TWI473879B - 用於保持未分化細胞之增殖以及分化潛力的方法 - Google Patents

Description

用於保持未分化細胞之增殖以及分化潛力的方法

本發明是關於未分化細胞的細胞生物學領域。更特定的是關於幹細胞的繁殖(propagation of stem cells)、培養條件以及有助於未分化細胞的增殖的物質(materials)以及未分化的使用。

未分化細胞，諸如組織前趨細胞、幹細胞以及它們的類似物，係具有使用於再生醫學或治療用組織工程的商業潛力。對於未分化細胞於再生醫學或治療用組織工程的應用而言，有於體外培養呈現未分化狀態之未分化細胞的便利之方法是必要的。

幹細胞係為一種未分化細胞之族群代，其可透過細胞分裂來保持自我再生(renew)的能力，並且可以分化成不同種類的已分化細胞，且其係被發現於全部的多細胞有機體(multiple cellular organism)中。在哺乳動物中，三種主要的幹細胞型態係為：胚胎幹細胞(embryonic stem cell)，其係被發現於胚母細胞(blastocytes)中；外胚胎幹細胞(extraembryonic stem cells)，其係被發現於外胚胎組織(extraembryonic tissues)中；以及成體幹細胞(postnatal stem cell)，其係被發現於成體組織(postnatal tissues)中。成體幹細胞係作用為用以補充特化的細胞(specialized cell)的修復系統。如此技術領域中所知，幹細胞可以於餵養細胞(feeder cells)存在下以未分化狀態繁殖培養。

然而，供用於再生醫學或治療用組織工程中之未分化細胞(諸如幹細胞)的培養中使用餵養細胞的潛在風險是諸如病毒的感染因子(infectious agents)可能會感染接受者(recipient)。因此，存在有一對於可以在沒有餵養細胞的存在下於活體外(in vitro )讓未分化細胞以未分化狀態進行培養之替代方法的需求。

部分的細胞外基質組分(extracelluar matrix components,ECM components)被使用來替代餵養細胞以培養未分化細胞，藉以讓它們維持於一未分化狀態。一些利用ECM組分[諸如(laminin)以及膠原蛋白(collagen)]來培養未分化細胞的方法已經被發展出。

WO 98/50526揭示一種用於培養神經上皮幹細胞(neuroepithelial stem cells)以及寡突神經膠細胞－星狀細胞前趨細胞(oligodentrocyte－astrocyte precursor cells)的方法。其中觀察到神經上皮幹細胞之分化成為寡突神經膠細胞、星狀細胞以及神經元可以藉由將細胞鋪設於層黏連蛋白(laminin)、去除有絲分裂誘致劑(mitogen)或於生長培養基中添加背部化試劑(dorsalizing agents)。

WO 2008/007082 A2則揭示於在沒有餵養細胞以及血清的細胞培養條件下維持靈長類胚胎幹細胞，該培養條件係使用塗布有蛋白質類細胞培養擔體(proteinaceous based cell culture support)之細胞培養皿，其中該蛋白質類細胞培養擔體是以膠原蛋白為主的細胞培養擔體。

基於上述，有些ECM組分非但不能維持細胞分化的 潛力，反而會誘導未分化細胞的分化。這指示不同ECM組分對於培養的未分化細胞不一致的功效是源自於不同ECM組分的多樣化特性。

玻尿酸(Hyaluronan,HA)，一種細胞外基質的組分，是一種廣佈於結締組織、上皮組織以及神經組織的未硫酸化的醣胺聚多醣(non－sulfated glycosaminoglycan)。

玻尿酸(hyaluronan,HA)是一種為了前述目的而被施用於成體幹細胞的細胞外基質組份，因為它曾經被報導會影響細胞的黏著(adhesion)、移行(migration)以及增殖(proliferation)(S.K.Nilssonet al .,(2003),Blood ,101：856－862；D.Peck and C.M.Isacke,(1996),Curr Biol ,6：884－890)以及間葉細胞的細胞命運決定(cell fate determination)(C.B.Knudson,(2003),Birth Def’ects Res C Embryo Today ,69：174－196)以及活體外的胚胎的發育能力(M.Stojkovic et al.,(2002),Reproduction ,124：141－153)。大鼠骨母細胞(osteoblast)藉由初步的施用HA來增強成骨潛力已被指出(L.Huanget al .,(2003),J Biomed Mater Res A ,66：880－884)。然而，沒有任一上述文獻揭露關於HA可以於培養情況下令未分化細胞(諸如幹細胞)維持於一未分化狀態之內容。

於美國專利申請案第20020042132號中，David K Gardner等人揭示一種哺乳類培養基添加物，其包含人類白蛋白(albumin)以及經發酵的HA以及含有可以增加配子(gamete)或胚胎細胞的存活率的添加物。某些研究發現指 出HA可以在早期的繼代培養刺激原始的豬骨髓基質細胞(primary porcine bone marrow stromal cells)的增殖(X.Zouet al .,(2004),Biomaterials ,25：5375－5385)。這顯示被懸浮於培養基中的HA不會維持反而會刺激細胞增殖的能力。

因此，這些源自於蛋白質類ECM組分與非蛋白質類ECM組份之間的差異以及用以將ECM組分呈現給未分化細胞的手段之不同會造成結果的不一致。

用以調控未分化細胞，特別是多能幹細胞(pluripotent stem cells)之分化的新穎技術會是朝向瞭解成體幹細胞用於治療之全面的商業潛力的重要成就，且對於再生醫學而言，亦會是一種之非常有價值的工具。

發明概要

因此，申請人致力於發展出一種用以在一未分化狀態下增殖未分化細胞(諸如幹細胞)的方法，以及它們在製備用於再生醫學的細胞上的應用。

本發明的主要目的在於提供一種用於保持未分化細胞的增殖以及分化潛力之方法，其包含下列步驟：提供一培養載體，其中該培養載體具有一塗布有一生物材料的表面，該生物材料是選自於由多醣(polysaccharide)、經硫酸化的多醣(sulfated polysaccharide)以及其衍生物所構成之群組；以及使用一適當的培養基來殖種並培養該未分化細胞於該培養載體的塗布有生物材料的表面上。

依據本發明之方法可以被使用來在不會失去它們的複製能力以及分化能力的情況下於活體外擴增幹細胞。因此，依據本發明之方法可以適用於再生醫學、組織工程(tissue engineering)以及使用臍帶血或其他細胞來源(諸如周邊血液細胞、幹細胞、組織前趨細胞或組織細胞)的治療。

藉由下列詳細說明同時參照隨文所附的圖式，本發明的其他目的、優點以及新穎的特徵會更為明顯。

發明之詳細說明

申請人將目標設定在評估HA在經長期培養的未分化細胞的體外擴增以及分化潛力的保持上之可行性；特定的是幹細胞；更特定的是間葉細胞(mesenchymal cells)；又更特定的是脂肪衍生基質細胞(adipose－derived stromal cell,ADSC)以及胎盤衍生幹細胞(placenta－derived mesenchymal stem cells)。

脂肪衍生基質細胞具有分化成多種譜系(lineage)的能力(K.M.saffordet al .,(2002),Biochem Biophys Res Commun 294：371－379；R.Ogawa,et al .,(2004),Biochem Biophys Res Commun 313：871－877；R.Ogawaet al .,(2004),Biochem Biophys Res Commun 319：511－517)。在申請人初步的研究中，對於活體外培養，mADSCs會展現一有限的增殖能力(proliferative capacity)以及具有衰老的型態(senescent morphology)。這可能是鼠類細胞對於環境壓力(environmental stress)(諸如那些被頻繁的繼代培養所誘發出者)(C.J.Sherr and R.A.DePinho,(2000),Cell 102：407－ 410；W.E.Wright and J.W.Shay,(2000),Nat Med ,6：849－851)或者活體外的高氧狀態(hyperoxic condition)(S.Parrinelloet al .,(2003),Nat Cell Biol 5：741－747)具有高度的敏感性。這些可能造成分化能力受損，這與經繼代培養的間葉細胞(mesenchymal stem cells)所報導者相似(T.Matsubaraet al .,(2004),Biochem Biophys Res Commun 313：503－508)。

關於長期培養，鼠類脂肪衍生基質細胞(mADSCs)在後期的繼代培養中會展現增殖活性上明顯的衰退、呈現衰老型態以及降低分化潛力(尤其是成骨作用)。為了延長成體幹細胞(諸如ADSCs)的生命期(lifespan)，含有HA的培養條件在下列實施例中予以檢視，其中一培養條件CHA，其中HA是被預先塗布於培養表面(cultural surface)顯示HA對於保持經長期培養的mADSCs之增殖以及分化潛力而言是有效的。

在另一方面，在歷經長期培養而處於後期繼代培養的胎盤衍生間葉幹細胞(PDMSCs)之增殖活性亦被檢視於下列實施例中。

下列的定義以及方法係被提供來更完善的定義本發明，並且指引所屬技術領域具有通常知識者實施本發明。除非另有所指，用語是依據在相關技術領域中具有通常知識者慣用者來作解釋。

在一方面，本發明提供一種用於保持未分化細胞增殖以及分化潛力之方法，其包含下列步驟： 提供一培養載體，其中該培養載體包括塗布有一生物材料的表面，該生物材料是選自於由多醣、經硫酸化多醣以及它們的衍生物所構成的群組；以及使用一適當的培養基，將該未分化細胞殖種並培養於該培養載體塗布有該生物材料的表面上，藉此未分化細胞的增殖以及分化潛力得以被保持。

如此處被使用的用語「保持(preserving)」是指保持(maintaining)、保留(conserving)、保存(saving)、維持(upholding)、保持(keeping)、延續(continuing)或支持(sustaining)，藉此細胞的增殖速率可以被延緩(slowing down)、降低(decreasing)或延遲(delaying)至一類似於活體內(in vivo )的「休眠狀態(dormant state)」。

活體內的成體幹細胞(postnatal stem cells)通常是呈現一「休眠狀態」[一緩慢的細胞週期現象(slow cell－cycling phenomenon)]，而當被組織再生或修護信息所刺激時會增殖。

本發明可以令未分化細胞於活體外維持於一緩慢的細胞週期狀態，其可以模擬活體內的狀態使細胞保持於原始狀態，藉以保持未分化細胞的增殖以及分化潛力。

如此處被使用的用語「分化(differentiation)」，是指藉以令單一細胞產生型態性以及功能性特化(morphological and functional specialization)之過程。

如此處被使用的用語「分化潛力(differentiation potential)」，是指一對於進行分化的可能性(potent)。

依據本發明，該未分化細胞是從一諸如牛、豬、鼠、馬、狗、貓、綿羊、猴以及人類的哺乳動物所取得。更特定的，該未分化細胞是取自於人類或鼠類。

依據本發明，該未分化細胞是選自於由下列者所構成的群組：幹細胞、基質細胞、組織前趨細胞以及間葉細胞。較佳地，該未分化細胞是脂肪衍生基質細胞；更佳地，該未分化細胞是胎盤衍生幹細胞。

如此處所使用的該用語「培養載體(culture carrier)」是指一可供作為在細胞培養過程中的一載體(carrier)或擔體(support)，而該用語不應以一限制性的方式來解讀。

依據本發明，該培養載體可以被瞭解為包括，但不限於：傳統的培養容器，例如攪拌式培養皿(stirring flask)、攪拌式反應槽(stirred tank reactor)、佩垂皿(petri dishes)、多孔盤(multiwell plates)、微量滴定盤(microtiter)、試管以及培養瓶(culture flasks)；其他可能的載體以及類似物。較佳地，這些載體可以是由下列材料所製成：例如，聚苯乙烯(polystyrene)、聚丙烯(polypropylene)、丙烯酸酯聚合物(acrylate polymer)、尼龍(nylon)、硝基纖維素(nitrocellulose)或瓊脂醣凝膠(sepharose)等。

依據本發明，該生物材料是選自於由下列物質所構成的群組：醣胺聚多醣、經硫酸化的醣胺聚多醣以及它們的衍生物。

依據本發明，該生物材料是選自於由下列物質所構成的群組：玻尿酸、硫酸玻尿酸、軟骨素(chondroitin)、硫 酸軟骨素、角質素(keratan)、硫酸角質素(keratan sulfate)、紅藻膠(carrageenan)、肝素(heparin)、硫酸肝素(heparan sulfate)、藻酸(alginate)、瓊脂醣(agarose)、瓊脂(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素、羧甲基纖維素(carboxyl methyl cellulose)、幾丁質(chitin)、幾丁聚醣(chitosan)、肝醣(glycogen)以及它們的衍生物。

較佳地，該生物材料是選自於由下列物質所構成的群組：玻尿酸以及它的衍生物。

如此處所使用的「玻尿酸」，是一具有重複的N－乙醯葡萄胺醣(N－acetylglucosamine)以及D－葡萄醣醛酸(D－glucuronic acid)的雙糖單位之天然存在的聚合物。

玻尿酸衍生物是為選自於由下列物質所構成的群組：玻尿酸酯類(hyaluronic acid esters)、玻尿酸之經交聯的化合物(crosslinked compounds)、玻尿酸與琥珀酸的半酯或與琥珀酸之重金屬鹽類的半酯(hemiesters of succinic acid or heavy metal salts of the hemiester of succinic acid with hyaluronic acid)、或玻尿酸之部分的或全部的酯類(partial or total esters of hyaluronic acid)、硫酸化的玻尿酸(sulphated hyaluronic acid)、N－硫酸化的玻尿酸(N－sulphated hyaluronic acid)以及它們的衍生物。

更佳地，玻尿酸衍生物是經由一依據文獻[Lynn L.H.Huang－Lee and Marcel E.Nimni.1994.經交聯的溴化氰活化之玻尿酸－膠原蛋白基質：對於纖維母細胞收縮作用之影響(Crosslinked cyanogen bromide activated hyaluronan－ collagen matrices：effects on fibroblast contraction).Matrix Biology ,14：147－157]之溴化氰活化程序(cyanogen bromide activation procedure)所產生的。

依據本發明，該適當的培養基可以是任何本技術領域中已知適合用於培養依據本發明之未分化細胞的培養基。例如，該適當的培養基可以包括，但不限於：杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)、英格爾最低必須培養基(Eagle’s minimal essential medium)、RPMI、Media199、F－12培養基、威廉氏培養基E(William’s medium E)或其類似物。較佳地，該適當的培養基是添加有胎牛血清或其類似物之前述培養基。

依據本發明，藉由高濃度CHA處理，mADSCs傾向於形成具有緩慢的生長特性的細胞聚集體(cell aggregates)。在將mADSCs從CHA移種至對照組表面後，它們會展現有延長的生命期以及增加的成骨潛力。因此，在本發明的另一方面，依據本發明的方法可以進一步包含：將該未分化細胞繼代培養於一另一培養載體。較佳的，該另一培養載體具有一被塗布有前述生物材料的表面。

在本發明的另一方面，該適當的培養基實質上缺少該生物材料，藉此該未分化細胞的增殖以及分化潛力可以皆被保持。

如此處所使用的用語「塗布(coating)」以及「塗布(coated)」，是指利用本技術領域中已知方法將一生物材料予以施加至一培養載體的表面，例如，但不限於：一塗覆 法(application method)、浸漬法(immersion method)或其類似方法。

塗覆法包括下列步驟：將一生物材料溶液塗覆於一培養載體的表面的步驟；選擇性以水洗滌表面的步驟；以及選擇性地可以於施行該塗覆步驟後接而進行一乾燥該表面的步驟。

浸漬法包括下列步驟：藉由將培養載體浸漬於一生物材料水性溶液之方式而將一生物材料層(biological material layer)黏著至一培養載體的表面上，以及選擇性地以水洗滌該表面的步驟，以及可以於施行該浸漬步驟後接而進行一乾燥該表面的步驟。被使用於這些方法中的生物材料之水性溶液的濃度沒有特定的限制。

特定的，被揭示於美國專利案第6,129,956號之使用玻尿酸及其衍生物或它們的天然的或半合成的聚合物來塗布物體表面的方法可以被使用於本發明中，用以製備一具有一塗布有一生物材料(特別是非蛋白質類的細胞外基質組分)的表面之培養載體。

依據本發明，培養載體的塗布有生物材料之表面是藉由一具有下列步驟的方法所製備出：將一培養載體的表面塗布以一含有大約1 ng/mL至大約1 g/mL的前述生物材料的塗料組成物(coating composition)；選擇性地，培育(incubate)該塗料組成物於培養載體的表面上；以及令該塗料組成物在該培養載體上乾燥化。

依據本發明，該含有大約1 ng/mL至大約1 g/mL的前述生物材料的塗料組成物是藉由將前述生物材料溶解於一適當的溶劑而被製備出。特定的，該適當的溶劑是一水性溶劑，諸如水、生理鹽水或類似物。

較佳地，在該塗布的步驟中，該表面是被塗布以一數量介於大約1 ng/cm² 至200 mg/cm² 的前述生物材料；更佳地，大約0.01 μg/cm² 至10 mg/cm² ；以及又更佳地，大約0.5 μg/cm² 至200 μg/cm² 。

依據本發明，前述生物材料具有一平均分子量落在1KDa至20,000KDa範圍內；以及較佳地，前述生物材料具有一平均分子量落在10KDa至15,000KDa範圍內。

本發明係可以被使用於再生醫學、組織工程、使用臍帶血、骨髓、幹細胞或其類似物的治療以及用於治療不同標的疾病的類似領域中。該等標的疾病是例如，但不限於：惡性腫瘤(malignant tumor)，諸如白血病、淋巴癌以及類似者；遺傳疾病，諸如心臟病及類似者：自體免疫疾病，諸如多發性硬化症(multiple sclerosis)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)及類似者；或者組織/器官損失(諸如皮膚、骨骼、軟骨、肝臟、神經、腦、角膜、血管、胃、小腸、結腸、鞏膜或類似者之缺陷)。

在另一方面，本發明提供一種培養載體用以保持未分化細胞增殖以及分化潛力之用途，其中該培養載體具有一表面，該表面係塗布有一選自於由多醣、經硫酸化多醣以及它們的衍生物所構成之群組的生物材料，用以保持未分 化細胞之增殖以及分化潛力。

依據本發明，該表面是被塗布以一數量介於大約0.1 ng/cm² 至200 mg/cm² 之間的生物材料。較佳地，該表面是被塗布以一數量介於大約0.01 μg/cm² 至10 mg/cm² 之間的生物材料。

在下述的實施例中，縮寫進一步具有如下文中所示之意義。未被界定的縮寫具有它們一般被接受的意義，或者如上所述之意義。

實施例1 mADSCs對HA反應而改變的增殖行為

實驗材料與方法： 1. mADSCs的分離與培養 mADSCs是以先前所述之方法而被分離出(R.Ogawa,et al.,(2004)，同上述)。雄性的FVB/N小鼠是依據關於實驗動物規範之組織導引(institutional guidelines for animal regulation)的標準條件被飼養並照護於國立成功大學。簡言之，腹股溝脂肪墊(inguinal fat pad)係取自於FVB/N小鼠，並且以磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline)(GibcoBRL,Grand Island,USA)予以洗滌，接而將之切碎並利用0.1%膠原蛋白酶(collagenase)(Worthington,Lakewood,USA)於37℃予以消化(digested)歷時45分鐘。加入一等體積的含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Biological Industries,Israel)之杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM) (GibcoBRL)(亦即DMEM－10% FBS)，而所形成的溶液係通過一100－μm之篩網(mesh)予以過濾，繼而以250 xg離心10分鐘。團塊(pellet)被收集並且被再懸浮(resuspended)於160 mM NH₄ Cl(Sigma,USA)中用以將紅血球溶融(lyse)，並且以250 xg離心10分鐘。細胞團塊(cell pellet)被收集並且再懸浮於具有1%抗生素/抗黴劑溶液之DMEM－10% FBS的習用培養基，或指定的含額外添加的HA之培養基(indicated HA－containing medium)。細胞懸浮液接而被以1 x 10⁴ 細胞/cm² 盛盤於(plated)於正常培養表面(regular culture surface)或HA預先塗佈的表面(HA pre－coated surface)，並且於37℃以5% CO² 培育(incubated)。

2.培養於正常的與含HA培養條件下的mADSCs使用DMEM－10% FBS予以培養於正常培養表面的mADSCs被使用作為對照組(control)。HA預先塗佈的表面是以將HA塗佈於一正常培養表面的方式被製備出，且被使用來作為CHA培養系統(CHA culture system)。就製備具有5及20 μg/cm² HA之培養系統(CHA5及CHA20)而言，200 μL的1mg/mL玻尿酸溶液(hyaluronic acid solution)被均勻地施用於24－孔培養盤(Nunc Cat.No.142475)，該培養盤被水平地置放並且預先加熱至40與50℃之間。190 μL及160μL的HA溶液被依序地吸取出，而留下約5及20μg/cm² HA溶液於24－孔培養皿的各個孔內。培養皿藉由加熱予以乾燥並利用臭氧予以滅菌歷時1小時。24－孔培養皿內的HA塗佈狀態可進一步藉由使用配於3%醋酸中之1% 艾爾遜藍(alcian blue)進行染色予以確認。所得的培養皿密封保存於乾燥箱內，並於一週內使用。

使用DMEM－10% FBS予以培養於正常培養表面的mADSCs被使用作為對照組(control)。CHA代表mADSCs係使用DMEM－10% FBS予以培育於含有5 μg/cm² 或20 μg/cm² HA之HA－預先塗佈表面的培養系統者(亦即分別代表CHA5與CHA20)。

一旦細胞達至一匯聚(confluence)的狀態時，對被培養於對照組以及CHA培養系統的mADSCs予以進行連續繼代培養(serial passage)。mADSCs被以胰蛋白酶處理(trypsinized)、予以離心並且再懸浮於適當的培養基，對於對照組及CHA組別使用DMEM－10% FBS。在各個組別中，細胞是以1 x 10⁴ 細胞/cm² 被盛盤。族群倍增的增加(the increase of population doubling，△PD)是依據下列公式計算出：△PD＝1og(N_f /N₀ )/1og 2，其中N_f 是細胞於將匯聚(subconfluence)狀態下的最終數目(final number)，且N₀ 是被盛盤的細胞的初始數目(initial number)。

3.移種培養(transfer culture) 初始地被培養於CHA20而歷經3與5次繼代培養的mADSCs被繼代培養(subcultured)於正常培養表面上。用語“CHA_P3/C”以及“CHA_P5/C”分別代表mADSCs從在P3(第三次繼代培養)及P5(第五次繼代培養)下之CHA20到正常培養表面之移種與繼代培養物(subculture)。“P3＋7”代表mADSCs是培養於CHA20上歷經3次繼代培養並且接 而被培養於正常培養表面上歷經“7”次繼代培養。△PD係如前述之方法被計算出。

4.細胞分化的誘發作用 mADSCs的成骨性誘發作用(adipogenic and osteogenic inductions)主要是依據為Zuk等人所報導的方法來進行(Zuket al .(2001),Tissue Eng ,7：211－228)。對於分化作用，如於“2.培養於正常的與含HA培養條件下的mADSCs”中所描述的方法，各個繼代培養下以及於CHA培養系統(亦即CHA)下的mADSCs初始地被以1 x 10⁴ /cm² 盛盤並且在誘發作用前予以培養3天。關於成骨誘導作用，mADSCs是被培養於添加有10 μg/mL胰島素、10 mM β－甘油磷酸(β－glycerophosphate)、100 nM地塞松(dexamethasone)與50 μg/mL抗壞血酸－2－磷酸酯(ascorbic acid－2－phosphate)的DMEM－10% FBS中歷時至少2週。對於定量成骨作用(osteogenesis)的程度，細胞被固定並以硝酸銀予以染色，該等鈣沉積區域是由10個顯微鏡視野所得且利用Sigma Scan Pro(SPSS Inc.)予以評估並計算出，對各個樣品為三重複。

5.統計分析 司徒頓t檢定(Student’s t test)被使用來計算p值(pvalues)。

實驗設計： I. mADSCs對HA反應之型態變化 在含HA的條件下(CHA)歷經1與5次繼代培養(分別 為P1以及P5)的mADSCs以前述的方法被收集及培育。mADSCs的細胞型態在第1與5次繼代培養時分別被檢視。

II. mADSCs對HA反應的增殖性生長期 被培養於對照組及CHA(5以及20 μg/cm² )培養系統內的mADSCs之增殖性生長期是如上述方法所述分別地藉由族群倍增的增加來作評估。在對照組中，予以執行3個獨立實驗，而在CHA5以及CHA20的各個組別中，予以執行2個獨立的實驗。

III.預先培養於CHA後之生命期延長 mADSCs初始地被培養於CHA20上歷經3以及5次繼代培養，接而被移種至對照組作為接續的培養。mADSCs在移種至對照組後之累計的族群倍增(cumulative population doublings)被計算出，並且相對於時間作圖，各個點代表一次繼代培養。在CHA_P3/C中予以執行3個獨立的實驗，在CHA_P5/C中，予以執行2個。

IV.在以HA預先條件化(pre－conditioning with HA)後的成骨潛力之保持作用(preservation of osteogenic potential) 受到不同的CHA處理(包括CHA5以及CHA20培養系統)而歷經1以及5次繼代培養的mADSCs被施以如前述的成骨性誘發作用。此外，被培養於對照組以及CHA20中歷經5次繼代培養的mADSCs，以及得自於CHA_P3/C於第7繼代培養(P3＋7)中的mADSCs被以成骨誘發培養基(osteogenic induction medium)培育歷時14天。細胞接而被 固定，而基質鈣化作用的程度是藉由硝酸銀染色而被檢測出，其中鈣沉積區域被顯示呈黑色。成骨作用(osteogenesis)的程度是如前所述係依據掃描AgNO₃ 正性區域來作定量。

結果： I. mADSCs對HA反應之型態變化 HA(CHA)的施用於培養mADSCs會改變增殖特性(altered proliferative behaviors)。被培養於CHA上的mADSCs甚至直到後來的繼代培養(P5)之後仍有形成細胞聚集體(cell aggregates)之傾向，然而被以懸浮的HA培養的mADSCs則是均勻地分散於培養表面上。有趣的是，相較於對照組，在CHA二者組別中較少的細胞在P5中被發現在型態上是衰老的。

II. mADSCs對HA反應的增殖性生長期 在各個條件下之mADSCs的增殖性生長期被比較於第一圖中。藉由CHA5以及CHA20，mADSCs會呈現一較為漸進的生長特性(growth profile)並且在P5之後的各個繼代培養中在細胞數上幾乎沒有增加。此外，細胞數目倍增或細胞週期的轉換(turnover)似乎隨著HA塗布之總量的增加而更緩慢(CHA20相對於CHA5)。

III.預先培養於CHA後之生命期延長 為了進一步闡明CHA的效果，初始地被培養於CHA20上歷經3次以及5次繼代培養的mADSCs(分別如第一圖的箭頭所指)接而被移種至正常培養表面，且被繼代培養。mADSCs的型態在移種之後仍保持纖維母細胞狀，歷經至 少5次繼代培養(P3＋5)，以及部分細胞相較於P3＋7，後者細胞較大以及較扁平(數據未顯示)。在CHA_P3/C組別中較高的△PD被觀察到，然而在CHA_P5/C組別中細胞的增殖明顯緩慢(如第二圖所示)。在CHA_P3/C組別中，mADSCs的生命期被顯示延長至6至10次繼代培養(如第二圖，向下箭頭以及向上箭頭所指)。例如，其中一個實驗中，mADSCs的生命期被延長至10次繼代培養，亦即36天(向下箭頭)，然而另一個實驗則僅延長至6個繼代培養，亦即18天(向上箭頭)。

IV.在以HA預先條件化(pre－conditioning with HA)後之成骨潛力保持作用 受到不同的HA處理而歷經1以及5次繼代培養的mADSCs被施以如前述的成骨性誘發作用。在P5的分化過程中，CHA組別的mADSCs(包括CHA5以及CHA20)在誘發作用後第14天有數量足以於硝酸銀染色後呈黑色而可視觀到的鈣沉積出(第三圖)。

進一步地，以CHA20予以預先培養並移種至對照組培養系統的mADSCs(CHA20_P3＋7)之成骨潛力(osteogenic potential)甚至在P3＋7中相較於未經預先培養之對照組仍是增加的(第四圖)。依據上述結果，經由CHA之預先培養的mADSCs顯示在繼代培養P3(第四圖)及P5(數據未顯示)後仍保留有成骨潛力，而且以HA預先予以條件化之組別(亦即以CHA預先培養之mADSCs組別)以及對照組之間的差異被顯示是顯著的(p至少<0.01)。

實施例2 人類胎盤衍生間葉幹細胞(human placenta－derived mesenchymal stem cells,hPDMSCs)對HA反應而改變的增殖行為

實驗材料與方法： 1.人類胎盤衍生間葉幹細胞的分離與培養 由健康人類捐贈者母體經剖腹產後收集第三期(third trimester)(38至40週GA,n>10)之胎盤組織。樣品是經知情同意而取得的，而且所有的實驗是為當地機關審查委員會所認可。羊膜以及蛻膜以人工方式予以分離；得自於胚胎部分的絨毛膜被切碎；並且接而使用膠原蛋白酶(200 U/mL,Sigma)於37℃於水浴中以溫和地迴轉式震盪方式予以降解歷時30分鐘。透過Percoll梯度(Percoll,Pharmacia Biotech)離心(密度＝1.073 g/cm³ )，單核細胞被純化並且予以繁殖於含有10%胎牛血清(Biological Industries)以及100單位/mL(units/mL)之健他黴素(gentamycin)(Biological Industries)的完全培養基(亦即杜氏改良英格爾培養基－低量葡萄糖)(Dulbecco’s modified Eagle’s medium－low glucose,DMEM－LG,Invitrogen)中以2x10⁴ 細胞/cm² (cells/cm² )盛盤。細胞於大氣壓下以5% CO₂ 進行培育。在初始盛盤後14天，群落(colonies)被收集並且繼代培養於正常培養表面上用以擴增(expansion)。

2.培養於正常的與含HA培養條件下的hPDMSCs HA溶液藉由將HA粉末(M.W.＝1X10⁶ Da,Genzyme)溶解於ddH₂ O中予以製備出，之後予以分裝並儲存於－80 ℃。CHA3是藉由將HA予以直接塗布於正常培養表面上之方式接而於加熱板上以45℃予以乾燥歷時至少30分鐘之方式所製備出(Huang－Lee and Nimni,(1994),Matrix Biol .14：147－57)，其中數字是代表每平方公分HA塗料的微克數(number of micrograms)(在此實施例中是3μg/cm² )。HA塗覆之效果可進一步藉由艾爾遜藍染色予以確認。在將前述CHA培養系統使用於hPDMSCs之前，係利用臭氧予以滅菌。

3. hPDMSCs的連續繼代培養 形成均勻群落的hPDMSCs在初始盛盤後14天被收集，接而被分成兩個部分，分別予以繁殖於正常的培養表面以及CHA上。在此之後，細胞以3天為間隔進行繼代培養之方式，培養歷時3週。每次繼代培養細胞之數目係以細胞計數儀予以測定。

3.增殖速率的量測 在第4次繼代培養中，處於指數生長期的hPDMSCs以胰蛋白酶予以處理，以從正常培養表面產生單細胞的懸浮液，並且再次以1X10⁴ 細胞/cm² 的細胞密度予以盛盤於對照組或各種CHA培養系統中，接而於37℃培育。△PD係如前述之方法被計算出並予以作圖。

5.統計學分析 所有數據是以上述三重複的結果之平均值以及平均標準差予以記載。統計性比較是藉由針對未成對樣品之變數單向分析(one－way analysis of variance,ANOVA)所做出，p 值差異小於0.05者被認為是具有顯著性。

實驗設計： I.長期培養於CHA培養系統的hPDMSCs之增殖特性 HA塗覆之效果藉由艾爾遜藍染色予以確認，可發現當表面含有3 μg/cm² 或更多之HA時，HA會形成一覆蓋於該正常培養表面的薄層(數據未顯示)。因此，選擇CHA3與正常培養表面(作為對照組)作為培養系統以進行hPDMSC之增殖比較。hPDMSCs是以1X10⁴ 細胞/cm² 的細胞密度予以播種。族群倍增的增加(△PD)是藉由前述方式予以計算。

結果： I.長期培養於CHA培養系統的hPDMSCs之增殖特性 hPDMSCs之累計的族群倍增在本實施例中的初始值約為10。在為期3週的培養期間，該累計的族群倍增是藉由細胞計算的方式予以量測，並且被顯示於第五圖。生長於CHA3的hPDMSCs之細胞數目的恆定增加指出這些細胞係保持其增殖特性。

討論 就mADSCs而言，申請人研究CHA對於mADSCs的影響，並且觀察在整個培養期間細胞聚集體的形成係伴隨有一非常緩慢的生長特性。移種培養(CHA_P3/C以及CHA_P5/C)被執行，且其中CHA_P3/C組別的mADSCs展現一培養生命期之進一步的延長，而CHA_P5/C組別的 mADSCs則展現mADSCs之可能的休眠狀態，其中該休眠狀態是利用與CHA一起培育之方式所促進產生。此二者條件皆可以保持mADSCs的增殖以及分化潛力。

就hPDMSCs而言，申請人證實CHA會降低hPDMSCs的增殖，但不影響hPDMSCs的增殖活性，甚至在長期連續的繼代培養亦是。這些研究的結果顯示HA係可供作為MSC的培養基質，用以於活體外使它們保持於緩慢的細胞週期之狀態(slow cell－cycling status)。

另外，申請人亦曾研究比較多醣及它們的衍生物與蛋白質類ECM組分的效力。位於經HA－塗布之培養表面與位於經膠原蛋白－塗布的培養表面上之人類ADSCs(hADSCs)的增殖速率被比較。結果顯示位於經膠原蛋白－塗布的培養表面之hADSCs比位於經HA－塗布的培養表面者為快速。這些結果進一步證實諸如膠原蛋白之蛋白質類ECM組分不但未保持反而會促進hADSCs的增殖以及分化作用，這些結果與被報導於WO2008/007082 A2中者相符合。

HA可以從動物組織、植物組織、或微生物分泌，抑或藉由遺傳工程方法所製得。相對地，如果基於疾病傳播之考量，要利用遺傳工程來大量產製膠原蛋白是困難的。這是因為原膠原蛋白(tropocollagen)基因是非常長的，且一天然的膠原蛋白分子含有三股相互交纏長鏈，其大量產製要藉由現今的遺傳工程技術來達成是十分困難的。相較於膠原蛋白，用於製備包括HA的多醣的工業技術是十分成熟的。因此，使用取自於動物以外的來源或藉由遺傳工程 所得之依據本發明的多醣來保持未分化細胞之增殖以及分化潛力係可以減少疾病傳播的問題。

綜上所述，將HA引入一培養系統中可以被使用來於活體外擴增諸如間葉細胞的未分化細胞，而不會使它們喪失複製能力(replicative ability)以及分化能力(differentiation capacity)。本發明提供用於利用經固定的非蛋白質類ECM組分(immobilized non－proteinaceous ECM component)來保持未分化細胞之增殖以及分化潛力之方法，它們對於再生醫學以及組織工程而言是非常有用的。

所有被引述於說明書中的專利、專利申請案以及文獻在此以其整體被併入本文作為參考。任何與說明書揭示內容(包括文中之定義)不一致之處，皆以本文之揭示為主。

儘管本發明的數個特性及優點以及本發明詳細的特徵已經被陳述於前述的說明之中，該等揭示內容僅只作為例示用。在本發明之原則至附屬的申請權利範圍中所使用的術語之廣泛的一般意涵所指出的範圍內之任何細節的改變以及修飾可以被作出。

第一圖顯示分別培養於對照組(正常培養表面)、CHA5以及CHA20(經塗布有5以及20 μg/cm² 的HA的正常培養表面)培養系統中的mADSCs的增殖性生長期上之mADSCs。

第二圖顯示mADSCs因應於從CHA20至對照組培養 系統之移種培養的增殖性生長期。

第三圖顯示來自於對照組、CHA5以及CHA20培養系統之第五代mADSCs的成骨潛力之硝酸銀染色圖。

第四圖顯示來自於對照組(在第5次繼代培養之mADSCs)以及CHA20_P3＋7(mADSCs初始地被培養於CHA20歷經3次繼代培養，接而被移種至正常培養表面歷經另外7次繼代培養)的成骨潛力。

第五圖顯示在長期培養中位於CHA3(經塗布有3 μg/cm² 的HA之正常培養表面)上的hPDMSCs之增殖特性。

Claims (18)

1. 一種用於保持未分化細胞的增殖以及分化潛力之方法，其包含下列步驟：提供一培養載體，其中該培養載體具有塗布有一生物材料的一表面，該生物材料是選自於由多醣、經硫酸化多醣以及它們的衍生物所構成的群組；以及使用一適當的培養基，將該未分化細胞殖種並培養於該培養載體塗布有該生物材料的表面上，其中該生物材料是選自於由下列者所構成的群組：玻尿酸或它的衍生物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該未分化細胞是選自於由下列者所構成的群組：幹細胞、基質細胞、組織前趨細胞以及間葉細胞。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該未分化細胞是間葉幹細胞。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該間葉幹細胞是選自於下列者所構成的群組：脂肪衍生基質細胞、脂肪衍生幹細胞、胎盤衍生幹細胞以及骨髓衍生幹細胞。
5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該未分化細胞是脂肪衍生基質細胞。
6. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該未分化細胞是胎盤衍生幹細胞。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該適當的培養基實質上缺少該生物材料，以令該未分化細胞的增殖以及分化潛力皆被保持。
8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括將 該未分化細胞繼代培養於一另一培養載體。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該另一培養載體具有一塗布有該生物材料的表面，並且該未分化細胞係被培養於該表面上。
10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.01ng/cm² 至200mg/cm² 的生物材料。
11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.01μg/cm² 至10mg/cm² 的生物材料。
12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.1ng/cm² 至1mg/cm² 的生物材料。
13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.5μg/cm² 至200μg/cm² 的生物材料。
14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中生物材料具有一平均分子量落在1KDa至20,000KDa範圍內。
15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中生物材料具有一平均分子量落在10KDa至15,000KDa範圍內。
16. 一種培養載體用以保持未分化細胞增殖以及分化潛力之用途，其中該培養載體具有一表面，該表面係塗布一生物材料，其中該生物材料是選自於由下列者所構成的群組：玻尿酸或它的衍生物。
17. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.1ng/cm² 至200mg/cm² 之間的生物材料。
18. 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該表面是被塗布以一數量介於大約0.01μg/cm² 至10mg/cm² 之間的生物材料。