TWI465567B - A method of regulating cell growth - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種細胞培養方法,尤指一種可以調控細胞生長之培養方法。
細胞治療在醫學技術上的大量應用,使得活體外之細胞培養成為臨床細胞醫療上廣為應用的技術。一般正常細胞於體外生長因缺乏自然生理環境的調節,通常必須提供予適當的養分以及生長因子(growth factor)。活體外的細胞培養一方面需要促進細胞生殖分裂,同時另一方面需要抑制細胞分化及死亡,方能使細胞維持良好生長狀態以及原先之特性,特別地對於未分化之細胞而言,能使其保有原始之分化能力。
細胞外基質(extracellular matrix)被認為可以調節細胞生長。玻尿酸(hyaluronan,HA)是常見的細胞外基質之一,曾經被報導可以影響間質細胞(mesenchymal cells)的附著(adhesion)、移動(migration)、增殖(proliferation)、細胞命運(cell fate),以及胚胎在活體外的發育能力等(S.K.Nilssonet al
.,(2003),Blood,
101:856-862;D.Peck and C.M.Isacke,(1996),Curr Biol,
6:884-890)。其他的研究也指出,HA在早期的繼代培養中可以刺激豬的初級骨髓基質細胞(primary porcine bone marrow stromal cells)之增殖(X.Zouet al
.,(2004),Biomaterials,25:5375-5385)。
依據申請人所知,在此技術領域中,存在有藉由例如細胞外基質(extracellular matrix)的生物性物質單獨促進細胞於活體外增殖之技術,還有藉由生物性物質單獨抑制細胞分化及死亡之方法,但是目前仍然缺乏一種可以使用一生物性物質於活體外來延緩細胞生長以及促進細胞生長以達到調控細胞生長之方法。
本發明的主要目的是提供一種利用一細胞外基質組份於活體外,依據使用者需求而調控細胞生長速率之方法。
為達到上述目的,在一個方面,本發明係提供一種用以調控細胞生長的方法,其包含:將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,其中該第一培養系統包括一培養載體以及一細胞外基質組份,該培養載體具有一表面,其中該細胞外基質組份係塗布於該培養載體之表面,藉此可延緩被培養於該第一培養系統之表面上之細胞的生長;收集經培養的細胞而形成一含有細胞的培養物;以及將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,其中該第二培養系統包括一培養載體以及一含有一細胞外基質組份的培養基,該含有細胞外基質組份的培養基係容置於該培養載體上,藉此可促進被培養於該第二培養系統中的細胞之生長。
在另一個方面,本發明係提供一種用以調控細胞生長的方法,其包含:將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,其中該第二培養系統包括一培養載體以及一含有一細胞外基質組份的培養基,該含有細胞外基質組份的培養基係容置於該培養載體上,藉此可促進被培養於該第二培養系統中的細胞之生長。
收集經培養的細胞而形成一含有細胞的培養物;以及將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,其中該第一培養系統包括一培養載體以及一細胞外基質組份,該培養載體具有一表面,其中該細胞外基質組份係塗布於該培養載體之表面,藉此可延緩被培養於該第一培養系統之表面上之細胞的生長;較佳的,其中該細胞外基質組份是選自由下列所構成的群組:玻尿酸、膠原蛋白、纖維結合素、彈性蛋白、層粘連蛋白、硫酸肝素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸角質素、明膠以及它們的衍生物。
基於上述,本發明之方法可以於欲使細胞維持緩慢而穩定的生長時,將細胞培養於該第一培養系統中,而後當需要使用較大量的細胞時,進而將細胞培養於該第二培養系統中,藉以促進細胞生長而取得較大族群之細胞。同理,反之亦然。
依據本發明之一種用以調控細胞生長的方法,其包含:將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,其中該第一培養系統包括一培養載體以及一細胞外基質組份(extracellular matrix component),該培養載體具有一表面,其中該細胞外基質組份係塗布在該培養載體的表面,藉此可延緩被培養於該第一培養系統之表面上之細胞的生長;收集經培養的細胞而形成一含有細胞的培養物;以及將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,其中該第二培養系統包括一含有一細胞外基質組份的培養基以及一培養載體,該含有細胞外基質組份的培養基係容置於該培養載體上,藉此可促進被培養於該第二培養系統中的細胞之生長。
依據本發明之方法,其中各步驟出現的順序並非代表其於本發明之方法中所使用的順序,亦即在本發明的一個具體實施例中,依據本發明的方法可以是先將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,接而收集該經培養於第一培養系統中的細胞而形成一含有細胞的培養物,復將將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中。
在本發明的另一個具體實施例中,依據本發明的方法可以是先將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,接而收集該經培養於第二培養系統中的細胞而形成一含有細胞的培養物,復將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中。
另一方面,依據本發明之方法可以重複進行將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中抑或將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中之培養步驟,藉以延緩細胞生長或促進細胞生長。
基於上述,使用者可以依其需要,選擇實施本發明之方法中步驟之順序,以達到調控細胞生長之目的。
依據本發明之方法,其中該細胞外基質組份是選自由下列所構成的群組:玻尿酸(hyaluronic acid)、膠原蛋白(collagen)、纖維結合素(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、層粘連蛋白(laminin)、硫酸肝素(heparan sulfate)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、肝素(heparin)、硫酸角質素(keratan sulfate)、明膠(gelatin)以及它們的衍生物。
較佳地,其中該細胞外基質組份是選自於由玻尿酸以及它的衍生物所構成的群組。
依據本發明之方法,其中該細胞是選自於下列所構成的群組:幹細胞(stem cell);組織前驅細胞(tissue progenitor cell);母細胞(blastcell),諸如纖維母細胞;組織特化細胞,諸如軟骨細胞以及癌細胞。
在本發明的一個較佳的實施例中,該細胞是幹細胞。
在本發明的一個較佳的實施例中,該細胞是纖維母細胞。
依據本發明之方法,其中該表面被塗布有該細胞外基質組份的培養載體,是藉由包含有下列步驟之方法所製備:一塗布步驟:將一含有該細胞外基質組份的塗料組成物塗布於該培養載體的一表面;選擇性的一培育步驟:令該塗料組成物於培養載體的表面上進行培育;以及一乾燥步驟:將該培養載體連同該塗料組成物一起乾燥。
較佳地,該表面是以數量大約為0.05至200 μg/cm2
的細胞外基質組份予以塗布。
更加地,該表面以數量大約為1至100 μg/cm2
的細胞外基質組份予以塗布。
再更佳地,該塗布步驟中的該表面以數量大約為2至50 μg/cm2
的細胞外基質組份予以塗布。
依據本發明,培養載體可以被瞭解為包括但不限於:一般的培養容器,例如攪拌式培養皿(stirring flask)、攪拌式反應槽(stirred tank reactor)、佩垂皿(petri dishes)、多孔盤(multiwell plates)、微量滴定盤(microtiter)、試管以及培養瓶(culture flasks);其他可能的載體以及類似物。較佳的,該等培養載體是由下列材料所製成,例如,但不限於:聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、丙烯酸酯聚合物(acrylate polymers)、尼龍(nylon)、硝化纖維素(nitrocellulose)或瓊脂糖凝膠(sepharose)等。
在本發明的一個較佳的實施例中,其中該培養載體是培養皿。
依據本發明之方法係可以進一步包含一細胞冷凍保存之步驟,用以保存細胞以供隨時取用。
依據本發明之方法係可供應用於活體外的細胞培養上。較佳地,本發明之方法可以適用於再生醫學、組織工程以及利用臍帶血細胞之治療。
本發明將進一步藉由下面的實施例來作說明,但應明瞭的是,該等實施例僅為說明之用,而不應被視為本發明的實施上的限制。
實施例
一般實驗材料與方法
1.小鼠脂肪衍生基質細胞(murine adipose-derived stromal cells,mADSCs)的分離與培養
mADSCs是以先前所述之方法而被分離出(R.Ogawa,et al.
,(2004),Biochem Biophys Res Commun
,313:871-877)。雄性的FVB/N小鼠是依據關於實驗動物規範之組織導引(institutional guidelines for animal regulation)的標準條件下被飼養與照顧於國立成功大學。簡言之,腹股溝脂肪墊(inguinal fat pad)是取自於FVB/N小鼠,並且以磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline)(GibcoBRL,Grand Island,USA)予以洗滌,接而將之切碎並利用0.1%膠原蛋白酶(collagenase)(Worthington,Lakewood,USA)於37℃予以消化(digested)歷時45分鐘。加入一等體積的含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Biological Industries,Israel)之杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)(GibcoBRL)(亦即DMEM-10% FBS),而所形成的溶液係通過一100-μm之篩網(mesh)予以過濾,繼而以250 xg離心10分鐘。沉澱丸(pellet)被收集並且被再懸浮(resuspended)於160mM NH4
Cl(Sigma,USA)中用以將紅血球溶融(lyse),並且於250 xg下離心10分鐘。細胞團塊(cell
pellet)被收集並且再懸浮於具有1%抗生素/抗黴劑溶液之DMEM-10% FBS的習用培養基,或指定的含額外添加的HA之培養基(indicated HA-containing medium)。細胞懸浮液接而以1 x 104
細胞/cm2
裝盤於(plated)於正常培養表面(regular culture surface)或於HA預先塗佈的表面(HA pre-coated surface),並且於37℃以5% CO2
培育(incubated)。
2.正常人類皮膚纖維母細胞之分離與培養
人類纖維母細胞是以一般習知方法,將取自於新生兒的包皮之真皮層,以分散酶(dispase)把表皮層去除,以膠原蛋白酵素或胰蛋白酶作用讓真皮層細胞游離出來,過濾後再離心收集,獲得真皮層之纖維母細胞,培養於DMEM+10%FBS備用。細胞懸浮液接而以1 x 104
細胞/cm2
裝盤於於正常培養表面(regular culture surface)或於HA預先塗佈的表面(HA pre-coated surface),並且於37℃以5% CO2
培育。
3.細胞培養於正常的與含HA培養條件下
I. CHA培養系統(CHA culture system)之建立
HA預先塗佈的表面是以將HA塗佈於一正常培養表面的方式製成,且被使用來作為CHA培養系統。關於製備具有20μg/cm2
HA之培養系統(CHA20),500μL的4mg/mL玻尿酸溶液(hyaluronic acid solution)被均勻地施用於24-孔培養盤(24-well plate)(Nunc,cat.no.142475),該培養盤被水平地置放並且預先加熱至40℃與50℃之間。300μL及190.5μL的HA溶液被依序地吸取出,而留下約5μL/cm2
HA溶液於24-孔培養皿的各個孔內。培養皿藉由加熱予以乾燥,並利用臭氧予以滅菌,歷時1小時。24-孔培養皿內的HA塗佈狀態可進一步藉由使用配於3%醋酸中之1%艾爾遜藍(alcian blue)進行染色予以確認。所得的培養皿密封保存於乾燥箱內,並於一週內使用。
II.含HA之培養系統(HA-containing culture system)利用DMEM-10% FBS被培養於正常培養表面的細胞被使用作為對照組(control)。可使用下列二種含HA之培養系統:(A)SHA,其中細胞是使用濃度為0.2 mg/mL(SHA0.2)或0.05 mg/mL(SHA0.05)的含有HA(Mw=720 kDa,Pentapharm,Basel,Switzerland)之DMEM-10% FBS被培育於正常培養表面上;(B)CHA,其中細胞是使用DMEM-10% FBS被培育於含有5 μg/cm2
(CHA5)或20 μg/cm2
(CHA20)HA的HA-預先塗佈的表面。
一旦細胞達至一匯聚(confluence)的狀態時,對被培養於對照組、SHA以及CHA的細胞予以進行序列繼代培養(serial passage)。細胞被以胰蛋白酶處理(trypsinized)、予以離心並且再懸浮於適當的培養基,亦即對於對照組及CHA組使用DMEM-10% FBS;對於SHA組使用DMEM-10% FBS-SHA。在各個組別中,細胞是以1 x 104
細胞/cm2
被裝盤。族群倍增之增加(the increase of population doubling,△PD)是依據下列公式計算出:△PD=log(Nf
/N0
)/log 2,其中Nf
是細胞於半匯聚(subconfluence)狀態下的最終數目(final number),且N0
是被裝盤的細胞的初始數目(initial number)。
本實驗是有關於藉由分析被施予不同HA處理的mADSCs的族群倍增之增加來研究其增殖行為特性之改變。
實驗方法:
mADSCs對HA反應的增殖性生長期(proliferative lifespan)被培養於對照組表面(control surface)上、以SHA(0.05以及0.2 mg/mL)及CHA(5以及20 μg/cm2
)的mADSCs之增殖性生長期是如“一般實驗材料與方法”中所述分別地藉由族群倍增之增加來作評估。在對照組中,予以執行3個獨立地實驗,而在SHA0.05、SHA0.2、CHA5以及CHA20的各個組別中,予以執行2個獨立的實驗。
結果:
在各個條件下之mADSCs的增殖性生長期的比較表示於第一圖中。以SHA0.05以及SHA0.2培養的mADSCs之生長速率相較於對照組所具者明顯地較高(於P5中分別為*
p<0.05以及**
p<0.01)。然而,SHA0.05與SHA0.2之間的差異則不顯著。藉由培養於CHA上,mADSCs呈現一較為漸進的生長特性(growth profile),並且在P5之後的各個繼代培養中在細胞數上幾乎沒有增加。此外,增殖性生長期似乎隨著CHA總量的增加而更短(CHA20相對於CHA5)。
本實驗是有關於藉由將mADSCs處理以不同序列之HA處理來達到調控mADSCs之增殖行為的目的。
實驗方法:
mADSCs主要是以如“一般實驗材料與方法”中所述的方法被收集以及被培育,其差別在於細胞是每三天予以繼代培養一次,並且配合下列二種方式予以處理,並以前述方法予以評估及計算各組的族群倍增之增加(the increase of population doubling,△PD):I. CHA-SHA組:mADSCs初始地被培養於CHA20上,接而在第6天被繼代培養(subcultured)至一添加HA之培養基中於正常培養表面(regular culture surface)上(SHA0.2)。
II. SHA-CHA組:mADSCs初始地被培養於SHA0.2上,接而在第6天再予以繼代培養至一CHA20之培養表面上。
結果:
如第二圖所示,mADSCs培養於CHA培養系統中時,族群倍增之增加似乎完全沒有改變,由此可知mADSCs呈現一緩慢生長,一旦經CHA培養的mADSCs,於第6天時被繼代培養至一含有HA的培養基(亦即SHA培養系統)中,由族群倍增之增加的變化可見,mADSCs重新獲取一較為快速的生長速率;相反地,當mADSCs初始地被培養於一SHA培養系統中,會呈現較為快速的生長速率,一旦mADSCs被繼代培養於一CHA培養系統中時,生長速率即因此趨緩,由是可見,利用本發明的CHA以及SHA培養系統之交替運用,可以有效地於活體外調控mADSCs之生長速率。
本實驗是有關於藉由將正常人類皮膚纖維母細胞(normal human dermal fibroblast,NHDF)處以不同序列之HA處理來達到調控NHDF之增殖行為的目的。
實驗方法:
NHDF主要是以如“一般實驗材料與方法”中所述的方法被收集以及被培育,其差別在於細胞是每三天予以繼代培養一次,並且配合下列二種方式予以處理,並以前述方法予以評估及計算各組的族群倍增之增加(the increase of population doubling,△PD):III. CHA-SHA組:NHDF初始地被培養於CHA20上,接而在第6天被繼代培養至一添加HA之培養基中於正常培養表面上(SHA0.2)。
IV. SHA-CHA組:NHDF初始地被培養於SHA0.2上,接而在第6天再予以繼代培養至一CHA20之培養表面上。
結果:
如第三圖所示,NHDF培養於CHA培養系統中時,族群倍增之增加似乎完全沒有改變,由此可知NHDF呈現一緩慢生長,一旦經CHA培養的NHDF,於第6天時被繼代培養至一含有HA的培養基(亦即SHA培養系統)中,由族群倍增之增加的變化可見,NHDF重新獲取一較為快速的生長速率;相反地,當NHDF初始地被培養於一SHA培養系統中,會呈現一較為快速的生長速率,一旦NHDF被繼代培養於一CHA培養系統中時,生長速率即因此而趨緩,由是可見,利用本發明的CHA以及SHA培養系統之交替運用,可以有效地於活體外調控NHDF之生長速率。
於本案說明書中被引述的所有文獻以及專利文件以其整體被併入本案作為參考。若有所衝突時,本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
第一圖顯示在各個條件下之mADSCs的增殖性生長期。
第二圖顯示mADSC在CHA培養系統以及SHA培養系統組合使用下之增殖性生長期的變化情形。
第三圖顯示NHDF在CHA培養系統以及SHA培養系統組合使用下之增殖性生長期的變化情形。
Claims (9)
- 一種用以調控細胞生長的方法,其包含:將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,其中該第一培養系統包括一培養載體以及一細胞外基質組份,該培養載體具有一表面,其中該細胞外基質組份係塗布於該培養載體之表面,以延緩被培養於該第一培養系統之表面上之細胞的族群倍增,其中該表面是以數量大約為0.05至200μg/cm2 的細胞外基質組份予以塗布;收集經培養的細胞而形成一含有細胞的培養物;以及將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,其中該第二培養系統包括一培養載體以及一含有一細胞外基質組份的培養基,該含有細胞外基質組份的培養基係容置於該培養載體上,藉此可促進被培養於該第二培養系統中的細胞之族群倍增,其中該細胞外基質組份是選自於由玻尿酸以及它的衍生物所構成的群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該細胞是選自於下列所構成的群組:幹細胞、組織前驅細胞、母細胞、組織特化細胞以及癌細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該細胞是幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該細胞是纖維母細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該表面 以數量大約為1至100μg/cm2 的細胞外基質組份予以塗布。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該表面以數量大約為2至50μg/cm2 的細胞外基質組份予以塗布。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中第二培養系統之細胞外基質組份的培養基之濃度為0.05至0.2mg/L。
- 一種用以調控細胞生長的方法,其包含:將含有細胞的培養物培養於一第二培養系統中,其中該第二培養系統包括一培養載體以及一含有一細胞外基質組份的培養基,該含有細胞外基質組份的培養基係容置於該培養載體上,藉此可促進被培養於該第二培養系統中的細胞之族群倍增;收集經培養的細胞而形成一含有細胞的培養物;以及將含有細胞的培養物培養於一第一培養系統中,其中該第一培養系統包括一培養載體以及一細胞外基質組份,該培養載體具有一表面,其中該細胞外基質組份係塗布於該培養載體之表面,以延緩被培養於該第一培養系統之表面上之細胞的族群倍增,其中該表面是以數量大約為0.05至200μg/cm2 的細胞外基質組份予以塗布,其中該細胞外基質組份是選自於由玻尿酸以及它的衍生物所構成的群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中第二培養系統之細胞外基質組份的培養基之濃度為0.05至0.2mg/L。
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---|---|---|---|---|
US6339074B1 (en) * | 1994-03-23 | 2002-01-15 | Fidia Advanced Biopolymers, Srl | Sulfated hyaluronic acid and esters thereof |
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2007
- 2007-12-07 TW TW096146693A patent/TWI465567B/zh active
Patent Citations (2)
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