CN103784960A

CN103784960A - 使用乙酰透明质酸的治疗方案

Info

Publication number: CN103784960A
Application number: CN201310690770.9A
Authority: CN
Inventors: T·J·布朗
Original assignee: Alchemia Oncology Pty Ltd
Current assignee: Alchemia Oncology Pty Ltd
Priority date: 2005-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2014-05-14
Also published as: EP1912658B1; JP5465431B2; CA2616607C; AU2006274509A1; CA2616607A1; JP2009502813A; AU2006274509B2; CN101287474B; US20090054537A1; WO2007012133A1; CN101287474A; EP1912658A1; EP1912658A4; US8937052B2

Abstract

本发明概括地涉及治疗剂、尤其是化疗领域。更具体地，本发明提供了可以降低化疗剂的毒性或增强化疗剂的效能的治疗策略。本发明也包括组合物，治疗和预防方法。

Description

使用乙酰透明质酸的治疗方案

本分案申请是基于申请号为200680035079.5，申请日为2006年7月27日，发明名称为“使用乙酰透明质酸的治疗方案”的原始中国专利申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明概括地涉及治疗剂领域，更具体地，涉及用作治疗剂的化疗剂和制剂。更具体地，本发明提供了可以降低治疗剂的毒性或增强治疗剂的效能的治疗策略。本发明也包括组合物、治疗和预防方法以及治疗方案。

现有技术

本说明书中对任意现有技术的参改不视为且不应视为承认或任何形式的提示：现有技术构成任意国家普通的一般知识的一部分。

药物毒性是治疗性化合物给药的主要限制。为了在病理部位处和内部达到和维持活性药物物质的治疗浓度，必须施用高剂量的化疗剂。系统毒性经常是最终的结果，因此在减轻系统毒性的尝试中，临床医生会施用亚适量的治疗剂，其中治疗活性的药物剂量和无毒的药物剂量之间存在复杂平衡。作为该妥协的、但是平衡的用药法的结果，患者中经常可以获得亚适量的给定治疗化合物的治疗血清水平。观察到的毒性可能导致给药频率、给药数量或给药周期数目的限制。

与显著毒性有关的一种这样的治疗物质的实例是盐酸依立替康(CPT-11;Camptosar.CPT-11)，它是喜树碱（最初从喜树分离出来的一种具有抗肿瘤活性的植物生物碱）的一种水溶性衍生物。CPT-11具有广谱的抗肿瘤活性，且已经证实可以有效地治疗难治的结肠直肠癌，为此已经在世界范围内批准了CPT-11的化疗。

在CPT-11化疗过程中，主要剂量限制毒性是延迟的腹泻和骨髓抑制。骨髓抑制是一种其中骨髓活性降低的状况。该状况会导致更少的红细胞、白细胞和血小板，这通常显示为降低的免疫系统和对原发和继发细菌和/或真菌感染的更高患病率。骨髓抑制的持续时间可以部分地受粒细胞集落刺激因子给药的控制，但是该治疗方案代表高成本的治疗以及对于患者而言侵害性且长期的住院。腹泻会影响生命质量，当与骨髓抑制并发时，会威胁生命。

CPT-11在体内会被肝羧酸酯酶转化，形成有活性的代谢物SN-38，即拓扑异构酶I的一种有效抑制剂，DNA复制和转录过程中的一种关键的核酶。在肝中，SN-38的一部分会经历UDP-葡萄糖醛酸转移酶系统的葡萄苷酸化的随后解毒，形成无活性的SN-38G。胆汁分泌代表CPT-11和它的代谢物的主要消除途径。SN-38G在肠中通过细菌或组织β-葡糖醛酸糖苷酶介导的对SN-38的切割而去轭合后，导致对肠的局部刺激和毒性(Takasuna等Cancer Res56:3752-3757,1996)。从肠中，CPT-11和它的代谢物也可以通过肠细胞重吸收，并形成肠肝再循环环路(Takasuna等1996同上)。

因此，尽管目前可以得到治疗剂，其在最佳剂量施用时，能治疗疾病，例如癌症，病原体感染，疼痛的治疗，胃肠障碍，和神经学病症以及许多其它的病症，仍然需要能减少虚弱副作用和/或促进特别有效形式的治疗剂的产生的组合物和治疗策略。

发明内容

在本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”或变体例如“包括”，应当理解为包括所述元素或整体、或元素或整体的组，但是不排除任何其它的元素或整体，或者元素或整体的组。

本发明部分地基于下述测定，即透明质酸（在本文中也称作乙酰透明质酸或HA、或它的化学修饰的衍生物）调控酶的水平或活性，所述酶产生治疗剂的有毒代谢物或它们的前药形式，或产生更有效形式的治疗剂。另外，乙酰透明质酸或HA、或它的化学修饰的衍生物可以调控负责这些药物或它们的代谢物的再吸收、运输和排泄的蛋白。因此，提出了同时或以任意次序连续地施用HA和治疗剂。

所述治疗剂可以是抗癌剂、抗病原体剂或表现或赋予有益治疗效果的任意治疗剂，例如在糖尿病、神经学病症、疼痛处理和胃肠障碍的治疗中。″有益治疗效果″包括疾病或病症的一种或多种症状的改善。术语″化疗剂″不应理解为将该试剂限制为任意特定类型的试剂(例如仅仅抗癌剂)。应当广义地理解为覆盖化学或蛋白性质的任意治疗剂。术语″化疗剂″和″治疗剂″在本文中视作同义词，并互换使用。

本发明令人惊奇地证实，包含特别低分子量HA作为用于治疗疾病的制剂的组分导致胃肠道中毒性水平的降低，同时改变药物的药效学，其中最终结果是循环中毒性药物或它们的代谢物的减少。

因此，本发明提供了一种治疗方法，其包含施用包含乙酰透明质酸(HA)和治疗剂的制剂，其中所述制剂或其组分会调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，降低胃肠毒性。

本发明的另一个方面提供了一种治疗方法，其包含施用包含乙酰透明质酸(HA)和治疗剂的制剂，其中所述制剂或其组分调控药物转运蛋白的活性，这样的阳离子交换蛋白称作cMOAT，它导致毒性药物或它们的代谢物的降低的循环水平；即具有降低的骨髓毒性的最终治疗效果的临床表现。

更具体地，所述治疗方法包含施用制剂，其中调控β-葡糖醛酸糖苷酶在消化道中的生物活性。

在一个具体的实施方案中，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量是约1kDa至约1000kDa。

在另一个具体的实施方案中，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量是约1kDa至约100kDa。

在另一个具体的实施方案中，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量是约350Da至约10kDa。

另一个具体的实施方案包括，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量是约350Da至约5kDa。

在另一个具体的实施方案中，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量是约350Da至约2kDa。

更具体地，所述治疗方法包含施用制剂，所述的制剂包含分子量约350-9500Da的乙酰透明质酸(HA)和降低胃肠道中毒性水平的治疗剂，其中所述HA调控胃肠道中β-葡糖醛酸糖苷酶的活性。

更具体地，所述治疗方法包含施用制剂，其包含:

(i)平均分子量约10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

其中所述制剂调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，降低胃肠毒性。

更具体地，所述治疗方法包含施用制剂，其包含:

(i)平均分子量约2kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

更具体地，在施用所述治疗剂之前或之后施用HA。

更具体地，在施用所述治疗剂之前施用HA。

更具体地，在施用所述治疗剂之后施用HA。

更具体地，口服施用平均分子量约10kDa的HA。

更具体地，口服施用平均分子量约2kDa的HA。

更具体地，全身施用平均分子量约860kDa的HA。

更具体地，所述治疗剂是β-葡糖醛酸糖苷酶的底物。

更具体地，所述治疗剂含有葡萄糖醛酸苷部分。

更具体地，所述治疗剂被代谢形成葡萄糖醛酸苷轭合物。

优选地，所述葡萄糖醛酸苷选自：吗啡-3-葡萄糖醛酸苷,吗啡-6-葡萄糖醛酸苷,石胆酸葡萄糖醛酸苷,D-葡萄糖醛酸苷,雌酮-3-葡萄糖醛酸苷,维甲酰葡萄糖醛酸苷,imboxyl-β-D-多柔比星葡萄糖醛酸苷,雄烷二醇葡萄糖醛酸苷和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸苷。

优选地，所述化疗剂选自：柔红霉素,道诺霉素,更生霉素,多柔比星,表柔比星,伊达比星,依索比星,博来霉素,马磷酰胺,异磷酰胺,阿糖胞苷,双氯乙基硝基脲,白消安,丝裂霉素C,放线菌素D,光辉霉素,泼尼松,羟孕酮,睾酮,他莫昔芬,达卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲蜜胺,五甲蜜胺,米托蒽醌,安吖啶,苯丁酸氮芥,甲基环己基硝基脲,氮芥,美法仑,环磷酰胺,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氮杂胞苷,羟基脲,脱氧柯福霉素,4-羟基过氧基-环磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-FU),5-氟脱氧尿苷(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),奥沙利铂,多柔比星,秋水仙素,紫杉醇,长春新碱,长春碱,依托泊苷(VP-16),三甲曲沙,依立替康,托泊替康,吉西他滨,替尼泊苷,顺铂,己烯雌酚(DES)和其葡萄糖醛酸苷轭合物。

优选地，所述化疗剂选自化疗化合物，包括抗代谢物,抗肿瘤抗生素,有丝分裂抑制剂,甾族化合物,激素,烷化剂,氮芥,亚硝基脲,激素激动剂和微管抑制剂。其它有用的治疗剂包括来自生物来源（例如植物、珊瑚或微生物）的提取物或纯化分子。来自植物的抗癌剂以分离形式或作为级分或提取物是特别有用的。

本发明的另一个方面提供了一种治疗方法，其包含施用包含乙酰透明质酸(HA)和治疗剂的制剂，其中所述制剂或其组分调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，增强药物激活。

本发明的另一个方面提供了一种治疗方法，其包含施用包含乙酰透明质酸(HA)和治疗剂的制剂，其中所述制剂调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，减少骨髓抑制。

优选地，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约1000kDa。

优选地，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约100kDa。

优选地，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约10kDa。

优选地，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约5kDa。

优选地，所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约2kDa。

优选地，所述治疗方法包含施用制剂，其包含:

(i)平均分子量约10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

其中所述制剂调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，减少骨髓抑制。

优选地，所述治疗方法包含施用制剂，其包含:

(i)平均分子量约2kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

优选地，在施用所述治疗剂之前或之后施用HA。

优选地，在施用所述治疗剂之前施用HA。

优选地，在施用所述治疗剂之后施用HA。

优选地，口服施用HA。

优选地，口服施用平均分子量约10kDa的HA。

优选地，口服施用平均分子量约2kDa的HA。

优选地，全身施用HA。

优选地，全身施用平均分子量约860kDa的HA。

优选地，所述治疗剂含有葡萄糖醛酸苷部分。

优选地，所述葡萄糖醛酸苷选自：吗啡-3-葡萄糖醛酸苷,吗啡-6-葡萄糖醛酸苷,石胆酸葡萄糖醛酸苷,雌酮-3-葡萄糖醛酸苷,维甲酰葡萄糖醛酸苷,imboxyl-β-D-葡萄糖醛酸苷,多柔比星葡萄糖醛酸苷,雄烷二醇葡萄糖醛酸苷和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸苷。

优选地，所述试剂是选自下述的化疗剂：柔红霉素,道诺霉素,更生霉素,多柔比星,表柔比星,伊达比星,依索比星,博来霉素,马磷酰胺,异磷酰胺,阿糖胞苷,双氯乙基硝基脲,白消安,丝裂霉素C,放线菌素D,光辉霉素,泼尼松,羟孕酮,睾酮,他莫昔芬,达卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲蜜胺,五甲蜜胺,米托蒽醌,安吖啶,苯丁酸氮芥,甲基环己基硝基脲,氮芥,美法仑,环磷酰胺,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氮杂胞苷,羟基脲,脱氧柯福霉素,4-羟基过氧基-环磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-FU),5-氟脱氧尿苷(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),奥沙利铂,多柔比星,秋水仙素,紫杉酚,长春新碱,长春碱,依托泊苷(VP-16),三甲曲沙,依立替康,托泊替康,吉西他滨,替尼泊苷,顺铂,己烯雌酚(DES)和其葡萄糖醛酸苷轭合物。

优选地，所述试剂是选自下述化疗化合物的化疗剂，包括抗代谢物,抗肿瘤抗生素,有丝分裂抑制剂,甾族化合物,激素,烷化剂,氮芥,亚硝基脲,激素激动剂和微管抑制剂。

优选地，包含根据本发明制剂的药物组合物用于治疗癌症。

本文提及的″治疗″包括预防和改善一种或多种症状。

附图简述

图1中的图解表示证实了<2kDa HA对胃肠道组织上β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。

图2中的图解表示证实了<2kDa HA对胃肠道组织中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。

图3中的图解表示证实了当以60mg/kg的剂量施用依立替康时，HA剂量调控对SN-38的组织分布的影响。

图4中的图解表示证实了当以60mg/kg的剂量施用依立替康时，HA剂量调控对SN-38G的组织分布的影响。

图5中的图解表示证实了在依立替康(30:空心正方形)之前15分钟单次静脉内注射依立替康(30:空心圆圈)、HyCAMP^TM(26.6/30:实心三角)和HA(26.6)后，CPT-11(a)、SN-38(b)、SN-38G(c)和APC(d)的累积胆汁分泌。每个值代表平均值±SEM，其中n=6，除非另有说明。(a)与依立替康组相比，p≤0.05。

图6中的图解表示证实了单次静脉内注射依立替康(60:空心圆圈)、HyCAMP^TM(26.6/60:实心三角)后，CPT-11(a)、SN-38(b)、SN-38G(c)和APC(d)的累积胆汁分泌。每个值代表平均值±SEM。(a):与依立替康组相比，p≤0.05。

图7中的图解表示证实了在依立替康(30:空心正方形)之前15分钟单次静脉内注射依立替康(30:空心圆圈)、HyCAMP^TM(26.6/30:实心三角)和HA(26.6)后，CPT-11(a)、SN-38(b)、SN-38G(c)和APC(d)的累积肠外吸渗。每个值代表平均值±SEM，其中n=6，除非另有说明。(a)&(b)与依立替康组相比，p≤0.05;(c)与依立替康前15分钟HA相比，p≤0.05。

图8中的图解表示证实了在依立替康(30:空心正方形)之前15分钟单次静脉内注射依立替康(60:空心圆圈)、HyCAMP^TM(26.6/60:实心三角)和HA(26.6)后，CPT-11(a)、SN-38(b)、SN-38G(c)和APC(d)的累积肠外吸渗。每个值代表平均值±SEM。(a):与依立替康组相比，p≤0.05。

图9中的图解表示显示了860kDa HA对肿瘤细胞内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。

图10中的图解表示显示了10kDa HA对肿瘤细胞内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。

图11中的图解表示显示了<2kDa HA对肿瘤细胞内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。

图12中的图显示了CPT-11的代谢途径。

图13中的用照片显示了长期暴露于依立替康和HyCAMP^TM的大鼠的盲肠形态学的变化。大鼠每日接受依立替康(60.0)或HyCAMP^TM(26.6/60.0)注射。在实验结束时，处理胃肠道的一部分。图A,D和G:接受乙酰透明质酸的大鼠的显微照片;图B,E和H:接受依立替康的大鼠的显微照片;图C,F和I:接受HyCAMP^TM的大鼠的显微照片。注意到依立替康和HyCAMP^TM(分别是图B和C)之间粘膜隐窝的一般形态学变化。HyCAMP^TM处理过的盲肠类似于在对照组(图A)中观察到的那些。

发明详述

本发明部分地基于下述测定，即透明质酸（HA）改变治疗剂的代谢。″改变″在本上下文中是指调控，因为在有些情况下，会抑制将治疗剂或它们的前药形式代谢成有毒产物或中间体的酶。结果，与在没有HA情况下施用该试剂相比，存在治疗剂的降低水平的有毒代谢副产物。在其它情况下，会升高产生更高活性的治疗性代谢副产物的酶的水平，从而与在没有HA情况下施用该试剂相比，增强施用的试剂或它的前药形式的效能。

术语″治疗剂″和″化疗剂″在本文中视作同义术语，在本说明书中互换使用。这些术语应当以它们的最广含义理解为包括用于诱导、表现或赋予治疗事件或益处的任意化学或顽固分子。治疗剂可以是非天然存在的化合物，例如抗癌剂或抗病原体剂。或者，化疗剂是抗生素或重组分子。在一个具体的实施方案中，所述化疗剂是葡糖醛酸糖苷酶（例如β-葡糖醛酸糖苷酶）的底物。术语″底物″在本上下文中是指，葡糖醛酸糖苷酶能催化化疗剂的代谢变化。根据该方面，本发明为受试者提供了一种治疗方案，其中所述治疗方案包含施用化疗剂或前药形式的所述治疗剂，所述方法包含，在施用治疗剂或它的前药形式之前、过程中或之后，给所述受试者施用有效调控酶的水平或活性量的HA或其衍生物，与在没有HA情况下施用该治疗剂相比所述酶会使治疗剂或它的前药形式有毒或更有活性。

应当理解，除非另有说明，本发明不限于组分的特定制剂,生产方法,给药方案等，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制。

另外，如在本说明书中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数方面，除非上下文另有清楚说明。因而，例如，提及的″一种化疗剂″、″一种抗癌剂″、″该透明质酸″等包括单一物质(即单一的抗癌剂、化疗剂或透明质酸)以及2种或更多种物质。

术语″HA″以它的最普通的含义使用，并也称作透明质酸钠,乙酰透明质酸或透明质酸。所有这些术语可以用于描述同一实体。粘多糖存在于哺乳动物体的每个部分中，是哺乳动物结缔组织的主要组分。在生理条件下，HA可以、尤其是将水吸收进胞间隙，形成″胶状基质″。在体内，这用于保护细胞结构，并防御免受外部损伤、细菌感染等。

本发明也提供了组合物，其包含一种或多种抗癌抗体和HA的衍生物、片段和/或盐。HA的许多衍生物和片段已经描述在文献中，意在包括在本发明的方法和制剂中。

示例性的HA衍生物是在美国专利号6,620,927(巯基修饰的透明质酸衍生物);美国专利号6,552,184(透明质酸和其衍生物的交联化合物);美国专利号6,579,978(透明质酸的硫酸化化合物和其衍生物);美国专利号6,831,172(交联的透明质酸和其半琥珀酰化衍生物);美国专利号6,027,741(硫酸化的透明质酸和其酯);欧洲专利号0 138 572(透明质酸片段HYALECTIN和HYALASTINE)中描述的那些。

Falk的更早的专利(例如US 5852002;US 6069135)将透明质酸定义为天然存在的糖胺聚糖（glycosaminoglucan），它的分子量可以从50,000Da向上。Fidia的专利(例如EP 01 3852)公开了称作HYALASTINE的分子量为约50kDa-100kDa的透明质酸，它具有用于促进伤口愈合的局部用材料所需的特征。Fidia等人也公开了包含小于30kDa的级分的低分子量材料。但是，这些级分作为杂质被抛弃，因此没有教导作为本发明所述制剂的用途。国际专利申请号WO 00/41730和WO02/05852,例如，主要涉及分子量超过750kDa的HA的用途。尽管WO 02/05852描述了几种低分子量乙酰透明质酸(例如四糖,己糖和十二糖,以及5600Da和50,000Da的HA),这些低分子量乙酰透明质酸用于测定HA对细胞周期的影响。这些现有技术都没有公开小于10,000Da的HA在降低毒性水平和/或改善骨髓抑制方面的用途。令人惊奇地，本发明的HA包括分子量远小于50,000Da、特别是小于10,000Da、优选约2000Da的级分。它们可以有利地降低在胃肠道中的毒性和/或改善骨髓抑制。

因此，本发明扩展至HA的用途，所述HA具有约350Da至1000kDa分子量，例如350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,501,502,503,504,505,506,507,508,509,510,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535,536,537,538,539,540,541,542,543,544,545,546,547,548,549,550,551,552,553,554,555,556,557,558,559,560,561,562,563,564,565,566,567,568,569,570,571,572,573,574,575,576,577,578,579,580,581,582,583,584,585,586,587,588,589,590,591,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623,624,625,626,627,628,629,630,631,632,633,634,635,636,637,638,639,640,641,642,643,644,645,646,647,648,649,650,651,652,653,654,655,656,657,658,659,660,661,662,663,664,665,666,667,668,669,670,671,672,673,674,675,676,677,678,679,680,681,682,683,684,685,686,687,688,689,690,691,692,693,694,695,696,697,698,699,700,701,702,703,704,705,706,707,708,709,710,711,712,713,714,715,716,717,718,719,720,721,722,723,724,725,726,727,728,729,730,731,732,733,734,735,736,737,738,739,740,741,742,743,744,745,746,747,748,749,750,751,752,753,754,755,756,757,758,759,760,761,762,763,764,765,766,767,768,769,770,771,772,773,774,775,776,777,778,779,780,781,782,783,784,785,786,787,788,789,790,791,792,793,794,795,796,797,798,799,800,801,802,803,804,805,806,807,808,809,810,811,812,813,814,815,816,817,818,819,820,821,822,823,824,825,826,827,828,829,830,831,832,833,834,835,836,837,838,839,840,841,842,843,844,845,846,847,848,849,850,851,852,853,854,855,856,857,858,859,860,861,862,863,864,865,866,867,868,869,870,871,872,873,874,875,876,877,878,879,880,881,882,883,884,885,886,887,888,889,890,891,892,893,894,895,896,897,898,899,900,901,902,903,904,905,906,907,908,909,910,911,912,913,914,915,916,917,918,919,920,921,922,923,924,925,926,927,928,929,930,931,932,933,934,935,936,937,938,939,940,941,942,943,944,945,946,947,948,949,950,951,952,953,954,955,956,957,958,959,960,961,962,963,964,965,966,967,968,969,970,971,972,973,974,975,976,977,978,979,980,981,982,983,984,985,986,987,988,989,990,991,992,993,994,995,996,997,998,999,1000Da和1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,268,269,270,271,272,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292,293,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,304,305,306,307,308,309,310,311,312,313,314,315,316,317,318,319,320,321,322,323,324,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,335,336,337,338,339,340,341,342,343,344,345,346,347,348,349,350,351,352,353,354,355,356,357,358,359,360,361,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,377,378,379,380,381,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,402,403,404,405,406,407,408,409,410,411,412,413,414,415,416,417,418,419,420,421,422,423,424,425,426,427,428,429,430,431,432,433,434,435,436,437,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,460,461,462,463,464,465,466,467,468,469,470,471,472,473,474,475,476,477,478,479,480,481,482,483,484,485,486,487,488,489,490,491,492,493,494,495,496,497,498,499,500,501,502,503,504,505,506,507,508,509,510,511,512,513,514,515,516,517,518,519,520,521,522,523,524,525,526,527,528,529,530,531,532,533,534,535,536,537,538,539,540,541,542,543,544,545,546,547,548,549,550,551,552,553,554,555,556,557,558,559,560,561,562,563,564,565,566,567,568,569,570,571,572,573,574,575,576,577,578,579,580,581,582,583,584,585,586,587,588,589,590,591,592,593,594,595,596,597,598,599,600,601,602,603,604,605,606,607,608,609,610,611,612,613,614,615,616,617,618,619,620,621,622,623,624,625,626,627,628,629,630,631,632,633,634,635,636,637,638,639,640,641,642,643,644,645,646,647,648,649,650,651,652,653,654,655,656,657,658,659,660,661,662,663,664,665,666,667,668,669,670,671,672,673,674,675,676,677,678,679,680,681,682,683,684,685,686,687,688,689,690,691,692,693,694,695,696,697,698,699,700,701,702,703,704,705,706,707,708,709,710,711,712,713,714,715,716,717,718,719,720,721,722,723,724,725,726,727,728,729,730,731,732,733,734,735,736,737,738,739,740,741,742,743,744,745,746,747,748,749,750,751,752,753,754,755,756,757,758,759,760,761,762,763,764,765,766,767,768,769,770,771,772,773,774,775,776,777,778,779,780,781,782,783,784,785,786,787,788,789,790,791,792,793,794,795,796,797,798,799,800,801,802,803,804,805,806,807,808,809,810,811,812,813,814,815,816,817,818,819,820,821,822,823,824,825,826,827,828,829,830,831,832,833,834,835,836,837,838,839,840,841,842,843,844,845,846,847,848,849,850,851,852,853,854,855,856,857,858,859,860,861,862,863,864,865,866,867,868,869,870,871,872,873,874,875,876,877,878,879,880,881,882,883,884,885,886,887,888,889,890,891,892,893,894,895,896,897,898,899,900,901,902,903,904,905,906,907,908,909,910,911,912,913,914,915,916,917,918,919,920,921,922,923,924,925,926,927,928,929,930,931,932,933,934,935,936,937,938,939,940,941,942,943,944,945,946,947,948,949,950,951,952,953,954,955,956,957,958,959,960,961,962,963,964,965,966,967,968,969,970,971,972,973,974,975,976,977,978,979,980,981,982,983,984,985,986,987,988,989,990,991,992,993,994,995,996,997,998,999,1000Da，包括其间的分子量。

除了HA的片段和衍生物以外，合成衍生物和/或半合成衍生物可以用于本发明的方法和组合物中。HA的示例性的半合成衍生物是HA与脂族、芳族、杂环和环脂族系醇的酯，称作″HYAFF″，它们描述在美国专利号4,851,521,4,965,353,和5,202,431,EP 0 341 745和EP0 216 453中。每篇上述专利的内容在本文中特别引作参考。

本文使用的术语″受试者″指可以从本发明的组合物和方法获益的动物，优选哺乳动物，更优选人。对于可以从本方法获益的动物的类型没有限制。受试者（无论人或非人动物）可以称作个体，受试者,动物，宿主或受体。本发明的方法可以应用于人药、兽药以及一般的驯养或野生动物饲养业。优选地，候选受试者是哺乳动物，例如人或实验室动物例如小鼠,大鼠,兔子,豚鼠,仓鼠或禽类例如家禽。

乙酰透明质酸是一种由交替的葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺单元组成的未分支的多糖。作为一种聚合分子，HA分子可以表现出许多分子量。因此，HA制剂可以包含不同分子量的分子。几乎HA的模态分子量制剂的任意平均量都在本发明的方法中是有效的，并且本发明不限于任何特定大小或大小范围的HA。HA的最小单位是分子量397Da的二糖。更高的糖是该二糖单元的多倍体，且分子量是(n-1x379)+397的倍数，因而四糖(2个最小单元,n=2)具有776的分子量等。优选地，n是约5至约2200。由于高分子量乙酰透明质酸会代谢或生物降解成低分子量乙酰透明质酸，我们预测根据本发明可以使用任意平均分子量的乙酰透明质酸。

本文使用的术语例如″透明质酸″、″乙酰透明质酸″、″HA″等也包括HA的化学或聚合或交联衍生物。可以对HA进行的化学修饰的实例包括，试剂与HA的4个反应基团(即:乙酰氨基,羧基,羟基和还原末端)的任意反应。

如上所述，HA和化疗剂可以作为单一组合物施用，其中两种物质混合在一起，或在治疗剂中包埋HA。或者，HA和治疗剂以任意次序分开施用，彼此间隔数秒、数分钟、数小时、数天或数周。因此，以任意次序同时和连续施用HA和治疗剂构成本发明的一部分。

本发明延伸至癌症以及许多其它病症的治疗，例如许多细菌、真菌、酵母、病毒和寄生物的感染。病原体的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV),乙型肝炎病毒(HBV),丙型肝炎病毒(HCV),原形体和多抗性葡萄球菌（stephylococcus）。

其它疾病状况包括治疗疼痛(急性和/或神经性疼痛),糖尿病,胃肠障碍(例如腹泻)和神经学病症，包括帕金森病,阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏舞蹈病。实际上，本发明包括其中可以施用葡萄糖醛酸苷来示踪或表现病症的任意疾病状况。

但是，在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。提及的″癌症″包括肿瘤、肉瘤、癌等。

因此，本发明的另一个方面包括治疗具有癌症受试者的方法，所述方法包含，在施用抗癌化疗剂或其前药形式之前、过程中或之后，给所述受试者施用有效调控酶的活性水平量的HA或其衍生物，与在没有HA情况下施用该治疗剂相比所述酶会使抗癌化疗剂或它的前药形式有毒或更具活性。

如上所述，″抗癌化疗剂″的表述包括对多种（即2种或更多种）治疗剂的表述。在一个优选的实施方案中，所述化疗剂是葡糖醛酸糖苷酶的底物，在最优选的实施方案中是葡萄糖醛酸苷。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了治疗或预防受试者中“实体瘤”的生长和/或转移的方法。本文使用的“实体瘤”指正在或已经以失控方式生长形成肿瘤的一个或多个细胞，这些细胞无任何分化成为专门化的和不同的细胞。本文使用的术语“实体瘤”包括但不限于“癌”、“腺癌”和“肉瘤”。“肉瘤”是结缔组织、软骨、骨、肌肉等的癌症。“癌”是上皮细胞(衬细胞)的癌症。“腺癌”指从腺起源的细胞衍生的癌。

根据本发明可以治疗的示例性的“肿瘤”包括AIDS相关肿瘤，听神经瘤,囊性腺样癌,肾上腺皮质癌,特发性骨髓外化生,脱发,泡状软组织肉瘤，肛门癌，血管肉瘤，再生障碍性贫血，星状细胞瘤，共济失调-毛细血管扩张症，基底细胞癌（皮肤），膀胱癌，骨癌，肠癌，脑干神经胶质瘤，脑和中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，CNS肿瘤，类癌肿瘤，子宫颈癌，幼年脑肿瘤，幼年癌症，幼年软组织肉瘤，软骨肉瘤，绒毛膜癌，结肠直肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，隆突性皮肤纤维肉瘤，促纤维组织增生性小细胞肿瘤，腺管癌，内分泌癌，室管膜瘤，食管癌，尤因氏肉瘤，肝外胆管癌，眼癌，眼黑色素瘤，视网膜母细胞瘤，输卵管癌，范可尼贫血综合症，骨纤维肉瘤，胆囊癌，胃癌，消化道癌，消化道类癌肿瘤，泌尿生殖癌，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞疾病，神经胶质瘤，子宫内膜癌，恶性血液疾病，头颈癌，肝细胞癌，遗传性乳腺癌，组织细胞增多病，霍奇金氏病，类乳头瘤病毒，葡萄胎，高血钙，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，卡波西肉瘤，肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，喉癌，平滑肌肉瘤，Li-Fraumeni综合征，唇癌，脂肪肉瘤，肝癌，肺癌，淋巴水肿，淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，男性乳腺癌，肾脏恶性横纹肌样瘤，成神经管细胞瘤，黑色素瘤，Merkel细胞癌，间皮瘤，转移的癌症，嘴癌，多发性内分泌瘤，蕈样真菌病，骨髓发育不良症综合征，骨髓瘤，骨髓增殖疾患，鼻癌，鼻咽癌，肾胚细胞瘤，神经母细胞瘤，神经纤维瘤，Nijmegen breakage综合征，非黑色素瘤皮肤癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，眼癌，食道癌，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，造口卵巢癌，胰腺癌，鼻旁癌，甲状旁腺癌，腮腺癌，阴茎癌，周边性神经外胚层肿瘤，垂体癌，真性红细胞增多症，前列腺癌，罕见癌症和相关的病患，肾细胞肿瘤，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，Rothmund-Thomson综合征，唾液腺癌，肉瘤，神经鞘瘤，Sezary综合征，皮肤癌，小细胞肺癌(SCLC)，小肠癌，软组织肉瘤，脊髓肿瘤，鳞状细胞癌（皮肤），胃癌，滑膜肉瘤睾丸癌，胸腺癌，甲状腺癌，转移性细胞癌（膀胱），转移性细胞癌（肾盂/输尿管），滋养层细胞癌，尿道癌，泌尿系统癌，膜板块蛋白，子宫肉瘤，子宫癌，阴道癌，外阴癌，Waldenstrom氏巨球蛋白血症，Wilms氏肿瘤。

使用本发明的方法治疗的肿瘤可以是原发病灶，或可以是原发癌转移的结果。此外，如果肿瘤是原发癌的转移，原发癌可以是上述的原发肿瘤，或可以是分散的原发癌，例如白血病或淋巴瘤。

本发明包括给受试者“施用”HA。本文使用的术语“施用”应当视作包括HA的所有施用方法。如本领域技术人员会明白的，最方便的或合适的施用途径取决于几个因素，且它们可以随受试者而异。但是，本领域技术人员无需过度试验，可以容易地确定对于任意特定受试者最方便的或合适的施用途径。施用途径包括动脉内、肝内、皮下、静脉内、通过吸入剂、栓剂或在缓释制剂中，包括在手术期间，尽管本发明无论如何不应当视作限于这些具体途径。另外，HA和化疗剂可以通过不同的途径或相同的途径施用。

HA的优选浓度是约0.00001%w/v至10,000%w/v，其中HA的该浓度经1min、且最高达336小时的时间段来施用，但是优选输注时间为120min。此外，HA可以与化疗剂同时施用，或两种物质可以以任意次序连续施用。另外，所述治疗方案可以包括多次施用一种HA或化疗剂，并低频施用另一种HA和化疗剂。

“共同施用”是指通过相同或不同的途径在同一制剂或在两种不同制剂中同时施用，或通过相同或不同的途径连续施用。“连续施用”是指在施用2种治疗剂或治疗方案之间间隔数秒、数分钟、数小时、数天或数周。连续施用的治疗剂或治疗方案可以以任意次序施用。在一个实施方案中，HA和化疗剂通过在相同制剂中递送来共同施用，或者在施用治疗剂之前和/或在施用治疗剂之后施用HA。

在另一个实施方案中，治疗剂可以被HA或其衍生物包囊，或与HA或其衍生物相结合。可以化学修饰HA，形成高分子量的粘性材料，其可以栓塞和捕获更小的治疗化合物，例如下述的治疗剂。在另一个实施方案中，可以化学修饰HA，形成HA珠子，其可以填满治疗剂，所述治疗剂可以一起栓塞在靶组织内。

可以与HA或其衍生物共同施用的这种治疗剂的实例包括但不限于柔红霉素,道诺霉素,更生霉素,多柔比星,表柔比星,伊达比星,依索比星,博来霉素,马磷酰胺,异磷酰胺,阿糖胞苷（cytosinearabinoside）,双氯乙基硝基脲,白消安,丝裂霉素C,放线菌素D,光辉霉素,泼尼松,羟孕酮,睾酮,他莫昔芬,达卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲蜜胺,五甲蜜胺,米托蒽醌,安吖啶,苯丁酸氮芥,甲基环己基硝基脲,氮芥,美法仑,环磷酰胺,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷（cytarabine）,5-氮杂胞苷,羟基脲,脱氧柯福霉素,4-羟基过氧环磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-FU),5-氟脱氧尿苷(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),奥沙利铂,多柔比星,秋水仙素,紫杉醇,长春新碱,长春碱,依托泊苷(VP-16),三甲曲沙,依立替康,托泊替康,吉西他滨,替尼泊苷,顺铂,己烯雌酚(DES)和其葡萄糖醛酸苷轭合物。化疗化合物的其它非限制性实例包括抗代谢物,抗肿瘤抗生素,有丝分裂抑制剂,甾族化合物,激素,烷化剂,氮芥,亚硝基脲,激素激动剂和微管抑制剂。组合物也可以包含通过调控癌症相关受体或结合蛋白来发挥抗血管发生活性或抗癌活性的抗体或蛋白。

本文使用的术语“抗代谢物”包括干扰细胞生长和再生所需的身体化学过程的物质；在癌症治疗中，抗代谢物药物会破坏DNA生产，这又阻止细胞分裂。实例包括偶氮丝氨酸,D-环丝氨酸,麦考酚酸,甲氧苄啶,5-氟尿嘧啶,卡培他滨,甲氨蝶呤,吉西他滨,阿糖胞苷(ara-C)和氟达拉滨。

“抗肿瘤抗生素”包括，通过阻断酶和有丝分裂或改变细胞周围膜来干扰DNA的化合物。这些治疗剂在细胞周期的所有阶段都起作用。因而，它们广泛用于许多种癌症。抗肿瘤抗生素的实例包括更生霉素,柔红霉素,多柔比星(阿霉素),伊达比星和米托蒽醌。

“有丝分裂抑制剂”包括植物生物碱和从天然产物衍生的其它化合物。它们可以抑制或终止有丝分裂，或抑制产生细胞再生所需蛋白的酶。它们在细胞周期的M期起作用。有丝分裂抑制剂的实例包括紫杉醇,多西他赛,依托泊苷(VP-16),长春碱,长春新碱和长春瑞滨。

本文使用的术语“甾族化合物”包括天然激素和激素-样药物，它们可以用于治疗某些类型的癌症(淋巴瘤,白血病和多发性骨髓瘤)以及其它疾病。当这些药物用于杀死癌细胞或减慢它们的生长时，它们视作化疗药物。它们经常与其它类型的化疗药物联合以增加它们的有效性。实例包括泼尼松和地塞米松。

“激素”包括性激素和激素-样药物，它们会改变雌激素或雄激素的作用或生产。它们用于减慢乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜(子宫衬里)癌的生长，这些癌通常响应于体内激素水平而生长。这些激素通常不以与标准化疗药物相同的方式起作用。实例包括抗雌激素(他莫昔芬,氟维司群),芳香酶抑制剂(阿那曲唑,来曲唑),黄体酮(醋酸甲地孕酮),抗雄激素(比卡鲁胺,氟他胺),和LHRH激动剂(亮丙瑞林,戈舍瑞林)。

“烷化剂”包括直接作用于DNA来阻止癌细胞的再生的化合物。作为一类药物，这些试剂不是阶段特异性的(换而言之，它们在细胞周期的所有阶段都起作用)。这些药物对慢性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤和某些肺癌、乳腺癌和卵巢癌是有活性的。烷化剂的实例包括白消安,顺铂,卡铂,苯丁酸氮芥,环磷酰胺,异磷酰胺,达卡巴嗪(DTIC),双氯乙基甲胺(氮芥)和美法仑。

“氮芥”，例如晶体盐酸盐形式的那些可以用作治疗霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤和脑瘤的药物。氮芥会造成细胞遗传物质的突变，从而破坏有丝分裂或细胞分裂。细胞对氮芥的敏感性不同，快速增殖的肿瘤和癌细胞最敏感；产生红细胞的骨髓也是敏感的，红细胞生产的抑制是氮芥治疗的常见副作用。氮芥也会抑制免疫应答(见免疫)。其它类型包括芳族芥美法仑和苯丁酸氮芥,环磷酰胺,HN1,双-(2-氯乙基),乙胺;HN2,双-(2-氯乙基),甲胺和HN3,三-(2-氯乙基),胺。

“亚硝基脲”通常以与烷化剂类似的方式起作用。它们干扰辅助修复DNA的酶。这些试剂能移动到脑中，所以它们被用于治疗脑瘤以及非霍奇金氏淋巴瘤,多发性骨髓瘤,和恶性黑素瘤。亚硝基脲的实例包括卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)。

“激素激动剂”包括调控一种或多种激素活性的化合物。实例包括：用于前列腺癌的亮丙瑞林(Lupron,Viadur,Eligard),用于乳腺癌和前列腺癌的戈舍瑞林(Zoladex)，和用于卵巢癌和前列腺癌的曲普瑞林(Trelstar)和醋酸那法瑞林(Synarel)。

“微管抑制剂”包括长春花生物碱,紫杉烷和苯并咪唑等化合物。

本发明包括的特别重要的化疗化合物是葡萄糖醛酸苷或葡萄糖醛酸苷轭合物。本发明包括的葡萄糖醛酸苷的实例包括但不限于吗啡-3-葡萄糖醛酸苷,吗啡-6-葡萄糖醛酸苷,石胆酸葡萄糖醛酸苷,维甲酰葡萄糖醛酸苷,imboxyl-β-D-葡萄糖醛酸苷,雌酮-3-葡萄糖醛酸苷,多柔比星葡萄糖醛酸苷,雄烷二醇葡萄糖醛酸苷和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸苷。

在一个具体的实施方案中，所述治疗剂是抗癌剂依立替康。共同施用依立替康和HA可以抑制无毒SN-38G形式向有毒SN-38形式的转化。其提示HA可以抑制β-葡糖醛酸糖苷酶活性。HA或其片段似乎会与SN-38G竞争β-葡糖醛酸糖苷酶转化，从而降低胃肠(GI)道毒性。

本发明提供的数据证实，非生理可达到浓度的乙酰透明质酸(860和10kDa)可以对源自肝和胃肠道组织的内源性β-葡糖醛酸糖苷酶的活性和腔内容物发挥刺激作用。但是，相反地，低分子量HA(<2kDa)会对源自肝和胃肠道组织的内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性发挥抑制作用(图1和2)。HA向片段<2kDa的分解代谢可能干扰SN-38G向SN-38的转化，这可能是外源施用的HA可以降低CPT-11-诱发的胃肠道毒性的严重性的机理。

本发明的上述新的基于HA/化疗剂的组合物和/或制剂(在本文中也称作″活性化合物″)可以掺入适合给药的药物组合物中。这样的组合物通常包含活性化合物和药学可接受的载体。本文使用的语言″药学可接受的载体″意在包括与药物施用相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂在药学活性物质中的应用是本领域众所周知的。如上所讨论的，也可以将补充活性化合物掺入组合物中。

将本发明的药物组合物制成与它的目标给药途径相容的制剂。给药途径的实例包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内,皮内,肌肉内,intraosseous,皮下,经口,鼻内,吸入,经皮(局部),经粘膜和直肠给药。用于肠胃外，皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下成分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可用安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量的小瓶包装。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液（溶于水的）或用于临时制备无菌注射溶液或分散液的分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM（BASF，Parsippany，NJ）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。组合物优选地是无菌的，并且其流动性应该达到易于通过注射器的程度。组合物在制造和存储的条件下应该是稳定的，且必须保护其不受微生物例如细菌和真菌作用的污染。载体可以是溶剂或分散介质包含，例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等）及其适当的混合物。可以例如，通过使用包衣例如卵磷脂，在混悬液的情况下通过维持所需粒子大小和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现微生物作用的预防。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，聚醇例如甘露醇、山梨醇，氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来使注射用组合物的吸收延长。

无菌注射用溶液可以通过在适当的溶剂中掺入治疗有效或有益量的活性化合物和上述列举的一种成分或组合来制备，如果需要，随后通过过滤除菌。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体来制备，所述无菌载体含有基本的分散介质和所需的上述列举的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上任意来自其先前无菌过滤溶液另外所需成分的粉末。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。合适的口服组合物可以例如包含在明胶胶囊中，或压制成片剂。为了口服施用的目的，可以将活性化合物和赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用液体载体制备，用作漱口剂，其中所述液体载体中的化合物经口应用、并且漱口，吐出或咽下。药物相容的粘合剂和／或辅料可作为组合物的一部分被包括。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任意以下成分，或相似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬酯酸镁或Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或桔子香精。

对于吸入施用，化合物以气溶胶喷雾剂形式从含有适当抛射剂（例如气体，例如羟基氟代烷(HFA)）的加压容器或分配器或喷雾器递送。或者，鼻内制剂可以包含干粉和适当的抛射剂例如HFA。全身施用也可以通过经粘膜或经皮的方式使用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。在本领域这样的渗透剂通常是已知的，包括例如对于经粘膜施用，洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻喷雾或栓剂实现经粘膜给药。对于经皮施用，可将活性化合物配制成本领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

对于直肠施用，化合物也可以制备成栓剂（例如使用常规栓剂基质例如可可脂和其他甘油酯）或保留灌肠剂的形式以递送。

在一个实施方案中，可将活性化合物与防止化合物从身体快速消除的载体，例如控释制剂，包括植入物和微囊化释放系统的载体一起制备。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酯和聚乳酸。制备这样制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。材料也可从例如Alza公司和Nova制药公司商购获得。脂质体混悬液（包括靶向于含有病毒抗原单克隆抗体的感染细胞的脂质体）也可作为药学可接受的载体使用。这些可通过本领域技术人员已知的方法制备，例如，描述于美国专利第4,522,811号。

配制便于施用和使剂量一致的剂量单位形式的口服或肠胃外组合物是特别有利的。如本文所用“剂量单位形式”指适合作为用于所治疗的患者的单一剂量的的物理离散单元；每个单元含有预先确定的计算量的以产生所需治疗效果的活性化合物与所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，以及将这样的活性化合物配药用于治疗个体的领域固有的限制。

通过标准的药学操作，可以在细胞培养或实验动物中测定这样的化合物的毒性和治疗效能，例如用于测定LD₅₀(50%群体致死的剂量)和ED50(在50%群体中治疗上有效的剂量)。毒性效应和治疗效应的剂量比是治疗指数，可以表达为LD₅₀/ED₅₀。优选呈现高治疗指数的化合物。虽然可以使用呈现毒副作用的化合物，但是需要仔细设计将化合物靶向于患病组织的递送系统，以将对未感染细胞的潜在损害减到最小，并由此减少副作用。

由细胞培养物试验和动物研究中获得的数据可用于设计用于人类的剂量范围。化合物的剂量优选位于包括具有很小或没有毒性的ED₅₀循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于使用的剂型和使用的施用途径。对于在本发明方法中使用的任意化合物，可从细胞培养试验估计最初的治疗有效剂量。可以在动物模型中设计剂量，以获得包括在细胞培养物中测定的IC₅₀（也就是达到半数最大症状抑制的实验化合物浓度）的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确的确定人类的有用剂量。可以通过例如高效液相色谱，测定血浆水平。

药物组合物可以与施用说明书(例如书面说明书)一起，包括在容器、包装或分配器中，更具体地，这样的说明书指出了使用该活性剂来治疗本文公开的病症或疾病，包括与Siglec-8表达细胞有关的疾病或病症。

本发明也可以用于增加特定治疗剂（例如蛋白,肽和抗体）在血流或其它生物流体中的半衰期或维持其稳定性。

下面的非限制性实例解释了本发明。本文提及的所有文件在本文中整体引作参考。

实施例1

体外测定HA浓度和分子量对胃肠组织中β-葡糖醛酸糖苷酶活性和胃肠内容物的影响

胃肠道组织匀浆的制备和胃肠道(腔)内容物声处理

从雄性远系杂交种Sprague Dawley大鼠切离胃肠(GI)道的回肠、盲肠、横结肠和降结肠部分。然后取出每个部分的腔内容物，并称重。然后用冰冷的0.9%w/v氯化钠溶液彻底冲洗每个组织部分，并称重。然后使用Ultra-Turrax组织匀浆器，在冰冷的磷酸钠缓冲液中匀浆化回肠、盲肠、横结肠和降结肠10分钟。也以相同方式，匀浆化从回肠、盲肠、横结肠和降结肠回收的腔内容物。然后，对所有样品进行声处理破碎4分钟，随后在6000g_av4℃离心30分钟。使用BCA方法，对得到的上清液定量蛋白含量。

肝组织匀浆的制备

将肝称重，然后在含有0.2%v/v TritonX100的冰冷的20mMTris/HCl pH7.5缓冲液中匀浆化5-10分钟，随后在6000g_av4℃离心30分钟。使用BCA方法，对上清液定量蛋白含量，等分，并在–20℃储存备用。

4-甲基-7-羟基重豆素(4-MU)标准曲线的制备

为了这些实施例的目的，将1单位的β-葡糖醛酸糖苷酶活性定义为每mg/hr释放出的1nmol的4MU(Sands等Protocols for GeneTransfer in Neuroscience263-274,1996)。因此，为了将相对荧光(来自测定的组织和腔内容物匀浆)转化成酶活性，制备了范围为0-10单位β-葡糖醛酸糖苷酶活性的4-MU的标准曲线。

在测定开始前，将肝匀浆稀释至0.8mg/mL，并将胃肠道和腔内容物稀释至0.1mg/ml。

将10mg/ml的模态分子量860kDa和10kDa的乙酰透明质酸原液加入表1的稀释样品中。以此方式，当100μl每种样品用于测定时，HA与固定量的蛋白的浓度范围是：10μg,40μg,80μg和100μg HA/μg蛋白。

表1

将25mg/ml的分子量<2kDa的乙酰透明质酸原料加入表2的稀释样品中。以此方式，当100μl每种样品用于测定时，HA与固定量的蛋白的浓度范围是：10μg,40μg,80μg和100μg HA/μg蛋白。

表2

加入HA后，彻底混合所有样品，然后在37℃温育过夜，此后将它们用于β-葡糖醛酸糖苷酶活性的定量。

β-葡糖醛酸糖苷酶测定:96孔平板方法

对于胃肠道测定，使用100μl样品(3.33μg),100μl底物和100μl终止缓冲液。在96-孔黑色澄清底平板中，一式三份地进行测定。对于对照样品，使用等体积的75mM磷酸钾缓冲液替代所用的生物样品。通过向每个实验孔和空白孔中加入适当体积的500μM4-甲基-7-羟基重豆素基-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-MUBG)底物，开始反应。在37℃温育平板1小时，此后向每个孔中加入终止缓冲液。然后在FluostarOptima平板读数器中，记录在每个孔中产生的产物的量，在350nm激发，并在450nm记录荧光。

实施例2

体外测定HA浓度和分子量对肝β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响

在用于测定之前，将肝匀浆原料稀释至0.8mg/mL。在磷酸钾缓冲液中，将乙酰透明质酸(860kDa,10kDa和<2kDa)稀释至8mg/ml,3.2mg/ml,1.6mg/ml,0.4mg/ml,0.2mg/ml,0.04mg/ml,0.02mg/ml和0.0008mg/ml。然后将等体积的HA的每种稀释制品与0.8mg/ml肝匀浆的等分试样彻底混合，在37℃温育过夜。次日，将样品简单地轻打混合，然后定量β-葡糖醛酸糖苷酶活性。样品制备参见表3:

表3

试管编号	HA浓度，mg/ml	μg HA/μg蛋白
			1	8mg/ml	10μg
2	3.2mg/ml	4μg
			3	1.6mg/ml	2μg
4	0.4mg/ml	0.5μg
			5	0.2mg/ml	0.25μg
6	0.04mg/ml	0.05μg
			7	0.02mg/ml	0.025μg
8	0.0008mg/ml	0.001μg

数据分析

施用空白对照样品，校正粗荧光读数的背景荧光。使用已知量的4-MU的标准曲线和β-葡糖醛酸糖苷酶活性单位，将校正过的荧光读数转换成酶活性单位。然后用下式确定β-葡糖醛酸糖苷酶酶活性的百分比变化:

测定百分比变化的平均值、百分比变化的标准差(SD)和百分比变化的平均值的标准误差(SEM)来绘图。一式三份地进行所有试验测定。

建立用于β-葡糖醛酸糖苷酶活性定量的标准曲线

为了这些实施例的目的，1单位的β-葡糖醛酸糖苷酶相当于产生1nmol的4-MU/hr(Wolfe & Sands Protocols for Gene Transfer inNeuroscience,1996)。通过改变反应终产物4-MU的浓度，制备将相对荧光单位与已知量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性相关联的标准曲线。通过使用0.01μm-50μm 4-MU的浓度范围，制备相对于0.01-10单位的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的标准曲线。在该0.001-5单位范围内，标准曲线是线性的，平均r²系数=0.99(n=5)，如表4所示。

表4

实施例3

体外测定HA分子量和浓度对胃肠道组织匀浆中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响

<2kDa HA的评价

测定了<2kDa HA对胃肠道组织匀浆中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。在表5和图1中显示了β-葡糖醛酸糖苷酶单位的定量，其表达为β-葡糖醛酸糖苷酶活性相对于未处理的组织样品的百分比变化(平均值±SEM)。在40μg,80μg和100μg的HA时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性显著降低。在该测定中使用最高浓度的HA(100μg)，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的抑制最高达64%。

由于测得盲肠含有最高β-葡糖醛酸糖苷酶活性，进行8-0.5μgHA/μg蛋白的HA进一步剂量滴定。

表5

测定<2kDa HA的活性阈值浓度

进一步滴定HA，包含下述范围0.5-8μg HA/μg蛋白，并从源自盲肠的组织匀浆重复测定。在表6和图2中显示了β-葡糖醛酸糖苷酶单位的定量，其表达为活性相对于未处理的组织样品的百分比变化(平均值±SEM)。

表6

HA浓度(μg HA/μg蛋白)	%变化	SEM
			0	0	0
0.5	-6	2
			1	-7	1
2	-6	1
			4	-8	0
8	-18	1

10kDa HA的评价

测定10kDa HA对胃肠道组织匀浆中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。在表7中，显示了β-葡糖醛酸糖苷酶单位的定量，其表达为β-葡糖醛酸糖苷酶活性相对于未处理的组织样品的百分比变化(平均值±SEM)。40μg,80μg和100μg HA/μg蛋白显著增加β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在100μg HA/μg组织时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加最高达43%。

表7

860kDa HA的评价

测定860kDa 分子量HA对胃肠道组织匀浆中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。在表8中显示了β-葡糖醛酸糖苷酶单位的定量，其表达为β-葡糖醛酸糖苷酶活性相对于未处理的组织样品的百分比变化(平均值±SEM)。在80μg和100μg HA/μg蛋白时，回肠、盲肠和横结肠中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性增加。随着HA的浓度从≥80μgHA/μg蛋白增加，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加最高达41%。

表8

实施例4

体内测定HA浓度和分子量对胃肠组织中β-葡糖醛酸糖苷酶活性和胃肠内容物的影响

雄性Sprague-Dawley大鼠购自Monash Animal Central Services(Monash Univerisity,Clayton)。适应1周后，将大鼠随机分配至各个治疗组(n=5)。然后限制每个动物，并在侧尾静脉单次推注注射实验物(参见表9)。

表9

治疗组和CPT-11和HA的剂量

治疗组	CPT-11剂量(mg/kg)	HA剂量(mg/kg)
			CPT-11(30)	30.0	0
CPT-11(60)	60.0	0
			HyCAMP^TM(13.0/30)	30.0	13.0
HyCAMP^TM(13.0/60)	60.0	13.0
			HyCAMP^TM(26.6/30)	30.0	26.6
HyCAMP^TM(26.6/60)	60.0	26.6
			HyCAMP^TM(55/30)	30.0	55.0
HyCAMP^TM(55/60)	60.0	55.0

单次静脉内注射表9列出的每种实验物，在90分钟、3小时和6小时时间点，处死每个治疗状况的大鼠。切离血液和肝的一部分、小肠、大肠、脾和肾，称重，并立即冷冻，直到通过HPLC对CPT-11、SN-38和SN-38G进行定量。

从血样提取CPT-11和SN-38

通过加入400μl在甲醇和乙腈(60:40)中的0.1%正磷酸，从最大体积(200μL)的血液提取CPT-11和SN-38。然后将每个样品涡旋1分钟，随后在室温在恒定搅拌下提取1小时。在结束提取时，将样品涡旋2分钟，在13000g_av、4℃离心5分钟。然后将上清液风干。

在200μl HPLC流动相中重配风干的样品后，将样品涡旋5分钟，在13000g_av、4℃离心5分钟。然后通过反相高效液相色谱(HPLC)，使用表10所示的洗脱条件分析得到的上清液。

表10

用于检测和定量CPT-11和SN-38的HPLC条件

从器官和粪便样品提取CPT-11和SN-38

在CPT-11和SN-38提取之前，将器官和粪便样品匀浆化。然后，通过向每份50mg样品中加入400μl在甲醇和乙腈(60:40)中的0.1%正磷酸，从器官和粪便样品提取CPT-11和SN-38。涡旋2分钟后，在定期搅拌下，在室温温育所有样品1小时，然后在13,000g_av、4℃离心样品10分钟。将得到的上清液转移至干净的埃彭道夫管，风干，然后在200μL HPLC流动相中重配。在13,000g_av、4℃重新离心所有样品5分钟，然后使用表10所示的洗脱条件，通过反相高效液相色谱(HPLC)进行分析。

估计血液或组织匀浆中的SN-38G水平

将血样、组织匀浆和来自小肠和大肠的粪便物与15-倍体积(w/v)的冷甲醇(-20℃)混合，然后涡旋，直到形成均质溶液。在3000g_av、4℃离心2-分钟后，将上清液转移至干净的埃彭道夫微量离心管。

使用TSK凝胶ODS-80TS柱(150x4.6mm内径)和流动相梯度进行色谱分离。流动相A和B分别是0.075M醋酸铵缓冲液(pH6.4)和乙腈。根据下述流动相B的线性方案，采用梯度洗脱：时间0,15%;6min,30%;9min,55%;13min,55%和15min,15%;其中流速是1.1ml/min，总运行时间20min,柱温度维持在40℃，自动取样器维持在4℃。荧光检测器设定在激发波长355nm，发射波长515nm。

计算

将标准品和样品的峰面积手工输入表格程序中，绘制标准曲线。从标准曲线外推样品的量，并如下计算样品的终浓度：

浓度=从标准曲线外推的量X稀释因子/注射体积

CPT-11或SN-38的量=浓度X重配体积

样品中CPT-11或SN-38浓度=CPT-11或SN-38的量/外推的样品的量

图中表示的数据是平均值±sem。通过使用参数t-检验分析的统计分析，进行治疗组和时间点之间的对比。正态分布失败后，使用Mann-Whitney秩和检验进行无参数分析。

结果

表11-14总结了从表9所示的所有试验组得到的CPT-11、SN-38和SN-38G的药代动力学和药效学数据。

表11

当以60mg/kg的剂量施用依立替康时，HA剂量调控对SN-38在小肠中的组织分布的影响(见图3)

表12

当以60mg/kg的剂量施用依立替康时，HA剂量调控对SN-38G在小肠中的组织分布的影响(见图4)

从表11-14中可以看出，含有依立替康的HA制剂(HyCAMP)发挥的主要药代动力学和药效学效应是：

i.在血流中存在更多的CPT-11代谢物SN-38，这证实改变了药物的胆汁分泌和肠运输，这是HA改变cMOAT运输蛋白的活性和外泌通道的结果；

ii在小肠中，存在更少的SN-38和更多的SN-38G，这明确证实HA可以抑制肠β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，这会导致降低的胃肠毒性。

实施例5

测定HA分子量和浓度对肝β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响

测定了860,10和<2kDa HA对肝β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响。在表15中显示了β-葡糖醛酸糖苷酶单位的定量，其表达为β-葡糖醛酸糖苷酶活性相对于未处理的组织样品的百分比变化(平均值±SEM)。尽管10和860kDa HA使β-葡糖醛酸糖苷酶的活性增加了最高达36%,<2kDa HA使该酶显著抑制了约61%。

表15

实施例6

乙酰透明质酸对盐酸依立替康(CPT-11)和它的代谢物SN-38和SN-38G的胆汁分泌和肠外吸渗的影响

用于静脉内给药的HyCAMP^TM和依立替康的制备

将20mg/mL的CPT-11原液在0.9%(w/v)无热原注射级NaCl中稀释至10mg/mL，并根据各动物质量，用于制备各依立替康注射剂，其目的是递送30或60mg/kg的依立替康。

将10mg/ml的HA在注射用水中的溶液用作原料HA，其中根据动物质量个别地制备注射剂以便施用26.6mg/kg HA。

在即将注射前，制备HyCAMP^TM(与依立替康一起配制的乙酰透明质酸)。然后根据各动物质量，制备HyCAMP^TM注射剂，其目的是递送26.6mg/kg动物质量的HA和60和30mg/kg动物质量的依立替康。

实验动物模型:原位灌注

动物规范

将雄性Wistar大鼠随机分成实验组(n=6/组)。当大鼠达到希望的起始重量280-340g时，开始治疗。在实验之前，将大鼠禁食过夜，自由接近饮用水。

原位灌注

通过腹膜内(i.p)注射氨基甲酸乙酯(1.2g/kg)麻醉大鼠。通过中线剖腹术暴露小肠。将聚乙烯管插入上十二指肠和回盲连接处。用37℃盐水洗涤小肠，并以1.3ml/min的流速，从十二指肠经小肠至回盲连接处，用乳酸盐化的林格溶液灌注。经2-3min后，通过股静脉静脉内施用30mg/kg或60mg/kg的CPT-11或HyCAMP^TM。给药后，进行5-min灌注进行平衡。在0,7.5,15,30,60,120,180和240min，经插入股动脉的插管抽取血样(0.4ml)。还在0,15,30,60,120,180和240min，从回肠流出物收集灌注液。在0,15,30,60,120,180和240min，从插入总胆管的插管收集胆汁样品。立即在10,000g_av、4℃离心2min分离血清，并在测定前储存在-80℃。完成血液、胆汁和灌注液的收集后，处死大鼠，取出组织(肝,脾,肾和肠)，立即储存于-70℃。

检测和定量所有(内酯和羧酸盐形式)的CPT-11、SN-38和SN-38G的分析方法

HPLC系统和运行条件

使用TSK凝胶ODS-80TS柱(150x4.6mm I.D.)和流动相梯度实现色谱分离。流动相A和B分别是0.075M醋酸铵缓冲液(pH6.4)和乙腈。根据下述流动相B的线性方案，采用梯度洗脱：时间0,15%;6min,30%;9min,55%;13min,55%和15min,15%;其中流速是1.1ml/min，总运行时间20min,柱温度维持在40℃，自动取样器维持在4℃。荧光检测器设定在激发波长355nm，发射波长515nm。

样品制备和HPLC分析

血清,肠液和胆汁

配有荧光检测器的HPLC系统用于测定CPT-11,SN-38和SN-38G。简而言之，将50-100μl在聚丙烯试管中的等分试样加入100ul乙腈，后者含有0.2μg/ml喜树碱作为内标。将试管涡旋混合5秒，在8000rpm、-10℃离心2min。将一部分上清液(100μl)转入新试管，加入100μl磷酸(pH3.0)。将溶液简单地涡旋混合，在室温放置1h，将CPT-11,SN-38和SN-38G转化成它们各自的内酯形式。将20μl等分试样注射进上述柱。

组织样品

为了分析组织水平，在15-倍体积(W/V)的冷甲醇(-20℃)中均质化组织样品，然后在3000rpm、4℃离心2min。将上清液(100μl)转入新试管，向其中加入70μl流动相缓冲液。将溶液简单地涡旋混合，将50μl等分试样注射进柱。

药代动力学分析

CPT-11,SN-38,SN-38G和APC

通过梯形法则，计算总CPT-11、SN-38和SN-38G的血清浓度-时间曲线下面积(AUC)。通过将4h期间分泌进胆汁或外吸进灌注液的药物总量分别除以0h-4h的AUC，计算CPT-11、SN-38、SN-38G和APC的表观胆和肠清除。未配对的t检验用于评估药代动力学参数。认为p<0.05的概率水平是显著的。

实验组,剂量和给药频率

6个治疗组(n=6)接受下述药物组合和所述剂量。下面示例了单次静脉内注射每种制剂和剂量;

组1:依立替康(30)

组2:HyCAMP^TM(26.6/30):(包含HA和依立替康的制剂)

组3:在依立替康(30)之前15分钟施用乙酰透明质酸(26.6)

组4:依立替康(60)

组5:HyCAMP^TM(26.6/60):(包含HA和依立替康的制剂)

组6:乙酰透明质酸(26.6)

使用下式计算施用的剂量：

注射体积(mL)=注射前注射器质量(g)–注射后注射器质量(g)

注射质量(mg)=药物浓度/注射溶液中的HA(mg/mL)X注射体积(mL)

施用剂量(mg/kg)=注射质量(mg)x1000/大鼠质量(g)

静脉内施用30mg/kg依立替康后的血清浓度

在HPLC分析之前，所有提取的样品进行酸化。因此，所有显示的结果代表内酯形式的CPT-11、SN-38和SN-38G。

胆汁分泌特性,依立替康(30)

在给大鼠施用依立替康(30)、HyCAMP^TM(26.6/30)或在依立替康(30)之前15分钟的HA(26.6)后，在确定的时间点从回肠流出物和插入总胆管的插管收集灌注液，并分析其中的CPT-11、SN-38、SN-38G和APC。

CPT-11的胆汁分泌

图5a显示了CPT-11的累积胆汁分泌速率。接受HyCAMP^TM的大鼠倾向于分泌更少的CPT-11，但是差异不显著(图5a)。施用HA、然后施用依立替康的大鼠中的CPT-11胆汁分泌与在CPT-11治疗组中观察到的结果相当(图5a)。在90至240分钟之间，HyCAMP^TM和HA+依立替康组之间的差异是统计上显著的(p≤0.05)，其中制剂HyCAMP^TM导致CPT-11更低的累积胆汁分泌。

SN-38的胆汁分泌

在仅用HyCAMP^TM和仅用依立替康治疗组中观察到了SN-38的类似胆汁分泌特性(图5b)。当给大鼠施用HA、然后施用CPT-11时，在给药后15分钟，SN-38的量比其它治疗组低约2.5-倍(图5b:1300ngCPT-11组相对于522HA+CPT-11组;p≤0.05)。该组中SN-38更低的累积胆汁分泌是一致的趋势，但是在所有随后的时间点不显著。

SN-38G的胆汁分泌

当对比SN-38G的胆汁分泌时，HyCAMP^TM治疗的大鼠倾向于含有比仅接受依立替康的大鼠更少的无活性代谢物(图5c)。这些差异不显著。施用HA、然后施用依立替康的大鼠中的SN-38G胆汁分泌与CPT-11治疗组相当(图5c)。令人感兴趣地，在给药后30和240分钟之间，HyCAMP^TM和CPT-11之前施用HA的治疗组之间的差异是显著的，其中HyCAMP^TM组在胆汁中含有更少的SN-38G(图5c)。

APC的胆汁分泌

与在仅施用CPT-11的大鼠中观察到的结果相比，施用HyCAMP^TM会显著降低APC的胆汁分泌(低约5-倍)(图5d)。这与在该治疗组中观察到的APC的低血清水平相关联。在所有时间点，这些结果是显著的(p≤0.05)。在CPT-11之前施用HA的大鼠中存在类似的趋势，其中观察到APC的更少胆汁分泌的趋势，但是与依立替康治疗的大鼠相比不显著(图5d)。在给药后30和60分钟，HyCAMP^TM和CPT-11之前施用HA的治疗组之间的APC胆汁分泌的差异是显著的。

胆汁分泌特性,依立替康(60)

CPT-11的胆汁分泌

母本化合物CPT-11代表着在依立替康和HyCAMP^TM治疗的动物中将要通过胆汁分泌的注射物的绝大部分。在施用HyCAMP^TM的大鼠中，累积胆汁分泌是在施用依立替康的动物中观察到的大约一半(图6a;在90分钟时间点1388μg CPT-11相对于653μg HyCAMP^TM:p≤0.05)。在30和180分钟之间，治疗组之间的差异是显著的。

SN-38的胆汁分泌

活性代谢物SN38的胆汁分泌是相当的，无论大鼠是施用HyCAMP^TM还是依立替康(图6b)。在最后时间点的值仅代表一只大鼠，因此在240分钟时SN38水平与HyCAMP^TM值的对比评价是不可能的。

SN-38G的胆汁分泌

当依立替康作为HyCAMP^TM施用时，会影响无活性代谢物SN-38G的胆汁分泌(图6c)。尽管仅仅在120分钟时间点是显著的，这时分泌约少2-倍的SN-38G，注射HyCAMP^TM的大鼠中的总趋势是通过胆汁途径分泌更少的SN-38G。

APC的胆汁分泌

正如在30mg/kg给药实验中观察到的，HyCAMP的最显著的作用是对于无活性代谢物APC的胆汁分泌(图6d)，其中与仅接受依立替康的那些相比，在HyCAMP大鼠中观察到少约5-至2-倍的APC。在30-和120分钟之间，治疗组之间的差异是显著的(p≤0.05)。该特性与在该治疗组中观察到的APC的低血清水平相关联。

肠外吸渗,依立替康(30)

CPT-11和代谢物的肠外吸渗

肠累积外吸渗代表经肠膜通过外吸渗从血液进入肠腔的CPT-11和其代谢物的量。在该分泌模式内，HyCAMP^TM(26.6/30)不仅对CPT-11具有最显著的作用，而且对SN-38、SN-38G和APC具有最显著的作用。这些图分别显示在图7a,b,c和d中。

CPT-11的肠外吸渗

进入接受HyCAMP^TM的大鼠的肠腔的CPT-11的量比在施用CPT-11的动物中观察到的量几乎少2-倍(图7a:120min525μgCPT-11相对于287μg HyCAMP^TM)。除了前2个时间点外，所有其它点都是显著的。CPT-11代表在肠腔中定量的所有代谢物的绝大部分。为了使HA发挥它对CPT-11的肠外吸渗的作用，必须以HyCAMP^TM的形式施用。从在依立替康之前施用HA的大鼠得到的数据支持了该论点，其中用仅接受依立替康的大鼠观察到CPT-11肠分泌的类似特性(图7a)。从60分钟至实验终点，HyCAMP^TM和HA+CPT-11的CPT-11肠分泌之间的差异是显著的(图7a)。

SN-38的肠外吸渗

当以HyCAMP^TM的形式施用CPT-11时，在回肠灌注液中收集到比施用依立替康的大鼠少约2-倍的活性代谢物SN-38(图7b:120min;1411ng/min CPT-11相对于696ng/min HyCAMP^TM:p≤0.05)。在实验的60和240min之间，2个治疗组之间的差异是显著的。在接受依立替康之前施用HA的大鼠中存在类似的趋势，但是该组和依立替康治疗组之间的差异不显著(图7b)。来自HyCAMP^TM和HA+CPT-11治疗的大鼠的SN-38肠外吸渗数据相当。

SN-38G的肠外吸渗

在施用依立替康的大鼠的肠腔中表征的无活性代谢物SN-38G的量显著不同于在接受HyCAMP^TM的大鼠中观察到的量(图7c)。更具体地，在HyCAMP^TM治疗的大鼠中发现的SN-38G的量比依立替康组少2至几乎3倍(图7c:180min;22μg依立替康组相对于9μg HyCAMP^TM:p≤0.05)。在实验的60至240min之间，治疗组之间的差异是显著的。在依立替康之前施用HA的大鼠中仍然影响SN-38G的肠外吸渗(图7c)。从90分钟至实验终点，接受该给药方法的大鼠与只注射依立替康的大鼠之间的差异是显著的(图7c:180min;22μg依立替康组相对于15μg HA+CPT-11:p≤0.05)。在HyCAMP^TM组中观察到SN-38G肠外吸渗的最大程度的调控，它在所有时间点都显著少于在依立替康之前施用HA的大鼠。

APC的肠外吸渗

正如在血清和胆汁分泌特性中观察到的，HyCAMP^TM对APC的肠外吸渗发挥最显著作用，其中与接受HyCAMP^TM的大鼠相比，2个治疗组之间的倍数差异是少约14至27倍的APC(见图7d:1500ng依立替康组相对于92ng HyCAMP^TM组)。在所有实验时间点，这2个组之间的差异是显著的。另外，当在依立替康之前施用HA时，在肠腔中存在更少APC积累的趋势，但是不显著。

肠外吸渗,依立替康(60)

CPT-11的肠外吸渗

CPT-11代表经肠膜通过外吸渗从血液进入肠腔的注射物的绝大部分(图8a)。在治疗组之间，以该方式进入肠腔的CPT-11的量相当。

SN-38的肠外吸渗

在15和30分钟的起始时间点，进入接受HyCAMP^TM的大鼠的肠腔的SN-38的量比仅接受依立替康的大鼠多约2-倍(图8b)。在给药后180分钟之前，这是一致的趋势，但是2个组之间的差异不显著。当考虑施用HyCAMP^TM的大鼠的血液循环中SN-38的升高水平时，这是特别令人感兴趣的，其发现所述水平显著高于依立替康治疗大鼠。

SN-38G的肠外吸渗

在无活性代谢物SN-38G的情况下，当对比2个治疗组时，在肠腔中发现了类似值，尽管在较晚的时间点(180分钟)，在接受HyCAMP^TM的大鼠中观察到了更少的SN-38G(图8c)。这些值是不显著的。

APC的肠外吸渗

与以前的观察相一致，在注射后15分钟的所有随后时间点，接受HyCAMP^TM的大鼠中APC的肠分泌显著更低(低约3至5倍)(图8d)。

数据的讨论

该研究描述了乙酰透明质酸对CPT-11、SN-38、SN-38G和APC的药代动力学的影响。除了这些参数外，还评价了这些化合物经胆汁途径分泌和从血流外吸渗进肠腔的速率。进行该研究来考察乙酰透明质酸降低依立替康的胃肠道毒性的可能机理。与接受相同剂量的单独的依立替康的大鼠相比，乙酰透明质酸/依立替康制剂降低胃肠道毒性。组织病理学检查清楚地证实了小肠和大肠中严重性较低的损伤。更具体地，与接受单独的依立替康的那些大鼠相比，当用本发明的制剂治疗时，大鼠的回肠和盲肠区域更少地受到影响。除了临床前观察外，在最近完成的I期临床试验中，还观察了患者的胃肠道毒性的减少。

CPT-11和SN-38都具有α-羟基-δ-内酯环，它可以经历可逆的依赖于pH的水解，以及每种化合物在水溶液中的内酯化反应。封闭的内酯形式在酸性条件下占优势，开环的羧酸酯形式在碱性条件下占优势。已经研究了这两种形式在CPT-11和SN-38之间的相互转化，其中已经显示，在pH7.6和5.6，以内酯和羧酸酯形式存在的喜树碱的百分比分别是11.7-和90.8%。另外已经显示，在pH7.4和6，内酯和羧酸酯形式的CPT-11和SN-38的百分比分别是10-和90%^[52]。因此，在血液的优势pH(约7.4)下，该平衡有利于水解以打开内酯环，并产生羧酸酯形式。

我们已经进行了体外研究来检查不同分子量的HA对参与CPT-11的生物转化的下述酶的影响：

1.羧酸酯酶

2.β-葡糖醛酸糖苷酶

将肝和胃肠道的组织匀浆用作每种酶的来源。这些研究清楚地证实，HA不会影响羧酸酯酶的活性，但是<2kDa HA片段在生理相关浓度会抑制肝和胃肠道提取物中β-葡糖醛酸糖苷酶的活性。CPT-11的肝活化后，存在的过量的HA片段(<2kDa)可以抑制SN-38G解离成SN-38，导致更少的SN-38通过胆汁途径分泌进胃肠道。除了该机理外，抑制胃肠道腔中的β-葡糖醛酸糖苷酶可以预防从SN-38G产生SN-38。

测试的所有分子量的乙酰透明质酸不能调控羧酸酯酶活性(没有观察到抑制或刺激作用)。当考虑该研究的结果以及无活性代谢物APC降低的血清水平时，这些发现是重要的并需要记住。更具体地，乙酰透明质酸会通过细胞色素P450途径调控和/或抑制CPT-11的氧化代谢，这已经导致形成更少的CPT-11无活性代谢物APC。

在含有更高剂量的依立替康(60)的制剂中，HyCAMP^TM(26.6/60)治疗造成了类似的趋势，该趋势就血清SN-38水平和APC形成更引人关注。尽管与仅依立替康治疗的大鼠相比，CPT-11和SN-38G的水平类似，乙酰透明质酸/依立替康治疗的大鼠表现出显著升高水平的SN-38，后者与显著减少的APC相关联。该结果加强了在更低剂量观察到的结果，并表明依立替康/乙酰透明质酸制剂的施用会以使CPT-11转入羧酸酯酶途径、产生更多SN-38的方式，扰乱细胞色素P450氧化途径。

与仅施用依立替康(30)的大鼠相比，施用乙酰透明质酸/依立替康(26.6/30)制剂的大鼠在血清-时间过程实验的早期时间点表现出一些微弱差异。更具体地，在注射后的平衡(5min)阶段后，观察到更少的CPT-11，这与SN-38水平的短暂升高有关。尽管随后的时间点不显著，将该数据与仅接受依立替康的大鼠相比，血清中存在更低CPT-11和更高SN-38水平的趋势。在CPT-11的生物激活之外，HA对SN-38与葡萄糖醛酸苷部分轭合形成的SN-38G的水平造成更明显的作用，即尿苷二磷酸葡糖醛酰基转移酶(UGT)催化的解毒步骤。在给药后最高达30分钟，乙酰透明质酸/依立替康和仅用依立替康的治疗组之间的差异是显著的。仅在接受乙酰透明质酸/依立替康制剂的大鼠中观察到这样的减少SN-38G形成的作用。令人感兴趣地，如果我们检查在接受依立替康之前15分钟施用HA(26.6)的大鼠中SN-38G的血清时间过程特性，SN-38G的水平最初增加，然后保持坪高最高达给药后120分钟，而施用依立替康的大鼠具有类似的起始增加，其下降至与用乙酰透明质酸/依立替康制剂（其中乙酰透明质酸和依立替康一起给药）治疗的动物相当的水平。这代表着肝β-葡糖醛酸糖苷酶的抑制，其中在依立替康之前15分钟施用HA已经造成参与HA代谢的酶、尤其β-葡糖醛酸糖苷酶的饱和动力学。相反，乙酰透明质酸/依立替康治疗的大鼠没有表现出该趋势，这可能反映了组合制剂形式的HA已经干扰了由UGT催化的SN-38向SN-38G的葡萄糖醛酸苷轭合反应。

在更高剂量的乙酰透明质酸/依立替康(26.6/60)，分泌进入肠中的CPT-11和SN-38G的量是在仅用依立替康治疗的大鼠中观察到的量的约一半。它们是重要的发现，其中该消除途径通过下述方式引起胃肠道毒性：

1.通过胆汁分泌进肠中的SN-38会诱导胃肠道损伤；

2.借助于固有肠微生物群的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，葡萄糖醛酸苷部分从SN-38G去轭合，产生SN-38(在SN-38G的胆汁分泌之后)；

3.肠羧酸酯酶活性将CPT-11转化成SN-38^[41]。

当考虑该分泌途径时，本发明的制剂已经降低了进入胃肠道的CPT-11和SN-38和SN-38G的量。因此，在这样做时，会预见到由于羧酸酯酶活性和SN-38G向SN-38的去轭合（这是由于肠腔中固有微生物群的β-葡糖醛酸糖苷酶活性）而产生更少的SN-38。

环孢霉素A是P-gp和cMOAT的已知抑制剂，会造成施用依立替康后CPT-11和SN-38向胆汁中分泌的减少。在施用乙酰透明质酸/依立替康制剂后，观察到CPT-11和SN-38向胆汁中分泌的类似减少，认为乙酰透明质酸会调控胆膜中cMOAT和/或P-gp的活性。这得到下述发现的支持，即在乙酰透明质酸/依立替康(26.6/60)治疗的大鼠中，血清SN-38水平明显高于用依立替康治疗的动物，而用乙酰透明质酸/依立替康治疗的动物中CPT-11和SN-38G的胆汁分泌减少，并且通过该途径分泌的SN-38的水平与仅接受依立替康的动物相当。由于血清CPT-11水平相对地相当，观察到的血清SN-38水平的增加可能是由于减少的胆汁分泌。

在这些实验中观察到的药代动力学干扰潜在地表明，HA已经抑制了参与CPT-11代谢的肝CYP3A4途径，优先将母本药物转向SN-38。

乙酰透明质酸减少外吸渗进胃肠道腔中的CPT-11、SN-38和SN-38G的量。当将CPT-11、SN-38和SN-38G的血清水平与它们的肠外吸渗特性相比较时，这是显然的。当治疗组之间CPT-11的血清水平基本上相当且血清SN-38适度增加时，乙酰透明质酸/依立替康制剂会使通过该途径进入肠中的母本药物和有毒代谢物的量减少约一半。只有当CPT-11以本发明制剂的形式施用时，才会影响该减少运输的机理。在乙酰透明质酸/依立替康治疗组中观察到的低水平的SN-38G部分地解释了进入胃肠道腔的较低水平的该无活性轭合物，与依立替康治疗的大鼠相比，在依立替康之前接受HA的大鼠表现出在血清中有更多SN-38G的趋势。在该环境下，该组大鼠仍然表现出显著减少的从血液循环进入肠腔的SN-38G，并表明HA受该运输机理的影响。无活性代谢物APC以类似方式受到影响，但是可能反映了开始时在血清中发现的低水平。

在更高剂量的乙酰透明质酸/依立替康(26.6/60)，CPT-11和它的代谢物的肠外吸渗基本上不显著，例外是APC。在乙酰透明质酸/依立替康组中最明显改变的血清代谢物是显著增加的SN-38，而治疗组之间SN-38的肠外吸渗相当。

仅在接受30mg/kg依立替康的治疗组中，可以对比CPT-11和它的代谢物的组织分布，这是由于在接受依立替康(60)的大鼠中观察到的毒性相关的死亡，其中仅一只大鼠存活至实验终点。相反，接受乙酰透明质酸/依立替康(26.6/60)的大鼠都存活，并证实当该药物自身施用时，该制剂不是急毒性的。在接受乙酰透明质酸/依立替康或在依立替康之前15分钟接受HA的大鼠中，进入脾的依立替康显著降低。令人感兴趣地，在只接受依立替康的大鼠的脾中没有检测到SN-38，尽管表现出更大量的CPT-11。在该环境下，我们以前已经证实，与只接受依立替康的大鼠相比，长期暴露于乙酰透明质酸/依立替康(26.6/60)的大鼠在实验终点时表现出明显较小的脾。

进入所有其它器官的CPT-11是相当的，因此表明乙酰透明质酸没有对药物在肝、肾、肠和肺中的生物分布发挥显著作用，因此不是HA对依立替康治疗后胃肠道诱发的毒性发挥保护作用的潜在机理。

在脾和肺中发现的SN-38的量都显著高于施用乙酰透明质酸/依立替康的大鼠。在单独施用依立替康后，在脾或肺中不能检测到SN-38。

更重要的是，在所有治疗组间相对相当的CPT-11和代谢物在肠中的分布表明乙酰透明质酸/依立替康对依立替康诱发的胃肠道毒性发挥保护作用的机理是在通过胆汁消除的基本途径中，也在肠外吸渗中。

实施例7

体外测定乙酰透明质酸的分子量和浓度对肿瘤细胞中内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响

实验品和对照品

乙酰透明质酸:

·批号:HA10509(生物疗法;Institute of Drug Technology使用固有粘度测量法测得模态分子量860kDa)；

·批号:150103E/3/240/S(CPN Ltd.模态分子量10kDa)

·乙酰透明质酸<2kDa(通过透明质酸酶消化，在HA Laboratory产生)

体外测定HA浓度和分子量对内源性肿瘤细胞β-葡糖醛酸糖苷酶的影响

样品的制备

从原始细胞胞溶产物制备肿瘤细胞胞溶产物原料(0.8mg蛋白/ml)。用磷酸钾缓冲液稀释10mg/ml的乙酰透明质酸原料(10kDa&860kDa)，达到8mg/ml,3.2mg/ml,1.6mg/ml,0.4mg/ml,0.2mg/ml,0.04mg/ml,0.02mg/ml和0.0008mg/ml乙酰透明质酸。用磷酸钾缓冲液稀释进一步25mg/ml<2kDa HA，达到8mg/ml,3.2mg/ml,1.6mg/ml,0.4mg/ml,0.2mg/ml,0.04mg/ml,0.02mg/ml和0.0008mg/ml乙酰透明质酸。通过将125μl不同稀释度的乙酰透明质酸等分进含有125μl0.8mg蛋白/ml的下述细胞系的细胞胞溶产物的埃彭道夫管中制备测定样品：HCT-116,LIM-1215,LIM-2099,SK-CO1,SW-1222,HT-29,SW-620,MSTO-211H,MDA-MB-468和MDA-MB-435。通过反复倒置混合(约20次)彻底混合样品，随后在37℃温育过夜。温育结束后，通过反复倒置混合(约20次)彻底混合样品，然后使用96-孔平板方法，定量β-葡糖醛酸糖苷酶。

β-葡糖醛酸糖苷酶测定:96-孔平板方法

该测定在黑色澄清底96-孔平板的孔中进行，其中将50μL肿瘤胞溶产物解物(20μg蛋白)加入孔中，并将50μL75mM磷酸钾缓冲液用作对照空白孔。该添加之后，向每个实验孔和空白孔中加入50μL500μM4-甲基-7-羟基重豆素基-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-MUBG)底物。在37℃温育平板刚好1小时。温育结束后，加入50μL终止缓冲液，在FluostarOptima平板读数器上，在350nm激发和450nm发射下读平板。

测定乙酰透明质酸分子量和浓度对内源性肿瘤β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响

860kDa乙酰透明质酸的评价

为了测定不同的HA浓度和分子量对β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响，将20μg细胞胞溶产物蛋白和500μM底物与0-10μg HA/μg蛋白共同温育。从图9和表16可以看出，在HA浓度和β-葡糖醛酸糖苷酶的刺激作用之间存在固有关系。另外，在CD44表达和HA对肿瘤细胞β-葡糖醛酸糖苷酶作用的倍数增加之间存在直接关系。与不含有HA的样品相比，含有≥2μg HA/μg蛋白的样品表现出明显更多的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在4μg时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加范围是0-28%。在10μg时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加范围是20-125%，其中与CD44表达存在高度关联。

有可能将观察到的HA刺激浓度模型化成在临床环境中发生的浓度，从而确定该现象是否在体内发生。在这些实验中使用的肿瘤细胞胞溶产物由26.7x10⁶肿瘤细胞产生，产生3.6mg肿瘤细胞蛋白/ml胞溶产物。这相当于每个细胞含有0.135ng蛋白的1个肿瘤细胞。因此，如果≥2μg HA/μg肿瘤细胞蛋白导致内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的刺激，则它是≥2μg/7407细胞或≥270pg HA/细胞。

为了建立快速推注注射850kDa乙酰透明质酸的生物分布，给携带人乳腺癌异种移植物的裸鼠静脉内注射15.9±1.2mg/kg825kDa[³H]HA。在静脉内给药后15min,30min,60min,2h,4h,8h,24h,48h和72h，杀死小鼠(n=5/时间点)。取出所有身体器官和流体，称重，使用β-闪烁计数法定量[³H]放射性。分析所有组织中HA代谢物的存在，其中在8小时后鉴别出[³H]水和[³H]醋酸盐的终产物；没有检测到HA的中间分解产物。下表仅仅报告了在开始825kDa HA的显著分解代谢之前HA的摄入。从下表可以看出，在肿瘤中积累的注射剂量的最高百分比是2.58%。因此，如果人接受2g HA(假定2m²患者接受1gHA/m²，这是在HyCAMP^TM I和II期临床试验中施用的HA的最高剂量)，则每克肿瘤会积累约51.6mg HA，相当于51.6pg HA/细胞(假定1g肿瘤相当于10⁹细胞)。

10kDa乙酰透明质酸的评价

为了测定不同的浓度和分子量的HA对肿瘤细胞β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响，将1微克肿瘤细胞蛋白和500μM底物与0-10μg模态分子量为10kDa的HA共同温育，该分子量相当于位于到达溶酶体途径上和在Hyal-1消化之前的溶酶体中的胞质内含体的Hyal-2消化产物。从图10和表17可以看出，在>2μg HA时，与不含有HA的样品相比，存在明显更高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在4μg时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加范围是0-28%。在10μg时，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的增加范围是13-63%。在10kDa HA的情况下，在CD44表达和β-葡糖醛酸糖苷酶活性的倍数增加之间没有显示关联。

有可能将观察到的HA刺激浓度模型化成在临床环境中发生的浓度，从而确定该现象是否在体内发生。在这些实验中使用的肿瘤细胞胞溶产物由26.7x10⁶肿瘤细胞产生，产生3.6mg肿瘤细胞蛋白/ml胞溶产物。其相当于每个细胞含有0.135ng蛋白的1个肿瘤细胞。因此，如果≥2μg HA/μg肿瘤细胞蛋白导致内源性β-葡糖醛酸糖苷酶活性的刺激，则它是≥2μg/7407细胞或≥270pg HA/细胞。静脉内施用2g HA(假定2m²患者接受1g HA/m²，这是在HyCAMP^TM I和II期临床试验中施用的HA的最高剂量)，理论上会产生约51.6mg HA/g肿瘤，相当于51.6pg HA/细胞(假定1g肿瘤相当于10⁹细胞)。注射825kDa[³H]HA后肿瘤匀浆的色谱分析没有检测到任何10kDa HA，因为HA的任意中间降解产物都被β-葡糖醛酸糖苷酶快速加工成单糖。由于10kDa可以是β-葡糖醛酸糖苷酶的底物，为了响应于肿瘤环境中底物的增加，β-葡糖醛酸糖苷酶可能仍然以类似体内的方式作出响应，导致酶活性的上调。

<2kDa乙酰透明质酸的评价

为了测定不同乙酰透明质酸浓度和分子量对β-葡糖醛酸糖苷酶活性的影响，将1微克肿瘤细胞蛋白和500μM底物与0-10μg模态分子量<2kDa的乙酰透明质酸共同温育。从图11和表18可以看出，在HA浓度低至2μg时，与不含有HA的样品相比，肿瘤细胞β-葡糖醛酸糖苷酶存在明显抑制。随着HA浓度增加至高达10μg HA，抑制程度增加，其中β-葡糖醛酸糖苷酶活性降低了最高达47%。

在肿瘤匀浆中检测注射825kDa[³H]HA后肿瘤匀浆的色谱分析(证实没有<2kDa的HA小片段)，因此如果这些发现可以转换成临床情形，则不存在HA-介导的肿瘤内β-葡糖醛酸糖苷酶的抑制。

实施例8

HyCAMP^TM的I期临床报告结果

材料和方法

患者选择

进入该研究的所有患者都具有晚期或转移性结肠直肠癌（CRC），现在或过去有结肠直肠腺癌的组织学文件。要求患者具有难治的或已经用一线5-FU(和/或卡培他滨)治疗6个月以内的转移性疾病。允许以前的奥沙利铂，但是在该I期研究开始时，基于奥沙利铂的疗法不能作为治疗转移性结肠直肠癌的一线治疗方案容易地得到。其它合格标准是年龄18-75,≥1可测量病变(在旋转CT或MRI上≥1cm),ECOG行为状态(PS)为0或1,估计存活时间≥12周,足够的骨髓功能(中性粒细胞计数≥1.5x10⁹/L,血小板≥100x10⁹/L),足够的肝功能(胆红素≤1.25x正常值上限,ALT≤5x正常值上限)和足够的肾功能(肌酸酐≤0.2mmol/L)。主要排除标准是活跃的炎性肠病,≥2级慢性腹泻,肿块性病变(>50%肝参与,>25%肺参与,或腹部肿块（abdominalmass）≥10cm),脑转移,吉尔伯特综合症,先前暴露于依立替康,对骨盆或>30%骨髓的任意先前放疗,现在活跃的第二种恶性的或其它严重的共存病。所有患者的在登记前提供书面志愿书，且研究经过主管机构伦理委员会的批准。

研究设计

每三周经90分钟静脉内施用HA和依立替康的制剂(HyCAMP^TM)，最多6个周期。HA的剂量固定在1000mg/m²，依立替康的起始剂量是300mg/m²[HyCAMP(1000/300)]。所有患者接受5-HT3抑制剂和地塞米松的预治疗。如果在该起始剂量没有观察到显著的治疗相关毒性，则在随后的周期中将依立替康的剂量升高至350mg/m²[HyCAMP(1000/350)]。没有设计HA的剂量调整。

根据国家癌症研究所普通毒性标准(NCICTC)第1版，对毒性分级。经历任意III或IV级毒性(除了脱发和血栓栓子事件外)的患者在其随后的依立替康周期中接受25%剂量减少(但是HA则不然)。剂量持续最高达21天，直到毒性消退至I级或更低。发展成III或IV级血栓栓子事件的患者退出研究。所有患者接受关于治疗相关腹泻的潜在性和适当使用洛哌丁胺的教育，洛哌丁胺在HyCAMP^TM的第一个周期时常规分配。不允许粒细胞集落刺激因子或促红细胞生成素的预防性使用。

基线效能和安全性评价

在治疗前，根据医疗史、体检、全血细胞计数、血清CEA和化学板评估每位患者的临床状态。在第一个治疗周期之前4周内，进行胸、腹和骨盆的基线CT扫描。在治疗期间，在每个周期的第1天，通过体检、全血细胞计数、血化学和毒性评级评估患者。另外，对于第二个周期，预定第10天的全血细胞计数。在每两个周期后，重复放射线成像以确定疾病状态。使用先前公开的完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)和渐进疾病(PD)的定义，用RECIST标准来评估反应。

药代动力学

在第一个周期中，在给药当天，在0,30,60,90min(在输注期间)和在停止药物输注后5,10,15,20,30,60min和2,3,4,6,24,47,72和96h，抽取用于定量依立替康和其代谢物SN-38和SN-38G的血样。将血液收集在肝素化的试管中，通过离心(1200g，10分钟)从血细胞分离血浆，在-20℃冷冻，然后在-80℃储存，直到分析。使用反相HPLC，测定融化的血浆中分析物的浓度。通过对比使用拟合的1/x加权线性回归建立的标准曲线和浓度-反应关系图，计算浓度，其中反应等于分析物峰面积与内标的比。

样品提取:在CPT-11和SN-38定量之前，通过向200μl患者血浆中加入400μl含有18ng内标(喜树碱,Sigma,USA)的冰冷的1:1乙腈:甲醇提取样品。通过在Biofuge13(Beckman,USA)中在13,5000rpm离心5min，澄清提取混合物。干燥上清液，并在200μl流动相中重配，然后应用于HPLC。

CPT-11和SN-38的HPLC定量:使用SGE SS Warkosil C18柱(5μm,150x4.6mm内径)进行分离，该柱由Alltech C18(5μm,7.5x4.6mm内径)保护柱保护。柱温度维持在30℃。流动相是0.025MKH₂PO₄:乙腈(75:25v/v)用H₃PO₄调节至pH2.5，流速设定在1ml/min。在4℃冷却样品，以30μl注射体积注射进柱。HPLC测定用于验证特异性、灵敏度、线性以及样品和原液经适当保藏/使用阶段后的稳定性。在检测限，一天内和两天间的准确度和精密度小于±15%或±20%。在分析之前，还评估了其它共同施用的试剂（包括透明质酸(HA)和一定量止吐剂和抗组胺）的色谱干扰的可能性。

SN-38G的定量:通过定量β-葡糖醛酸糖苷酶水解SN-38G后SN-38水平的增加，估计SN-38G。简而言之，在37℃，用1000单位的β-葡糖醛酸糖苷酶(Type B10,10,400单位/mg;Sigma,USA)温育200μl血浆样品等分试样2h。在酶消化结束时，如上所述提取样品，并进行色谱分离。基于SN-38的100%纯参照标准品，将SN-38G水平表达为ng/ml SN-38。

结果

患者特征

在2003年7月和2004年9月间，有12位患者登记进入研究。对于所有患者都评价反应和毒性。登记了9位男性和3位女性，平均年龄63岁(39至73岁)。所有患者接受先前的5-FU化疗，3位还接受奥沙利铂。在表1中显示了研究开始时的患者特征。接受的周期平均数是5(1-6)。

药代动力学

与历史数据相比，HyCAMP制剂会改变依立替康(CPT-11)和SN38的药代动力学(表19)。当与HA配制时，CPT-11的平均半衰期

为约18h，与此相对比，已经观察到单独的依立替康是约12h。这些数据表明，由于未改变C_max和清除数字，HA的制剂会改变依立替康的代谢或药效学。当对比有效代谢物SN-38的C_max和曲线下面积时，证实了该科学假设。这些集合的SN-38药代动力学数据表明，HA会调整依立替康的代谢活化和可能的药效学。该代谢级联中的关键酶是羧酸酯酶,UDP葡糖醛酰基转移酶和β-葡糖醛酸糖苷酶。

如果该观察到的效应是降低的羧酸酯酶活性的结果，CPT-11的C_max水平会高于预期，因为该酶不能同样有效地将CPT-11转化成SN-38，这会显示为减少的SN-38、但是升高水平的循环CPT-11。如果UDP葡糖醛酰基转移酶是靶标酶，则药代动力学效应是改变了水平的SN-38G，但是这没有观察到。观察到的结果可能是下述代谢途径改变的结果(图12)。

毒性

在第一个治疗周期后在HyCAMP(1000/300)剂量水平登记的第一位患者中观察到被认为归因于渐进性疾病的III级肝功能障碍。在该水平治疗另外4位患者没有剂量限制毒性，它们接受HyCAMP(1000/350)，进行第二个和随后的周期。7位患者开始HyCAMP(1000/350)剂量水平的治疗。2位患者发生剂量减少：由于在周期1的IV级热性中性白血球减少症，在周期2中依立替康剂量减少50%;由于在周期4的III级嗜睡，在周期5中依立替康剂量减少25%。由于在周期1和5中的中性白血球减少症(分别是III和II级)，一位患者在周期2和6中需要治疗延迟(但是没有剂量调整)。

在表3中总结了根据预定就诊的治疗相关的III和IV级毒性。发作在周期5期间的单次III级腹泻发生在以前没有显著腹泻的患者中。该患者在周期6中要求剂量减少，但是这没有发生，因为该患者由于在周期5结束时的渐进性疾病而退出研究。在表3中显示的其它III级/IV级毒性包括，被认为与渐进性疾病有关的肝功能障碍，和被认为与甾族化合物预治疗有关的高血糖症。NCICTC III/IV级毒性共发作9次。其中，3次被认为是研究药物相关的。它们是1次III级腹泻,1次IV级中性白血球减少症和1次III级中性白血球减少症。在第10天记录了III级中性白血球减少症的发作，并且在进行下一个周期之前，中性粒细胞计数已经恢复，所以这没有影响治疗。没有与治疗有关的毒性死亡。

肿瘤反应和存活时间

所有12位患者都用于评价反应。反应数据总结在表20中。在2位患者中观察到部分反应，总反应率是17%。5位患者具有稳定疾病，5位具有渐进性疾病作为他们的最好反应。发展的中间时间是6个月，中间总存活时间是16个月。

尽管样品群体较小，CEA水平的分析证实是令人感兴趣的，其中在患者6和9中，CEA水平实质上降低，而计算机x线断层摄影术评估指示渐进性疾病。对这些“不反应”患者的随访已经揭示，这些患者仍然存活至开始治疗后623和629天，这在通过CEA评估的反应者的预期存活时间内。

表20:肿瘤反应和存活时间

本领域技术人员会明白，本文所述的发明易于进行除特别描述的那些以外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明也包括在本说明书中单独或一起提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，和任意2个或多个所述步骤或特征的任意和所有组合。

文献目录

欧洲专利号0 138 572

欧洲专利号0 216 453

欧洲专利号0 341 745

Sands等Protocols for Gene Transfer in Neuroscience263-274,1996

Takasuna等Cancer Res56:3752-3757,1996

美国专利号4,522,811

美国专利号4,851,521

美国专利号4,965,353

美国专利号5,202,431,

美国专利号5,852,002

美国专利号6,027,741

美国专利号6,069,135

美国专利号6,552,184

美国专利号6,579,978

美国专利号6,620,927

美国专利号6,831,172

WO 00/41730

WO 02/05852

Wolfe&Sands Protocols for Gene Transfer in Neuroscience,1996

Claims

1.一种治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含平均分子量为约350Da至约10kDa的乙酰透明质酸(HA)和治疗剂，其中所述治疗调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，降低胃肠毒性。

2.权利要求1的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约10kDa。

3.权利要求1的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约5kDa。

4.权利要求1的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约2kDa。

5.根据权利要求1治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含分子量为约350-9500Da的乙酰透明质酸(HA)和降低胃肠道中的毒性水平的治疗剂，其中所述HA调控胃肠道中β-葡糖醛酸糖苷酶的活性。

6.治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量350Da至90kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量750kDa至2000kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

7.根据权利要求6的治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量350Da至10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量750kDa至2000kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

8.根据权利要求7的制剂，其包含:

(i)平均分子量350Da至10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量750kDa至1000kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

9.根据权利要求6的治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量约10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

10.根据权利要求7的治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量约2kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

11.权利要求6的方法，其中在施用所述治疗剂之前或之后施用HA。

12.权利要求6的方法，其中在施用所述治疗剂之前施用HA。

13.权利要求6的方法，其中在施用所述治疗剂之后施用HA。

14.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中口服施用HA。

15.权利要求9的方法，其中口服施用平均分子量约10kDa的HA。

16.权利要求10的方法，其中口服施用平均分子量约2kDa的HA。

17.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中全身施用HA。

18.根据权利要求9或10的方法，其中全身施用平均分子量约860kDa的HA。

19.用于治疗癌症的权利要求9或10的方法。

20.权利要求1-5和10-14中任一项的方法，其中所述治疗剂是β-葡糖醛酸糖苷酶的底物。

21.权利要求1和6-10中任一项的方法，其中所述治疗剂含有葡萄糖醛酸苷部分。

22.权利要求1和6-10中任一项的方法，其中所述治疗剂被代谢，形成葡萄糖醛酸苷轭合物。

23.权利要求21和22中任一项的方法，其中所述葡萄糖醛酸苷选自：吗啡-3-葡萄糖醛酸苷,吗啡-6-葡萄糖醛酸苷,石胆酸葡萄糖醛酸苷,雌酮-3-葡萄糖醛酸苷,维甲酰葡萄糖醛酸苷,imboxyl-β-D-葡萄糖醛酸苷,多柔比星葡萄糖醛酸苷,雄烷二醇葡萄糖醛酸苷和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸苷。

24.权利要求1和6-13中任一项的方法，其中所述治疗剂是选自下述的化疗剂：化疗化合物，包括抗代谢物,抗肿瘤抗生素,有丝分裂抑制剂,甾族化合物,激素,烷化剂,氮芥,亚硝基脲,激素激动剂和微管抑制剂。

25.权利要求24的方法，其中所述治疗剂是选自下述的化疗剂：柔红霉素,道诺霉素,更生霉素,多柔比星,表柔比星,伊达比星,依索比星,博来霉素,马磷酰胺,异磷酰胺,阿糖胞苷,双氯乙基硝基脲,白消安,丝裂霉素C,放线菌素D,光辉霉素,泼尼松,羟孕酮,睾酮,他莫昔芬,达卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲蜜胺,五甲蜜胺,米托蒽醌,安吖啶,苯丁酸氮芥,甲基环己基硝基脲,氮芥,美法仑,环磷酰胺,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氮杂胞苷,羟基脲,脱氧柯福霉素,4-羟基过氧环磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-FU),5-氟脱氧尿苷(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),奥沙利铂,多柔比星,秋水仙素,紫杉醇,长春新碱,长春碱,依托泊苷(VP-16),三甲曲沙,依立替康,托泊替康,吉西他滨,替尼泊苷,顺铂,己烯雌酚(DES)和其葡萄糖醛酸苷轭合物。

26.一种治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含平均分子量为约350Da至约10kDa的乙酰透明质酸(HA)和治疗剂，其中所述制剂调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，增强药物激活。

27.一种治疗方法，其包含施用制剂，所述制剂包含平均分子量为约350Da至约10kDa的乙酰透明质酸(HA)和治疗剂，其中所述治疗调控β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，并与单独的治疗剂相比，减少骨髓抑制。

28.权利要求27的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约10kDa。

29.权利要求28的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约1kDa至约10kDa。

30.权利要求29的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约1kDa。

31.权利要求30的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约5kDa。

32.权利要求30的制剂，其中所述乙酰透明质酸组分的平均分子量为约350Da至约2kDa。

33.权利要求27的方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量约10kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

34.权利要求27的方法，其包含施用制剂，所述制剂包含：

(i)平均分子量约2kDa的乙酰透明质酸(HA);和

(ii)平均分子量约860kDa的乙酰透明质酸(HA),和

(iii)治疗剂,

35.权利要求27的方法，其中在施用所述治疗剂之前或之后施用HA。

36.权利要求27的方法，其中在施用所述治疗剂之前施用HA。

37.权利要求27的方法，其中在施用所述治疗剂之后施用HA。

38.根据权利要求27-37中任一项的方法，其中口服施用HA。

39.权利要求34的方法，其中口服施用平均分子量约10kDa的HA。

40.权利要求35的方法，其中口服施用平均分子量约2kDa的HA。

41.根据权利要求27-37中任一项的方法，其中全身施用HA。

42.权利要求33或34的方法，其中全身施用平均分子量约860kDa的HA。

43.权利要求34的方法，其中口服施用平均分子量约2kDa的HA，并全身施用平均分子量约860kDa的HA。

44.用于治疗癌症的权利要求1或27的制剂。

45.权利要求27至43-47中任一项的方法，其中所述治疗剂含有葡萄糖醛酸苷部分。

46.权利要求27-43中任一项的方法，其中所述葡萄糖醛酸苷选自：吗啡-3-葡萄糖醛酸苷,吗啡-6-葡萄糖醛酸苷,石胆酸葡萄糖醛酸苷,雌酮-3-葡萄糖醛酸苷,维甲酰葡萄糖醛酸苷,imboxyl-β-D-葡萄糖醛酸苷,多柔比星葡萄糖醛酸苷,雄烷二醇葡萄糖醛酸苷和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸苷。

47.权利要求27的方法，其中所述治疗剂是选自下述的化疗剂：化疗化合物，包括抗代谢物,抗肿瘤抗生素,有丝分裂抑制剂,甾族化合物,激素,烷化剂,氮芥,亚硝基脲,激素激动剂和微管抑制剂。

48.权利要求47的方法，其中所述治疗剂是选自下述的化疗剂：柔红霉素,道诺霉素,更生霉素,多柔比星,表柔比星,伊达比星,依索比星,博来霉素,马磷酰胺,异磷酰胺,阿糖胞苷,双氯乙基硝基脲,白消安,丝裂霉素C,放线菌素D,光辉霉素,泼尼松,羟孕酮,睾酮,他莫昔芬,达卡巴嗪,丙卡巴肼,六甲蜜胺,五甲蜜胺,米托蒽醌,安吖啶,苯丁酸氮芥,甲基环己基硝基脲,氮芥,美法仑,环磷酰胺,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氮杂胞苷,羟基脲,脱氧柯福霉素,4-羟基过氧环磷酰胺,5-氟尿嘧啶(5-FU),5-氟脱氧尿苷(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),奥沙利铂,多柔比星,秋水仙素,紫杉醇,长春新碱,长春碱,依托泊苷(VP-16),三甲曲沙,依立替康,托泊替康,吉西他滨,替尼泊苷,顺铂,己烯雌酚(DES)和其葡萄糖醛酸苷轭合物。

49.根据权利要求1或27的治疗方法，其包含施用包含乙酰透明质酸(HA)和治疗剂的制剂，其中所述制剂或其组分调控药物转运蛋白的活性。

50.根据权利要求49的方法，其中所述药物转运蛋白是阳离子交换蛋白cMOAT。

51.根据权利要求50的方法，其中所述阳离子交换蛋白cMOAT降低毒性药物的循环水平。