ES2234635T3 - Tratamiento de dolencias dependientes de angiogenesis con sulfato de dextrina. - Google Patents

Abstract

Uso de sulfato de dextrina en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que tiene al menos 50%, preferiblemente más de 90%, en peso de polímeros de glucosa de GP mayor de 12, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno dependiente de angiogénesis, distinto de tumor hipervascular, en el que la inflamación crónica es un componente significativo de la enfermedad.

Description

Tratamiento de dolencias dependientes de angiogénesis con sulfato de dextrina.

Esta invención se refiere al tratamiento de enfermedades o trastornos que son dependientes de angiogénesis.

La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de un lecho vascular existente, es un proceso complejo de múltiples etapas que implica la degradación de componentes de la matriz extracelular y luego la migración, proliferación y diferenciación de células endoteliales para formar túbulos y eventualmente nuevos vasos. La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos normales incluyendo, por ejemplo y no a modo de limitación, implantación del embrión; embriogénesis y desarrollo; y cicatrización de heridas. La angiogénesis, sin embargo, no es común en adultos sanos.

La angiogénesis también está implicada en dolencias patológicas como: glaucoma neovascular ocular; retinopatía diabética; rechazo al injerto corneal; deficiencia de vitamina A; enfermedad de Sjorgen; acné rosácea; infecciones por micobacteria; úlceras bacterianas y fúngicas; infecciones por Herpes simplex; lupus sistémico; artritis reumatoide; osteoartritis; psoriasis; enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn); enfermedades hereditarias como enfermedad de Osler-Weber Rendu y telangiectasia hemorrágica.

El endotelio vascular es inactivo normalmente. Sin embargo, tras la activación las células endoteliales proliferan y migran para formar microtúbulos que formarán a la larga un lecho capilar para suministrar sangre a tejidos en desarrollo y, por supuesto, a un tumor que está creciendo. Se han identificado varios factores de crecimiento que fomentan/activan células endoteliales para que experimenten angiogénesis. Estas incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); factor de crecimiento transformante (TGFb); factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico (aFGF y bFGF); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).

Ahora se reconoce ampliamente que la angiogénesis es un aspecto de varias enfermedades o trastornos y que dichas dolencias se pueden tratar mediante la administración de inhibidores de la angiogénesis. Se han descubierto muchos de dichos inhibidores. Se han descubierto varios de los inhibidores endógenos de angiogénesis, ejemplos de los cuales son angiostatina y endostatina, que se forman por la disociación proteolítica de plasminógeno y colágeno XVIII respectivamente. Ambos factores han mostrado que suprimen la actividad de factores de crecimiento pro-angiogénicos como bFGF y VEGF vascular. Ambos factores suprimen las respuestas de la célula endotelial a VEGF y bFGF in vitro, y reducen la vascularización y el crecimiento de tumores experimentales en modelos animales.

La solicitud PCT WO 98/24421 se refiere al tratamiento de pacientes que sufren de tumores hipervasculares que comprende la administración de sulfato de dextrina al paciente. El mecanismo de acción del sulfato de dextrina en tumores hipervasculares no se conocía.

Hemos descubierto ahora que el sulfato de dextrina es un inhibidor de angiogénesis. La formación de nuevos vasos se inhibe mediante un efecto de acción directa de sulfato de dextrina sobre células endoteliales. Este efecto es para evitar que las células endoteliales se junten para formar nuevos vasos y que formen entonces nuevos vasos sanguíneos. Ambos procesos son un prerrequisito para la progresión de una dolencia dependiente de angiogénesis, como el crecimiento continuado de un tumor vascular y de sus lesiones metastásicas. La administración de sulfato de dextrina a un paciente puede proporcionar, por lo tanto, un modo de prevenir angiogénesis y, por lo tanto, detener la progresión de una dolencia dependiente de angiogénesis.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de sulfato de dextrina en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que tiene al menos el 50%, preferiblemente más del 90%, en peso de polímeros de glucosa de GP mayor de 12, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno dependiente de angiogénesis, distinta de tumor hipervascular, en la que la inflamación crónica es un componente significativo de la enfermedad.

Se han dirigido considerables esfuerzos al desarrollo de fármacos que interfieren con angiogénesis. Uno de dichos grupos son los polisacáridos sulfatados. Su actividad anti-angiogénica se demostró en primer lugar usando una combinación de heparina y cortisona. Esto fue seguido de informes de varios otros polisacáridos sulfatados distintos que demostraron actividad anti-angiogénica in vitro. El compuesto más notable de estos compuestos fue un polisacárido sulfatado-peptidoglicano (SP-PG) de origen natural que es producido por la bacteria Arthrobacter sp (cepa AT-25). SP-PG inhibió el crecimiento de las células fusiformes derivadas del sarcoma de Kaposi asociadas al SIDA a concentraciones que no fueron citotóxicas. También bloqueó la angiogénesis que es inducida por las células del sarcoma de Kaposi-SIDA en ratones desnudos. Sin embargo, no se observó una ventaja clínica cuando se administró SP-PG por vía intravenosa a pacientes con sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA.

Un efecto antiangiogénico de polisacáridos sulfatados como sulfato de dextrano ha sido mostrado por HAHNENBERGER R. y JACKOBSON A. (GLYCO-CONJUGATE JOURNAL, 1991 8:350-353).

En un ensayo clínico de Fase I de 2-sulfato de dextrina en pacientes con SIDA en estados tardíos, demostramos que la administración directa de 2-sulfato de dextrina en la circulación linfática usando la ruta intra-peritoneal dio como resultado una bajada significativa y continua en la carga viral de VIH-1. No se observó toxicidad clínica o bioquímica incluso después de la administración de varios gramos del fármaco. Durante el transcurso del ensayo clínico, advertimos la regresión clínica del sarcoma de Kaposi en tres pacientes y estas observaciones fueron el tema del documento WO 98/24421. Aquí, proporcionamos datos in vitro e in vivo para un mecanismo de acción de la actividad anti-angiogénica de las dextrinas sulfatadas que es independiente de su actividad anti-VIH-1.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Tabla para mostrar la interiorización de 2-sulfato de dextrina (D2S) y 6-sulfato de dextrina (D6S) mediante diferentes tipos de células.

Figura 2: Tabla para mostrar la formación de microtúbulos endoteliales en presencia de dextrinas sulfatadas.

Figura 3: Gráfico para mostrar el efecto de dextrinas sulfatadas sobre la proliferación de HUVECs inducidas por bFGF o VEGF se midió usando un ensayo de incorporación de [^{3}H]-timidina. No hubo un efecto significativo de D2S o D6S sobre la proliferación celular. En experimentos similares con la línea celular KSY-1, bFGF y VEGF no aumentaron la proliferación celular, y las dextrinas sulfatadas no tuvieron efecto (los datos no se muestran).

Figura 4: Las fotomicrografías muestran formación de nuevos vasos sanguíneos al día 22 (x 40 aumentos).

(a) vaso cultivado en Medio 199 solo; puntuación = 3

(b) vaso cultivado en Medio 199 y D2S (100 \mug/ml); puntuación = 1,

Figura 5: Gráfico para mostrar que 2-sulfato de dextrina (\medcirc) y 6-sulfato de dextrina (\triangledown) redujeron la velocidad de formación de nuevos vasos en un modelo de ensayo de angiogénesis in vitro en comparación con medios solos (\Box). Los compuestos se analizaron a una concentración final de 100 \mug/ml. El grado de formación de nuevos vasos se cuantificó dos veces por semana usando una escala análoga visual en la que 0 = sin crecimiento, 1 = mínima formación de nuevos vasos, 2 = formación de nuevos vasos significativa, y 3 = densa formación de nuevos vasos. Se derivó una puntuación de angiogénesis de cada recuento al dividir la puntuación total (es decir la suma de todos los pocillos) por la puntuación máxima posible y expresando entonces el resultado como un porcentaje. Este gráfico es representativo de 3 experimentos con un total de 20 esteatocistomas/placa/experimento para cada compuesto analizado.

Valores de p:

ns: p>0,05.

*: p<0,05.

** : p<0,01.

Figura 6 : Las fotomicrografías muestran la formación de microtúbulos endoteliales en presencia de dextrinas sulfatadas (x 40 aumentos). Se usó una escala visual análoga para determinar el grado de formación de tubos y se puntuó en una escala de 0 (todas las células permanecen solas) a 4 (todas las células implicadas en estructuras tubulares) como se describió previamente (ref: 1,14). Barra de espacio = 100 micrómetros.

(A) Pocillo de control en presencia de dextrina (100 \mug/ml),

(B) D2S presente a 200 \mug/ml,

(C) D6S presente a 100 \mug/ml.

Figura 7: Gráfico para mostrar el efecto del lote de sulfato de dextrina en el crecimiento in vitro de células ECV304 (Experimento 1).

Figura 8: Gráfico para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en el crecimiento in vitro de células ECV304 (Experimento 2).

Figura 9: Gráfico para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en el crecimiento in vitro de células SK-HEP-1 (Experimento 1).

Figura 10: Gráfico para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en el crecimiento in vitro de células SK-HEP-1 (Experimento 2).

Figura 11: Tabla para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en la inhibición in vitro de líneas celulares similares a las endoteliales (FK-HEP-1 y ECV304).

Figura 12: Tabla para mostrar medidas de angiogénesis medias.

Figura 13: Gráfico para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en el número de túbulos de HUVEC.

Figura 14: Gráfico para mostrar el efecto de sulfato de dextrina en los puntos de ramificación de túbulos de HUVEC.

Las figuras 15 a 19 muestran imágenes microscópicas y representan el efecto de sulfato de dextrina en la formación de microtúbulos. Cada imagen microscópica está acompañada por una figura de número correspondiente marcado con el sufijo (a) que proporciona una indicación más clara de desarrollo de túbulos.

Figura 15: muestra las imágenes microscópicas para los experimentos de control usando Sumarin d2 7 y VEGF d1 4.

Figura 15a: corresponde a la figura 15 y muestra el desarrollo de túbulos para los experimentos de control usando Sumarin d27 y VEGF d1 4.

Figura 16: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a baja concentración (0 \mug d2 9 y 1 \mug d1 5).

Figura 16a: corresponde a la figura 16 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a baja concentración (0 \mug d2 9 y 1 \mug d1 5).

Figura 17: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a concentraciones de 5 \mug d1 1 y 10 \mug d1 2.

Figura 17a: corresponde a la figura 17 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a concentraciones de 5 \mug d1 1 y 10 \mug d1 2.

Figura 18: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a dosis medias (50 \mug d1 1 y 100 \mug d1 4).

Figura 18a: corresponde a la figura 18 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a dosis medias (50 \mug d1 1 y 100 \mug d1 4).

Figura 19: muestra las imágenes microscópicas para el efecto de sulfato de dextrina a dosis elevadas (500 \mug d1 4 y 1000 \mug d2 1).

Figura 19a: corresponde a la figura 19 y muestra el desarrollo de túbulos con sulfato de dextrina a dosis elevadas (500 \mug d1 4 y 1000 \mug d2 1).

Figura 20: gráfico para mostrar los efectos de sulfato de dextrina sobre pesos tumorales individuales.

Figura 21: gráfico para mostrar los efectos de sulfato de dextrina sobre un peso tumoral final medio.

Ejemplo 1

Trombina de plasma bovina, fibrinógeno de plasma bovino, ácido \varepsilon-amino-n-caproico, anhídrido succínico, carbonil dimidazol, hidrácido de biotina y sustrato de rojo naftiónico/naftol se adquirieron de Sigma (Poole, Reino Unido). Dimetilformamida y dimetilaminopiridina fueron de Aldrich (Gillingham Reino Unido) y éter dietílico de BDH Merck (Lutterworth, Reino Unido). 2-sulfato de dextrina, 6-sulfato de dextrina, 2,6 sulfato de dextrina (ML 95/50) y dextrina libres de endotoxinas y de tipo clínico se obtuvieron de ML Laboratories (Wavertree, Reino Unido). Medio MCDB 131, Medio 199, solución salina equilibrada de Hanks, suero de ternero fetal, penicilina, estreptomicina y L-glutamina fueron de Life Technologies (Paisley, Escocia).

Hemos mostrado previamente que 2-sulfato de [^{3}H]-dextrina se une a las células HPB-ALL de una manera específica y saturable con una constante de disociación (Kd) de 82 \pm 14 nM y una Bmax de 4,8 \pm 0,3 pmol/10^{6} células. Las células CEM, C8166 y H9 tuvieron valores de Kd similares para la unión de [^{3}H]-D2S. También hemos mostrado que 2-sulfato de [^{3}H]-dextrina se une a células HeLa (una línea celular endotelial inmortalizada) con una Kd similar de 107 \pm 12 nM y una Bmax de 4,1 \pm 0,2 pmol/10^{6} células; n=9, p<0,05.

Se acumuló 2-sulfato de dextrina en los macrófagos peritoneales y células mesoteliales de pacientes tratados, pero no en cualquier otro tipo de células encontradas en la cavidad peritoneal o en la sangre periférica de estos pacientes. En posteriores experimentos in vitro, se cultivaron diferentes tipos de células con 100 \mug/ml D2S libre de endotoxinas, 100 \mug/ml de dextrina o 100 \mug/ml de dextrina biotinilada, o 100 \mug/ml de 6 sulfato de dextrina, durante hasta 4 semanas (Figura 1). Las células se tiñeron entonces con azul de 1,9-dimetilmetileno que detecta glicosaminoglicanos sulfatados (Blysan, Biocolor, Belfast), o estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina y rojo naftiónico/naftol que detecta dextrinas sulfatadas biotiniladas intracelulares.

Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) también se recolectaron de cordones umbilicales mediante digestión con colagenasa tipo II y se cultivaron en matraces de cultivo de tejido recubiertos con gelatina al 1% en Medio 199 suplementado con suero de bovino fetal al 20%, penicilina 100 IU/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, L-glutamina 2 mM, heparina 10 U/ml y suplemento para el crecimiento celular endotelial 20 \mug/ml. También se estudió la línea celular KS Y-1 que se estableció a partir de la efusión pleural de un paciente con sarcoma de Kaposi asociado a SIDA. Fue CD34 y CD31 positivo confirmando que era de origen endotelial.

Después de 3 semanas de cultivo continuo, se encontró que D2S y D6S sólo se acumulan en los macrófagos peritoneales.

Las células se mantuvieron en presencia de la dextrina sulfatada durante hasta 4 semanas.

Dado que las dextrinas sulfatadas no se acumulan en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) o en la línea celular del sarcoma de Kaposi, KSY-1, determinamos si las dextrinas sulfatadas podrían interferir con el crecimiento normal de éstas células mediante una acción al nivel de la superficie celular. Nuestros estudios previos de células mononucleares de la sangre periférica y los macrófagos derivados de monocitos han mostrado que el D2S se une a la superficie celular de una manera específica y saturable con una constante de disociación de 82 \pm 14 nM. Además, las concentraciones de hasta 250 \mug/ml no afectaron al recuento celular, viabilidad celular, proliferación celular o actividad metabólica cuando se compara con células cultivadas en ausencia de cada compuesto.

Ni la dextrina ni las dextrinas sulfatadas afectaron a la velocidad de división celular de células HUVECs o KSY-1 durante un periodo de 7 días según se determinó mediante recuentos celulares dos veces por semana. La viabilidad celular permaneció > 95% en todo momento según se determinó por exclusión con azul de Trypan. También se determinó el efecto de las dextrinas sulfatadas en el crecimiento de células HUVECs y KSY-1 que se cultivaron en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Para estos experimentos, se suspendieron HUVECs (5 x 10^{3}/pocillo) en Medio M199 que contiene FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml y estreptomicina 0,1 mg/ml. Tras 24 horas, los medios se sustituyeron con medios frescos que contienen D2S (100 \mug/ml) o D6S (100 \mug/ml) durante 1 hora tras la cual se añadieron bFGF (10 ng/ml) o VEGF (20 ng/ml, Preprotech, Rocky Hill, NJ). Estas concentraciones de VEGF y bFGF se eligieron porque habían mostrado que provocaban la proliferación de HUVECs. Se añadió [^{3}H]-timidina (1 mCi/ml, Amersham Pharmacia, Bucks, Reino Unido) 48 horas más tarde y las células se cultivaron durante 16 horas adicionales. Las células se recolectaron usando un recolector de 96 pocillos Betaplate automático (Wallac OY, Turku, Finlandia) y la radiactividad se contó usando un contador de centelleo líquido Betaplate. Las dextrinas sulfatadas no alteraron la velocidad de proliferación de células HUVECs o KSY-1 según se determinó mediante recuentos celulares e incorporaciones de [^{3}H]-timidina, incluso cuando se añadieron bFGF o VEGF exógenos.

Ejemplo 2

Se extirparon vasos sanguíneos (aproximadamente de 1-2 mm de diámetro) de la superficie apical de placentas humanas dentro de las 6 horas de un nacimiento por cesárea electiva. El uso de las placentas para estos estudios se aprobó por el Comité de Ética de la Fundación del Hospital Hammersmith, Londres. Los vasos sanguíneos se pusieron en una solución salina equilibrada de Hank y se cortaron en fragmentos de 1-2 mm usando fórceps de disección finos y tijeras de iredectomía. Se retiraron los coágulos residuales y los vasos sanguíneos se empaparon entonces en solución salina equilibrada de Hank.

El efecto de cada compuesto en una nueva formulación de vasos sanguíneos se determinó al cultivar los vasos sanguíneos dentro de un coágulo de fibrina en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos. Se añadieron treinta \mul de trombina bovina (50 NIH U/ml en cloruro de sodio 0,15 M) a cada pocillo seguido de 1 ml/pocillo de fibrinógeno bovino de 3 mg/ml en Medio 199. La trombina y el fibrinógeno se mezclaron rápidamente en un fragmento de vasos sanguíneos situado en el centro del pocillo. La formación de gel de fibrina ocurrió rápidamente y dejó el vaso suspendido dentro del gel. Se añadió entonces a cada pocillo un ml/pocillo de Medio 199 suplementado con suero de ternero fetal al 20%, penicilina 250 IU/ml y estreptomicina 250 U/ml. También se añadió ácido \varepsilon-amino-n-caproico (300 \mug/ml) durante los primeros 4 días y dos veces por semana a partir de entonces (50 \mug/ml) para prevenir la disolución del coágulo de fibrina. Los vasos se cultivaron a 37ºC en un incubador humidificado durante 25 días cambiándose los medios dos veces por semana.

El grado de formación de nuevos vasos fue cuantificado dos veces por semana por tres observadores diferentes usando una escala visual análoga en la que 0 = sin crecimiento, 1 = muy poca formación de nuevos vasos, 2 = formación significativa de nuevos vasos y 3 = densa formación de nuevos vasos. Se derivó una puntuación de angiogénesis los recuentos asumidos para cada pocillo al dividir la puntuación total por la máxima puntuación posible y expresando entonces el resultado como un porcentaje. En cada una de las 3 ocasiones distintas, cada compuesto se analizó en 20 pocillos replicados. Los experimentos en los que los vasos sanguíneos se cultivaron en MCDB 131 (es decir medios libres de suero) mostraron que los factores de suero no fueron necesarios para la formación de nuevos vasos sanguíneos. Algunos de los coágulos de fibrina se fijaron durante la noche en formalina al 10%, inmersa en parafina, se seccionaron para histología y luego se tiñeron para los marcadores de células endoteliales Factor VIII y CD31. Los resultados se expresan como la media \pm S.E.M. Se usó una prueba t de Student para determinar el nivel de significancia.

Durante las 3 semanas de transcurso del ensayo, una galería compleja de microvasos surgió de la sección cortada del vaso sanguíneo inmerso dentro de un coágulo de fibrina. Se observó muy poco crecimiento de nuevos vasos a partir de esas áreas del vaso que no se habían seccionado. Los primeros vasos sanguíneos aparecieron hacia el día 4 y fueron normalmente de extremo romo. Durante los siguientes 18 días, continuaron ramificándose y dando lugar a complejas galerías de vasos. El crecimiento fue rápido durante las 2 primeras semanas y luego se ralentizó considerablemente. Estos nuevos vasos estaban recubiertos por células endoteliales como se demostró mediante inmunohistoquímica positiva para Factor VIII y CD31.

Las figuras 4 y 5 muestran el efecto de 2-sulfato de dextrina y 6-sulfato de dextrina en la formación de nuevos vasos. No hubo diferencia entre vasos cultivados en medios en comparación con vasos cultivados en medios que contienen dextrina (100 \mug/ml); (40 pocillos; 2 experimentos; p = 0,9 en el día 18). En contraposición, hubo una reducción significativa en el número de nuevos vasos que se formaron cuando estuvo presente el 2-sulfato de dextrina (100 \mug/ml). Esto se vio por primera vez en el día 13 (p = 0,02), y la diferencia siguió estando presente en el día 22 (p = 0,03). El 6-sulfato de dextrina también provocó una disminución significativa en la formación de nuevos vasos. Esto se vio por primera vez en el día 13 (60 pocillos; 3 experimentos; p = 0,004) y siguió estando presente el día 22 (p = 0,002).

Ejemplo 3

Kubota y col informaron de que las células endoteliales de la vena umbilical humana experimentan diferenciación morfológica con formación tubular cuando se cultivan en un gel reconstituido compuesto por proteínas de membrana del basamento (Matrigel; Beckton-Dickinson). Esto tiene similitudes con la situación in vivo donde las células endoteliales recubren el lumen de vasos sanguíneos y están en contacto con la matriz extracelular de las membranas del basamento que está compuesta de colágeno IV, heparán sulfato proteoglicano y las glicoproteínas laminina y nidogen/entactina.

Debido a la capacidad de las membranas del basamento para estimular la diferenciación, las células cultivadas en placa sobre el gel se unen rápidamente. Dentro de entre una y dos horas, se observan procesos alargados. Después de ocho horas, los cultivos de células endoteliales muestran redes abundantes de ramificación y anastomosación de cordones de células. Mediante espectroscopía de luz, la mayoría de estos cordones mostraron una estructura translúcida central a lo largo de su eje longitudinal sugiriendo la presencia de un lumen. Hacia las dieciocho horas, las células endoteliales habían formado una red interconectada de células anostomosantes que, mediante espectroscopía de luz de baja potencia, tienen un aspecto de panal. Las estructuras similares a tubos formadas por células endoteliales sobre Matrigel persisten durante varios días. Con el tiempo, la red comienza a separarse del Matrigel apareciendo células endoteliales viables en los medios de cultivo. La formación de las estructuras tubulares no depende de factores de crecimiento extracelulares o de la presencia de heparina en los medios de cultivo.

La formación de tubos parece ser relativamente específica para células endoteliales porque ni los fibroblastos dérmicos humanos ni las células del músculo liso humano forman tubos cuando se cultivan sobre Matrigel. Las células endoteliales cultivadas sobre matrigel retienen la reactividad al Factor VIII y son metabólicamente activas según se indica mediante su absorción de lipoproteínas acetiladas de baja densidad. Además, después de más de una semana de cultivo, las células endoteliales de la vena umbilical humana cultivadas sobre Matrigel no mostraron un aumento en su número celular, en comparación con células cultivadas sobre fibronectina que muestran un aumento de cuatro veces en el número celular.

Estudios de EM ultraestructurales han confirmado que las extensiones citoplásmicas anastomosantes de las células endoteliales morfológicamente diferenciadas contienen un lumen que está completamente rodeado por una o dos células endoteliales en la sección transversal. El lumen contiene varias cantidades de citoplasma degenerado, sugiriendo que la remodelación muy rápida de las células tiene lugar durante la formación de los tubos. Los estudios de viabilidad de células endoteliales cultivadas sobre Matrigel no indican que la muerte celular desempeña un papel importante en la formación de los tubos. Además, estas células diferenciadas retienen los cuerpos de Weibel-Palade característicos de las células endoteliales.

El ensayo de la formación de microtubos se llevó a cabo al aislar células endoteliales de la vena umbilical humana a partir de cordones umbilicales dentro de las 6 h del parto mediante sección cesárea. La vena umbilical se canuló y se introdujo colagenasa al 0,1% en salino tamponado con fosfato y se incubó durante 20 minutos. Las células endoteliales liberadas por la colagenasa se obtuvieron al lavar la vena umbilical con Medio 199. Las células se lavaron tres veces con Medio 199 y luego se cultivaron en matraces de cultivo de tejido recubiertos con fibronectina. Los medios de cultivo estaban formados por Medio 199 con suero de bovino fetal al 20%, suplemento para el crecimiento celular epidérmico de 30 \mug/ml, heparina de 10 IU/ml penicilina de 100 IU/ml, estreptomicina de 100 \mug/ml y L-glutamina 2 mM. Las células endoteliales de la vena umbilical humana se pasaron hasta confluencia tras tratamiento con tripsina-AEDT. Todas las células se usaron con entre 3 y 6 pases.

Se dispensaron alícuotas de Matrigel en platos de cultivo de tejido de 35 mm de diámetro sobre hielo y entonces se incubaron a 37ºC durante 10 minutos para dejar que el gel se fijara. Se prepararon series de dilución de D2S y D6S en medio de cultivo de HUVEC y se añadió a los platos.

Se recolectaron HUVECs con entre 3 y 6 pases usando tripsina y se suspendieron en un medio de cultivo a una densidad de 2 - 3 x 10^{5} células/ml. Se añadieron alícuotas de un ml de la suspensión de las células a las placas que contienen las dextrinas sulfatadas y se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2}. En distintos momentos entre las 8 - 24 horas, las placas se examinaron y se puntuaron usando un esquema publicado entre 0 - 4, donde 0 = todas las células adherentes permanecen solas, y 4 = todas las células adherentes implicadas en estructuras tubulares. La formación de nuevos vasos fue cuantificada por tres observadores diferentes a las 18 h. La variabilidad dentro del observador y entre los observadores fue < 10%. n = 3. Los resultados a partir de 2-sulfato de dextrina y 6-sulfato de dextrina se muestran en las Figuras 2 y 6.

También se analizó un sulfato de dextrina bisulfatado (es decir: 2,6 sulfato de dextrina libre de endotoxina; ML 95/50) en este ensayo. Esta molécula está formada por un sulfato en la posición 2' en cada molécula de glucosa teniendo también aproximadamente el 30% de las moléculas de glucosa un sulfato en la posición 6'. Su actividad anti-angiogénica fue mayor que la observada con D2S pero menor que la observada con D6S. Esto mostró que tener más de un sulfato por molécula de glucano aumenta la actividad anti-angiogénica de las dextrinas sulfatadas.

El modelo in vitro de angiogénesis usado para analizar dextrinas sulfatadas cumple con los dos sellos característicos de la angiogénesis, es decir: proliferación de células endoteliales y la brotación de capilares. Cuando se han usado ensayos in vitro similares para analizar otros polisacáridos sulfatados, los datos han sido difíciles de interpretar porque los compuestos no experimentaron primero la caracterización química detallada. Nuestras observaciones in vitro muestran que las dextrinas sulfatadas inhiben la formación de nuevos vasos mediante células endoteliales normales y que esto previene la formación de nuevos vasos; es decir: angiogénesis.

Al respecto, es interesante revisar los estudios de Nakamura y col, quienes mostraron que SP-PG inhibió la angiogénesis que se observó después de la inoculación subcutánea de células de SK-SIDA en ratones desnudos. Sin embargo, tuvieron que administrar 250 mg/kg/día para suprimir la angiogénesis. Dicha dosis nunca se podría haber logrado en pacientes y explica probablemente porqué no se observó una inhibición de angiogénesis en un ensayo clínico posterior cuando el fármaco se administró por vía intravenosa. Por el contrario, hemos administrado una dosis de \approx 2 mg/kg/día y observamos un efecto clínico significativo sobre lesiones de sarcoma de Kaposi tempranas sin ninguna toxicidad asociada.

En un reciente informe se mostró que las dextrinas sulfatadas no interfirieron con el crecimiento pero inhibieron la diferenciación morfológica de las células epiteliales (Thornton y col, Anti-microbial Agents and Chemotherapy 43, 2528-2533, 1999). Los resultados del ensayo de angiogénesis placental muestran que el sulfato de dextrina inhibe la formación de nuevos vasos y la diferenciación de la línea celular de HUVEC.

Ejemplo 4

Se evaluó el efecto de sulfato de dextrina en la proliferación in vitro de 2 líneas celulares endoteliales y la formación de la línea celular endotelial HUVEC.

SK-HEP-1 es un adenocarcinoma de hígado humano con morfología endotelial y ECV304 es un carcinoma de vejiga urinaria humana con características similares a las endoteliales. Ambas líneas celulares se obtuvieron de ECACC. HUVEC fue suministrado como un cultivo por TCS Biologicals.

Las células se cultivaron y se prepararon en un medio RPMI que contiene FCS al 10% y glutamina 2 mM. Para los ensayos in vitro, las células se recolectaron con AEDT al 0,025%, se lavaron en el medio de cultivo y se cultivaron en placas de 96 pocillos a 5 x 10^{3}y 1 x 10^{4} células/pocillo en un volumen de 100 \mul. Tras 24 horas, para permitir la adherencia de las células, el medio se sustituyó por medio fresco que contiene sulfato de dextrina a concentraciones de 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 \mug/ml. Tras 48 horas, se evaluó la proliferación mediante absorción de metil tiazol tetrazolio (MTT) de la manera siguiente:

Se añadió MTT (Sigma) a los pocillos en un volumen de 50 \mul a una concentración de 1 mg/ml. Tras 4 horas de incubación los cristales de formazán insolubles se solubilizaron mediante la adición de 75 \mul de DMSO/pocillo y se midió la absorbancia a 550 nm. El ensayo de MTT ha mostrado previamente estar en correlación con recuentos de células directos para varias líneas de células epiteliales GI (Watson y col, Anti-cancer drugs, 1994; 5, p 591-597).

El efecto de dextrina sulfatada en la formación de vasos de la línea celular de HUVEC se llevó a cabo mediante el uso del Modelo de Angiogénesis Humano de TCS Biologicals. El ensayo se proporciona como un cultivo de la línea celular de HUVEC junto con matriz de cultivo y células humanas adicionales presentes (la naturaleza exacta de las células no se conoce) en las etapas más tempranas de la formación de túbulos en un formato de 24 pocillos. El reactivo de control positivo fue una solución de reserva patrón de VEGF y el control negativo fue Suramin. Tras retirar los sellados de los pocillos, los cultivos se examinaron para ver la morfología celular para confirmar su viabilidad.

El medio de crecimiento se proporcionó con el kit y se usó para preparar la dextrina sulfatada a concentraciones que varían entre 0-1000 \mug/ml. El medio existente se aspiró desde los pocillos y se sustituyó con medio que contiene las concentraciones de sulfato de dextrina en un volumen de 0,5 ml. Éste se puso a 37ºC, en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}. Esto se repitió en los días 4, 7 y 9.

Entre los días 7-11 los cultivos se fijaron mediante el fijador adjunto y se tiñeron con el anticuerpo anti-PECAM-1 monoclonal de ratón a una dilución 1:4000 (presente en el tampón de bloqueo). Se añadió 0,5 ml de anticuerpo diluido por pocillo y se incubó durante 60 minutos a 37ºC. El anticuerpo secundario (conjugado de fosfatasa alcalina IgG anti-ratón de cabra) se diluyó 1:500 en tampón de bloqueo y se añadió a los pocillos después de lavar durante 60 minutos a 37ºC. Tras lavar la placa se preparó el sustrato; se disolvieron comprimidos de BCIP/NBT en agua destilada y se añadieron a los pocillos. Tras la incubación durante 5-10 minutos los pocillos se lavaron y se representaron mediante una imagen usando el paquete de software de análisis de imagen Leica Qwin.

El sulfato de dextrina se evaluó en dos experimentos distintos. Todos los experimentos se llevaron a cabo con dos diferentes concentraciones de siembra de células diferentes. El sulfato de dextrina indujo niveles moderados de inhibición (Véase Figuras 7, 8, 9 y 10). Para comparar entre líneas celulares y experimentos, se calculó el nivel de inhibición alcanzado a las concentraciones más altas evaluadas (1000 \mug/ml) al igual que la significancia a partir del control sin tratar. (Véase Figura 11).

La línea celular de SK-HEP-1 se inhibió hasta un mayor grado que la línea celular de ECV304, induciendo el sulfato de dextrina \sim 65% de inhibición a la menor concentración celular. La inhibición a la mayor concentración celular no fue tan grande.

El nivel de inhibición que se mostró con la línea celular de ECV304 estuvo en el intervalo entre 11-33%. No hubo diferencia entre el nivel de inhibición a las 2 concentraciones celulares.

Los resultados del efecto del sulfato de dextrina sobre la formación de túbulos se dan en las Figuras 12, 13 y 14.

La distancia de túbulos no se representó gráficamente ya que no hubo discriminación dentro del experimento entre los controles positivos y negativos. Respecto al número de túbulos, Suramin indujo un efecto inhibitorio significativo (51%, p<0,0001, prueba t de Student) cuando se comparó con el control vehículo mientras que VEGF indujo un aumento significativo (174%, p<0,0001). El efecto del sulfato de dextrina en el punto de ramificación fue dependiente de la concentración, ocurriendo una estimulación significativa a las concentraciones más bajas (1 y 5 \mug/ml, 120% y 115% de control). La inhibición se mostró sin embargo a concentraciones mayores que 10 \mug/ml (26%, 48%, 53% y 68% de inhibición, a concentraciones de 50, 100, 500 y 1000 \mug/ml, respectivamente). Suramin inhibió significativamente puntos de ramificación (98% de inhibición, p<0,0001) mientras que VEGF sólo significativamente puntos de ramificación elevados (131%, p<0,05). Todas las concentraciones de sulfato de dextrina redujeron significativamente los puntos de ramificación de los túbulos entre 31% con 1 \mug/ml hasta 93% con 1000 \mug/ml (significancia mostrada en la Figura 12). Las imágenes microscópicas se muestran en las Figuras 15, 16, 17, 18 y 19.

El sulfato de dextrina inhibió el crecimiento basal de las líneas celulares similares a las endoteliales, SK-HEP-1 y EVC304 según se evaluó mediante el ensayo MTT. Los efectos inhibitorios se observaron a concentraciones > 100 \mug/ml. Las células sembradas a una mayor concentración no parecen aumentar la magnitud del efecto inhibitorio, lo que indica que la acción es probable que sea citostática en lugar de citotóxica. SK-HEP-1 fue más sensible a los efectos inhibitorios del crecimiento de la dextrina sulfatada.

Se sabe que la proliferación de células HUVEC no está directamente inhibida por sulfato de dextrina in vitro (Thomton y col, 1999). Sin embargo el efecto de sulfato de dextrina se evaluó sobre las características angiogénicas de las células HUVEC en un cultivo de células mezcladas en la presencia de ECM. Se usaron VEGF y Suramin como controles positivos y negativos, respectivamente, y afectaron a la formación de túbulos y puntos de ramificación en la dirección correcta. El sulfato de dextrina indujo una estimulación baja pero significativa del número de túbulos a las concentraciones más bajas pero a la mayor concentración de 1000 \mug/ml indujo 68% de inhibición. El nivel de inhibición del número de túbulos a 100 \mug/ml (48%) fue comparable con el presentado en el estudio de Thornton y col.

El sulfato de dextrina indujo un efecto inhibitorio en el número de puntos de ramificación a todas las concentraciones evaluadas.

La dextrina sulfatada inhibió el crecimiento de 2 líneas celulares similares a las endoteliales en un ensayo in vitro e inhibió el número de túbulos y puntos de ramificación de la línea celular HUVEC en un ensayo de angiogénesis.

Ejemplo 5

Se investigó la capacidad del sulfato de dextrina para inhibir el crecimiento in vivo del xenoinjerto colorrectal humano AP5VL bien vascularizado.

Se administró sulfato de dextrina, 10 mg/kg en 1 ml de icodextrina cada segundo día a dos ratones SCID macho. La dosificación continuó durante 14 días.

La línea celular evaluada, AP5LV, es una variante de una línea celular colorrectal humana establecida, derivada originalmente de un tumor principal de un paciente. Las células AP5LV se han seleccionado por su capacidad para colonizar los pulmones después de la inyección intravenosa y por metastatizarse espontáneamente a los pulmones después de la inyección de las células en la pared muscular peritoneal. Las células AP5LV se mantuvieron in vitro en un medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Reino Unido) que contiene suero de bovino fetal termoinactivado al 10% (v/v) (Sigma, Poole, Reino Unido) a 37ºC en 5% de CO_{2} y condiciones húmedas. Las células de monocapas semi-confluentes se recolectaron con AEDT al 0,025%, se lavaron dos veces en el medio de cultivo descrito anteriormente, y se re-suspendieron a 5 x 10^{6}/50 \mul en salino tamponado con fosfato esterilizado, pH 7,4 (PBS).

Los ratones se anestesiaron usando Hypnorm (Roche)/Hyponovel (Janssen) y la suspensión de células se inyectó en la pared muscular peritoneal de 20 ratones SCID macho. Los ratones se etiquetaron electrónicamente con fines identificativos (RS Biotech, Traker), y se asignaron aleatoriamente a dos grupos experimentales (véase más adelante). El régimen de tratamiento se inició en el día 1 y se continuó cada día hasta la terminación en el día 38.

A la terminación se extirparon las paredes musculares peritoneales y se pesaron, congelándose repentinamente la mitad y fijándose con Formalina la otra mitad. Los pulmones también se retiraron y se fijaron con Formalina para la evaluación de la carga tumoral metastática.

Los ratones se pesaron durante todo el estudio.

Grupo 1, n = 10 machos - 4% Icodextrina, 1 ml i.p. cada segundo día.

Grupo 2, n = 10 machos - sulfato de dextrina 10 mg/kg en 4% Icodextrina, 1 ml i.p. cada segundo día.

Los pesos tumorales finales se muestran en la Figura 20 (pesos tumorales para ratones individuales) y Figura 23 (pesos tumorales medios para cada grupo experimental).

El sulfato de dextrina indujo una reducción del 28% en el peso tumoral final que no logró por poco alcanzar significancia (p=0,065, prueba T de Student).

La dosis de sulfato de dextrina elegida para el estudio de terapia inicial no logró por poco inducir un efecto significativo en los pesos tumorales finales del xenoinjerto colorrectal humano, AP5LV. Esto puede reflejar el hecho de que n=9/10 ratones por grupo no fueran lo suficientemente grandes para mostrar significancia a este nivel de inhibición. No hubo toxicidad con esta dosis.

Ejemplo 6

Los sulfatos de dextrina son compuestos conocidos. Se producen por la sulfatación de dextrinas, que son mezclas de polímeros de glucosa producidos mediante la hidrólisis del almidón. Estos polímeros de glucosa tienen un amplio intervalo de polimerización. El grado de polimerización (GP) varía entre 1 (el monómero, glucosa) hasta valores muy elevados, por ejemplo de hasta cientos de miles o más de unidades de glucosa.

Normalmente, el resultado directo de hidrolizar un almidón es una dextrina que contiene una elevada proporción de polímeros de peso molecular relativamente bajo y puede contener por ejemplo hasta 60% en peso de polímeros de glucosa de GP menor de 12. Los sulfatos de dextrina usados en la presente invención pueden tener un amplio intervalo de composición, pero se derivan preferiblemente de dextrinas que contienen al menos 50% en peso, preferiblemente más de 90%, de polímeros de glucosa mayores de 12, y/o contienen menos de 10%, preferiblemente menos de 5%, en peso de polímeros de glucosa de GP menor de 12. El peso molecular medio ponderal de la dextrina puede estar, por ejemplo, entre 10.000 y 35.000, preferiblemente entre 15.000 y 25.000. (La técnica usada para determinar el peso molecular de la dextrina es cromatografía líquida de alta presión usando columnas cromatográficas calibradas con patrones de dextrina, como designaron Alsop y col, J Chromatography 246, 227-240, 1989). Preferiblemente, la dextrina contiene no más de 10%, preferiblemente menos de 5%, en peso de polímeros de peso molecular mayor de 40.000. El peso molecular medio ponderal deseado y el perfil del polímero se consiguen al someter a la dextrina a fraccionamiento, usando técnicas conocidas, incluyendo precipitación con disolvente y fraccionamiento de membrana. Entre las dextrinas a partir de las cuales se pueden proporcionar sulfatos de dextrina adecuados para uso en la presente invención están aquellas descritas en las memorias descriptivas de patente europea nº 115911, 153164 y
207676.

Los sulfatos de dextrina se han usado previamente de modo farmacéutico. Por ejemplo, la memoria descriptiva de la patente británica 871.590 describe el uso de ciertos sulfatos de dextrina como agentes antilipémicos, la memoria descriptiva de la patente de Estados Unidos 5.439.892 describe el uso de ciertos sulfatos de dextrina como agentes anti-VIH. Estos antecedentes también describen procedimientos para la producción de sulfatos de dextrina; sus descripciones se incorporan en el presente documento como referencia.

En el procedimiento de la invención el sulfato de dextrina se puede administrar al paciente por cualquier ruta, enteral o parenteral, a juicio del médico. La administración por vía intraperitoneal es particularmente efectiva, pero el sulfato de dextrina también se puede proporcionar, por ejemplo, por vía oral, vía intravenosa, o se puede inyectar directamente en las lesiones en una base de lesión por lesión, o se puede aplicar por vía tópica. El nivel de dosificación debe determinarlo el médico.

Las dextrinas pueden estar sulfatadas en las posiciones 2, 3 y 6, y una dextrina completamente sulfatada contiene, por lo tanto, tres grupos sulfato por unidad de glucosa. El sulfato de dextrina usado en la presente invención puede tener cualquier grado de sulfatación, pero preferiblemente contiene como mucho dos, más preferiblemente entre 0,5 y 1,5, grupos sulfato por unidad de glucosa. Además, el sulfato de dextrina es preferiblemente 2-sulfato de dextrina, 6-sulfato de dextrina o una mezcla de éstos.

Se preparó una composición para uso en la administración de un sulfato de dextrina por vía intraperitoneal, en forma de una solución acuosa esterilizada que contiene:

Sulfato de dextrina	1,00	microgramos/ml
Mezcla de polímero de glucosa	10	gramos/litro
Na	132	mmol/litro
Ca	1,75	mmol/litro
Mg	0,75	mmol/litro
Lactato	35	mmol/litro

El sulfato de dextrina fue 2-sulfato de dextrina, preparado como se describe en el Ejemplo 3 de la patente de Estados Unidos 5.439.892. La mezcla de polímero de glucosa, presente en la solución como un agente osmótico, fue la mezcla de polímero de glucosa descrita en el Ejemplo 2 de la memoria descriptiva europea 153164; contenía 91,9% de polímeros de GP mayor de 12 y 7,9% de polímeros de GP entre 2 y 10, y tuvo un peso molecular medio ponderal de 23.700.

Ejemplo 7

En el organismo adulto, las células endoteliales proliferan a una velocidad extremadamente lenta con tiempos de cambio que se ha estimado que son de años. En ciertos estados fisiológicos (por ejemplo: ovulación) y patológicos (por ejemplo: cicatrización, inflamación, crecimiento tumoral, artritis reumatoide, retinopatía diabética y enfermedad inflamatoria del intestino), nuevos vasos sanguíneos crecen rápidamente a partir de capilares preexistentes mediante un proceso de brotación que es similar a la angiogénesis embrionaria. La angiogénesis fisiológica es rara por lo tanto. Otras formas de angiogénesis en el adulto se asocian casi siempre con un proceso de enfermedad patológico.

a) Inflamación y angiogénesis

Aunque los dos procesos son distintos y separables, están sin embargo estrechamente relacionados. El aspecto histológico de la inflamación crónica incluye la presencia de tejido de granulación del cual la neovascularización es un aspecto destacado. El marcado aumento en las demandas metabólicas de un tejido que está proliferando, reparándose o experimentando una hipertofia debe estar acompañado por un aumento proporcional en el suministro de sangre capilar. Este es un requisito absoluto y sugiere varias características de angiogénesis. En primer lugar, el sistema vascular debe ser capaz de responder rápidamente a las necesidades crecientes del tejido con un aumento en su micro-vasculatura. En segundo lugar, el elevado coste metabólico de la angiogénesis significa que el proceso debe estar estrechamente controlado en condiciones basales y que debe ocurrir sólo cuando sea absolutamente necesario. En tercer lugar, cuando se pierde dicho control estricto, se crea un entorno anormal y esto conduce a enfermedad.

Por lo tanto, las células endoteliales que son normalmente inactivas se activan como parte de la respuesta angiogénica. Cuando se estimulan las células endoteliales de la microvasculatura, degradan su membrana basal y la matriz extracelular proximal, migran direccionalmente, se dividen, y se organizan en capilares de funcionamiento que se revisten mediante una nueva lámina basal. Estas etapas no son secuenciales. Más bien representan una orquestación de sucesos de solapamiento que son necesarios para intentar devolver el tejido dañado al estado homeostático normal. En cada una de estas etapas de angiogénesis, sigue habiendo vacíos sustanciales en nuestro conocimiento de los mecanismos exactos implicados.

La señal que inicia la angiogénesis varía con el estado que activa la estimulación y la angiogénesis y se cree que es específica de cada órgano. Por ejemplo, la degranulación de las plaquetas así como la digestión proteolítica de la matriz extracelular han estado implicadas porque ocurren rápidamente después del daño al tejido y no requieren nueva síntesis de proteínas. Sin embargo, muchas células también pueden ser el origen de señales angiogénicas e incluyen células tumorales, fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales.

Por lo tanto, la angiogénesis, según se define mediante el crecimiento de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes, es un proceso biológico fundamental que está en el núcleo de muchos procesos fisiológicos y patológicos. En la inflamación crónica y en el crecimiento tumoral, la angiogénesis progresa desde un proceso fisiológico hasta un proceso patológico.

Esto significa que un fármaco como 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina que reduce y/o previene la proliferación de células endoteliales y previene la neo-angiogénesis durante las etapas más tempranas de un proceso de enfermedad patológico podría abortar o incluso prevenir el daño al tejido que ocurriría como consecuencia de la respuesta inflamatoria crónica. El objetivo de dicho fármaco sería prevenir la lenta progresión de la destrucción del tejido y la fibrosis que es inducida por la respuesta angiogénica observada en la inflamación crónica.

b) Crecimiento tumoral y metástasis

Ha habido una investigación considerable en el papel de la angiogénesis en el crecimiento tumoral. Al principio de la patogénesis de un tumor, y antes de que un tumor se vuelva clínicamente significativo, debe haber un cambio a un fenotipo angiogénico. Este cambio angiogénico puede estar mediado por un aumento en la expresión de factores angiogénicos, o por un descenso en la expresión de factores angiostáticos, o ambos. Muchos factores han estado implicados en el control de actividad angiogénica asociada a tumores incluyendo factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) y las quimoquinas CXC. Ya hemos mostrado que 2-sulfato de dextrina y 6-sulfato de dextrina no interfieren con la acción proliferativa del crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento de fibroblasto básico en células endoteliales principales de la línea celular KSY-1. La propagación y crecimiento de metástasis distal sólo se puede conseguir mediante células individuales que han sido capaces de diseminarse por todo el cuerpo y que pueden estimular una respuesta angiogénica.

Por lo tanto, sólo cuando el depósito metastático de las células ha hecho el cambio a un fenotipo angiogénico la velocidad de proliferación de estas células será lo suficientemente rápida para que el foco metastático sea clínicamente evidente. Un inhibidor eficaz de la proliferación mediada por células endoteliales prevendría, por lo tanto, un crecimiento ulterior del tumor principal y detendría el desarrollo de metástasis. Dado que el propio endotelio tumoral no es genéticamente anormal, y, por lo tanto, no está sometido a una elevada velocidad de mutación, es muy poco probable desarrollar resistencia al fármaco a la terapia angiostática.

Esto significa que un fármaco como 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina que reduce o previene la proliferación de células endoteliales y previene la neo-angiogénesis durante las etapas más tempranas del crecimiento de la metástasis podría abortar o incluso prevenir el desarrollo de la lesión metastática.

c) Nefropatía y retinopatía diabética

La enfermedad microvascular que se manifiesta como formación de nuevos vasos es la forma más grave de daño al tejido que ocurre en pacientes diabéticos. Su manifestación más seria es microangiopatía que conduce a nefropatía diabética y a enfermedad ocular retinal diabética. También se cree que los cambios microvasculares contribuyen a la neuropatía diabética y a enfermedad diabética de los pies. Aunque un mal control de glucosa es un factor contribuyente principal, no es el único factor responsable para este proceso de enfermedad patológico.

Tanto la nefropatía diabética como la retinopatía diabética tienen una patogénesis multifactorial. Hay cambios en las células endoteliales, espesamiento de las membranas basales del capilar, número reducido de pericitos intramusculares, hipoxia del tejido y flujo reducido de sangre retinal. En el caso de la retina, los cambios en las arteriolas, capilares y venas conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos en los márgenes del área isquémica. Se cree que esto da como resultado la liberación de factores angiogénicos que fomentan la formación de nuevos vasos sanguíneos. Se han aislado a partir de las retinas de varias especies factores angiogénicos con propiedades similares a las aisladas a partir de algunos tumores. Este estímulo a la neo-vascularización da como resultado una retinopatía proliferativa cuyos aspectos son el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. La hemorragia a partir de estos nuevos vasos sanguíneos conduce a menudo a la ceguera.

Muchos pacientes con nefropatía diabética desarrollan un fallo renal crónico. Son tratados a menudo usando diálisis peritoneal ambulatoria continua. Esto requiere el uso de soluciones de diálisis como glucosa o dextrina. Al añadir una dextrina sulfatada a una concentración apropiada a la solución de diálisis de dextrina, debe ser posible reducir un daño ulterior al riñón al inhibir la respuesta angiogénica que la dirige. Estudios en animales han mostrado que cuando se administran dextrinas sulfatadas por vía intraperitoneal, se acumulan en el riñón. Al monitorizar también las retinas de estos pacientes, será posible establecer si las dextrinas sulfatadas suministradas por vía intraperitoneal prevendrán la formación de nuevos vasos sanguíneos (es decir: retinopatía diabética) en el ojo.

d) Artritis reumatoide

La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por una destrucción progresiva de las articulaciones. Los sellos característicos de los cambios patológicos en el sinovio incluyen hiperplasia de las células del revestimiento sinovial y la agregación similar a folículos de linfocitos y células plasmáticas. Esta inflamación del sinovio conduce a la formación de pannus muy vascularizado y a la destrucción eventual de la articulación. La destrucción del tejido es parcialmente dependiente de las proteasas y colagenasas que se liberan durante la respuesta angiogénica.

Aunque estudios patológicos han identificado daño capilar, edema, congestión vascular y un infiltrado celular como cambios patológicos tempranos en el sinovio reumatoide, los factores que inician el proceso de la enfermedad y conducen a esta inflamación crónica todavía permanecen poco claros. Hirohata S & Sakakibara J, Lancet: Angiogenesis as a possible elusive triggering factor in rheumatoid arthritis, 17 de abril 1999, página 1331, se advirtió que la neo-angiogénesis precede a todos los otros aspectos de la artritis reumatoide como proliferación de células del revestimiento e infiltración celular entre uno y dos años. Aunque se ha mostrado que las células que revisten el sinovio producen factores de crecimiento angiogénico como factor de crecimiento de fibroblasto básico y factor de crecimiento endotelial vascular en el sinovio al comienzo de la artritis reumatoide, en sus etapas más tempranas, el sinovio muestra neo-angiogénesis sin proliferación de células del revestimiento. Esto confirma que la angiogénesis es el evento patológico principal que se activa mediante un antígeno desconocido. Por lo tanto, la intervención con un fármaco como 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina que reduce o previene la proliferación de células endoteliales y la neo-angiogénesis durante sus etapas más tempranas podría se beneficioso tanto para el tratamiento de artritis reumatoide temprana y para la prevención de la artritis destructiva que se desarrolla eventualmente.

e) Enfermedad inflamatoria del intestino

La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa son las formas principales de enfermedad inflamatoria del intestino. Estos trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal se activan por un patógeno desconocido. Su patología se caracteriza por un infiltrado leucocitario crónico en la pared intestinal que conduce a un daño progresivo en el tejido. La microvasculatura intestinal ha estado implicada desempeñando un papel principal en la patogénesis y la progresión de la enfermedad inflamatoria del intestino. Los estudios inmuno-histoquímicos de tejido de pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino activa han mostrado que las células endoteliales microvasculares expresan grandes niveles de E-selección, molécula de adhesión intercelular de tipo 1(ICAM-1) y CD31. Estas moléculas de adhesión median en la unión y transmigración de leucocitos circulantes. De este modo la función celular endotelial alterada se asocia con inflamación crónica persistente en la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.

En el caso de estos dos trastornos, es posible que la administración intraperitoneal de 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina tuviese un beneficio terapéutico. La administración intraperitoneal del fármaco da como resultado que cantidades sustanciales del fármaco se acumulan en todos los tejidos asociados con el intestino delgado y el intestino grueso. Esto podría dar como resultado una reducción en el número de células endoteliales activadas que proliferan, así como prevenir la activación y proliferación de nuevas poblaciones de células endoteliales. Esto a su vez prevendría la neo-angiogénesis y la continuación de la respuesta inflamatoria crónica que conduce al desarrollo de la enfermedad clínica.

f) Psoriasis

Esto es un trastorno de la piel que se caracteriza por un infiltrado celular inflamatorio, proliferación anormal de queratinocitos y neovascularización dérmica. Aunque se reconoce que la angiogénesis asociada con psoriasis no es la causa principal de la patogénesis de esta enfermedad, la actividad angiogénica es debida sin embargo a una combinación de la sobreproducción de IL-8 y una subproducción del inhibidor de angiogénesis, trombospondina-1. También hay una sobreexpresión de otros factores angiogénicos como factor de crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento transformante alfa. El factor angiostático IP 10 se expresa en placas psoriásicas con una expresión que está reducida tras el tratamiento exitoso de las lesiones activas. Esto sirve para resaltar la importancia de los factores angiostáticos endógenos en los trastornos dependientes de angiogénesis. De manera interesante, muchos tratamientos usados comúnmente para psoriasis como esteroides tópicos, ciclosporina y retinoides tienen actividad angiostática.

Por lo tanto, la aplicación regular de una preparación tópica (es decir: piel) de 2-sulfato de dextrina o 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina para lesiones de placa activa de psoriasis podría dar como resultado la curación de estas lesiones al reducir o prevenir la proliferación de células endoteliales y la respuesta angiogénica que está dirigiendo el desarrollo de la lesión psoriásica.

Claims (9)

1. Uso de sulfato de dextrina en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que tiene al menos 50%, preferiblemente más de 90%, en peso de polímeros de glucosa de GP mayor de 12, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno dependiente de angiogénesis, distinto de tumor hipervascular, en el que la inflamación crónica es un componente significativo de la enfermedad.

2. Uso de sulfato de dextrina según la reivindicación 1 en el que dicho trastorno es nefropatía o retinopatía diabética, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino o psoriasis.

3. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medicamento es para administración por vía intraperitoneal.

4. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que contiene menos de 10%, preferiblemente menos de 5%, en peso de polímeros de glucosa de GP menor de 12.

5. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que tiene un peso molecular medio ponderal entre 10.000 y 35.000, preferiblemente entre 15.000 y 25.000.

6. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sulfato de dextrina se deriva de una dextrina que contiene menos de 10%, preferiblemente menos de 5%, en peso de polímeros de glucosa de peso molecular mayor de 40.000.

7. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sulfato de dextrina contiene como mucho dos grupos sulfato por unidad de glucosa.

8. Uso de sulfato de dextrina según la reivindicación 7 en el que el sulfato de dextrina contiene entre 0,5 y 1,5 grupos sulfato por unidad de glucosa.

9. Uso de sulfato de dextrina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sulfato de dextrina es 2-sulfato de dextrina, 6-sulfato de dextrina o 2,6-sulfato de dextrina o una mezcla de éstos.