ITMI20010779A1 - Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi - Google Patents
Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI20010779A1 ITMI20010779A1 IT2001MI000779A ITMI20010779A ITMI20010779A1 IT MI20010779 A1 ITMI20010779 A1 IT MI20010779A1 IT 2001MI000779 A IT2001MI000779 A IT 2001MI000779A IT MI20010779 A ITMI20010779 A IT MI20010779A IT MI20010779 A1 ITMI20010779 A1 IT MI20010779A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- molecular weight
- degree
- sulfation
- pharmaceutical composition
- distribution
- Prior art date
Links
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 title claims description 22
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title description 25
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title description 4
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 title description 2
- -1 SULPHATE POLYSACCHARIDES Chemical class 0.000 title 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims description 43
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 28
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 27
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 11
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 9
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022211 Arteriovenous Malformations Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 3
- 230000005744 arteriovenous malformation Effects 0.000 claims description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 claims description 3
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims description 2
- 206010037649 Pyogenic granuloma Diseases 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Chemical compound O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 7
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- OFQCQIGMURIECL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(diethylamino)ethyl]-2',6'-dimethylspiro[isoquinoline-4,4'-oxane]-1,3-dione;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.O=C1N(CCN(CC)CC)C(=O)C2=CC=CC=C2C21CC(C)OC(C)C2 OFQCQIGMURIECL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical class [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Chemical class 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Chemical class 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000964 angiostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N cytochalasin D Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@H]\3[C@]2([C@@H](/C=C/[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)C/C=C/3)OC(C)=O)C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical group 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 125000005270 trialkylamine group Chemical group 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-(4,4-dimethyl-2-oxoimidazolidin-1-yl)-n-[3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(C)(C)CN1C(N=C1N)=NC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N Carbon-13 Chemical compound [13C] OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N N-methyl-DL-tyrosine Natural products CNC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 210000002403 aortic endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical class O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 1
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 1
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 159000000011 group IA salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012493 hydrazine sulfate Substances 0.000 description 1
- 229910000377 hydrazine sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Descrizione dell’invenzione che ha per titolo:
“Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi”
Contesto dell'invenzione
E' noto che l'angiogenesi o neovascolarizzazione può rappresentare sia un processo fisiologico sia un processo patologico. L'angiogenesi occorre raramente nell'individuo adulto con l'eccezione dell'apparato riproduttivo femminile, dove essa avviene nell'ovaio e nell'endometrio durante il ciclo mestruale e nella placenta durante la gravidanza.
L'angiogenesi svolge inoltre un ruolo importante nei fenomeni infiammatori e nei processi di riparazione delle ferite.
Tali processi angiogenetici sono limitati nel tempo e rigorosamente regolati. Un processo angiogenetico incontrollato è invece alla base di numerose patologie che, per tale ragione, sono definite "angiogenesi dipendenti". Si citano ad esempio in campo oftalmologico la retinopatia diabetica, la neovascolarizzazione della cornea trapiantata, il glaucoma neovascolare, il tracoma e la fibrodisplasia retrolentale. In dermatologia si citano la psoriasi e il glaucoma piogenico. A livello cardiovascolare l'angiogenesi è coinvolta nello sviluppo della placca aterosclerotica, nell'emangioma ed angiofibroma e nelle malformazioni artero-venose. Si osserva inoltre angiogenesi in corso di artrite.
Infine l'angiogenesi rappresenta un momento patogenetico fondamentale sia per lo sviluppo del tumore solido sia per la sua diffusione metastatica (Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Med, 1995; 1:27-31).
La crescita dei nuovi capillari è un processo ordinato durante il quale la cellula endoteliale produce enzimi proteolitici, migra verso lo stimolo angiogenetico e prolifera. I nuovi capillari originano delle piccole venule o da capillari preformati, dove si osserva una locale degradazione della membrana basale ad opera di proteasi rilasciate dalle cellule endoteliali. In seguito alla dissoluzione della membrana basale le cellule endoteliali iniziano la migrazione chemiotattica dando origine a gettoni endoteliali. L'abbozzo vasale continua a crescere grazie alla moltiplicazione delle cellule endoteliali della regione medio-distale ed alla migrazione delle cellule endoteliali del polo apicale. I gettoni endoteliali anastomizzano e le cellule endoteliali differenziano dando origine a nuovi vasi (Ausprunk DH, Folkman J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvasc. Res. 1977; 14:53-65).
Tutte le tappe di tale processo possono essere riprodotte in vitro in opportuni modelli sperimentali e possono essere bersaglio dell'azione di potenziali agenti ad attività angiostatica. Inoltre sostanze potenzialmente angiostatiche possono essere saggiate in vivo in modelli animali quali la membrana corioallantoidea di embrione di pollo (Auerbach W., Auerbach R. Angiogenesis inhibition: a review. Pharmac. Ther. 1994; 63: 265-311).
Tecnica anteriore
Sono note sostanze atte all'inibizione dell'angiogenesi quali suramina, citocalasina D, TGF beta e genisteina le quali, tuttavia, presentano vari inconvenienti per quanto riguarda la loro somministrazione come farmaci. E' inoltre noto che il polisaccaride capsulare K5 isolato da ceppi di Escherichia coli (qui di seguito chiamato anche semplicemente "K5") descritto da W.F. Vann et al. (1981) in Eur. J. Biochem 116, 359-364, mostra la stessa sequenza del precursore del’eparina e dell’eparansolfato (N-acetileparosano) ed è chimicamente costituito da sequenze ripetitive di unità disaccaridiche formate da acido d-glucuronico e da N-acetilglucosamina uniti con un legame a 1-4, mentre il legame tra le diverse unità disaccaridiche dglucoronil-N-acetilglucosamina è β 1-4. La sola differenza, del tutto ininfluente sulle proprietà biologiche del K5 e i suoi derivati, tra l'Ν-acetileparosano precursore dell'eparina e il polisaccaride K5 risiede nella presenza, in certe catene polisaccaridiche, di un doppio legame nella posizione 4(5) deH'estremità non riducente del K5, come per esempio riportato nei documenti EP 489647 e EP 544592 qui sotto menzionati.
Dopo questa prima divulgazione, numerose altre pubblicazioni e domande di brevetto hanno descritto la preparazione di K5 da Escherichia coli aventi dei pesi molecolari variabili dalle poche migliaia alle molte centinaia di migliaia di Dalton. Si citano per esempio EP 333243, IT 1230785, EP 489647, EP 544592, WO 92/17507, WO 01/02597, nonché la pubblicazione di M. Manzoni et al. (1996), Journal Bioactive and Compatible Polymers, 11, 301-311.
Inoltre, il K5 proveniente da fermentazione è stato chimicamente modificato in modo da ottenere prodotti che mimassero l'eparina. Così, tra i documenti sopra citati, WO 92/17507, EP 489647 e EP 544592 descrivono eparosani Ν,Ο-solfati di basso e di elevato peso molecolare aventi attività anticoagulante-antitrombotica, IT 1230785 e WO 92/17507 descrivono derivati del K5, N-deacetilato-N,0-solfato aventi un certo numero di unità glucuroniche epimerizzate in C5 in unità iduroniche. Inoltre, WO 98/34958 descrive derivati O-solfatati del polisaccaride K5 ad attività anti-metastatica ed antivirale. Derivati Ν,Ο-solfati del polisaccaride K5 N-deacetilato, pure aventi attività anti-metastatica, sono descritti in WO 98/09636. 1 derivati Ν,Ο-solfati del K5 descritti in questi riferimenti hanno un grado di solfatazione che va da 1,6 a 3,1, mentre il grado di solfatazione dei K5-0-solfati può arrivare anche a un valore di 4.
Casu et al. (1994), Carbohydrate Research, 263, 271-284, descrivono la N-deacetilazione del K5, la N-solfatazione e tre metodi di O-solfatazione indicati con B, C e AC. Secondo il metodo C, che prevede la solfatazione del K5 N-solfato utilizzando 10 moli equivalenti di agente solfatante per ossidrile libero e operando a 25-55° C per un periodo di tempo da 1 a 24 ore, si ottiene, dopo ulteriore N-solfatazione, prodotti polisolfati con rapporto solfati/carbossili massimo di 3,1.
Qui di seguito, i derivati del polisaccaride K5, verranno anche così designati: "K5-deacetilato" il polisaccaride K5 N-deacetilato, "K5-N-solfato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N-solfatato, "K5-N,0-solfato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N,0-solfato e "K5-N,0-supersolfatato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N,0-solfatato ad elevato grado di solfatazione otenibile seguendo il "Metodo C" della pubblicazione Casu et al. sopra citata. L'espressione "condizioni di O-supersolfatazione" indica condizioni di O-solfatazione spinta, come quella del Metodo C suddeto, con 2 a 10 moli di SO3/OH libero a 25-55°C per 1-24 ore. Con "grado di solfatazione" si designa il numero di gruppi solfati per unità disaccaridica, espresso come rapporto solfati/carbossili (SO3VCOO') determinato secondo Casu et al., 1975, Carbohydrate Research, 39, 168-176.
L’invenzione si basa sull'ipotesi che polisaccaridi Ν,Ο-solfati provenienti da K5 possano avere elevata atività antiangiogenetica, con basso rischio emorragico e che detti K5-N,0-solfati possano essere usati nel trattamento delle patologie angiogenesi-dipendenti.
Tuttavia, la Ν,Ο-solfatazione del K5 previamente N-deacetilato avviene con difficoltà e la leteratura descrive polisaccaridi da K5 Ν,Ο-solfati il cui grado di solfatazione non arriva a 3,2.
Riassunto dell'invenzione
E’ stato ora trovato che K5-N,0-solfati aventi grado di solfatazione di almeno 2 esercitano una marcata attività antiangiogenetica in vivo con un favorevole rapporto rispeto all’atività anticoagulante globale.
E' stato inoltre trovato che purificando il K5, otenuto per fermentazione, mediante trattamento con isopropanolo in una soluzione fortemente salina si ottiene un polisaccaride K5 puro sostanzialmente privo di sostanze lipofile e che, sotoponendo deto K5 privo di sostanze lipofile a N-deacetilazione, N-solfatazione, O-solfatazione nelle condizioni di O-supersolfatazione e, eventualmente, a una nuova N-solfatazione, si otengono K5-N,0-supersolfatati che hanno un grado di solfatazione superiore a 3,2. Anche questi K5-N,0-supersolfatati posseggono elevata attività antiangiogenetica in vivo con favorevole rapporto rispeto all'atività anticoagulante globale.
Deti K5-N,0-solfati aventi grado di solfatazione di almeno 2 possono quindi essere impiegati nella preparazione di composizioni farmaceutiche ate al trattamento delle patologie angiogenesi-dipendenti a dosi in cui il rischio di effetti collaterali emorragici è estremamente ridoto.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Così, secondo imo dei suoi aspeti, la presente invenzione si riferisce all’uso di K5-N,0-solfati aventi un grado di solfatazione di almeno 2, o dei loro sali farmaceuticamente accettabili, per la preparazione di medicamenti per combatere le patologie angiogenesi-dipendenti.
In particolare, i K5-N,0-solfati a grado di solfatazione di almeno 2 e i loro sali hanno una grande affinità per i fatori di crescita come ad esempio il fatore di crescita basico dei fibroblasti (FGF2) ed esercitano una marcata attività antiangiogenetica in vitro ed in vivo. Questi composti sono ativi nell'inibizione di tute le tappe dell'angiogenesi ed in particolare inibiscono il legame del fatore di crescita angiogenetico FGF2 ai suoi recetori ad alta affinità ed ai proteoglicani eparansolfati della superficie cellulare, la proliferazione indotta da FGF2 su cellule endoteliali in coltura, la formazione di gettoni pluricellulari in gel di fibrina ed il differenziamento su matrice extracellulare di cellule endoteliali. Essi inibiscono inoltre in vivo la neovascolarizzazione su membrana corioallantoidea di embrione di pollo. Condizione essenziale perché un prodotto sia considerato un buon farmaco antiangiogenetico è che esso mostri una buona attività in tutti i tests. I K5-Ν,Ο-solfati a grado di solfatazione di almeno 2, o comunque da 2 a 4, specialmente quelli con grado di solfatazione da 2,5 a 4, in particolare i K5-Ν,Ο-supersolfatati con grado di solfatazione da 3,2 a 4, vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4, sono in genere attivi in tutti i tests suddetti e saranno qui di seguito globalmente designati “principi attivi” dell’invenzione. L’espressione “principi attivi” include anche i sali farmaceuticamente accettabili dei K5-N,0-solfati a grado di solfatazione di almeno 2 sopra illustrati.
Le varie tappe dell'angiogenesi sono inibite dai principi attivi della presente invenzione a concentrazioni da 0,01 a 100 μg/ml nei test in vitro ed a dosi comprese fra 10 e 50 μg per impianto su membrana corioallantoidea.
Così, secondo un altro dei suoi aspetti, la presente invenzione concerne un metodo per trattare malattie angiogenesi-dipendenti in mammiferi, comprendente il somministrare a un mammifero che abbisogna di un tale trattamento, una quantità efficace di un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di almeno 2, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile. Più particolarmente, il K5 Ν,Ο-solfato utilizzato per tale metodo avrà un grado di solfatazione da 2,5 a 4, o sarà un K5-N,0-supersolfatato a grado di solfatazione da 3,2 a 4, vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4.
Tra i sali del K5-N,0-solfato suddetto, i sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco sono i preferiti.
I principi attivi dell'invenzione presentano preferibilmente pesi molecolari medi compresi tra circa 2.000 e circa 65.000, vantaggiosamente tra circa 2.500 e circa 20.000 dalton (D). Tutti i pesi molecolari indicati qui di seguito sono intesi essere espressi in Dalton e calcolati secondo Harenberg et al. Journal Chromatography (1983), 261, 287-292.
Malattie angiogenesi-dipendenti .che possono essere trattate con i principi attivi dell’ invenzione sono per esempio, tra quelle che si riscontrano nella specie umana, la retinopatia diabetica, la neovascolarizzazione della cornea trapiantata, il glaucoma neovascolare, il tracoma, la fibrodisplasia retrolentale, la psoriasi, il glaucoma piogenico, lo sviluppo della placca aterosclerotica, emangioma ed angiofibroma, malformazioni arterovenose, artrite, e nella terapia combinatoriale dei tumori solidi.
I K5-N,0-supersolfatati aventi un grado di solfatazione da 3,2 a 4 sono preparati mediante un procedimento caratterizzato dal fatto che
(a) si tratta un K5 proveniente da fermentazione con isopropanolo in soluzione acquosa fortemente salina;
(b) si sottopone il K5 così purificato a ima N-deacetilazione mediante idrolisi alcalina ed a una successiva N-solfatazione mediante trattamento con un agente N-solfatante;
(c) si tratta un sale ammonico del K5-N-solfato così ottenuto con un agente di O-solfatazione nelle condizioni di O-supersolfatazione; e
(d) se necessario si sottopone il prodotto così ottenuto ad una N-risolfatazione e si isola il K5-N,0-supersolfatato sotto forma di sale di sodio che, eventualmente, viene convertito in un altro sale.
Nel passaggio (a), il K5 utilizzato come materiale di partenza può essere uno qualsiasi dei prodotti ottenuti per fermentazione di ceppi di Escherichia coli selvaggi o ricombinanti, produttori di K5. In particolare, possono essere impiegati i K5 descritti in letteratura come quelli sopra citati, vantaggiosamente quelli descritti da M. Manzoni et al. Journal Bioactive and Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 e quello illustrato nella PREPARAZIONE I qui di seguito.
Più vantaggiosamente, il K5 di partenza avrà un peso molecolare basso, in particolare con una distribuzione da circa 1.500 a circa 15.000, preferibilmente da circa 2.000 a circa 9.000, con un peso molecolare medio di circa 5.000, oppure un peso molecolare medio, in particolare con una distribuzione da circa 10.000 a circa 50.000, preferibilmente da circa 20.000 a circa 40.000, con un peso molecolare medio di circa 30.000. Preferibilmente, il K5 di partenza avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 1.500 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di 20.000-25.000.
il peso molecolare del K5 e quello dei suoi derivati qui descritti è inteso calcolato utilizzando come standard delle frazioni di eparina a peso molecolare noto.
Il prodotto di partenza può essere un K5 previamente purificato da cui, per esempio, sono state eliminate le endotossine, le sostanze pirogene o altre impurezze mediante metodi noti.
Analogamente, nel caso in cui il K5 ottenuto al termine del passaggio (a) dovesse essere impiegato per scopi farmaceutici o per la preparazione di K5-Ν,Ο-solfati ad uso farmaceutico, esso potrebbe essere liberato dalle sostanze pirogene e dalle endotossine.
In pratica, il K5 di partenza viene disciolto in una soluzione salina 2-5 M, preferibilmente di cloruro di sodio, ad una concentrazione da 0,5 a 10% e la soluzione così ottenuta, portata a 2 - 4 M mediante ulteriore aggiunta di sale, preferibilmente cloruro di sodio, viene trattata con 1-3 volumi di isopropanolo ad una temperatura di 0 - 8°C.
Dopo 1 - 18 ore alla stessa temperatura, il prodotto del passaggio (a) precipita completamente e viene isolato mediante filtrazione o centrifugazione. Se la purezza del prodotto non è soddisfacente, il procedimento del passaggio (a) viene ripetuto. Il prodotto solido così ottenuto viene ridisciolto in acqua e recuperato mediante ultrafiltrazione su membrana.
Alla fine del passaggio (a) si ottiene un K5 avente le stesse caratteristiche del prodotto di partenza ma che è sostanzialmente privo di sostanze lipofile.
In pratica, il K5 privo di sostanze lipofile è ottenibile mediante un procedimento caratterizzato dal fatto che (al) si tratta un K5 proveniente da fermentazione, disciolto in ima soluzione di cloruro sodico 4 M a 4°C con 1 volume di isopropanolo, (a2) si porta la soluzione salina a una concentrazione 3 M per aggiunta della quantità calcolata di una soluzione satura di cloruro sodico, (a3) si lascia la soluzione a 4°C per una notte e (a4) si isola il prodotto per centrifugazione e si eliminano i sali per ultrafiltrazione.
Mediante la purificazione con isopropanolo è così possibile ottenere un K5 privo di sostanze lipofile che ha una purezza superiore al 99%. Questo K5 permette di ottenere, nel successivo passaggio (c), una O-solfatazione elevata. Nel passaggio (b), la N-deacetilazione viene effettuata secondo le procedure di idrolisi alcalina note, per esempio con idrazina solfato in idrazina oppure con una base come un idrossido alcalino, per esempio l'idrossido di sodio o di potassio, in acqua. Preferibilmente, la reazione viene condotta in una soluzione acquosa di idrossido sodico ad una temperatura di 40-80°C, controllando l'andamento della reazione. In generale, dopo al massimo 30 ore, ma in pratica dopo 12-24 ore, la N-deacetilazione è completa e l'alcalinità del mezzo viene neutralizzata mediante trattamento con un acido, preferibilmente acido cloridrico.
La soluzione contenente il K5 e i sali viene successivamente trattata con un agente di N-solfatazione come l'addotto di una base organica terziaria con anidride solforica (triossido di zolfo), per esempio piridina.triossido di zolfo (C5H5N.SO3) o una trialchilammina.triossido di zolfo, come trimetilammina.triossido di zolfo in presenza di un carbonato alcalino, per esempio il carbonato sodico. La reazione può essere effettuata a temperatura ambiente (20-30°C), ma è possibile anche operare a temperature più elevate (fino a circa 65 °C) al fine di abbreviare i tempi di reazione. L'addizione del carbonato alcalino e dell'agente solfatante può essere effettuata contemporaneamente oppure il carbonato alcalino viene introdotto tutto in una volta e l'agente solfatante viene aggiunto successivamente, a porzioni, in un periodo di tempo che può andare dai cinque minuti alle 12 ore. Alla fine della reazione la miscela, a temperatura ambiente, viene portata ad un pH di 7,5-8 mediante un acido, preferibilmente acido cloridrico ed i sali presenti vengono eliminati per esempio mediante diafiltrazione. La soluzione così ottenuta, contenente il K5-N-solfato sotto forma di sale alcalino, può essere passata al successivo passaggio (c), oppure può essere concentrata e il K5-N-solfato può essere isolato come sale di sodio secondo metodi convenzionali. Il K5-N-solfato così ottenuto è solfatato al 90-100%
Nel passaggio (c) una soluzione contenente K5-N-solfato , così come ottenuto nel passaggio (b), viene passata su resina a scambio cationico, come IR 120 H<+ >fino a un pH acido. La soluzione acida così ottenuta viene trattata con una base organica terziaria o quaternaria, per esempio con una trialchilammina come tributilammina, o con l'idrossido di un tetraalchilammonio, preferibilmente tetrabutilammonio idrossido, ridotta a minimo volume e liofilizzata. il sale di ammonio del K5-N-solfato così isolato viene sospeso in un solvente polare aprotico come dimetilformammide o dimetilsolfossido e trattato con un agente O-solfatante, per esempio con l'addotto C5H5N.SO3. L'addotto C5H5N.SO3 può essere utilizzato sia allo stato solido che in soluzione nello stesso solvente aprotico polare. La solfatazione viene condotta ad una temperatura che può variare dalla temperatura ambiente (20-30°C) a 70°C, preferibilmente da 40 a 60°C, per un periodo di tempo da 2 a 24 ore. Alla fine della reazione, la soluzione, a temperatura ambiente, è trattata con acetone saturato con cloruro sodico fino a completa precipitazione. Il precipitato è separato dal solvente per filtrazione, disciolto nella minima quantità (per esempio 100 mi) di acqua deionizzata ed alla soluzione viene aggiunto cloruro sodico fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione è portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2N e trattata con acetone fino a completa precipitazione. Dopo filtrazione, il solido viene sciolto in 100 ml di acqua deionizzata e purificato dai sali residui mediante ultrafiltrazione come sopra descritto nel passaggio (b).
Se, dall'analisi mediante 13C-RMN di un campione liofilizzato del prodotto così ottenuto, si constata che durante la supersolfatazione si è verificata una parziale N-desolfatazione, il resto del prodotto viene sottoposto al passaggio (d).
Nel passaggio (d), il prodotto ottenuto al termine del passaggio (c) viene trattato con un agente di N-solfatazione operando nelle condizioni del passaggio (b) suddetto fino a N-solfatazione completa, ripetendo l’operazione se l'Ν-solfatazione non risulta completa.
Il K5-N,0-supersolfatato così ottenuto viene isolato sotto forma di sale sodico, che può essere trasformato in un altro sale, come il sale di potassio, di calcio, di magnesio, di alluminio, di zinco, o in sali complessi secondo metodi noti, per esempio mediante scambio ionico con opportuna resina, mediante precipitazione con solventi oppure mediante ultrafiltrazione attraverso membrane.
La purezza del nuovo K5 purificato, ottenuto per fermentazione, può essere verificata sia mediante esame dello spettro di RMN del protone, sia mediante esame dello spettro ultravioletto, sia mediante un esame secondo il test al carbazolo, sia mediante un kit per la determinazione delle proteine. In questi esami, è stato dimostrato che il K5 ottenuto alla fine del passaggio (a) ha, come caratteristica essenziale, uno spettro 1H-RMN in cui sono assenti segnali nella zona inferiore a 1,5 ppm. Inoltre gli acidi nucleici sono non determinabili, (assorbenza 0 a 260 nm con uno spettrofotometro UV standard) e le proteine sono inferiori a 0,5% secondo kit Biorad.
In effetti, il nuovo K5 puro ottenuto alla fine del passaggio (a) è privo di sostanze lipofile e di acidi nucleici. L'uso di "sostanzialmente", riferito all'assenza di sostanze lipofile, e di "non determinabile", riferito agli acidi nucleici tiene conto della sensibilità degli strumenti impiegati che non hanno rivelato le impurezze suddette.
Si è dunque constatato, che lo spettro di RMN del protone del polisaccaride K5 puro così ottenuto manca di segnali a ppm < 1,5 propri del metile di sostanze lipofile.
I nuovi K5 così purificati, che permettono la preparazione di K5-N,0-supersolfatati a elevato grado di solfatazione, hanno di preferenza un peso molecolare basso, in particolare con ima distribuzione da circa 1.500 a circa 15.000, preferibilmente da circa 2.000 a circa 9.000, con un peso molecolare medio di circa 5.000, oppure un peso molecolare un po' più elevato, in particolare con una distribuzione da circa 10.000 a circa 50.000, preferibilmente da circa 20.000 a circa 40.000 con un peso molecolare medio di circa 30.000. Preferibilmente, il K5 di partenza avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 1.500 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di 20.000-25.000.
I K5-N,0-solfati a grado di solfatazione superiore a 2, come sopra illustrati, specialmente sotto forma dei loro sali farmaceuticamente accettabili, sono principi attivi di composizioni farmaceutiche destinate al trattamento di patologie angiogenesi-dipendenti.
Vantaggiosamente, detti K5-N,0-solfati hanno un peso molecolare basso, in particolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000 preferibilmente da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500, oppure un peso molecolare un po' più elevato, in particolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000, preferibilmente da circa 25.000 a circa 50.000 con un peso molecolare medio di circa 40.000. Preferibilmente, il K5-N,0-solfato per l’uso della presente invenzione avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000. Anche K5-N,0-solfati aventi un peso molecolare medio molto basso, per esempio da 2.000 a 5.000, ottenuti per depolimerizzazione, costituiscono prodotti particolarmente interessanti.
Nel caso di K5-N,0-supersolfatati la depolimerizzazione che permette di preparare i prodotti di peso molecolare medio da 2.000 a 5.000 può essere effettuata alla fine di imo dei passaggi (b)-(d) del procedimento sopra illustrato, preferibilmente alla fine del passaggio (b) oppure sul K5-N,0-supersolfatato finale.
La depolimerizzazione può essere effettuata secondo uno dei metodi noti per la depolimerizzazione dell'eparina, per esempio mediante acido nitroso e successiva riduzione con boroidruro di sodio (EP 37319), mediante periodato (EP 287477), mediante radicali liberi (EP 121067) o mediante β-eliminazione (EP 40144). Nel caso del K5-N,0-supersolfatato, la depolimerizzazione viene vantaggiosamente condotta su un K5-N-solfato ottenuto al termine del passaggio (b) con acido nitroso e successiva riduzione con sodio boroidruro come descritto in dettaglio in EP 544592. Al termine della depolimerizzazione e riduzione, il prodotto a basso peso molecolare così ottenuto viene sottoposto ai passaggi (c) e, eventualmente, (d) e si isola il K5-N,0-supersolfatato a basso peso molecolare.
Tra i sali dei K5-N,0-solfati a grado di solfatazione di almeno 2 sopra illustrati, i sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco sono principi attivi preferiti.
Per i previsti impieghi terapeutici, i principi attivi della presente invenzione e i loro sali saranno formulati secondo tecniche convenzionali in adatte forme di somministrazione quali ad esempio soluzioni sterili, forme di dosaggio topiche e, in generale, in tutte quelle forme fino ad oggi proposte per derivati di tipo polisaccaridico o di glicosamminoglicani. Anche i dosaggi terapeutici saranno scelti in analogia a quelli già studiati per i composti naturali noti. La somministrazione del principio attivo può avvenire per via orale, transcutanea o preferibilmente parenterale, in particolare sottocutanea, intramuscolare o endovenosa oppure topica o ancora transmucosa, quale ad esempio la somministrazione per via nasale.
Nell'uomo, il dosaggio giornaliero per la somministrazione parenterale è previsto in 0,5 - 500 mg/Kg/die, vantaggiosamente in 5 - 250 mg/Kg/die, preferibilmente in 10 - 150 mg/Kg/die, mentre il dosaggio previsto per via topica è di 1 - 1000 mg/Kg/die, vantaggiosamente 10 - 500 mg/Kg/die, preferibilmente 20 - 100 mg/Kg/die.
Per la loro somministrazione, i principi attivi dell’invenzione vengono formulati in composizioni farmaceutiche atte al trattamento delle patologie angiogenesi-dipendenti come quelle sopra ricordate.
Così, secondo un altro dei suoi aspetti, la presente invenzione concerne una composizione farmaceutica per il trattamento di patologie angiogenesidipendenti che comprende, in qualità di un suo principio attivo, una quantità farmacologicamente efficace di un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di almeno 2, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile, preferibilmente in miscela con un veicolo o eccipiente farmaceutico.
Detto K5-N,0-solfato può avere una delle altre caratteristiche di grado di solfatazione e di peso molecolare qui sopra illustrate.
Un sale scelto nel gruppo consistente nei sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco costituisce valido principio attivo delle composizioni della presente invenzione.
Nelle composizioni farmaceutiche della presente invenzione per la somministrazione orale sottocutanea, endovenosa, intramuscolare, transdermica, transmucosa o topica, i principi attivi sono preferibilmente somministrati sotto forma di unità di dosaggio, in miscela con i classici eccipienti o veicoli farmaceutici. La posologia può variare ampiamente in funzione dell'età, del peso, e delle condizioni di salute del paziente, come pure della gravità dell'infezione e dalla via di somministrazione. Questa posologia comprende la somministrazione di una unità di dosaggio da 1 a 1000 mg, vantaggiosamente da 10 a 750 mg, preferibilmente da 250 a 500 mg, da ima a tre volte al giorno per via endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, orale, transdermica, transmucosa o topica.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione concerne un metodo per trattare le patologie angiogenesi-dipendenti, che comprende il somministrare al paziente che abbisogna di un tale trattamento una quantità efficace di un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di almeno 2 , specialmente da 2,5 a 4, vantaggiosamente una quantità efficace di un K5-N,0-supersolfatato avente un grado di solfatazione da 3,2 a 4, vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile. Il metodo dell’invenzione viene realizzato somministrando una composizione farmaceutica contenente un principio attivo secondo l’invenzione in unità di dosaggio e alle dosi giornaliere come quelle illustrate qui sopra.
Vantaggiosamente il metodo dell’ invenzione prevede per la somministrazione parenterale una posologia da 0,5 a 500 mg/Kg/die e per la somministrazione topica una posologia da 1 a 1.000 mg/Kg/die.
I seguenti esempi illustrano l'invenzione.
PREPARAZIONE I
Preparazione del polisaccaride K5 da Escherichia coli
Viene dapprima eseguita una fermentazione in beuta utilizzando il seguente medium:
Il medium viene sterilizzato a 120°C per 20 minuti. Il glucosio viene preparato separatamente in forma di soluzione che viene sterilizzata a 120°C per 30 minuti e addizionata sterilmente al medium. La beuta viene inoculata con una sospensione di cellule di E. coli Bi 8337/41 (O10:K5:H4) proveniente da uno slant tenuto in Triptic soy agar, e incubata a 37°C per 24 ore sotto agitazione controllata (160 rpm, 6 cm di corsa). La crescita batterica si misura contando le cellule con il microscopio. In un’operazione successiva, un fermentatore Chemap-Braun da 141 contenente lo stesso medium di cui sopra, viene inoculato allo 0,1% con la coltura della beuta di cui sopra e si effettua la fermentazione mediante aerazione di 1 wm, (wm = volume di aria per volume di liquido per minuto) agitazione 400 rpm e temperatura di 37°C per 18 ore. Durante la fermentazione vengono misurati il pH, l’ossigeno, il glucosio residuo, il polisaccaride K5 prodotto e la crescita batterica. Alla fine della fermentazione la temperatura viene portata a 80°C per 10 minuti. Le cellule vengono separate dal medium tramite centrifugazione a 10.000 rpm e il sumatante viene ultrafiltrato usando un modulo SS 316 (MST) equipaggiato con membrane PES con cut-off nominale di 800 e 10.000 D per ridurre il volume a 1/5. D polisaccaride K5 viene quindi precipitato mediante addizione di 4 volumi di acetone a 4°C e lasciato a sedimentare per una notte a 4°C. Infine viene recuperato mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 20 minuti o filtrazione. Si esegue poi la deproteinizzazione del solido ottenuto utilizzando una proteasi di tipo Π da Aspergili us orizae in tampone di NaCl 0,1 M e EDTA 0,15 M a pH 8 contenente SDS (sodio dodecil solfato) allo 0,5% (10 mg/1 di filtrato) a 37°C per 90 minuti. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su modello SS 316 con membrane a cut-off nominale di 10.000 D con 2 estrazioni con NaCl 1M e lavata con acqua fino a scomparsa dell’ assorbenza neH’ultrafiltrato. Il polisaccaride K5 viene quindi precipitato con acetone e si ottiene una resa di 850 mg per litro di fermentatore. La purezza del polisaccaride ottenuto viene misurata tramite la determinazione degli acidi uranici (metodo al carbazolo), NMR al protone e al carbonio 13, UV e contenuto di proteine. La purezza risulta maggiore dell’ 80%.
Il polisaccaride ottenuto, avente un peso molecolare medio di circa 15.000 è composto da due frazioni a diverso peso molecolare, rispettivamente 30.000 e 5.000 D come risulta dalla determinazione mediante HPLC impiegando una colonna Pharmacia Superdex TM 75 HR e una frazione singola con un tempo di ritenzione di circa 9 minuti usando due colonne in serie di Bio-sil SEC 250 (Bio Rad) e Na2SO4 come fase mobile a temperatura ambiente e flusso di 0,5 Il/minuti. La misura viene effettuata contro una curva standard ottenuta con frazioni di eparina a peso molecolare noto.
Lo spettro 1H- RMN del K5 così ottenuto mostra che nella zona sotto 1,5 ppm sono presenti diversi segnali attribuibili a metili di sostanze lipofile.
PREPARAZIONE II
Preparazione di un K5 privo di sostanze lipofile A 100 mi di una soluzione acquosa contenente di cloruro di sodio 4M e termostatata a 4°C vengono sciolti 5 g del K5 ottenuto alla fine della PREPARAZIONE I e alla soluzione così ottenuta viene addizionato 1 volume di isopropanolo freddo. La concentrazione salina della soluzione viene portata a 3 M mediante aggiunta della quantità calcolata di una soluzione satura di cloruro sodico e si lascia la soluzione ottenuta in ambiente freddo (circa 4°C) per una notte. Il precipitato formatosi viene separato mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 20 minuti e la purezza del prodotto viene controllata mediante dialisi per una notte e successivo esame dello spettro 1H-RMN, da cui devono essere assenti segnali nella regione sotto 1,5 ppm. Se necessario, l'operazione di dissoluzione in acqua contenente NaCl 4 M e precipitazione con isopropanolo viene ripetuta. Il precipitato viene sciolto in acqua e ultrafiltrato su membrana Miniplate Millipore cut off 10.000 D fino a scomparsa dei sali. Si ottiene così un K5 avente una purezza di almeno il 99% nel cui spettro 1H-RMN non si nota alcuna traccia di impurezze lipofile nella regione sotto 1,5 ppm.
Il contenuto in proteine calcolato con il kit BioRad risulta essere 0,02 % e gli acidi nucleici non determinabili (assorbenza 0 a 260 nm).
PREPARAZIONE ΙII
Preparazione di un K5-N, O-supersolfatato
(i) N-Deacetilazione
Dieci grammi di polisaccaride K5 puro preparato come descritto nella PREPARAZIONE I e purificato come descritto nella PREPARAZIONE Π vengono solubilizzati con 1.000 mi di sodio idrossido 2N e la soluzione così preparata viene lasciata a 60 °C per 24 ore. La soluzione viene portata a temperatura ambiente quindi a pH neutro (pH7) con acido cloridrico 6N.
(ii) N-solfatazione
Alla soluzione contenente il K5 deacetilato, mantenuta a 40 °C, vengono aggiunti 16 g di sodio carbonato e successivamente in 4 ore, 16 g di piridina.solfotriossido. Alla fine della reazione, dopo 24 ore, la soluzione viene portata a temperatura ambiente, poi a pH 7,5-8 con una soluzione al 5% di acido cloridrico. Il prodotto viene purificato dai sali mediante diafiltrazione usando una membrana a spirale avvolta da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore). Il processo viene terminato quando la conducibilità del permeato è inferiore a 1.000 pS, preferibilmente inferiore a 100 pS. L’intradialisi si riduce fino ad ottenere una concentrazione del polisaccaride del 10% usando lo stesso sistema da dialisi in concentrazione. La soluzione concentrata viene essiccata mediante liofilizzazione. All'analisi dello spettro <13>C-RMN non appaiono N-acetili o NH2 residui.
(iii) O-supersolfatazione
11 prodotto liofilizzato ottenuto alla fine del passaggio (ii), viene disciolto in 100 mi di acqua deionizzata, e la soluzione portata a 10 °C con bagno raffreddato quindi passata su resina a scambio cationico IR- 120 H<+ >(100 ml). Sia la colonna che il contenitore dell’eluato sono mantenuti a 10°C. Dopo il passaggio della soluzione contenente il campione la resina viene lavata con acqua deionizzata fino a che il pH del permeato è maggiore di 6 (circa 3 volumi di acqua deionizzata). La soluzione acida viene portata a neutralità (pH 7) con tetrabutilammonio idrossido (soluzione acquosa al 15%) quindi ridotta a volume minimo e liofilizzata. Il sale di tetrabutilammonio viene disciolto in 400 ml di dimetilformammide e addizionato con 35 g di l’addotto C5H5N.S03 in forma solida. La soluzione viene mantenuta a 50°C per 24 ore. Alla fine della reazione la soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente e addizionata con 3 volumi di acetone saturato con sodio cloniro, raffreddata a 4°C fino a completa precipitazione (12 ore). Il precipitato viene separato dal solvente tramite filtrazione, solubilizzato con la minima quantità di acqua deionizzata (circa 100 mi) e alla soluzione si aggiunge sodio cloruro fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione viene portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2 N e trattata con due volumi di acetone fino a completa precipitazione. Il precipitato viene separato dal solvente mediante filtrazione. Il solido ottenuto viene solubilizzato con 100 mi di acqua deionizzata e purificato dai sali residui tramite ultrafiltrazione come descritto nel passaggio (ii) usando una membrana a spirale avvolta da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore).
(iv) N-solfatazione
La soluzione così ottenuta, contenente il prodotto O-solfatato, viene trattata come descritto in precedenza nel passaggio (ii) per la N-solfatazione. Il K5-Ν,Ο-supersolfatato così preparato, designato K5-N,OS(H) presenta un peso molecolare medio di 15.000 D e un rapporto solfati/carbossili di 3,84. La distribuzione dei gruppi solfati, determinata allo spettro <13>C-RMN, è la seguente: l'unità glucosamminica del disaccaride costitutivo è N-solfatata e 6-O-solfatata al 100%, mentre, per quanto riguarda le unità glucuroniche, il 70% è O-disolfatato e il 30% è mono O-solfato.
PREPARAZIONE IV
Preparazione di un K5 -NO-super solfatato
Operando come descritto nella preparazione III,I a partire da un K5 ottenuto e caratterizzato come descritto da M. Manzoni et al. (1996), purificato come descritto nella preparazione II,I si ottiene un K5-N,0-supersolfatato, designato K5-N,OS(Hl), avente peso molecolare medio di 13.000 e un rapporto solfati/carbossili di 3,54.
PREPARAZIONE V
Preparazione di un K5-N, O-solfatato
Operando come descritto nella PREPARAZIONE III , ma utilizzando nel passaggio (iii) 7 g di addotto C5H5N.S03 , si ottiene un K5-N, O-solfatato, designato K5-N,OS(L) avente un peso molecolare medio di 14.000 e un rapporto solfati/carbossili di 1,7.
PREPARAZIONE VI
Preparazione di un K5-Osupersolfatato
Operando come descritto nel passaggio (iii) della PREPARAZIONE DI su un K5 ottenuto come descritto nella PREPARAZIONE I e purificato come descritto nella PREPARAZIONE II si ottiene un K5 O-supersolfatato, designato K5-OS(H), avente un peso molecolare medio di 18.000 e un rapporto solfati/carbossili di 3,77.
Esempio 1
Un principio attivo rappresentativo dell’invenzione, il K5-N, O-supersolfatato ottenuto secondo la PREPARAZIONE ΙII, rappresentativo della presente invenzione, avente un grado di solfatazione di 3,84 e designato K5-N,OS(H), è stato confrontato con due altri derivati del polisaccaride K5, in particolare con un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di 1,7 e designato K5-N,OS(L), ottenuto come descritto nella PREPARAZIONE V, e con un K5-0-supersolfato avente un grado di solfatazione di 3,77, designato K5-OS(H) e preparato come descritto nella PREPARAZIONE VI. I prodotti in esame sono stati sottoposti a 6 diversi test.
Test 1. Inibizione della formazione del complesso ternario
HSPG/FGF2/FGFR1 .
L'inibizione della formazione del complesso ternario HSPG/FGF2/FGFR1 è stata studiata mediante un saggio di adesione intercellulare come descritto da LIEKENS S., LEALI D., NEYTS J„ ESNOUF R., RUSNATI M., DELL’ERA P., MAUDGAL PC., DE CLERCQ E., e PRESTA M. Modulation of fibroblast growth factor-2 receptor binding, signaling, and mitogenic activity by heparin-mimicking polysulfonated compounds. Mol. Pharmacol. (1999), 56:204-213. In breve, cellule CHO-K1 sono seminate alla densità di 90.000 cellule/cm<2 >in piastre da 24 pozzetti. Dopo 24 ore le cellule sono fissate in 3% glutaraldeide in PBS per 2 ore a 4°C e lavate con 0,1 M glicina/PBS. Sui monostrati fissati vengono quindi seminate cellule CHO 745/flg trasfettate con FGFR-1 alla densità di 50.000 cellule/cm<2 >in DMEM contenente 10 mM EDTA, 30 ng/ml FGF2, e dosi crescenti dei composti K5-N,OS(H), K5-N,OS(L) e K5-OS(H). Dopo 2 ore di incubazione a 37°C, le cellule non adese al monostrato vengono allontanate mediante un lavaggio con PBS e le cellule adese vengono quindi contate al microscopio rovesciato.
I risultati sono espressi come percentuale del numero di cellule adese rispetto a quelle misurate in assenza del composto in esame.
I composti K5-N,OS(H) e K5-N,OS(L) inibiscono l’adesione intercellulare mediata dalla formazione del complesso ternario HSPG/FGF2/FGFR1 in maniera più efficace del composto K5-OS(H).
I risultati di questo test sono riportati in Tabella 1, colonna 2.
Test 2. Inibizione del legame di FGF-2 alle cellule endoteliali.
Cellule endoteliali aortiche bovine venivano seminate alla densità di 80.000/cm<2 >in piastre da 24 pozzetti in terreno MEM Eagle contenente 10% siero fetale bovino (FCS) e venivano così incubate per 24 ore a 37 °C. Al termine dell’incubazione le cellule adese ai pozzetti venivano lavate due volte con MEM-Eagle senza FCS e quindi incubate per 2 ore a 4 °C in MEM-Eagle contenente gelatina allo 0,15%, 20 mM HEPES pH 7,5, 30 ng/ml <125>I-FGF-2 in assenza ed in presenza di 10 mg/ml dei derivati in esame. Al termine dell’incubazione la radioattività associata ai recettori ad alta (FGFR) ed a bassa affinità (HSPGs) era valutata come precedentemente descritto (MOSCATELLI, D (1992) J Biol Chem 267:25803-25809). Brevemente, la radioattività associata agli HSPGs veniva rimossa mediante due lavaggi del monostrato cellulare con tampone HEPES 20 mM pH 7,5 contenente NaCl 2M, mentre la radioattività associata agli FGFRs veniva successivamente recuperata mediante due lavaggi con tampone sodio acetato 20 mM pH 4,5 contenente NaCl 2M. Il legame aspecifico veniva determinato incubando le cellule con <125>I-FGF-2 come descritto in presenza di un eccesso 1 mg/ml di FGF-2 non marcato.
I tre derivati studiati inibiscono con simile efficacia il legame di <125>I-FGF-2 ai suoi recettori FGFR e HSPG.
I risultati sono riportati nella Tabella 1, colonna 3.
Test 3. Inibizione della proliferazione cellulare.
Cellule endoteliali umane da cordone ombelicale (HUVEC) venivano seminate alla concentrazione di 2.500/pozzetto in piastre da 96 pozzetti in terreno EGM-2 completo e venivano così incubate per 24 ore a 37 °C. Al termine dell’incubazione, le cellule adese ai pozzetti venivano lavate due volte con terreno e quindi incubate per ulteriori 72 ore a 37 °C in EGM-2 contenente 2% siero fetale bovino (FCS) in assenza o in presenza di FGF-2 (30 ng/ml) e di dosi crescenti dei tre composti. Al termine dell’incubazione le cellule venivano colorate con cristal-violetto e le piastre lette ad un lettore di piastre ELISA alla lunghezza d'onda di 595 nm.
Solo il derivato K5-N,OS(H) inibisce la proliferazione cellulare in maniera significativa.
I risultati sono mostrati in tabella 1, colonna 4.
Test 4. Inibizione della formazione dì gettoni endoteliali in gel di fibrina. L'inibizione della formazione di gettoni endoteliali in gel di fibrina è stata valutata come descritto da GUALANDRIS A, M. RUSNATI, M. BELLERI, E.E. NELLI, M. BASTAKI, M.P. MOLINARI-TOSATTI, F. BONARDI, S. PAROLINE A. ALBINI, L. MORBIDELLI, M. ZICHE, A. CORALLINI, L. POSSATI, A. VACCA, D. RIBATTI e M. PRESTA, Celi Growth & Diff. (1996), 7, 147-160. In breve, cellule MAE-3F2T sono seminate su gel di agarosio alla densità di 75.000 cellule/cm2 in terreno con 10% FCS per indurre la formazione di aggregati cellulari (sferoidi). Dopo 16 ore gli sferoidi sono raccolti e incorporati in un gel di fibrina al 2,5% contenente aprotinina (50 U/ml). La miscela viene quindi seminata in piastre da 48 pozzetti (0,25 ml/pozzetto) e lasciata gelificare mediante aggiunta di trombina per 10 min a 37°C. Al termine, i tre derivati vengono aggiunti alla dose di 100 μg/ml in terreno contenente 10% FCS ed aprotinina. Le cellule sono osservate dopo 24 dall’ inizio del trattamento.
I derivati K5-OS(H) e K5-N,OS(H) inibiscono completamente la formazione dei gettoni endoteliali, mentre il K5-N,OS(L) è inefficace.
I risultati sono mostrati in Tabella 1, colonna 5.
Test 5. Inibizione del differenziamento endoteliale su Matrigel.
L'inibizione del differenziamento endoteliale su Matrigel è stata valutata come descritto da GUALANDRIS A, M. RUSNATI, M. BELLERI, E.E. NELLI, M. BASTAKI, M.P. MOLINARI-TOSATTI, F. BONARDI, S. PAROLINI, A. ALBINI, L. MORBIDELLI, M. ZICHE, A. CORALLINI, L. POSSATI, A. VACCA, D. RIBATTI e M. PRESTA, Celi Growth & Diff. (1996), 7, 147-160. In breve, cellule MAE-3F2T sono seminate su Matrigel in piastre da 48 pozzetti alla densità di 75.000 cellule/cm<2 >in terreno con 10% FCS. Dopo 20 min dalla semina i derivati in esame vengono aggiunti al terreno alla dose di 100 μg/ml. Le cellule sono osservate al microscopio durante le successive 24 ore.
I prodotti K5-OS(H) e K5-N,OS(H) inibiscono completamente il differenziamento endoteliale, mentre il K5-NOS(L) è inefficace.
I risultati sono mostrati nella Tabella 1, colonna 6.
Test 6. Inibizione dell'angiogenesi in vivo su membrana corioallantoidea (CAM) di embrione di pollo.
Impianti di spugna di Gelfoam (Upjohn) erano applicati sulla CAM di embrioni di pollo all'80 giorno di sviluppo secondo RIBATTI D, GUALANDRIS A, BASTAKI M, IURLARO M, RONCALI L e PRESTA M., (J. Vasc. Res. (1997), 34, 455-463. Immediatamente dopo l'applicazione si pipettavano 5 μl di ima soluzione di fiosiologica salina contenenti 50 μg di derivato del K5. Le spugne erano esaminate ogni giorno fino al 12° giorno d'incubazione. La quantificazione dell'angiogenesi era ottenuta mediante conta del numero di vasi macroscopici osservabili intorno alla spugna ai vari giorni di sviluppo.
Il derivato K5-N,OS(H) inibisce significativamente l’angiogenesi della CAM, mentre i derivati K5-OS(H) e K-5N,OS(L) sono inefficaci.
I risultati sono mostrati in Tabella 1, colonna 7.
I risultati riportati in detta tabella mostrano che il composto K5-N,OS(H), rappresentativo della presente invenzione, è l'unico attivo in tutti i test ed è il più attivo nei test 1, 3 e 6.
Esempio 2
Determinazione dell'attività anticoagulante globale
Per il K5-N,0-solfato rappresentativo dell’invenzione esaminato nell’esempio 1, il K5-N,OS(H), è stata valutata l’attività anticoagulante globale determinando l’aPTT in plasma secondo Andersson et al. (1976) Thrombosis Res. 9, 575 contro il IV Standard internazionale di eparina II campione risulta possedere 40 UI (Unità Intemazionali)/mg rispetto alle 200 UI/mg dell 'eparina standard.
Claims (25)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di almeno 2 o di un suo sale farmaceuticamente accettabile per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate a combattere le patologie angiogenesi-dipendenti.
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-solfato ha un grado di solfatazione da 2,5 a 4.
- 3. Uso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-solfato è un K5-N,0-supersolfatato avente un grado di solfatazione da 3,2 a 4.
- 4. Uso secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,5 a 4.
- 5. Uso secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,7 a 4.
- 6. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-5, caratterizzato dal fatto che dette patologie angiogenesi-dipendenti comprendono la retinopatia diabetica, la neovascolarizzazione della cornea trapiantata, il glaucoma neovascolare, il tracoma, la fibrodisplasia retrolentale, la psoriasi, il granuloma piogenico, lo sviluppo della placca aterosclerotica, emangioma ed angiofibroma, malformazioni artero venose, artrite, ed i tumori solidi.
- 7. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-6, caratterizzato dal fatto che il sale farmaceuticamente accettabile è scelto tra i sali di sodio, di potassio, di calcio, di magnesio, di alluminio e di zinco.
- 8. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000.
- 9. Uso secondo là rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detta distribuzione è da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500.
- 10. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000.
- 11. Uso secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detta distribuzione è da circa 25.000 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di circa 40.000.
- 12. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000.
- 13. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,0-solfato è ottenuto per depolimerizzazione e ha un peso molecolare medio da 2.000 a 5.000.
- 14. Composizione farmaceutica per il trattamento di patologie angiogenesidipendenti che comprende, in qualità di un suo principio attivo, una quantità farmacologicamente efficace di un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di almeno 2, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile, eventualmente in miscela con un veicolo o eccipiente farmaceutico.
- 15. Composizione secondo la rivendicazione 14, caratterizzata dal fatto di essere in unità di dosaggio.
- 16. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14 e 15, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un grado di solfatazione da 2,5 a 4.
- 17. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14 e 15, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato è un K5-N,0-supersolfatato a grado di solfatazione da 3,2 a 4.
- 18. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 17, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,5 a 4.
- 19. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 17, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,7 a 4.
- 20. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-19, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000.
- 21. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 20, caratterizzata dal fatto che detta distribuzione è da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500.
- 22. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-19, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000.
- 23. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 22, caratterizzata dal fatto che detta distribuzione è da circa 25.000 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di circa 40.000.
- 24. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-19, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000.
- 25. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 24, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,0-solfato è ottenuto per depolimerizzazione e ha un peso molecolare medio da 2.000 a 5.000.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001MI000779A ITMI20010779A1 (it) | 2001-04-12 | 2001-04-12 | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi |
| PCT/IB2002/001138 WO2002083155A1 (en) | 2001-04-12 | 2002-04-10 | Use of sulfated bacterial polysaccharides suitable for the inhibition of angiogenesis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2001MI000779A ITMI20010779A1 (it) | 2001-04-12 | 2001-04-12 | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20010779A0 ITMI20010779A0 (it) | 2001-04-12 |
| ITMI20010779A1 true ITMI20010779A1 (it) | 2002-10-12 |
Family
ID=11447485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT2001MI000779A ITMI20010779A1 (it) | 2001-04-12 | 2001-04-12 | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITMI20010779A1 (it) |
| WO (1) | WO2002083155A1 (it) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20011633A1 (it) * | 2001-07-27 | 2003-01-27 | San Raffaele Centro Fond | Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'hiv |
| ITMI20021294A1 (it) * | 2002-06-12 | 2003-12-12 | Inalco Spa | Polisaccaridi batterici o-solfatati e loro uso |
| CA2489870A1 (en) * | 2002-06-18 | 2003-12-24 | Glycores 2000 S.R.L. | Low molecular weight oversulfated polysaccharide |
| CN103301088B (zh) * | 2013-07-03 | 2016-02-10 | 金莲英 | 一种鸡胚多糖胶囊制剂及其制备方法 |
| GB201320786D0 (en) * | 2013-11-25 | 2014-01-08 | Glycomar Ltd | Medicament |
| KR20200110328A (ko) * | 2017-12-14 | 2020-09-23 | 모닝벨 웰니스 엘엘씨 | 황산화 다당류에 의한 죽상경화성 병변의 안정화 및 역전 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2254083A (en) * | 1991-03-28 | 1992-09-30 | Italfarmaco Spa | Anticoagulants from e.coli saccharide |
| IT1284143B1 (it) * | 1996-09-06 | 1998-05-08 | Istituto Scient Di Chimica E B | Eparansolfati semi-sintetici ad elevata attivita' antimetastica e ridotto rischio emorragico |
| IT1289613B1 (it) * | 1997-02-07 | 1998-10-15 | Inalco Spa | Polisaccaridi batterici o-solfatati |
-
2001
- 2001-04-12 IT IT2001MI000779A patent/ITMI20010779A1/it unknown
-
2002
- 2002-04-10 WO PCT/IB2002/001138 patent/WO2002083155A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ITMI20010779A0 (it) | 2001-04-12 |
| WO2002083155A1 (en) | 2002-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0355088B1 (en) | Sulphated polysaccharides having anti-metastatic activity | |
| DK173982B1 (da) | Depolymeriserede heparinderivater, fremgangsmåde til fremstilling deraf og farmaceutisk præparat samt biologisk reagens med indhold heraf | |
| JP5371167B2 (ja) | 抗脈管形成活性を有し、かつ、抗凝固作用がない、部分脱硫酸グリコサミノグリカンの誘導体 | |
| US8912149B1 (en) | Glycosaminoglycan mimetics | |
| CA2856918C (en) | Use of chemically modified heparin derivates in sickle cell disease | |
| JPH09510493A (ja) | 新規なヘパリン様硫酸化多糖類 | |
| JPH06506685A (ja) | 新規な非抗凝固剤ヘパリン誘導体 | |
| JPH11504018A (ja) | 硫酸化オリゴ糖の製造および使用 | |
| CN108350094A (zh) | 生产高纯度硫酸化ha的改进方法 | |
| ITMI20010397A1 (it) | Derivati altamente n,o-solfatati del polisaccaride k5 e loro preparazione | |
| CA2472093C (en) | Use of sulfated glycosaminoglycans for establishing effective labor in women | |
| ITMI20010779A1 (it) | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi | |
| BR112013027389B1 (pt) | Processo para o preparo de sal sódico de sulfato de condroitina | |
| JP6444399B2 (ja) | 癌の処置に用いるための硫酸化多糖 | |
| AU2003242881A1 (en) | Low molecular weight oversulfated polysaccharide | |
| ITMI20011633A1 (it) | Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'hiv | |
| JP4019128B2 (ja) | 抗ヘルペスウイルス剤 | |
| ES2234635T3 (es) | Tratamiento de dolencias dependientes de angiogenesis con sulfato de dextrina. | |
| Harenberg et al. | Analysis of heparin binding to human leukocytes using a fluorescein‐5‐isothiocyanate labeled heparin fragment | |
| ZA200410358B (en) | Low molecular weight oversulfated polysaccharide. |