
contenía ácido hialurónico sulfatado aumentó con el tiempo,
mostrándose un mejor crecimiento que en el medio conteniendo ácido
hialurónico o en un medio de control puro.
La morfología de las células endoteliales se
examinó utilizando el microscopio de inversión. Las células
endoteliales en el medio que contenía ácido hialurónico sulfatado se
diseminaron bien, sin alteraciones morfológicas y sin cambios
estructurales en la organización celular.
Se observó una morfología idéntica para las
células endoteliales en presencia de ácido hialurónico y para el
control. La única diferencia digna de mención fue en la
proliferación celular. De hecho, después de un día, las células en
el medio que contenía ácido hialurónico sulfatado formaron casi una
monocapa confluyente, mientras que las células en el medio que
contenía ácido hialurónico o medio puro alcanzaban la confluencia
sólo después de tres
días.
días.
El ácido hialurónico sulfatado, como la heparina,
forma complejos con el ión Cu(II), con una composición
estequiométrica de Cu(OH)_{2}L (L'' =
"ligando") (Barbucci y otros (1995) Gazetta Chimica
Italiana, en prensa). Como es conocido por la literatura, el
complejo Cu(II)-heparina posee un efecto
angiogénico (Alessandri y otros (1983) Cancer Research
43:1790-1797).
Se investigó, por tanto, la capacidad del ácido
hialurónico sulfatado para inducir la angiogénesis in vitro
utilizando un procedimiento de migración celular (Alessandri y otros
(1983) Cancer Research 43: 1790-1797).
Se observó la emigración de las células
endoteliales en el agar, mostrándose esquemáticamente el
procedimiento en la figura 3. La capacidad de una muestra de prueba
para inducir la angiogénesis in vitro puede determinarse por
el número de células endoteliales que migran preferentemente hacia
la muestra de prueba, respecto a las que lo hacen hacia la muestra
de control.
El ensayo de migración celular para evaluar la
angiogénesis inducida por el complejo
Cu(II)-heparina, tal como se describe en
Alessandri y otros, se llevó a cabo en una solución tampón de 0,1 M
Tris, pH 7,5. Sin embargo, en presencia de Tris, el complejo que se
forma es Cu(II)-Tris, no
Cu(II)-heparina, de forma que el efecto
angiogénico observado se refiere al complejo
Cu(II)-Tris en presencia de heparina.
Estos ensayos se realizaron utilizando una
solución tampón de 0,1 M PBS, pH 7,4. A este pH, el Cu(II)
que no está en el complejo precipita en forma de un hidróxido. Se
filtraron por tanto soluciones de moléculas biológicas-
Cu(II) sobre filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0,2
micras con objeto de eliminar el precipitado de hidróxido de cobre
antes de utilizar soluciones para la prueba.
Dos muestras de ácido hialurónico sulfatado, una
con 2,0 grupos SO_{3} y la otra con 3,5 grupos SO_{3} por
unidad repetitiva, se analizaron. Los experimentos se procesaron por
duplicado, y las muestras que contenían los complejos CU
(II)-heparina y Cu(II)-Tris
se analizaron también. En cada experimento, el efecto angiogénico
del complejo Cu(II)-molécula biológica se
evaluó solo en comparación con el de la molécula biológica.
Específicamente, el ácido hialurónico
Cu(II)-sulfatado se comparó con el ácido
hialurónico sulfatado, y la Cu(II)-heparina
se comparó con la heparina. En el caso de
Cu(II)-Tris, la muestra de control contenía
sólo medio.
Tal como se muestra en las figuras 4A, 4B, 5A,
5B, 6A y 6B, el complejo Cu(II)-ácido hialurónico sulfatado
(3,5 grupos de SO_{3} por unidad repetitiva) fue capaz de inducir
la angiogénesis in vitro en un grado similar al del complejo
Cu(II)-heparina.
Tal como se muestra en las figuras 4A y 4B,
existe una migración preferente por las células endoteliales hacia
el ácido hialurónico-Cu(II) sulfatado que
respecto al ácido hialurónico sulfatado solo.
En el caso de la heparina, las células
endoteliales migran preferentemente hacia el complejo
Cu(II)-heparina respecto a la heparina sola
(figuras 5A y 5B).
El efecto es más pronunciado con el ácido
hialurónico sulfatado que con la heparina (compárense las figuras
4A, 5A y 4B, 5B).
Por otra parte, en el caso del complejo
Cu(II)-Tris (figuras 6A y 6B), no existe
migración preferente de las células hacia el complejo respecto al
medio solo.
El efecto de la muestra que contiene
Cu(II)-ácido hialurónico sulfatado (2,0 grupos de SO_{3}
por unidad repetitiva) fue comparable al del complejo
Cu(II)-Tris, más que al del complejo
Cu(II)-heparina. Esto demuestra que el número
de grupos SO_{3} por unidad repetitiva influencia
significativamente la obtención de actividad de tipo heparínico en
la inducción de la angiogénesis in vitro.
Las preparaciones farmacéuticas y los
biomateriales que constituyen los nuevos derivados sulfatados del
ácido hialurónico y otros polisacáridos sulfatados de la presente
invención pueden administrarse al hombre, solo o en asociación con
otros polímeros químicos, tales como el poliuretano, el ácido
poliláctico, la carboximetilcelulosa, la carboximetilquitina, el
almidón carboximetilo, y polímeros entrecruzados, o ésteres del
ácido hialurónico, sales, derivados, complejos, fragmentos,
subunidades, y/o medicamentos farmacológicamente aceptables, como
ayuda en los campos biomédico, del cuidado de la salud, y
farmacéutico.
A causa de sus actividades antitrombóticas y
anticoagulantes, los biopolímeros de la presente invención pueden
utilizarse ventajosamente para preparar biomateriales tales como
canales de guía, desviaciones, venas artificiales, o derivaciones
para utilizarse en hemodiálisis, cardiología, circulación
extracorpórea y más generalmente, en el sistema cardiovascular.
La actividad angiogénica de los complejos ácido
hialurónico sulfatado-Cu(II) puede
utilizarse para estimular el desarrollo capilar.
Se ha demostrado recientemente que el ácido
hialurónico sulfatado es un potente inhibidor del factor de necrosis
tumoral \alpha (TNF-\alpha) y
TNF-\beta (Chang y otros (1994) Journal of
Leukocyte Biology 55: 778-784). Así, los
productos ácido hialurónico sulfatado y éster del ácido hialurónico
de la presente invención puede también encontrar utilización
terapéutica como agentes antiinflamatorios en el tratamiento de la
inflamación mediada por TNF, toxicidad sistémica y patologías
relacionadas.
Además, los derivados del ácido hialurónico
sulfatado pueden utilizarse como revestimientos para las superficies
de materiales, utilizando técnicas tales como el revestimiento
plasmático para producir dispositivos que haya que usar en las
aplicaciones de la circulación extracorpórea.
Los derivados del ácido hialurónico sulfatado de
la presente invención pueden también utilizarse en forma de gasas,
hilos, geles, hidrogeles, esponjas, membranas, géneros no tejidos y
microesferas, según la utilización terapéutica que se intenta, para
promover los procesos de crecimiento celular, tales como el
desarrollo queratinocítico, para acelerar la curación en pacientes
afectos de escaras, heridas, quemaduras, y úlceras dérmicas, o como
antiadherentes en cirugía.
Dependiendo del grado de sulfatación y del peso
molecular del polímero, los nuevos polisacáridos sulfatados de la
presente invención pueden también utilizarse solos o en asociación
con otros polímeros químicos, tales como los que se listaron
anteriormente, o con polímeros de entrecruzamiento o ésteres del
ácido hialurónico, sales, derivados, complejos, fragmentos,
subunidades, y/o medicamentos farmacológicamente aceptables, por
ejemplo en dermatología, oftalmología, otorrinolaringología,
odontología, ginecología, urología, y como un sistema suministrador
medicamentoso en el tratamiento de infecciones bacterianas,
micóticas o víricas.
Ejemplos de medicamentos de combinación según la
presente invención incluyen:
- asociación de ácido hialurónico sulfatado y un
éster del ácido hialurónico, tal como el éster bencílico o
etílico;
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y un
éster entrecruzado del ácido hialurónico;
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y un
polímero químico tal como el listado supra;
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y
iones Cu (II);
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y de
un ión metálico, tal como el calcio o la plata;
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y de
un éster del ácido hialurónico, con un agente antiinfeccioso tal
como un antibiótico básico o no básico, sulfamídico, antivírico (tal
como el aciclovir), un antiinflamatorio asteroideo (tal como la
hidrocortisona o la prednisolona), un antiinflamatorio no asteroideo
(tal como la indometacina), un curador de heridas (tal como el
factor de crecimiento epidérmico), un antimicrobiano, un
antibacteriano o un desinfectante,
- asociación del ácido hialurónico sulfatado y un
ácido hialurónico entrecruzado con un agente antiinfeccioso tal como
un antibiótico básico o no básico, sulfamídico, antivírico (tal como
el aciclovir), un antiinflamatorio asteroideo (tal como la
hidrocortisona o la prednisolona), un antiinflamatorio no asteroideo
(tal como la indometacina), un curador de heridas (tal como el
factor de crecimiento epidérmico), un antimicrobiano, un
antibacteriano o un desinfectante.
Claims (31)
1. Ácido hialurónico sulfatado con un grado de
sulfatación de 2,5, 3,0 ó 3,5 grupos sulfato por unidad repetitiva
de ácido hialurónico, seleccionado entre:
- (i)
- ácido hialurónico que tiene un peso molecular comprendido entre 10.000 y 50.000 Daltons;
- (ii)
- ácido hialurónico que tiene un peso molecular comprendido entre 50.000 y 250.000 Daltons;
- (iii)
- ácido hialurónico que tiene un peso molecular comprendido entre 250.000 y 750.000 Daltons;
- (iv)
- ácido hialurónico que tiene un peso molecular comprendido entre 750.000 y 1.250.000 Daltons;
2. Éster de hialuronato sulfatado, en el que el
número de grupos sulfato por unidad repetitiva se encuentra
comprendido entre 0,5 y 3,5.
3. Éster de hialuronato sulfatado, según la
reivindicación 2, caracterizado porque dicho éster es un
éster de ácido hialurónico con un alcohol alifático, aralifático,
heterocíclico o cicloalifático.
4. Éster de hialuronato sulfatado, según la
reivindicación 2 ó 3, que es seleccionado entre el bencil
hialuronato sulfatado y el etil hialuronato sulfatado, de manera que
en cada caso el grado de esterificación es de 25%, 50%, 75% ó
100%.
5. Éster de hialuronato sulfatado, según la
reivindicación 4, en el que el peso molecular de la fracción éster
de hialuronato es de 200.000 Daltons.
6. Éster de hialuronato sulfatado, según
cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que el
grado de sulfatación por unidad dimérica es menor de 2.
7. Ión complejo, que comprende Cu (II) y ácido
hialurónico sulfatado, según la reivindicación 1.
8. Ión complejo, que comprende Cu (II) y éster
hialuronato sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6.
9. Objeto biomédico, que comprende ácido
hialurónico sulfatado, según la reivindicación 1.
10. objeto biomédico, según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicho objeto está dotado de un
recubrimiento de dicho ácido hialurónico sulfatado.
11. Objeto biomédico, que comprende éster de
hialuronato sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6.
12. Objeto biomédico, según la reivindicación 11,
producido a partir de dicho éster de hialuronato sulfatado.
13. Objeto biomédico, según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho objeto está dotado de un
recubrimiento de dicho éster de hialuronato sulfatado.
14. Objeto biomédico, según cualquiera de las
reivindicaciones 9-13, que es seleccionado de un
canal de guía, un implante permanente o biodegradable, un bypass,
una vena artificial, una derivación ("shunt"), una gasa, un
hilo, un tubo de diálisis, una película, una membrana, una esponja,
una tela no tejida o género tissue, y una microesfera.
15. Compuesto farmacéutico, que comprende ácido
hialurónico sulfatado, según la reivindicación 1.
16. Compuesto farmacéutico, que comprende éster
de hialuronato sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6.
17. Compuesto farmacéutico, según la
reivindicación 15 ó 16, que está constituido por un gel, hidrogel,
crema o ungüento.
18. Compuesto farmacéutico, según cualquiera de
las reivindicaciones 15-17, para su utilización como
agente antiinflamatorio.
19. Utilización de ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, en la fabricación de un objeto biomédico
o compuesto farmacéutico.
20. Utilización de éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, en la fabricación de un objeto biomédico o un
compuesto farmacéutico.
21. Utilización del ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, para la fabricación de un sistema de
liberación controlada de medicamentos.
22. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, para la fabricación de un sistema de liberación
controlada de medicamentos.
23. Utilización del ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, en la fabricación de un biomaterial que
tiene características antitrombóticas, anticoagulantes o
antivíricas, en especial de inhibición HIV.
24. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, en la fabricación de un biomaterial que tiene
características antitrombóticas, anticoagulantes o antivíricas,
particularmente de inhibición de HIV.
25. Utilización de ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, en la fabricación de un biomaterial para
promover procesos de crecimiento celular, particularmente
angiogénesis.
26. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, en la fabricación de un biomaterial para
promover procesos de crecimiento celular, particularmente
angiogénesis.
27. Utilización de ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para
la aceleración de la curación de heridas, quemaduras, llagas de
encamado o úlceras de la piel.
28. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, en la fabricación de un medicamento para
acelerar la curación de heridas, quemaduras, llagas de encamado o
úlceras de la piel.
29. Utilización de ácido hialurónico sulfatado,
según la reivindicación 1, para el recubrimiento de un objeto
biomédico.
30. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, para el recubrimiento del objeto biomédico.
31. Utilización del éster de hialuronato
sulfatado, según cualquiera de las reivindicaciones
2-6, para la producción de un objeto biomédico.
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