BR112020013714A2 - compostos para tratamento e prevenção de patologias mediadas por histona extracelular - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a compostos com alta estabilidade química e métodos para inibir a atividade patológica de histonas extracelulares num sujeito. Em particular, a invenção se refere a compostos com alta estabilidade química, usos dos mesmos e métodos para inibir ou melhorar enfermidades mediadas por histona extracelular (tal como, por exemplo, sepse, síndrome de resposta imunológica sistêmica (SIRS) e lesão por reperfusão e isquemia (IRI)). Mais particularmente, a invenção se refere a métodos e usos de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução, em que a presença do substituinte resulta numa molécula com alta estabilidade química sem afetar a capacidade da molécula para ser eficaz na terapia de enfermidades mediadas por histona extracelular. Por exemplo, a presente invenção se refere a métodos e usos de sulfato de ß-O-metil celobiosídeo (mCBS) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, mCBS.Na), na terapia de uma gama de enfermidades mediadas por histona extracelular em sujeitos.

Description

“COMPOSTOS PARA TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE PATOLOGIAS MEDIADAS POR HISTONA EXTRACELULAR” CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a compostos e métodos para inibir a atividade patológica de histonas extracelulares num sujeito. Em particular, a invenção se refere a compostos, usos e métodos para inibir ou melhorar enfermidades mediadas por histona extracelular (tal como, por exemplo, sepse, síndrome de resposta imunológica sistêmica (SIRS) e lesão por reperfusão e isquemia (IRI)). Mais particularmente, a invenção se refere a métodos e usos de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução, em que a presença do substituinte resulta numa molécula com alta estabilidade química sem afetar a capacidade da molécula para ser eficaz na terapia de enfermidades mediadas por histona extracelular. Por exemplo, a presente invenção se refere a métodos e usos de sulfato de -O-metil celobiosídeo (mCBS) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, mCBS.Na), na terapia de uma gama de enfermidades mediadas por histona extracelular em sujeitos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As histonas são proteínas básicas pequenas que funcionam no núcleo celular para regular a expressão de genes mediante a complexação com DNA para formar nucleossomas, que se assemelham em estrutura de cromatina. Além de funções intranucleares, Xu et al, (Nat Med.

2009. 15:1318-21) relataram uma atividade citotóxica para histonas liberadas em resposta a processos inflamatórios com as histonas extracelulares que agem como mediadores de disfunção de célula endotelial, falência de órgão e morte em sepse.

[003] As histonas também são agora reconhecidas como sinais de perigo endógeno ou DAMPs quando translocam do núcleo para o espaço extranuclear. São frequentemente detectadas na superfície celular ou no citoplasma de células imunes, neurônios cerebelares, células de Schwann e microglia em resposta ao estresse e demonstraram causar respostas inflamatórias e tóxicas sistêmicas através da ativação de receptores similares a Toll e vias de inflamassoma. Os níveis elevados de histonas circulantes, bem como nucleossomas, têm sido implicados em múltiplos processos fisiopatológicos e na progressão de doenças, incluindo doenças autoimunes, doenças inflamatórias e câncer, suportando um papel para histonas extracelulares em muitas doenças humanas.

[004] Várias tentativas foram feitas nos últimos tempos para encontrar uma nova terapia eficaz para doenças mediadas por histonas extracelulares. Por exemplo, foi feito esforço considerável para produzir anticorpos monoclonais contra os mediadores principais de inflamação, mas estes se mostraram clinicamente ineficazes e também foram constatados como tendo efeitos colaterais perigosos, particularmente em pacientes com sepse.

[005] Os tratamentos anti-histonas, tais como anticorpos neutralizantes, proteína C ativada, trombomodulina recombinante e heparina, foram constatados como protegendo camundongos contra endotoxemia letal, sepse, lesão por isquemia/reperfusão, trauma, pancreatite, peritonite, acidente vascular cerebral, coagulação e trombose, mas tiveram valor clínico limitado devido à falta de eficácia ou efeitos colaterais inaceitáveis. Por exemplo, fatores de coagulação humana purificados, tais como a proteína C ativada (APC), incluindo a APC humana recombinante (por exemplo, Xigris ®), tiveram pouco impacto clínico. Existem várias razões para isto. Uma razão inclui a atividade anticoagulante de APC, que leva a um risco aumentado de hemorragia, excluindo assim o fármaco de APC da terapia de SIRS, que pode se desenvolver em pacientes pós-cirurgia ou pós-trauma. Pela mesma razão, os agentes terapêuticos à base de APC são excluídos do uso em sepse que ocorre em pacientes com leucemia que têm alto risco de sangramento. Adicionalmente, à medida que a sepse se desenvolve rapidamente, o modo de ação relativamente lento da APC é uma desvantagem. De fato, devido à falta de eficácia, Xigris® foi retirado de venda em 25 de outubro de 2011.

[006] Desta forma, apesar destes esforços, as doenças mediadas por histonas extracelulares permanecem praticamente não tratada, enquanto são algumas das doenças mais debilitantes e mortais que existem em seres humanos. Daí, representam uma preocupação clínica significativa.

[007] Uma classe de composto que foi aplicada ao tratamento de condições ou doenças mediadas por histonas extracelulares, tais como sepse, é divulgada na Patente US n° 9.226.939. Esta patente US é dirigida a uma invenção que se refere a um método para inibir a atividade citotóxica de histonas extracelulares num sujeito, o que exige a administração de uma quantidade eficaz de um poliânion ao sujeito. Uma ampla gama de poliânions estruturalmente muito diferentes foi divulgada nesta publicação de patente US.

[008] É neste contexto do reconhecimento crescente do papel de histonas extracelulares em múltiplas doenças que a presente invenção foi desenvolvida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] As histonas extracelulares liberadas em resposta à provocação inflamatória são mediadores que contribuem para a disfunção endotelial, falência de órgão e morte celular (particularmente durante a sepse). A presente invenção é baseada numa constatação que a seleção de compostos polianiônicos altamente estáveis pode interagir eletrostaticamente com histonas para neutralizar as propriedades pró-coagulantes e de ativação de plaquetas, danos de hemácias e citopáticas destas moléculas. A complexação de tais moléculas polianiônicas com histonas extracelulares na circulação de um animal vivo fornece um meio para pelo menos melhorar a atividade citotóxica das histonas extracelulares.

[010] Em particular, os inventores identificaram que certos dissacarídeos sulfatados são eficazes na neutralização destes efeitos patológicos de histonas. Por exemplo, um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução fornece um poliânion quimicamente estável que também tem capacidade para fornecer tratamento altamente eficaz para enfermidades mediadas por histona extracelular (como, por exemplo, sepse, SIRS e IRI e pelo menos melhorar estas condições em pacientes).

[011] Os inventores também identificaram que os compostos da invenção fornecem métodos para o diagnóstico, prognóstico e gerenciamento de enfermidades mediadas por histona extracelular.

[012] A presente invenção também se baseia na constatação dos inventores de que um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução protege as células endoteliais contra a citotoxicidade de histona extracelular de uma maneira dependente de concentração e reduz ou mesmo reverte os danos induzidos por histona, como agregação e lise de hemácias, e protege contra lesões celulares e disfunção de órgãos, por exemplo, em sujeitos sépticos, com SIRS e IRI.

[013] O uso de um celobiosídeo sulfatado modificado com um substituinte pequeno não carregado em sua terminação de redução, com estabilidade química resultante, apresenta ou fornece um novo princípio geral de aplicação no campo de tratamento de pacientes que sofrem de patologias mediadas por histonas e/ou prevenção da ocorrência de patologias mediadas por histonas em pacientes de risco.

[014] Num primeiro aspecto da invenção, é fornecido um composto para uso no tratamento ou prevenção de enfermidades mediadas por histona extracelular, em que o composto compreende: um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado na sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução.

[015] Os compostos da invenção, quando presentes numa quantidade terapeuticamente ou farmaceuticamente eficaz, fornecem um meio para melhorar, tratar ou prevenir enfermidades mediadas por histona extracelular.

[016] Numa modalidade da invenção, o celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado tem a estrutura geral: em que: R1 é um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado, por exemplo, O ou S-(C1-6)alquila; e R2 a R8 são, cada um, selecionados de: (i) um substituinte pequeno ligado a O não carregado ou (ii) um grupo sulfato.

[017] De preferência, R1 é O ou S-(C1-6)alquila. De preferência, R1 aprimora a estabilidade química do poliânion, em comparação com o mesmo poliânion com um grupo sulfato em R1.

[018] De preferência, R2 a R8 são, cada um, selecionados de: (a) um grupo hidroxila não modificado; ou (b) um grupo sulfato.

[019] Mais preferencialmente, R1 é um grupo metóxi ou etóxi e R2 a R8 são, cada um, um grupo sulfato selecionado de: O-sulfato ou N- sulfato.

[020] Desejavelmente, a classe de composto tem uma carga líquida negativa alta, isto é, é um poliânion.

[021] A configuração anomérica do substituinte pequeno de glicosídeo não carregado (R1) pode ser da posição  ou . De preferência, o substituinte pequeno não carregado está na configuração .

[022] Numa forma altamente preferencial da invenção, o composto é mCBS ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é um dissacarídeo de β-O-metil celobiosídeo sulfatado. A título de ilustração, o composto é o sal de sódio de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo, a saber, sulfato de β-O-Metil celobiosídeo de sódio (mCBS.Na).

[023] mCBS é altamente estável em relação a CBS e bem tolerado em altas concentrações. Tem efeitos anticoagulantes mínimos e capacidade para reduzir a perturbação de coagulação de plasma induzido por histona. A atividade anticoagulante de mCBS é 110 vezes menor que a heparina de baixo peso molecular e 750 vezes menos que a heparina não fracionada.

[024] Num segundo aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar (terapêutica ou preventivamente) uma condição médica, enfermidade ou doença que envolve histonas extracelulares num sujeito que compreende: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[025] Por exemplo, numa modalidade do segundo da invenção, é fornecido um método para tratar, prevenir ou melhorar sepse, SIRS ou uma condição médica ou doença associada a sepse e/ou SIRS num sujeito, em que o método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[026] De acordo com esta modalidade da invenção, o tratamento de sepse/SIRS melhora a sepse/SIRS ou uma condição séptica/SIRS ou uma doença associada à mesma, permitindo que um médico administre outros fármacos para tratar condições secundárias.

[027] Numa outra modalidade do segundo da invenção, é fornecido um método para tratar, prevenir ou melhorar IRI ou uma condição médica ou doença associada a IRI num sujeito, em que o método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[028] Num terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar o acúmulo de histona extracelular num sujeito, sendo que o referido método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[029] Por exemplo, numa modalidade do terceiro aspecto da invenção, o método é usado para prevenir uma condição ou enfermidade associada a uma complicação associada a histona extracelular tal como, por exemplo, sepse, SIRS ou IRI.

[030] Em certas modalidades exemplificadoras de acordo com o segundo ou o terceiro aspectos da invenção, os métodos identificados podem compreender ainda a etapa de: administrar ao sujeito, juntamente com ou concomitantemente com o celobiosídeo sulfatado modificado, uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de uma segunda composição, composto ou agente ativo selecionado de: um ou mais dentre agentes anti- inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composição farmacêutica que trata uma ou mais condições que um sujeito é afetado com ou está em risco de ser afetado.

[031] De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece um tratamento auxiliar para o tratamento dirigido à complicação associada à histona extracelular (tal como, por exemplo, sepse, SIRS ou IRI) e/ou para condições médicas ou doenças associadas a tais complicações. De preferência, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[032] De preferência, o segundo agente ativo apresenta um meio para intervenção médica de uma doença que um paciente é afetado que está relacionada a ou é distinta da enfermidade médica tratada pelos compostos desta invenção, sendo que o referido segundo agente ativo fornece um tratamento auxiliar para o paciente.

[033] Num quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar ou prevenir uma condição médica ou doença associada à citotoxicidade de histona extracelular num sujeito, em que o método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[034] Num exemplo preferencial do quarto aspecto da invenção, o método é usado para neutralizar histonas extracelulares que (i) são citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito e/ou (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito. Adicional ou alternativamente, o método é usado para tratar uma condição séptica ou SIRS ou uma IRI ou uma doença associada a sepse, SIRS ou uma IRI que é causada por ou mediada por uma liberação de histonas extracelulares num sujeito após infecção, inflamação ou hipoxia ou qualquer resposta de infecção, inflamatória ou hipoxia num sujeito.

[035] Num quinto aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou terapêutica para uso no tratamento de uma complicação associada à histona extracelular que compreende: pelo menos um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. De preferência, o composto está presente numa quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz na composição farmacêutica ou terapêutica. A composição pode incluir também um carreador, excipiente e/ou diluente terapêutica ou farmaceuticamente aceitável. O composto na composição farmacêutica ou terapêutica é numa forma de base livre neutra ou forma de sal. De preferência, o composto de celobiosídeo sulfatado polianiônico é mCBS ou, mais particularmente, é o sal de sódio de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo.

[036] Em certas modalidades exemplificadoras, de acordo com o quinto aspecto da invenção, a composição identificada também pode compreender uma segunda composição, composto ou agente ativo selecionado de: um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composto farmacêutico ou terapêutico que trata uma ou mais condições que o sujeito é afetado.

[037] De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece desejavelmente uma terapia adjunta para sepse, SIRS ou uma IRI ou para uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou uma IRI. De preferência, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[038] Num sexto aspecto da invenção, é fornecido um uso de uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para tratar uma condição médica, enfermidade ou doença que envolve histonas extracelulares. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[039] Por exemplo, numa modalidade do sexto aspecto da invenção, é fornecido um uso de uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de sepse, SIRS ou uma IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou uma IRI num sujeito. De preferência, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[040] Numa modalidade de tal uso, o medicamento é para o tratamento de sepse, ou SIRS ou uma condição médica ou doença associada a sepse ou SIRS num sujeito, em que o referido tratamento melhora ou inibe a referida sepse ou SIRS ou a referida condição ou doença associada à referida sepse ou SIRS.

[041] Numa outra modalidade de tal uso, o medicamento é para o tratamento de uma IRI ou de uma condição médica ou doença associada a uma IRI num sujeito, em que o referido tratamento melhora ou inibe a referida IRI ou a referida condição ou doença associada à referida lesão.

[042] Em ainda outra modalidade de tal uso, o medicamento é usado para neutralizar histonas extracelulares que (i) são citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito, (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito, (iii) iniciam a coagulação mediante a ativação de plaquetas num sujeito ou (iv) induzem a fragilidade de hemácia e anemia resultante num sujeito.

[043] Em ainda outra modalidade, o medicamento fabricado pode incluir também uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de uma segunda composição, composto ou agente ativo. De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece uma terapia adjunta para tratar uma condição médica, enfermidade ou doença que envolve histonas extracelulares. Desejavelmente, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece uma terapia adjunta para o tratamento de sepse, SIRS ou uma IRI ou para uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou uma IRI. De preferência, o segundo agente ativo é selecionado de: um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composto farmacêutico ou terapêutico que trata uma ou mais condições que o sujeito é afetado. Mais preferencialmente, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[044] Quando o composto de celobiosídeo sulfatado modificado é usado em qualquer um dos métodos da invenção, o composto pode ser administrado ou formulado para administração ao sujeito que precisa do mesmo, numa dose única de formulação. Em certas modalidades alternativas, o composto de celobiosídeo sulfatado modificado é administrado, ou formulado para administração ao sujeito que precisa do mesmo, como uma formulação de dose múltipla.

[045] Os objetivos adicionais, vantagens e recursos inovadores serão apresentados na descrição que se segue ou ficarão evidentes aos versados na técnica mediante o exame dos desenhos e da descrição detalhada subsequente de várias modalidades não limitantes a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[046] A divulgação irá fornecer detalhes na descrição a seguir de modalidades preferenciais com referência às seguintes figuras em que: A Figura 1 é a comparação d estabilidade de CBS contra mCBS quando armazenado a 5±3°C (Figura 1A), 25±2°C/60% de RH (Figura 1B) e 40±2°C/75% de RH (Figura 1C) conforme medido por HPLC. As Figuras refletem a porcentagem (%) de alteração de mCBS e CBS em relação à sua quantidade inicial (em T=0). A Figura 2 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado humano conforme mostrado pela medição (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado humano sob condições permissivas de metabolismo de fase I.

A Figura 3 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado de rato conforme mostrado pela medição (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado de rato sob condições permissivas de metabolismo de fase I.

A Figura 4 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado canino conforme mostrado pela medição (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado canino sob condições permissivas de metabolismo de fase I.

As Figuras 5 A a D fornecem uma representação gráfica de saída de citometria de fluxo e os painéis E a G fornecem uma representação pictórica de resultados de microscopia confocal que demonstram que mCBS protege células endoteliais microvasculares humanas (HMECs) contra danos de histona.

As HMECs cultivadas foram tratadas durante 60 min com (A & E) equivalente de volume de água, (B & F) histonas 400 μg/ml, (C & G) mCBS 100 μg/ml + histonas 400 μg/ml ou (D) mCBS 25 μg/ml + histonas 400 μg/ml, então, marcadas com os corantes calceína-AM e PI e analisadas acerca da extensão de absorção de corante usando citometria de fluxo (A, B, C & D) ou microscopia confocal (E, F & G). Os números nos quadrantes indicam a porcentagem de células presentes em cada quadrante.

As células viáveis absorvem calceína-AM (verde) e excluem PI, enquanto as células mortas e danificadas absorvem PI (vermelho) e são incapazes de reter calceína-AM.

O ensaio baseado em citometria de fluxo usou suspensões de HMEC (painéis A a D), enquanto o experimento de microscopia confocal usou monocamadas de HMEC (painéis E a G), com as monocamadas de HMEC sendo mais sensíveis ao dano de histona.

A Figura 6 é uma representação gráfica que demonstra que o efeito protetor de mCBS contra danos induzidos por histona para HMECs é dependente de concentração.

As HMECs cultivadas foram expostas a 400 μg/ml de histonas após a adição de concentrações crescentes de mCBS, então, analisadas acerca da absorção de calceína-AM (viáveis) ou PI (mortas) usando citometria de fluxo.

As células mortas/viáveis expressadas como % de células não tratadas de controle.

As barras de erros representam SEM.

A Figura 7 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS pode reverter o dano numa proporção de HMECs expostas a histonas durante 1 hora.

As HMECs cultivadas foram expostas a 400 μg/ml de histonas durante 60 min, tratadas com mCBS (100 μg/ml) durante 10 min e, então, analisadas acerca da absorção de PI usando citometria de fluxo.

A citotoxicidade expressa como uma porcentagem de absorção de PI por células tratadas com histonas durante 60 min (controle positivo). As barras de erros representam SEM.

A Figura 8 os painéis A a C fornecem uma representação gráfica de saída de citometria de fluxo e os painéis D a F fornecem uma representação pictórica de resultados de microscopia eletrônica de varredura que demonstram que a agregação de RBC induzida por histona é impedida por mCBS.

As RBCs humanas isoladas foram analisadas por citometria de fluxo usando parâmetros de FSC log versus autofluorescência log (canal de FL-1) ou visualizadas usando microscopia eletrônica de varredura acerca da extensão da agregação após (A & D) nenhum tratamento, (B & E) incubação com histonas (400 μg/ml) durante 60 min e (C & F) após tratamento com histonas (400 μg/ml) durante 60 min, então, exposição a mCBS (200 μg/ml) durante 10 min.

A Figura 9 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS inibe agregação de RBC induzida por histona de uma maneira dependente de dose.

As RBCs humanas isoladas foram expostas (painel A) a concentrações variadas de histonas durante 60 min e a extensão da agregação medida pelo nível de autofluorescência (FL-1) conforme na Figura 8. (Painel B) conforme em (A) exceto pelo fato de que concentrações variadas de mCBS são adicionadas a RBCs antes da adição de 400 μg/ml de histonas.

As barras de erros representam SEM.

Asteriscos representam a diferença significativa do controle (sem histonas presentes), sendo que os valores P são <0001 (****). A Figura 10 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS inibe a fragilidade de RBC induzida por histona, um efeito que é exacerbado por taxa de fluxo de cisalhamento mais alta e maior duração de exposição ao cisalhamento.

As RBCs humanas isoladas diluídas em solução salina a 60% (solução salina normal:água a uma razão de 6:4) foram (painel A) incubadas com concentrações crescentes de histonas durante 60 min, então, expostas a taxas de fluxo progressivamente rápidas (mm/s) em repetição 40 X e (painel B) repetições variadas de pipetagem em taxa de fluxo de 100 mm/s, ou (painel C) tratadas com concentrações variadas de mCBS, então, expostas a 400 μg/ml de histonas durante 60 mins e uma taxa de fluxo de cisalhamento de 100 mm/s e repetições de pipetagem 40 X, dentro de um sistema robótico.

O sobrenadante a partir de cada amostra foi, então, medido acerca do teor de hemoglobina a A540 nm como uma indicação da extensão de lise de RBC.

As barras de erros representam SEM.

Asteriscos representam a diferença significativa de tratamentos anteriores, sendo que os valores P são <05 (*), <001 (***) e <0001 (****). A Figura 11 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS reverte a suscetibilidade de RBC induzida por histona à lise e agregação.

As RBCs humanas isoladas foram expostas a 400 μg/ml de histonas durante 55 min, então, concentrações variadas de mCBS durante 5 min antes (painel A) da aplicação de forças de cisalhamento (taxa de fluxo de 100 mm/s e repetições de pipetagem 40 X) e a medição de hemoglobina no sobrenadante através de A540 nm, e a análise (painel B) da extensão de agregação de RBC conforme medido pelo nível de autofluorescência em FL1 usando citometria de fluxo.

As barras de erros representam SEM.

Asteriscos representam a diferença significativa do tratamento de controle (histonas sozinhas, sem mCBS presente), sendo que todos os valores P são <0001 (****). A Figura 12 mostra que a sulfatação de nível alto de mCBS é necessária para que seja um inibidor eficaz de patologias mediadas por histona. a, Estruturas de preparações de mCBS di-, tri-, tetra- e pentassulfatado em comparação com mCBS completamente sulfatado (heptassulfatado). b, Curvas de inibição que mostram que apenas o mCBS pentassulfatado inibe fracamente a citotoxicidade mediada por histona para HMEC-1. c, Resultados similares obtidos mediante o exame da inibição de fragilidade de eritrócito induzida por histona.

Dados expressos como média ± s.e.m. (n=3). A Figura 13 é uma representação gráfica que demonstra que histonas induzem a desgranulação e agregação de plaquetas, e estes efeitos podem ser inibidos por mCBS e CBS. (Painel A) As plaquetas humanas isoladas foram incubadas com concentrações variadas de histonas durante 1 h antes da análise de agregação por citometria de fluxo usando FSC e SSC para discriminar entre plaquetas únicas e agregadas. (Painel B) conforme em (A), entretanto, concentrações variadas de mCBS, CBS e CB não sulfatado foram adicionadas antes de histonas (150 µg/ml). (Painel C) As plaquetas humanas em sangue total foram analisadas acerca de desgranulação (liberação de ATP) após a adição de concentrações crescentes de histonas usando quimioluminometria com trombina incluída como um controle positivo. (Painel D) conforme em (C), exceto pelo fato de que concentrações crescentes de mCBS, CBS e o CB não sulfatado foram adicionados antes da adição de histonas (400 µg/ml). As barras de erros representam SEM.

Figura 14 Citotoxicidade mediada por histona para células não exige sulfato de heparano de superfície celular. a, HMEC-1 em suspensão foram tratadas com heparinases bacterianas 1, 2 e 3 (derivadas de Flavobacterium) ou heparanase de plaqueta humana.

A suscetibilidade de HMEC-1 não tratada (histona sozinha) e tratada com heparinise/heparanase à citotoxicidade mediada por histona foi, então, determinada.

A remoção enzimática de sulfato de heparano de HMEC-1 não teve efeito na sensibilidade das células à citotoxicidade mediada por histona nem o tratamento teve qualquer efeito na viabilidade de HMEC (Heparinase sozinha). b, Suspensões de células CHO-K1 do tipo selvagem e pgsA-745 CHO-K1 deficientes de GAG foram incubadas durante 1 h a 37°C com concentrações crescentes de histonas e células exterminadas detectadas por citometria de fluxo.

A ausência de GAGs resultou em apenas uma redução pequena, mas significativa, na suscetibilidade das células à citotoxicidade de histona em altas concentrações de histona.

Dados expressos como média ± s.e.m. (n=3). *P≤0,05, **P<0,01 (ANOVA bidirecional com testes de múltiplas comparações de Sidak). A Figura 15 mostra que histonas rompem bicamadas de lipídio e induzem um fluxo de Ca2+ celular, processos bloqueados por mCBS e CBS. a, O tempo de vida de bicamadas de lipídio artificiais expostas a histonas (HIS)(1 μm) sozinha (n=47) ou na presença de CBS (n=52) (10 μM). As bicamadas de controle (n=125) continham a proteína de canal de íons RμR1. Os valores P calculados usando teste de Kruskal-Wallis não paramétrico. b, Plotagens de citometria de fluxo representativas, usando corante sensível a Ca2+ Indo-1, que mostra HMEC-1 em fluxo de Ca2+ após a adição de histona (100 μg ml−1). c, Curso do tempo de efeito de mCBS (100 μg ml−1) em fluxo de Ca2+ induzido por histona por HMEC-1. A Figura 16 é uma representação gráfica que demonstra que histonas reduzem coagulação sanguínea.

Usando análise de coagulação de sangue total ROTEM (painel A) a adição de concentrações crescentes de histona ao sangue total humano resultou num prolongamento do tempo de coagulação em todos os ensaios, mas particularmente nos ensaios NATEM e INTEM. (Painel B) O mesmo efeito anticoagulante de histonas na coagulação foi demonstrado usando o ensaio de coagulação baseado em plasma, tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT). As barras de erros representam SEM.

A Figura 17 é uma representação gráfica que demonstra análise

ROTEM de efeitos de sacarídeos sulfatados na coagulação de sangue total. (Painel A) O sangue total foi suplementado com mCBS, sulfato de maltotriose ou sulfato de melezitose (200 μg/ml) imediatamente antes de os ensaios NATEM (não ativado), EXTEM (ativação de via extrínseca), INTEM (ativação de via intrínseca) e FIBTEM (ativação de via extrínseca com plaquetas neutralizadas) serem realizados.

Os dados representam o tempo de coagulação expresso como aumento em vezes acima do controle de água. (Painel B) O sangue total, suplementado com concentrações variadas de mCBS, sulfato de melezitose ou sulfato de maltotriose, foi analisado usando o ensaio NATEM acerca do tempo de coagulação. (painel C) conforme em (B), exceto pelo fato de que os dados representam a amplitude de coágulo em 20 min.

Nenhuma coagulação foi detectada com os dois trissacarídeos em 50 e 100 μg/ml.

As barras de erros representam SEM.

A Figura 18 é uma representação gráfica que demonstra uma comparação entre o efeito anticoagulante de mCBS com heparina e a heparina de baixo peso molecular, Enoxaparina.

Usando o ensaio NATEM, a coagulação de sangue total foi medida após a adição de heparina, Enoxaparina, o trissacarídeo, sulfato de maltotriose e mCBS nas concentrações em μg/ml indicadas entre colchetes.

A Figura 19 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS inibe perturbações induzidas por histona de coagulação de sangue total.

Usando o ensaio EXTEM, o prolongamento do tempo de coagulação induzido por 400 e 800 μg/ml de histonas poderia ser inibido pela adição anterior de 200 μg/ml de mCBS.

A adição do mesmo volume de água não teve efeito inibitório.

As barras de erros representam SEM.

A Figura 20 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS e CBS protegem camundongos contra dano de órgão induzido por histona.

Os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de mCBS, CBS ou o CB não sulfatado nas concentrações indicadas, (ou um volume equivalente de PBS) 10 min antes de uma injeção intravenosa de 50 mg/kg de histonas (ou um volume equivalente de PBS). O sangue foi coletado retro- orbitalmente 4 h depois para análise de marcadores de lesão celular (LDH – lactato desidrogenase), disfunção de fígado (ALT - alanina aminotransferase) e disfunção renal (Crea - creatinina). As barras de erros representam SEM.

Dados média ± s.e.m. *P≤0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 (ANOVA unidirecional com teste de múltiplas comparações de Dunnett). A Figura 21 é uma representação gráfica que demonstra que mCBS reduz ou previne reduções mediadas por histona em leucócitos, plaquetas e eritrócitos em circulação.

Os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de mCBS (ou um volume equivalente de PBS) 10 min antes de uma injeção intravenosa de 50 mg/kg de histonas (ou volume equivalente de PBS), então, 10 min depois foram sangrados retro- orbitalmente.

O sangue total foi analisado acerca de números de leucócito, plaqueta e eritrócito e concentração de hemoglobina usando um sistema de hematologia ADVIA 2120. As barras de erros representam SEM.

Asteriscos representam a diferença significativa de controle de PBS + HIS, sendo que os valores P são <01 (**), <001 (***) (ANOVA unidirecional com teste de múltiplas comparações de Dunnett). A Figura 22 mostra que mCBS protege ratos contra dano celular induzido por sepse moderada.

Uma representação gráfica que demonstra a taxa de sobrevivência de ratos tratados com mCBS (mCBS) e não tratados (Controle) num modelo de rato de sepse moderada (painel A), e que demonstra que mCBS reduz o dano celular (lactato desidrogenase (LDH)) num modelo de animal de sepse moderada (painel B). Os ratos machos Wistar (n=8/grupo) se submeteram à laparotomia, punção e ligação cecal (CLP) para estimular a peritonite fecal e sepse subsequente, então, foram tratados com solução salina (Controle CLP) ou 50 mg/kg de mCBS em 0, 5 e 10 h após operação via injeção i.p. e monitorados durante 20 h.

Uma vez que os ratos alcançaram um estado de morbidade grave, os mesmos foram humanamente submetidos à eutanásia, no ponto em que uma morte foi registrada.

Conforme visto no painel A, os ratos tratados com mCBS mostraram taxa de sobrevivência de 100% e, conforme visto no painel B, o tratamento com mCBS reduziu significativamente os níveis de LDH circulantes em comparação com o grupo de Controle CLP de ratos (Análise estatística: bicaudal, teste t de Student, p ≤ 0,05). Figura 23 CBS protege ratos contra dano de órgão e morbidade induzida por sepse grave. a, Sobrevivência de ratos (n=8/grupo) submetidos à punção e ligação cecal (CLP) e que recebem solução salina (Controle) e CBS.

Valores P obtidos com o teste Log-rank (Mantel-Cox). b, Dano de fígado e rim em ratos CLP, conforme medido por níveis sanguíneos de creatinina e ALT, respectivamente.

Figura 24 CBS reduz obstrução microvascular e necrose do miocárdio num modelo de lesão por reperfusão e isquemia cardíaca.

Efeito de CBS (n=6/grupo) em IRI cardíaca, com zona isquêmica (IZ) no ventrículo esquerdo (LV), obstrução microvascular (MVO) e necrose do miocárdio (território de infarto) sendo medidos.

A Figura 25 demonstra que mCBS aprimora a viabilidade de retalho de tecido após reperfusão e isquemia.

Um retalho fasciocutâneo foi excisado do abdômen de ratos (n = 3 a 5/grupo), deixando o pedículo vascular intacto e o vaso de alimentação foi pinçado por 10 horas, então, liberado. mCBS (50 mg/kg) ou solução salina foi administrada i.p. 5 min antes da aplicação de pinça e 5 min após sua remoção.

Os ratos foram monitorados durante um período experimental total de 72 h, durante o qual os ratos receberam composto adicional ou solução salina i.p. em 24 e 48 h pós- operatório.

A viabilidade do retalho foi determinada em 72 h, através da extensão da necrose de retalho (áreas enegrecidas ou avermelhadas), com fotos representativas mostradas.

A Figura 26 mostra que o CBS previne trombose venosa profunda induzida por histona.

A veia cava inferior (VCI) em camundongos (n = 8/grupo) foi ligada a ~10% de permeabilidade após a qual todos os camundongos receberam uma injeção i.v. de histonas através da veia da cauda (10 mg/kg) ou um volume equivalente de solução salina, seguido 5 minutos depois de uma injeção i.v. de CBS (50 mg/kg) ou solução salina. Os camundongos foram monitorados durante 48 h, após o qual foram novamente anestesiados e quaisquer trombos que se desenvolveram distalmente à estenose de IVC foram removidos para análise. Dados média ± s.e.m. *P≤0,05. (ANOVA com teste de múltiplas comparações de Dunnett). A Figura 27 mostra atividade de mCBS num modelo de esclerose múltipla. Os camundongos C57Bl/6 foram imunizados com MOG35- 55/CFA/PT para induzir EAE. mCBS ou PBS sozinho (veículo) foi sado i.p. diariamente no dia 0 a 9. Os camundongos foram diariamente monitorados durante um período de 17 a 35 dias após a imunização acerca de sinais de doença. Escore clínico médio de tratado com mCBS (n=36) e tratado com veículo (n=33), EAE induzido apenas (n=14), controles não tratados (n=32). Dados são a partir de 6 experimentos agrupados independentes. São mostrados escores médios de doença +/- SEM. O significado estatístico foi determinado usando o método de Sidak-Bonferroni.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[047] A presente invenção é dirigida ao uso de compostos de celobiosídeo sulfatado modificado, que têm alta estabilidade química, no tratamento ou prevenção de enfermidades mediadas por histona extracelular (tais como, por exemplo, sepse, SIRS ou IRI) num sujeito. Tais compostos podem melhorar, inibir ou prevenir o efeito citotóxico de histonas extracelulares num sujeito.

[048] Por conveniência, as seguintes seções descrevem, de modo geral, os diversos significados de termos usados no presente documento. Após esta discussão, as modalidades exemplificadoras gerais que ilustram a invenção são divulgadas, seguido de exemplos específicos que fornecem ilustração mais específica de propriedades de diversas modalidades exemplificadoras da invenção.

GERAL

[049] Os versados na técnica irão observar que a invenção descrita no presente documento é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas sem se afastar do espírito e escopo da invenção, conforme descrito no presente documento. A invenção inclui todas tais variações e modificações. A invenção inclui também todas as etapas, recursos, composições e componentes mencionados ou indicados no relatório descritivo, individual ou coletivamente e toda e qualquer combinação ou quaisquer duas ou mais dentre as referidas etapas ou recursos. Os produtos funcionalmente equivalentes, composições de matéria e métodos estão claramente dentro do escopo da invenção, conforme descrito aqui.

[050] Todas as publicações, referências, documentos, patentes e pedidos de patente citados no presente documento, supra ou infra, estão aqui incorporados por referência em sua totalidade, o que significa que estas publicações, referências, documentos, patentes e pedidos de patentes devem ser lidos e considerados como parte deste texto. O fato de que qualquer publicação, referência, documento, patente e pedido de patente citados neste texto não é repetido neste texto é apenas por razões de concisão. Entretanto, publicações, referências, documentos, patentes e pedidos de patente mencionados no presente documento são citados para descrever e divulgar os protocolos, reagentes e produtos que são relatados nas publicações e que poderiam ser usados em conexão com a invenção. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antedatar tal divulgação em virtude da invenção antecedente ou por qualquer outra razão. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo destes documentos são baseadas nas informações disponíveis para os requerentes e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou do conteúdo destes documentos.

[051] Quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto e fichas de produto para qualquer produto mencionado no presente documento ou qualquer documento incorporado ao presente documento a título de referência, estão aqui incorporadas, a título de referência e podem ser empregadas na prática da invenção.

[052] As definições para os termos selecionados aqui usados podem ser encontradas no resumo da invenção e na descrição detalhada da invenção e aplicam ao longo do presente documento. Exceto onde definido em contrário, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado na técnica a qual a invenção pertence. Se houver uma discrepância evidente entre o uso de um termo na técnica e sua definição aqui fornecida, a definição fornecida no relatório descritivo deve prevalecer.

DEFINIÇÕES

[053] Além dos exemplos operacionais, ou onde indicado de outra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui usados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”. Por exemplo, o termo “cerca de” quando usado em conexão com porcentagens pode significar ± 10%.

[054] A menos que o contexto exija de outro modo, ou o relatório descritivo declare especificamente o contrário, números inteiros, etapas ou elementos da invenção citados aqui como números inteiros singulares, etapas ou elementos abrangem claramente tanto as formas singulares como plurais dos números inteiros, etapas ou elementos citados. Ao longo do presente relatório descritivo, a menos que seja especificado de outra forma ou o contexto exija em contrário, deve-se fazer referência a uma única etapa, composição ou matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria para abranger uma e uma pluralidade (isto é, um ou mais) ou aquelas etapas, composições ou matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria. Consequentemente, conforme usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um/uma”, “um/uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Desta forma, por exemplo, a referência a “um celobiosídeo sulfatado modificado com um substituto pequeno não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo” inclui uma pluralidade de tais compostos de celobiosídeo sulfatado modificado ou uma pluralidade de sais dos mesmos, e assim por diante.

[055] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações, a menos que o contexto exija em contrário, a palavra “compreender” ou variações tais como “compreende” ou “que compreende” será entendida como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento ou número inteiro especificado ou grupo de etapas ou elementos ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou número inteiro ou grupo de etapas ou elementos ou números inteiros.

[056] Conforme usado no presente documento, o termo “incluindo”, bem como variações como “inclui” e “incluído”, também serão entendidos como não limitantes.

[057] Neste pedido, o uso de “ou” significa “e / ou”, exceto onde especificado em contrário.

[058] A invenção descrita no presente documento pode incluir uma ou mais faixas de valores (por exemplo, tamanho, deslocamento e intensidade de campo etc.). Uma faixa de valores será entendida como incluindo todos os valores dentro da faixa, incluindo os valores que definem a faixa e valores adjacentes à faixa que levam ao mesmo ou substancialmente ao mesmo resultado que os valores imediatamente adjacentes àquele valor que define o limite para a faixa. Por exemplo, um versado no campo relevante entenderá que uma variação de 10% nos limites superior ou inferior de uma faixa pode ser totalmente adequada e é abrangida pela invenção. Mais particularmente, a variação nos limites superior ou inferior de uma faixa será de 5% ou como é comumente reconhecido na técnica, o que for maior.

[059] Conforme usado no presente documento, os termos “condição”, “enfermidade” ou “doença” (usados de forma intercambiável)

significam uma complicação associada à histona extracelular mediada pela liberação de histonas extracelulares.

[060] Conforme usado no presente documento, a frase “complicação associada à histona extracelular” significa, sem limitação particular, mediada por histona: (a) respostas inflamatórias sistêmicas à infecção tal como, por exemplo, sepse (incluindo sepse induzida por bactérias, vírus, fungos, parasita, prião) ou a indutores não infecciosos incluindo cirurgia, trauma, hemorragia, queimaduras, pancreatite aguda e lesão renal aguda. (b) hipoxia no nível de tecido localizado , por exemplo, após o bloqueio de uma artéria devido à aterosclerose, ruptura espontânea de um vaso, dano traumático a um vaso e incluindo IRI cardíaca e associada ao transplante; ou no nível de corpo inteiro após a interrupção da respiração, por exemplo, devido a afogamento, exposição a gases ou parada cardiorrespiratória e inclui doenças tais como, por exemplo, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar obstrutiva crônica e lesão tecidual mediada por fármaco; (c) hemostase ou obstrução vascular tal como, por exemplo, doença cardiovascular ou doença cardiovascular crônica, tal como aterosclerose, coagulação e trombose (por exemplo, trombose venosa profunda), (d) estados de doença autoimune e estados de doença de inflamação tais como, por exemplo: esclerose múltipla, estados de doença hiper-inflamatória, lúpus eritematoso sistêmico, espondiloartropatia, espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa, artrite enteropática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino irritável, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, vasculite associada (AAV) a anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo (ANCA), tal como granulomatose com poliangite, granulomatose eosinofílica com poliangite e poliangite microscópica, caracterizada por destruição e inflamação de pequenos vasos, febre familiar do Mediterrâneo, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Sjögren, artrite precoce, artrite viral, psoríase, fibrose de órgão relacionada à idade, fibrose pulmonar idiopática, diabetes juvenil (Tipo I), diabetes mellitus (Tipo 2), síndrome antifosfolipídeo e diversas doenças do sistema nervoso central tais como doença de Huntington.

[061] Conforme usado no presente documento, o termo “sepse” inclui em seu significado todos os estágios de uma doença ou condição de sepse, conforme caracterizado por textos de referência médica padrão e/ou conhecidos por um versado na técnica. Por exemplo, a sepse inclui sepse grave, sepse aguda e crônica e choque séptico. O termo “sepse”, conforme usado no presente documento, também inclui episódios associados à infecção. O termo “SIRS” (síndrome de resposta imunológica sistêmica) usado no presente documento inclui episódios não associados à infecção como, por exemplo, trauma, queimaduras, pancreatite, transplante de órgãos, cirurgia, lise tumoral após regimes terapêuticos para câncer, complicações perinatais e profilaxia imunossupressiva para enxertos alogênicos.

[062] Conforme usado no presente documento, os termos “condição médica associada a sepse ou SIRS” ou “doença associada a sepse ou SIRS” incluem em seu significado todos os sinais e sintomas direta ou indiretamente associados a, derivados de, causados por ou que acompanham todos ou qualquer um dos estágios das doenças ou condições de SIRS ou sepse, conforme caracterizado por textos médicos de referência padrão e/ou conhecidos por um versado na técnica. Por exemplo, as condições médicas ou doenças associadas a sepse ou SIRS incluem um ou mais dos seguintes sinais ou sintomas associados a, derivados de, causados por ou que acompanham todos ou qualquer um dos estágios de doenças ou condições de SIRS ou sepse num sujeito que podem se manifestar no sujeito com ou sem infecção: hipotensão arterial, acidose metabólica, resistência vascular sistêmica diminuída, frequência cardíaca aumentada (taquicardia), frequência respiratória aumentada (taquipneia), inflamação geral ou sistêmica, contagem elevada ou diminuída de glóbulos brancos (leucocitose ou leucopenia) , histonas extracelulares aumentados no sangue, disfunção orgânica tal como disfunção de órgão aguda, disfunção do sistema circulatório, síndrome da disfunção de múltiplos órgãos, coagulação intravascular disseminada (DIC), deposição de fibrina na microvasculatura de um ou mais órgãos, febre, confusão, pneumonia , tosse com pneumonia, infecção nos rins, micção dolorosa com uma infecção nos rins e/ou choque séptico.

[063] Conforme usado no presente documento, os termos “diminuição”, “reduzido”, “redução”, “diminuir” ou "inibir” são todos usados genericamente para significar uma diminuição numa quantidade estatisticamente significativa. Entretanto, para evitar dúvidas, “reduzido”, “redução”, “diminuir” ou “inibição” significa uma diminuição de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, na ausência de um agente, por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80%.

[064] Conforme usado no presente documento, os termos “aprimorar”, “aumentado”, “aumentar”, “intensificar” ou “ativar” são todos usados para significar genericamente um aumento numa quantidade estatisticamente significativa; para evitar qualquer dúvida, os termos “aprimorar”, “aumentado”, “aumentar”, “intensificar” ou “ativar” significam um aumento de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, na ausência de um agente, por exemplo, um aumento de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80%, ou um aumento de pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou qualquer aumento entre 2 e 10 vezes ou mais em comparação com um nível de referência.

[065] Conforme usado no presente documento, os termos “administrar”, “administrado” e “administração” se referem à colocação de uma composição num sujeito por meio de um método ou via que resulta em localização pelo menos parcial da composição num sítio desejado, de modo que o efeito desejado seja produzido. Um composto ou composição aqui descrito pode ser administrado por qualquer via adequada conhecida na técnica, incluindo, porém sem limitação, vias orais ou parenterais, incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, vias aéreas (aerossol), pulmonar, nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, o composto é um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Quando o composto acima estiver presente numa composição tal como uma composição terapêutica, o mesmo será preparado para administração parenteral ou outro método que permita a entrega num sítio alvo. Alguns modos de administração exemplificadores incluem, porém sem limitação, injeção, infusão, instilação, inalação ou ingestão.

[066] Conforme usado no presente documento, o termo “injeção” inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinhal, intra-cérebro-espinhal e intraesternal. Nas modalidades preferenciais, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa.

[067] Conforme usado no presente documento, os termos “tratar”, “tratamento”, “tratando” e similares, no contexto da presente invenção, na medida em que se refere a qualquer uma das condições ou doenças aqui citadas, significa atenuar, aliviar, melhorar, inibir, desacelerar, reverter ou interromper a progressão, agravamento, deterioração, progressão, progressão antecipada ou gravidade de pelo menos um sintoma ou complicação associada a tal condição ou doença. Numa modalidade, os sintomas de uma condição ou doença são aliviados em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%.

[068] Conforme usado no presente documento, as frases “quantidade eficaz”, “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “dose eficaz” (usada de forma intercambiável no presente documento) incluem em seu significado uma quantidade suficiente, mas não tóxica, de um composto ou composição da invenção para fornecer um efeito desejado. A quantidade exata de um composto ou composição necessária irá variar de sujeito para sujeito, dependendo de fatores como o efeito desejado, da espécie que é tratada, da idade e da condição geral do sujeito, da gravidade da condição que é tratada e do agente que é administrado, do modo de administração e assim por diante. Desta forma, não é possível especificar uma “quantidade eficaz” exata. Entretanto, para qualquer determinado caso, uma quantidade (dose) eficaz adequada pode ser determinada por um versado na técnica usando apenas experimentação de rotina. De modo geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com o histórico, idade, condição, sexo do sujeito, bem como a gravidade e o tipo da condição médica no sujeito e a administração de outros agentes farmaceuticamente ativos.

[069] Conforme usado no presente documento, a referência ao uso de um composto ou composição em aplicações terapêuticas ou farmacêuticas será entendida como sendo igualmente aplicável a aplicações humanas e não humanas, tais como veterinárias. Por conseguinte, deve ser entendido que, exceto onde indicado de outro modo, a referência a um “paciente”, “sujeito” ou “indivíduo” (usado de forma intercambiável no presente documento) significa um ser humano ou não humano, tal como um indivíduo de qualquer espécie de importância social, econômica ou de pesquisa incluindo, porém sem limitação, espécies de mamíferos, aves, lagomorfos, ovinos, bovinos, equinos, suínos, felinos, caninos, primatas e roedores. Mais preferencialmente, o paciente, sujeito ou indivíduo é um animal que pertence a uma espécie de mamífero. A espécie de mamífero é desejavelmente um ser humano ou primata não humano ou um animal de estimação como um cão, gato, cavalo, macaco, camundongo, rato, coelho, ovelha, cabra, vaca ou porco domesticado. Num exemplo particularmente preferencial, o paciente, sujeito ou indivíduo é um ser humano.

[070] As definições para os termos selecionados usados no presente documento podem ser encontradas dentro da descrição detalhada da invenção e se aplicam a todo o documento. Exceto onde definido em contrário, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado na técnica a qual a invenção pertence.

MODALIDADES ILUSTRATIVAS DA INVENÇÃO

[071] A seguinte descrição detalhada desta invenção está incluída apenas para os propósitos de ilustrar a invenção e não deve ser entendida de forma alguma como uma restrição na ampla descrição da invenção, conforme apresentado acima.

1. COMPOSTOS DA INVENÇÃO

[072] Num primeiro aspecto da invenção, é fornecido um composto para uso no tratamento de uma complicação mediada por histona extracelular, em que o composto compreende: um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado na sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em que o substituinte torna a molécula com alta estabilidade química, em relação ao poliânion, mas que é sulfatado em sua terminação de redução. De preferência, esta classe de composto deve ter uma carga líquida negativa alta.

[073] Os compostos da invenção podem melhorar complicações mediadas por histona extracelular (tais como sepse ou lesões por reperfusão e isquemia) tanto preventivamente, isto é, como um pré-tratamento profilático a um procedimento médico como terapeuticamente durante o tratamento depois que as condições ou a doença ocorreu.

[074] Numa modalidade da invenção, o celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado tem a estrutura geral: em que: R1 é um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado, por exemplo, O ou S-(C1-6)alquila; e R2 a R8 são, cada um, selecionados de: (i) um substituinte pequeno ligado a O não carregado ou (ii) um grupo sulfato.

[075] De preferência, R1 é O ou S-(C1-6)alquila. De preferência, R1 aprimora a estabilidade química do poliânion, em comparação com o mesmo poliânion com um grupo sulfato em R1.

[076] De preferência, R2 a R8 são, cada um, selecionados de: (a) um grupo hidroxila não modificado; ou (b) um grupo sulfato.

[077] Mais preferencialmente, R1 é um grupo metóxi ou etóxi e R2 a R8 são, cada um, um grupo sulfato selecionado de: O-sulfato ou N- sulfato.

[078] Desejavelmente, a classe de composto tem uma carga líquida negativa alta, isto é, é um poliânion.

[079] A configuração anomérica do substituinte pequeno de glicosídeo não carregado (R1) pode ser da posição  ou . De preferência, o substituinte pequeno não carregado está na configuração .

[080] Numa forma altamente preferencial da invenção, o composto é sulfato de β-O-Metil celobiosídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que é um dissacarídeo de -O-metil celobiosídeo sulfatado. A título de ilustração, o composto é o sal de sódio de sulfato de β-O- Metil celobiosídeo.

[081] mCBS é altamente estável em relação a CBS e bem tolerado em doses altas. Tem efeitos anticoagulantes mínimos e capacidade para reduzir a perturbação de coagulação de plasma induzido por histona. A atividade anticoagulante de mCBS é 110 vezes menor que a heparina de baixo peso molecular e 750 vezes menos que a heparina não fracionada.

[082] O substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução.

[083] A estabilidade química, conforme usado no presente documento, representa a tendência do composto da invenção em resistir à alteração (em particular, decomposição em seu ambiente natural ou quando exposto ao ar, calor, luz, pressão ou outras condições naturais, ou devido à reação interna.

[084] Um composto da invenção é “estável” se não decompor significativamente, em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução, após pelo menos um mês de armazenamento sob condições de uso antecipado ou condições ambientais normais.

[085] Um composto da invenção terá decomposto significativamente se tiver perdido 3 ou mais grupos sulfato após pelo menos um mês de armazenamento, sob condições de uso antecipado ou condições ambientais normais. De preferência, um composto da invenção terá decomposto significativamente se tiver perdido 2 grupos sulfato após pelo menos um mês de armazenamento, sob condições de uso antecipado ou condições ambientais normais. Mais preferencialmente, um composto da invenção terá decomposto significativamente se tiver perdido 1 grupo sulfato após pelo menos um mês de armazenamento, sob condições de uso antecipado ou condições ambientais normais.

[086] De preferência, o composto da invenção é quimicamente estável durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 meses quando armazenado numa formulação de fosfato tamponada até o pH 7,5 e armazenado a 2 a 8°C. Mais preferencialmente, a estabilidade é medida durante um período de 6 meses a 2 anos com o composto sendo armazenado numa formulação de fosfato tamponada até o pH 7,5 e armazenado a 2 a 8°C.

[087] Conforme usado no presente documento, a frase “sal farmaceuticamente aceitável (ou sais farmaceuticamente aceitáveis)” inclui aqueles sais que, dentro do escopo de julgamento médico, são adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais inferiores sem a toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida e similares, e estão de acordo com uma razão entre benefício e risco razoável.

[088] Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Os mesmos incluem, por exemplo, sais de adição ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) derivados de ácidos inorgânicos (por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou de ácidos orgânicos (por exemplo, cítrico, acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares). Os sais formados com os grupos carboxila livres da proteína também podem ser derivados de bases inorgânicas (por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos) ou de bases orgânicas (por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares).

[089] Numa forma preferencial da invenção, o celobiosídeo sulfatado modificado da invenção está presente como um sal farmaceuticamente aceitável. A título de ilustração, o composto é o sal de sódio de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo, a saber, sulfato de β-O-Metil celobiosídeo de sódio (mCBS.Na).

[090] Os compostos de celobiosídeo sulfatado modificado ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos usados nos métodos ou composições da presente invenção podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os métodos para preparar compostos sulfatados modificados com um substituinte não carregado em suas terminações de redução são descritos de maneira geral em Katrin C Probst e Hans Peter Wessel, 2001, J. Carbohydrate Chemistry, 20 (7 & 8): 549-560, que está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.

2. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[091] À medida que os compostos da invenção e as composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos podem melhorar ou prevenir a atividade patológica de proteínas de histona extracelular, a presente invenção fornece como um segundo aspecto da invenção, um método de tratamento ou prevenção para complicações associadas à histona extracelular, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[092] Adicionalmente, num terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar o acúmulo de histona extracelular num sujeito, sendo que o referido método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[093] A presente invenção, conforme descrito pelo segundo e pelo terceiro aspectos da invenção, contempla ou tratamento ou prevenção de uma variedade de enfermidades de histona extracelular diferentes que são causadas pela liberação de histonas e pela toxicidade extracelular resultante das mesmas. De acordo com estes aspectos da invenção, os respectivos métodos podem ser usados para o tratamento ou prevenção de complicações associadas à histona extracelular num sujeito que tem: (a) respostas inflamatórias sistêmicas à infecção tal como, por exemplo, sepse (incluindo sepse induzida por bactérias, vírus, fungos, parasita, prião) ou a indutores não infecciosos incluindo cirurgia, trauma, hemorragia, queimaduras, pancreatite aguda e lesão renal aguda. (b) hipoxia no nível de tecido localizado , por exemplo, após o bloqueio de uma artéria devido à aterosclerose, ruptura espontânea de um vaso, dano traumático a um vaso e incluindo IRI cardíaca e associada ao transplante; ou no nível de corpo inteiro após a interrupção da respiração, por exemplo, devido a afogamento, exposição a gases ou parada cardiorrespiratória e inclui doenças tais como, por exemplo, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar obstrutiva crônica e lesão tecidual mediada por fármaco; (c) hemostase ou obstrução vascular tal como, por exemplo, doença cardiovascular ou doença cardiovascular crônica, tal como aterosclerose, coagulação e trombose (por exemplo, trombose venosa profunda), (d) estados de doença autoimune e estados de doença de inflamação tais como, por exemplo: esclerose múltipla, estados de doença hiper-inflamatória, lúpus eritematoso sistêmico, espondiloartropatia, espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa, artrite enteropática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino irritável, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, vasculite associada (AAV) a anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo (ANCA), tal como granulomatose com poliangite, granulomatose eosinofílica com poliangite e poliangite microscópica, caracterizada por destruição e inflamação de pequenos vasos, febre familiar do Mediterrâneo, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Sjögren, artrite precoce, artrite viral, psoríase, fibrose de órgão relacionada à idade, fibrose pulmonar idiopática, diabetes juvenil (Tipo I), diabetes mellitus (Tipo 2), síndrome antifosfolipídeo e diversas doenças do sistema nervoso central tais como doença de Huntington.

[094] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspectos da invenção, os respectivos métodos podem compreender ainda administrar ao sujeito, ao mesmo tempo ou concomitantemente com o composto da invenção, um segundo agente terapêutico (tal como agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos ou outras formas de intervenção médica) que é distinto do composto da invenção que fornece um tratamento auxiliar para uma condição médica que o sujeito se encontra ou pode sofrer.

[095] De preferência, como um exemplo destes aspectos da invenção, os respectivos métodos fornecem um meio para tratar ou prevenir sepse ou SIRS ou uma condição médica ou doença associada a sepse ou SIRS num sujeito. Como outro exemplo destes aspectos da invenção, os respectivos métodos fornecem um meio para tratar ou prevenir IRI ou uma condição médica ou doença associada a IRI num sujeito.

[096] De preferência, o método melhora a condição ou um estado doentio suficientemente para permitir que um médico administre outros fármacos para tratar condições secundárias. Desta forma, a invenção inclui também administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um sujeito, para os propósitos de melhorar complicações associadas à histona extracelular no paciente.

[097] Em certas modalidades exemplificadoras de acordo com o segundo ou o terceiro aspectos da invenção, os métodos identificados podem compreender ainda a etapa de: administrar ao sujeito, juntamente com ou concomitantemente com o celobiosídeo sulfatado modificado, uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de uma segunda composição, composto ou agente ativo selecionado de: um ou mais dentre agentes anti- inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composição farmacêutica que trata uma ou mais condições que um sujeito é afetado com ou está em risco de ser afetado.

[098] De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece um tratamento auxiliar para o tratamento dirigido à complicação associada à histona extracelular (tal como, por exemplo, sepse, SIRS ou IRI) e/ou para condições médicas ou doenças associadas a tais complicações. De preferência, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[099] De preferência, o segundo agente ativo apresenta um meio para intervenção médica de uma doença que um paciente é afetado que está relacionada a ou é distinta da enfermidade médica tratada pelos compostos desta invenção, sendo que o referido segundo agente ativo fornece um tratamento auxiliar para o paciente.

[0100] As composições terapêuticas e/ou farmacêuticas da invenção divulgadas no presente documento podem ser administradas de maneira terapêutica ou preventiva. Numa aplicação terapêutica, os compostos e as composições são administrados a um paciente que já sofre de complicações associadas à histona extracelular ou uma enfermidade associada a complicações associadas à histona extracelular, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente impedir seus sintomas. O composto ou a composição deve ser fornecida numa quantidade do composto ativo suficiente para tratar de modo eficaz o paciente numa dose única ou como parte de um regime de tratamento, por exemplo um regime de tratamento de dose múltipla. Numa aplicação preventiva, os compostos e as composições da invenção são administrados a um sujeito em risco de desenvolver uma enfermidade associada a complicações associadas à histona extracelular, numa quantidade suficiente para pelo menos parcialmente impedir as complicações e/ou sintomas da enfermidade.

[0101] Num quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar ou prevenir uma condição médica, enfermidade ou doença associada à patologia mediada por histona extracelular num sujeito, em que o método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0102] De preferência, o celobiosídeo sulfatado é sulfato de β-O- Metil celobiosídeo (mCBS) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0103] Num exemplo preferencial, o método é usado para tratar histonas extracelulares que (i) são citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito, (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito, (iii) iniciam a coagulação mediante a ativação de plaquetas num sujeito ou (iv) induzem a fragilidade de hemácia e anemia resultante num sujeito.

[0104] Numa forma exemplificadora altamente preferencial da invenção, de acordo com qualquer aspecto, modalidade ou exemplo descrito no presente documento, o composto da invenção é usado para tratar ou prevenir uma ou mais dentre as seguintes enfermidades ou condições discutidas. A. SEPSE

[0105] A sepse (incluindo choque séptico) é uma reação sistêmica à infecção caracterizada por hipotensão arterial, acidose metabólica, resistência vascular sistêmica diminuída, taquipneia e disfunção orgânica. A sepse (incluindo choque séptico) também é uma resposta inflamatória sistêmica à infecção associada e mediada pela ativação de vários mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo a rede de citocinas, leucócitos e os sistemas de fibrinólise de complemento e coagulação. A coagulação intravascular disseminada (DIC) com deposição generalizada de fibrina na microvasculatura de vários órgãos pode ser uma manifestação precoce de sepse. A DIC é um mediador importante no desenvolvimento da síndrome de falência múltipla de órgãos e contribui para o prognóstico insatisfatório de pacientes com choque séptico.

[0106] A resposta imunológica que causa sepse é uma resposta inflamatória sistêmica que causa ativação generalizada de vias de inflamação e coagulação. Isto pode progredir para disfunção do sistema circulatório e, mesmo sob tratamento ideal, pode resultar na síndrome de disfunção de múltiplos órgãos e, eventualmente, morte.

[0107] Os sintomas de sepse estão muitas vezes relacionados a um processo infeccioso subjacente e, se não forem tratados, podem se manifestar como sepse grave (sepse com disfunção aguda de órgão) ou choque séptico (sepse com hipotensão arterial refratária). Quando dois ou mais critérios de síndrome da resposta inflamatória sistêmica (por exemplo, inflamação geral, febre, contagem elevada de glóbulos brancos (leucocitose) e frequência cardíaca elevada (taquicardia) e frequência respiratória elevada (taquipneia)) são atendidos sem evidência de infecção, os pacientes podem ser diagnosticados simplesmente com “SIRS”, que é um estado inflamatório séptico que afeta todo o corpo.

[0108] Muitos pacientes com sepse exibem um declínio rápido durante um período de 24 a 48 horas. O tratamento rápido é essencial para o tratamento eficaz da sepse. Infelizmente, o diagnóstico do tipo de infecção exige análise microbiológica para identificar o patógeno que pode levar vários dias. Portanto, a terapia para eliminar um patógeno (por exemplo, terapia com antibióticos) precisa ser iniciada sem o conhecimento do tipo e espécie do patógeno e sem meios de conhecer a extensão da infecção. A presente invenção fornece tal método.

[0109] Os pacientes que sofrem de sepse têm níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de sepse.

[0110] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) sepse associada à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0111] Conforme demonstrado no presente documento, os compostos da invenção, em particular, mCBS, bloqueiam os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento para a sepse.

[0112] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em sepse, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da sepse. B. SIRS NÃO INFECCIOSA

[0113] A síndrome da resposta inflamatória sistêmica não infecciosa (SIRS) é um estado inflamatório que afeta todo o corpo. É a resposta do corpo ao insulto não infeccioso. Embora a definição de SIRS se refira a mesma como uma resposta “inflamatória”, realmente tem componentes pró e anti-inflamatórios.

[0114] SIRS é uma condição séria relacionada à inflamação sistêmica, disfunção de órgãos e falência de órgãos. É um subconjunto de tempestade de citocinas, na qual existe uma regulação anormal de várias citocinas. A SIRS também está intimamente relacionada à sepse, na qual os pacientes satisfazem os critérios para SIRS e têm uma infecção suspeita ou comprovada. As causas de SIRS não infecciosa incluem, por exemplo: trauma, de cirurgia, hemorragia traumática, queimaduras e pancreatite aguda, a título de ilustração.

[0115] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) SIRS não infecciosa associada à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0116] Conforme demonstrado no presente documento, os compostos da invenção, em particular, mCBS, bloqueiam os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento para SIRS não infecciosa.

[0117] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em SIRS não infecciosa, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de SIRS não infecciosa. B.1 TRAUMA

[0118] O trauma físico é uma lesão física grave e que altera o corpo, tal como o esmagamento ou a amputação de um membro.

[0119] O trauma por ação contundente, um tipo de trauma físico causado por impacto ou outra força aplicada de ou com um objeto contuso, enquanto o trauma penetrante é um tipo de trauma físico no qual a pele ou os tecidos são perfurados por um objeto. O trauma também pode ser descrito como não planejado, tal como um acidente, ou planejado, no caso de cirurgia. Ambos podem ser caracterizados por danos leves a graves no tecido, perda de sangue e/ou choque, e ambos podem levar a SIRS, mas também aumentam significativamente o risco de infecção e sepse subsequentes.

[0120] As histonas são liberadas após o trauma ou estresse celular grave na ausência de infecção. Por exemplo, os níveis séricos de histona são significativamente elevados após traumatismo contuso não torácico grave. Os níveis séricos elevados de histona se correlacionam positivamente com complicações graves, incidência e prognóstico sombrio. In vitro, as histonas exógenas levam à produção e secreção de uma variedade de citocinas (por exemplo, TNF-α, IL-6 e IL-10), estimulam a liberação de mieloperoxidase e aumentam o influxo de cálcio nas células imunológicas e endoteliais, que medeiam parcialmente a citotoxicidade induzida por histona. In vivo, a administração de histona também acelera a liberação de citocina, dano endotelial, ativação de coagulação e lesão pulmonar em modelos de trauma de animal.

[0121] Os pacientes que sofrem de trauma podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de trauma.

[0122] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) trauma associado à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0123] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de trauma.

[0124] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em trauma, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da lesão por trauma. B.2. CIRURGIA

[0125] A cirurgia usa técnicas operatórias instrumentais e manuais num paciente para investigar e/ou tratar uma condição patológica, tal como doença ou lesão, para ajudar a aprimorar a função ou aparência corporal, ou às vezes por alguma outra razão. A presente invenção pode tratar de trauma resultante de cirurgias, conforme definido mais abaixo.

[0126] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) trauma cirúrgico associado à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0127] Como uma regra, um procedimento é considerado cirúrgico quando envolve o corte de tecidos de um paciente ou o fechamento de um ferimento previamente sustentado. Outros procedimentos que não necessariamente se enquadram nesta rubrica, tais como angioplastia ou endoscopia, podem ser considerados cirurgia se envolverem configurações ou procedimentos cirúrgicos comuns, tais como o uso de um ambiente estéril, anestesia, condições antissépticas, instrumentos cirúrgicos típicos e sutura ou grampeamento. Todas as formas de cirurgia são consideradas procedimentos invasivos; a chamada cirurgia não invasiva normalmente se refere a uma excisão que não penetra na estrutura a ser tratada (por exemplo, ablação a laser da córnea) ou a um procedimento radio-cirúrgico (por exemplo, irradiação de um tumor)

[0128] À medida que os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, podem melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular, a presente invenção fornece um tratamento para uso em trauma cirúrgico, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da lesão cirúrgica. B.3. HEMORRAGIA TRAUMÁTICA

[0129] A hemorragia traumática é responsável por grande parte do amplo impacto internacional de lesões, causando uma grande proporção de mortes e criando grande morbidade nos lesionados. Apesar das diferenças em cuidados pré-hospitalares, o gerenciamento agudo da hemorragia traumática é similar em todo o mundo e segue diretrizes publicadas bem aceitas. O cuidado de um paciente gravemente lesionado ocorre em quatro segmentos, muitas vezes sobrepostos: as fases de ressuscitação, operatória e cuidado crítico. O diagnóstico e o controle do sangramento devem ser de alta prioridade durante todas as fases de cuidado de trauma e são especialmente importantes no paciente que está em choque hemorrágico. As tentativas precoces de controle de hemorragia incluem o controle direto de fontes visíveis de sangramento grave com pressão direta, curativos sob pressão ou torniquetes; estabilização de fraturas ósseas e pélvicas longas; e manter o paciente aquecido. Durante a fase de ressuscitação, são fornecidos fluidos intravenosos aquecidos, ressuscitação hipotensiva antes do controle cirúrgico da hemorragia e transfusão adequada de sangue e produtos sanguíneos. Na fase operatória, é fornecido controle cirúrgico da hemorragia e de qualquer outra lesão e transfusão adicional. Finalmente, a fase de cuidado crítico fornece suporte pós- operatório e perfusão de tecido.

[0130] À medida que os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, podem melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular, a presente invenção fornece tratamento para uso em hemorragia traumática, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da hemorragia traumática. B.4. QUEIMADURAS

[0131] Uma queimadura pode ser uma lesão causada por calor, frio, eletricidade, produtos químicos, atrito ou radiação. As queimaduras de primeiro grau são normalmente limitadas a vermelhidão (eritema), uma placa branca e dor mínima no local da lesão. Estas queimaduras normalmente se estendem apenas para a epiderme. As queimaduras de segundo grau adicionalmente se enchem de líquido claro, têm bolhas superficiais da pele e podem envolver mais ou menos dor, dependendo do nível de envolvimento dos nervos. As queimaduras de segundo grau envolvem a derme superficial (papilar) e também podem envolver a camada profunda (reticular) da derme. As queimaduras de terceiro grau têm adicionalmente carbonização da pele e produzem escaras duras semelhantes a couro. Uma escara é uma crosta que se separou da parte não afetada do corpo. Frequentemente, também existe líquido púrpura. Estes tipos de queimaduras são muitas vezes indolores, devido ao fato de que as terminações nervosas foram destruídas nas áreas queimadas. As queimaduras graves, especialmente se cobrem grandes áreas do corpo, podem causar a morte; qualquer indício de lesão por queimadura nos pulmões (por exemplo, através da inalação de fumaça) é uma emergência médica.

[0132] As queimaduras que lesionam os tecidos subjacentes à pele, tais como músculos ou ossos, são às vezes categorizadas como queimaduras de quarto grau. Estas queimaduras são divididas em três graus adicionais: queimaduras de quarto grau resultam na perda irrecuperável de pele, queimaduras de quinto grau resultam na perda irrecuperável de músculo e queimaduras de sexto grau resultam em carbonização de osso.

[0133] Várias queimaduras levam a um aumento nos níveis de histonas extracelulares que, por sua vez, estão associadas à toxicidade. Na medida em que a toxicidade é causada pelo menos em parte pelas ações extracelulares de histonas, a presente invenção procura reduzir esta toxicidade usando as composições farmacêuticas da presente invenção, reduzindo ou aliviando assim o desconforto por parte do paciente, bem como permitindo doses mais altas da terapia.

[0134] Os pacientes que sofrem de queimaduras podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de queimaduras.

[0135] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar citotoxicidade induzida por histona causada por queimaduras a um sujeito, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0136] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de queimaduras.

[0137] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular numa queimadura num sujeito. B.5. PANCREATITE AGUDA

[0138] A pancreatite aguda é caracterizada como inflamação do pâncreas de início rápido por inflamação estéril e morte de célula acinar, incluindo necrose e apoptose. Neste aspecto, a liberação de HMGB1 mediada por histona extracelular em células imunes ativadas é responsável pela pancreatite aguda induzida por l-arginina em camundongos knockout condicionais pancreáticos HMGB1. A perda de HMGB1 no pâncreas aumenta a liberação de histona na circulação após lesão nuclear extensa e morte celular. As histonas em circulação recrutam macrófagos, resultando na ativação de macrófagos e liberação adicional de HMGB1.

[0139] Dependendo da sua gravidade, a pancreatite aguda pode ter complicações graves e alta mortalidade, apesar do tratamento. Embora casos leves sejam muitas vezes tratados com sucesso com medidas conservadoras ou laparoscopia, os casos graves exigem cirurgia invasiva (muitas vezes mais de uma intervenção) para conter o processo da doença.

[0140] Os pacientes que sofrem de pancreatite aguda podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de pancreatite aguda.

[0141] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) pancreatite aguda associada à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0142] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de pancreatite aguda.

[0143] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em pancreatite aguda, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da pancreatite aguda. C. LESÃO POR REPERFUSÃO E ISQUEMIA

[0144] As lesões por reperfusão e isquemia (incluindo lesões por reperfusão e isquemia associadas ao transplante) e lesão de tecido mediada por fármaco resultam em inflamação estéril, um processo que ocorre na ausência de micro-organismos.

[0145] A isquemia é uma restrição no suprimento de sangue para tecidos, causando uma escassez de oxigênio que é necessário para o metabolismo celular. Na isquemia prolongada (60 min ou mais), a hipoxantina é formada como um produto de decomposição do metabolismo de ATP. A enzima xantina desidrogenase é convertida em xantina oxidase como resultado da maior disponibilidade de oxigênio. Esta oxidação resulta na conversão de oxigênio molecular em radicais superóxido e hidroxila altamente reativos. A xantina oxidase também produz ácido úrico, que pode agir tanto como um pró- oxidante quanto como um sequestrante de espécies reativas, tais como o peroxinitrito. O óxido nítrico excessivo produzido durante a reperfusão reage com o superóxido para produzir o peroxinitrito de espécie reativa potente. Tais radicais e espécies reativas de oxigênio atacam lipídios, proteínas e glicosaminoglicanos de membrana celular, causando danos adicionais.

Também podem iniciar processos biológicos específicos por meio da sinalização redox.

[0146] A lesão por reperfusão se refere a danos devidos, em parte, à resposta inflamatória de tecidos danificados. Os glóbulos brancos transportados para a área pelo sangue recém-retornado liberam diversos fatores inflamatórios, tais como interleucinas, bem como radicais livres, em resposta a danos de tecido. O fluxo sanguíneo restaurado reintroduz oxigênio nas células que danifica proteínas celulares, DNA e a membrana plasmática. Os danos à membrana da célula podem, por sua vez, causar a liberação de mais radicais livres. Tais espécies reativas agem indiretamente na sinalização redox para ativar a apoptose. Os leucócitos também se acumulam em pequenos capilares, obstruindo-os e levando a mais isquemia.

[0147] A lesão por reperfusão também desempenha um papel na cascata isquêmica do cérebro, que está envolvida em acidente vascular cerebral e trauma cerebral. Acredita-se que ataques repetidos de lesão por reperfusão e isquemia sejam um fator que leva à formação e falha na cicatrização de feridas crônicas, tais como úlceras de pressão e úlceras nos pés diabéticos. A pressão contínua limita o suprimento sanguíneo e causa isquemia, e a inflamação ocorre durante a reperfusão. À medida que este processo é repetido, eventualmente danifica o tecido o suficiente para causar um ferimento.

[0148] Os níveis séricos de histona são significativamente elevados nos modelos de reperfusão e isquemia em animais com lesão hepática, renal, pulmonar e cerebral, sugerindo um papel importante de histonas na regulação da inflamação estéril. De fato, as histonas circulantes são os principais mediadores de morte animal em vários modelos de lesão hepática, incluindo lesão hepática disparada por concanavalina A, hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno, I/R de fígado e insuficiência hepática aguda.

[0149] Uma vez liberadas, as histonas se ligam seletivamente aos receptores do tipo Toll (TLRs), incluindo TLR2, TLR4 e TLR927 para produzir citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α e IL-6), que por sua vez aceleram respostas inflamatórias e lesão tecidual.

[0150] As histonas extracelulares medeiam não apenas o fígado, mas também a lesão renal aguda ou acidente vascular cerebral isquêmico através de toxicidade direta ou efeitos pró-inflamatórios. De modo similar, as vias de sinalização mediadas por TLR2 e TLR4 (por exemplo, MyD88, NF-κB e proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK)) são responsáveis pela lesão renal aguda mediada por histona extracelular.

[0151] A infusão de histona aumenta o tamanho do infarto cerebral e exacerba o resultado do acidente vascular cerebral. Os níveis séricos de H3 e H4 são aumentados notavelmente no líquido de lavagem broncoalveolar de modelos animais ou pacientes com lesão pulmonar aguda (ALI).

[0152] Coletivamente, as histonas extracelulares funcionam como DAMPs e medeiam a inflamação estéril e os danos em órgão. A inibição da liberação e atividade de histona apresenta uma estratégia terapêutica para lesão de tecido.

[0153] Os pacientes que sofrem de lesões de reperfusão e isquemia (incluindo lesões de reperfusão e isquemia associadas a transplante) e lesão de tecido mediada por fármaco aumentaram os níveis de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas foram implicadas como mediadores importantes de patologia de lesão de tecido mediada por fármaco e isquemia/reperfusão.

[0154] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) lesão de tecido mediada por fármaco e/ou IRI associada à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0155] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de lesão de tecido mediada por fármaco e isquemia/reperfusão.

[0156] Desta forma, os compostos da invenção e composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em lesão de tecido mediada por fármaco e isquemia/reperfusão, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de lesão de tecido mediada por fármaco e isquemia/reperfusão. D. COAGULAÇÃO E TROMBOSE

[0157] A coagulação é o processo biológico pelo qual o sangue forma coágulos. Um mecanismo de regulação preciso previne a coagulação anormal que resulta num risco aumentado de sangramento (hemorragia) ou coagulação obstrutiva (trombose). A administração de histona em camundongos, por exemplo, aumenta a trombose microvascular com perda de barreira vascular, o que contribui para a falência e disfunção múltipla de órgãos.

[0158] As histonas incluindo H1, H2A, H2B, H3 e H4 induzem a agregação de plaquetas e formação de trombina dependente de plaquetas subsequente in vivo e in vitro. Dentre as mesmas, a H4 tem o impacto maior na atividade de plaquetas. As histonas também induzem um fenótipo pró- coagulante em plaquetas humanas, o que intensifica a geração de trombina e acelera o processo de coagulação de sangue. TLR2 e TLR4 são responsáveis pela ativação de plaqueta mediada por histona através da ativação de vias de sinalização (por exemplo, ERK, Akt, p38 e NF-κB), indução de influxo de cálcio e recrutamento de fibrinogênio.

[0159] Os complexos histona-DNA aumentam a geração de trombina, enquanto a administração de APC abole este processo. A heparina e a albumina neutralizam a toxicidade de histona, bem como a ativação de plaqueta relacionada à histona in vitro e in vivo. Além disto, a infusão de histona aumenta os níveis plasmáticos de fator de von Willebrand em camundongos, o que contribui para a ativação de plaquetas e o desenvolvimento subsequente de trombose venosa profunda. Além das plaquetas, as histonas comprometem o sistema de proteína C-trombomodulina. A dose de histonas exógenas aumenta de maneira dependente a geração de trombina plasmática na presença de trombomodulina. De forma interessante, a trombomodulina recombinante (rTM), que foi aprovada para o tratamento de pacientes com coagulação intravascular disseminada no Japão, se liga diretamente à histona e protege os camundongos contra trombose letal em camundongos. Os efeitos protetores do rTM contra a toxicidade de histona são mediados tanto através de meios dependentes como independentes de APC.

[0160] Os pacientes que sofrem de coagulação e/ou trombose causada por histonas extracelulares têm níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes de patologia de coagulação e/ou trombose.

[0161] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar coagulação e trombose num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0162] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de coagulação e/ou trombose.

[0163] Desta forma, os compostos da invenção e composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em coagulação e/ou trombose causada por proteínas de histona extracelular, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de coagulação ou trombose. E. DOENÇA AUTOIMUNE/INFLAMATÓRIA

[0164] A presente invenção contempla o tratamento de uma variedade de estados doentios autoimunes e/ou inflamatórios, tais como esclerose múltipla, espondiloartropatia, espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa, artrite enteropática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino irritável, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, febre familiar do Mediterrâneo, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Sjögren, artrite precoce, artrite viral ou psoríase. O diagnóstico e tratamento destas doenças estão bem documentados na literatura.

[0165] A histona tem sido implicada em várias doenças autoimunes e autoinflamatórias, como artrite reumatoide, lúpus sistêmico, vasculite de pequenos vasos e doenças relacionadas à transfusão de sangue.

Além de agir como autoantígenos diretos em distúrbios autoimunes, as histonas extracelulares podem impedir a degradação de DNA através da formação do complexo histona-DNA, que intensifica a resposta autoimune. Além disto, as arginina desaminases de proteína (por exemplo, PDA4) medeiam a desiminação e a citrulinação de histonas, que, por sua vez, aumentam a imunogenicidade de histonas.

[0166] Os pacientes que sofrem de doença autoimune e/ou inflamatória têm níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de doença autoimune e/ou inflamatória.

[0167] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar doença autoimune e/ou inflamatória num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0168] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de doença autoimune e/ou inflamatória.

[0169] Desta forma, os compostos da invenção e composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em doença autoimune e/ou inflamatória, incluindo tanto o pré- tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da doença autoimune e/ou inflamatória. F. SÍNDROME DO DESCONFORTO RESPIRATÓRIO AGUDO

[0170] A síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), também conhecida como síndrome do desconforto respiratório (RDS) ou síndrome do desconforto respiratório em adultos (em contraste com o IRDS) é uma reação séria a várias formas de lesões nos pulmões. Este é o distúrbio mais importante que resulta em edema pulmonar de permeabilidade aumentada.

[0171] A ARDS é causada por uma variedade de insultos diretos e indiretos. É caracterizada pela inflamação do parênquima pulmonar, levando à troca gasosa prejudicada, com liberação sistêmica concomitante de mediadores inflamatórios, causando inflamação, hipoxemia e frequentemente resultando em falência múltipla de órgãos. Esta condição é fatal e muitas vezes letal, normalmente exigindo ventilação mecânica e admissão numa unidade de terapia intensiva. Uma forma menos grave é chamada de lesão pulmonar aguda (ALI), incluindo lesão pulmonar aguda relacionada à transfusão (TRALI).

[0172] A ARDS pode ocorrer dentro de 24 a 48 horas após uma lesão ou ataque de doença aguda. Em tal caso, o paciente normalmente apresenta falta de ar, taquipneia e sintomas relacionadas à causa subjacente, isto é, choque. As doenças de longo prazo também podem desencadear o mesmo, tal como a malária. A ARDS pode, então, ocorrer algum tempo após o início de um caso particularmente agudo da infecção.

[0173] Os pacientes que sofrem de ARDS podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de ARDS.

[0174] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) síndrome do desconforto respiratório agudo associado à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0175] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de ARDS.

[0176] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos, fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em ARDS, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de ARDS. G. DOENÇA CARDIOVASCULAR

[0177] A doença cardiovascular se refere à classe de doenças que envolvem o coração ou os vasos sanguíneos (artérias e veias). Embora o termo se refira tecnicamente a qualquer doença que afeta o sistema cardiovascular, normalmente é usado para se referir àquelas relacionadas à aterosclerose (doença arterial). Estas condições têm causas, mecanismos e tratamentos similares.

[0178] O tratamento da doença cardiovascular depende da forma específica da doença em cada paciente, mas o tratamento eficaz sempre inclui mudanças preventivas no estilo de vida discutidas acima. Os medicamentos, tais como medicamentos para redução de pressão sanguínea, aspirina e os fármacos para baixar o colesterol de estatina podem ser úteis. Em algumas circunstâncias, pode ser necessária cirurgia ou angioplastia para reabrir, reparar ou substituir vasos sanguíneos danificados

[0179] Várias formas de doença cardiovascular incluem aneurismas, angina, arritmia, aterosclerose, cardiomiopatia, doença cerebrovascular, doença cardíaca congênita, insuficiência cardíaca congestiva, miocardite, doença de válvula, doença arterial coronariana, cardiomiopatia dilatada, disfunção diastólica, endocardite, pressão sanguínea alta (hipertensão), cardiomiopatia hipertrófica, prolapso da válvula nitral, infarto do miocárdio e tromboembolismo venoso.

[0180] Os pacientes que sofrem de doença cardiovascular associada a histona têm níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de doença cardiovascular associada a histona.

[0181] Numa modalidade do segundo, terceiro ou quarto aspectos da invenção, é fornecido um método para tratar (profilática ou terapeuticamente) doença cardiovascular associada à histona extracelular num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0182] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de doença cardiovascular associada à histona.

[0183] Desta forma, os compostos da invenção e composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em doença cardiovascular associada à histona, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da doença cardiovascular associada à histona. H. DESCOLAMENTO DE RETINA

[0184] O descolamento de retina é um distúrbio do olho em que a camada neural da retina se desprende do epitélio pigmentar da retina, normalmente causada por uma ruptura ou rasgamento da retina. A concentração intravítreo de histonas é maior nos olhos de pacientes com descolamento de retina do que em olhos normais.

[0185] As histonas extracelulares são tóxicas e induzem a produção de IL-8 in vivo e in vitro através de uma via dependente de TLR4/MAPK (ERK1/2 e p38). O ácido hialurônico do corpo vítreo diminui a toxicidade mediada por histona mediante a inibição da difusão de histonas. Desta forma, as histonas liberadas das retinas agonizantes podem agir como DAMPs para induzir a liberação de citocinas pró-inflamatórias e mediar a toxicidade celular.

[0186] Os pacientes que sofrem de descolamento de retina podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de descolamento de retina.

[0187] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar descolamento de retina num sujeito mediante a inibição das atividades citotóxicas de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0188] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de descolamento de retina.

[0189] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em descolamento de retina, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência do descolamento de retina.

[0190] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em sujeitos de queimadura. I. FIBROSE

[0191] Os pacientes que sofrem de fibrose têm níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de fibrose.

[0192] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar citotoxicidade induzida por histona causada por fibrose num sujeito, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0193] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de fibrose.

[0194] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em fibrose num sujeito, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de fibrose. J. DIABETES

[0195] Os pacientes que sofrem de diabetes podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de diabetes.

[0196] A invenção fornece métodos para tratar complicações associadas à histona em diabetes (por exemplo, inflamação e cura de ferimentos retardada). Os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto da invenção a um sujeito diagnosticado com diabetes tipo 1, tipo 1,5 ou tipo 2.

[0197] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar diabetes num sujeito, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0198] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes de diabetes.

[0199] Em certas modalidades, o sintoma de diabetes que tem envolvimento de histona é inflamação. A redução em inflamação pode ser monitorada por exame físico, bem como a redução na presença de marcadores inflamatórios.

[0200] Em certas modalidades, é fornecido um método para tratamento de diabetes que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente usado para tratar diabetes e pelo menos um composto da invenção. O agente usado para tratar diabetes pode ser insulina ou outros agentes selecionados a partir dos seguintes Biguanidas, Metformina (Glucofago), Metformina líquida (Riomet), Metformina de liberação prolongada (Glucophage XR, Fortamet, Glumetza), Sulfonilureias, Glimepirida (Amaril), Gliburida ( Diabeta, Micronase), Glipizida (Glucotrol, Glucotrol XL), Gliburida micronizada (Glynase), Meglitinidas, Repaglinida (Prandin), Derivados de D-fenilalanina, Nateglinida (Starlix), Tiazolidinadionas, Pioglitazona (TZDs),

Pioglitazona (Actos) Inibidor de DPP-4, Sitagliptina (Januvia), Saxagliptina (Onglyza), Linagliptina (Tradjenta), Alfa-glucosidase, Acarbose (Precose), Miglitol (Glyset), Sequestrantes de ácido biliar, Colesevelam (Welchol), Pioglitazona e metformina (Actoplus Met) Gliburida e metformina (Glucovance), Glipizida e metformina (Metaglip), Sitagliptina e metformina (Janumet), Saxagliptina e metformina (kombiglyze), Repaglinida e metformina (Prandimet) e Pioglitazona e Glimepirida (Duetact).

[0201] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em diabetes num sujeito. Como tal, a presente invenção fornece um tratamento para diabetes num sujeito, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência de diabetes. K. TOXICIDADE EM QUIMIOTERAPIA, RADIOTERAPIA E

TERAPIA DE CITOCINA

[0202] Várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e citocinas, estão associadas à toxicidade, às vezes severa, no paciente com câncer. Na medida em que a toxicidade é causada pelo menos em parte pelas ações extracelulares de histonas, a presente invenção procura reduzir esta toxicidade usando as composições farmacêuticas da presente invenção, reduzindo ou aliviando assim o desconforto por parte do paciente, bem como permitindo doses mais altas da terapia.

[0203] Os pacientes que sofrem dos efeitos colaterais de várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e terapia de citocina, podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes destes efeitos colaterais.

[0204] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar os efeitos colaterais de várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e terapia de citocina num sujeito mediante a inibição da atividade citotóxica de histonas extracelulares, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0205] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento para os efeitos colaterais de várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e terapia de citocina.

[0206] Numa forma altamente preferencial da invenção, o composto usado no tratamento dos efeitos colaterais de várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e terapia de citocina nos pacientes submetidos a tal terapia, é o composto de sulfato de β-O-metil- celobiosídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Por exemplo, o composto usado no método é o sulfato de β-O-metil-celobiosídeo de sódio.

[0207] Deste modo, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular nos efeitos colaterais de várias formas de terapia contra câncer, incluindo quimioterapia, radiação e terapia de citocina, incluindo tanto o pré- tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência destas terapias. L. CURA DE FERIMENTO

[0208] Também são fornecidos métodos para uso na cura de ferimento. Conforme usado no presente documento, “cura de ferimento” se refere ao processo complicado em que a pele (ou um outro tecido-órgão) se repara após lesão. O modelo clássico de cura de ferimento é dividido em três ou quatro fases sequenciais, ainda que sobrepostas: (1) hemostase, quando o coágulo para de sangrar, (2) inflamação, (3) proliferação e (4) remodelação. Após lesão na pele, um conjunto de eventos bioquímicos complexos ocorre numa cascata intimamente orquestrada para reparar os danos. Durante a fase de inflamação, bactérias e restos de células são fagocitados e removidos do ferimento pelos glóbulos brancos. Os fatores de crescimento derivados de plaquetas (armazenados nos grânulos alfa das plaquetas) são liberados no ferimento que causam a migração e divisão de células durante a fase proliferativa. A fase de proliferação é caracterizada por angiogênese, deposição de colágeno, formação de tecido de granulação, epitelização e contração do ferimento. Novos vasos sanguíneos são formados e os fibroblastos crescem e formam uma nova matriz extracelular provisória (ECM) mediante a excreção de colágeno e fibronectina. Simultaneamente, ocorre a reepitelização da epiderme, na qual as células epiteliais proliferam e “rastejam” no topo do leito do ferimento, fornecendo cobertura para o novo tecido.

[0209] Os pacientes que sofrem de dificuldades de cura de ferimento podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de cura de ferimento.

[0210] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar a citotoxicidade induzida por histona causada durante a cura de ferimento num sujeito, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0211] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento em pacientes que sofrem de dificuldades de cura de ferimento.

[0212] Desta forma, os compostos da invenção e as composições terapêuticas ou farmacêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular no tratamento num sujeito. M. HISTONAS EM DOENÇA DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

[0213] Os pacientes que sofrem de doença do sistema nervoso central podem ter níveis aumentados de histonas extracelulares presentes em seu sangue e estas proteínas têm sido implicadas como mediadores importantes da patologia de doença do sistema nervoso central. Por exemplo, a doença de Huntington é um distúrbio neurodegenerativo autossômico dominante causado por uma expansão de repetição de poliglutamina, resultando numa faixa de poliglutamina expandida na proteína de huntingtina. A evidência recente indica que a desregulação transcricional mediada pela modificação de histona é um mecanismo patogênico importante na doença de Huntington.

[0214] As manipulações farmacológicas de atividade de histona desacetilase têm sido benéficas em vários modelos experimentais de doença do sistema nervoso central, tal como doença de Huntington, epilepsia e doença de Alzheimer. A morte neuronal, respostas inflamatórias e gliose reativa são os marcadores das principais doenças neurológicas. A evidência mais recente indica que a histona extracelular H1 é um fator pró-inflamatório neurotóxico e causa gliose reativa no sistema nervoso central. Estas conclusões sugerem que tanto as modificações de histona como as histonas extracelulares contribuem para a doença do sistema nervoso central.

[0215] Numa modalidade do segundo ou terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para melhorar doença do sistema nervoso central induzida por histona num sujeito, sendo que o referido método compreende a etapa de: administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0216] Os compostos, tais como mCBS, podem bloquear os efeitos tóxicos de histonas extracelulares e, assim, são úteis como um tratamento na doença do sistema nervoso central.

[0217] Desta forma, os compostos da invenção e composições farmacêuticas ou terapêuticas que incluem os referidos compostos fornecem um meio para melhorar a atividade citotóxica de proteínas de histona extracelular em doença do sistema nervoso central num sujeito, incluindo tanto o pré-tratamento (no caso de um procedimento médico) como o tratamento após a ocorrência da doença do sistema nervoso central.

3. FORMAS FARMACÊUTICAS E TERAPÊUTICAS

[0218] Num quinto aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica ou terapêutica para uso no tratamento de uma complicação associada à histona extracelular que compreende: pelo menos um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. De preferência, a composição inclui um carreador, excipiente e/ou diluente terapêutico ou farmaceuticamente aceitável. O composto na composição farmacêutica ou terapêutica pode ser numa forma de base livre neutra ou forma de sal. De preferência, o composto é o sal de sódio de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo.

[0219] Conforme usado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável" ou “terapeuticamente eficaz” se referem àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão contidas no escopo do julgamento médico do parecer, adequados para o uso em contato com os tecidos de indivíduos humanos e indivíduos animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma razão benefício/risco razoável.

[0220] Os métodos para preparar composições administráveis são evidentes aos versados na técnica, e são descritos em maiores detalhes em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15 a edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa., aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.

[0221] Conforme usado aqui, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “um excipiente farmaceuticamente aceitável” ou “diluente farmaceuticamente aceitável”, “carreador terapeuticamente aceitável” ou “um excipiente terapeuticamente aceitável" ou “diluente terapeuticamente aceitável” significa um material, composição ou veículo, tal como uma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco magnésio, estearato de cálcio ou zinco ou ácido estérico) ou material de encapsulamento de solvente, envolvido no carregamento ou transporte do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para um outro órgão ou porção do corpo.

Cada carreador, diluente e excipiente precisa ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente.

É um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, isto é, o material pode ser aplicado a um indivíduo juntamente com o agente ativo sem causar efeitos biológicos inaceitáveis ou interagir de maneira prejudicial com qualquer um ou mais dos componentes da composição em que está contido.

Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose de sódio, metilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina e acetato de celulose; (4) tragacanta em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol (PEG); (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos (23), componente sérico, tal como albumina sérica, HDL e LDL; (22) álcoois C 2- C12 tais como etanol; e (23) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

Os agentes umectantes, agentes aglutinantes, cargas, lubrificantes, agentes corantes, desintegrantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes perfumantes, conservante, água, soluções salinas,

álcoois, antioxidantes, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares também podem estar presentes na formulação. Os termos como “excipiente”, “carreador”, “diluente” e “carreador farmaceuticamente aceitável” ou similares são usados aqui de forma intercambiável.

[0222] Os exemplos de carreadores, excipientes ou diluentes terapêutica ou farmaceuticamente aceitáveis são água desmineralizada ou destilada; solução salina; óleos à base de vegetais, tais como óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleos de gergelim, tais como óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim, óleo de arachis ou óleo de coco; óleos de silicone, incluindo polissiloxanos, tais como metil polissiloxano, fenil polissiloxano e metilfenil polissolpoxano; silicones voláteis; óleos minerais tais como parafina líquida, parafina macia ou esqualano; derivados de celulose, tais como metilcelulose, etil celulose, carboximetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanóis inferiores, por exemplo, etanol ou isopropanol; aralcanóis inferiores; polialquileno glicóis inferiores ou alquileno glicóis inferiores, por exemplo polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etilenoglicol, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol ou glicerina; ésteres de ácidos graxos, tais como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinilpirridona; ágar; carragenina; goma tragacanta ou goma acácia e vaselina. Tipicamente, o carreador ou carreadores irão formar de 10% a 99,9% em peso das composições.

[0223] As composições aqui descritas podem adicionalmente conter outros componentes auxiliares encontrados convencionalmente em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Desta forma, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais farmaceuticamente ativos compatíveis tais como, por exemplo,

antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti- inflamatórios. Entretanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições aqui descritas.

[0224] Conforme descrito em detalhes abaixo, as composições terapêutica ou farmaceuticamente aceitáveis descritas aqui podem ser especialmente formuladas para administração na forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, líquidos (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), pastilhas, drágeas, cápsulas, pílulas, comprimidos (por exemplo, aqueles direcionados à absorção bucal, sublingual e sistêmica), bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; (2) administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou peridural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril, ou formulação de liberação sustentada; (3) injeção diretamente no órgão que necessita de tratamento, tal como por administração intraparenquimatosa (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra-hepática; (4) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, loção, gel, pomada ou emplastro ou spray de liberação controlada aplicado à pele; (5) numa forma de aerossol adequada para administração por inalação, tal como por inalação intranasal ou inalação oral; (6) de modo intravaginal ou intrarretal, por exemplo, como um pessário, creme, supositório ou espuma; (7) de modo sublingual; (8) de modo ocular como um colírio; (9) de modo transdérmico; (10) transmucosa; ou (11) nasal.

[0225] Numa modalidade, a composição da invenção é administrada por injeção, tal como por injeção parenteral (tal como por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou localmente em tecidos e órgãos, tal como por administração intraparenquimatosa (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra-hepática.

[0226] As composições farmacêuticas adequadas para injeção incluem soluções aquosas estéreis (onde solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Idealmente, a composição é estável nas condições de fabricação e armazenamento e pode incluir um conservante para estabilizar a composição contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

[0227] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas mediante a incorporação da composição farmacêutica da invenção na quantidade necessária num solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. A título de ilustração, uma dose única pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido ou injetada no local proposto da infusão (consultar, por exemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15ª Edição, páginas 1035 -1038 e 1570-1580).

[0228] No caso de soluções injetáveis, o carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, solução de Ringer, solução salina isotônica, solução salina tamponada com fosfato, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol (por exemplo, 1,2 propilenoglicol) e polietilenoglicol líquido e similares), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais.

[0229] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, usando um revestimento tal como lecitina, por meio da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e usando tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada mediante a inclusão de vários agentes antibacterianos e/ou antifúngicos. Os agentes adequados são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, álcool benzílico, ácido ascórbico, tiomerosal e similares. Em muitos casos, pode ser preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida mediante a inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0230] Numa segunda modalidade, a composição da invenção é administrada por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um carreador comestível assimilável. Para administração terapêutica oral, a composição farmacêutica pode ser incorporada com excipientes e usada na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e similares.

[0231] Alguns exemplos de carreadores, diluentes, excipientes e adjuvantes adequados para uso oral incluem óleo de amendoim, parafina líquida, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, alginato de sódio, goma acácia, goma tragacanta, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, gelatina e lecitina. Além disto, estas formulações orais podem conter agentes flavorizantes e corantes adequados.

[0232] Quando usadas na forma de cápsula, as cápsulas podem ser revestidas com compostos tais como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila que retardam a desintegração. Os tabletes, trociscos, pílulas, cápsulas e similares podem conter também os seguintes: um aglutinante, tal como goma tragacanta, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante adicional, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante, tal como sacarose, lactose ou sacarina, ou um agente flavorizante, tal como hortelã, óleo de gaultéria ou sabor de cereja.

[0233] Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, a mesma pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carreador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos.

[0234] As formas líquidas para administração oral (tal como xarope ou elixir) podem conter, além dos agentes acima, um carreador líquido, um agente adoçante (por exemplo, sacarose), um conservante (por exemplo, metil e propilparabenos), um corante e flavorizante, tal como sabor de cereja ou laranja. Os carreadores líquidos adequados incluem água, óleos tais como óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de gergelim, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de arachis, óleo de coco, parafina líquida, etilenoglicol, propilenoglicol, polietilenoglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, álcoois graxos, triglicerídeos ou misturas dos mesmos.

[0235] As suspensões para administração oral podem compreender ainda agentes de dispersão e/ou agentes de suspensão. Os agentes de suspensão adequados incluem carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, alginato de sódio ou álcool acetílico. Os agentes de dispersão adequados incluem lecitina, ésteres de polioxietileno de ácidos graxos, tais como ácido esteárico, mono- ou di-oleato, -estearato ou - laurato de polioxietileno sorbitol, mono- ou di-oleato, - estearato ou -laurato de polioxietileno sorbitano e similares. As emulsões para administração oral podem compreender ainda um ou mais agentes emulsificantes. Os agentes emulsificantes adequados incluem agentes de dispersão conforme exemplificado acima, ou gomas naturais, tais como goma de guar, goma acácia ou goma tragacanta.

[0236] Numa terceira modalidade exemplificadora, a composição da invenção é administrada diretamente às vias aéreas de um sujeito na forma de um aerossol ou por nebulização. Para uso como aerossóis, a solução ou suspensão das composições farmacêuticas aceitáveis da invenção pode ser embalada num recipiente de aerossol pressurizado juntamente com propelentes adequados, por exemplo, propelentes de hidrocarboneto como propano, butano ou isobutano com adjuvantes convencionais. Tais composições também podem ser administradas numa forma não pressurizada, tal como num nebulizador ou atomizador.

[0237] Os aerossóis para a entrega ao trato respiratório são conhecidos na técnica: consultar, por exemplo, Adjei, A. e Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. e Lamm, J - W. J. Int. J. Pharm., 114: 111- 115 (1995); Gonda, I. “Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract”, em Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317- 1324 (1989)).

[0238] Numa quarta modalidade exemplificadora, a composição pode ser administrada na forma de lipossomas. Os lipossomas são geralmente derivados de fosfolipídios ou outras substâncias lipídicas e são formados por cristais líquidos hidratados mono- ou multilamelares que são dispersos num meio aquoso. Pode ser usado qualquer lipídio não tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável com capacidade para formar lipossomas. As composições na forma de lipossoma podem conter estabilizantes, conservantes, excipientes e similares. Os lipídios preferenciais são os fosfolipídios e as fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturais como sintéticas. Os métodos para formar lipossomas são conhecidos na técnica e, em relação a esta referência específica, é feita referência a: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, Nova Iorque, N.Y. (1976), p. 33 et seq., cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência.

[0239] Além disto, a composição terapêutica ou farmacêutica aceitável da invenção, de acordo com qualquer aspecto, modalidade ou exemplo aqui descrito, pode ser incorporada em preparações e formulações de liberação sustentada. Tais composições terapêuticas ou farmacêuticas podem incluir ainda um tampão adequado para minimizar a hidrólise ácida. Os agentes de tampão adequados são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem, porém sem limitação, fosfatos, citratos, carbonatos e misturas dos mesmos.

[0240] Os compostos da invenção também podem ser administrados na forma de um “pró-fármaco”. Um pró-fármaco é uma forma inativa de um composto que é transformado in vivo na forma ativa. Os pró-

fármacos adequados incluem ésteres, ésteres de fosfonato etc., da forma ativa do composto.

[0241] Adicionalmente, as composições da invenção podem ser implantadas num paciente ou injetadas usando um sistema de entrega de fármaco. Os dispositivos de entrega revestidos também podem ser úteis. Consultar, por exemplo, Urquhart, et al. (1984), Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236; Lewis, ed. “Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals” (Plenum Press, Nova Iorque, 1981); patente US n° 3.773.919; patente US

6.747.014; e na Patente no U.S. n° 35 3.270.960.

[0242] Em certas modalidades, as composições são entregues usando um dispositivo ou bandagem, usada, por exemplo, no processo de tratamento de um ferimento.

[0243] A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica divulgada aqui para qualquer sujeito particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo: a toxicidade e eficácia terapêutica da composição farmacêutica; a severidade da enfermidade; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração; a taxa de sequestro das composições; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o tratamento, juntamente com outros fatores relacionados bem conhecidos na medicina.

[0244] A toxicidade e eficácia terapêutica podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. As composições que exibem grandes índices terapêuticos são preferenciais.

[0245] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura celular e modelos animais aqui descritos podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens terapeuticamente eficazes para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos se encontra, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada.

[0246] A quantidade de composto da invenção aqui descrita que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade irá se situar na faixa de cerca de 0,1% a 99% do composto, de preferência, de cerca de 5% a cerca de 70%, com a máxima preferência, de 10% a cerca de 30%.

[0247] A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme necessário, para se adequar aos efeitos observados do tratamento. A título de ilustração, apenas as composições podem ser administradas de modo que as composições farmacêuticas aceitáveis sejam dadas a uma doses de 1 μg/kg a 150 mg/kg, 1 μg/kg a 100 mg/kg, 1 μg/kg a 50 mg/kg, 1 μg/kg a 20 mg/kg, 1 μg/kg a 10 mg/kg, 1 μg/kg a 1 mg/kg, 100 μg/kg a 100 mg/kg, 100 μg/kg a 50 mg/kg, 100 μg/kg a 20 mg/kg, 100 μg/kg a 10 mg/kg, 100 μg/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 50 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a 100 mg/kg, 10 mg/kg a 50 mg/kg ou 10 mg/kg a 20 mg/kg. Deve ser entendido que as faixas dadas aqui incluem todas as faixas intermediárias, por exemplo, a faixa de 1 mg/kg a 10 mg/kg inclui 1 mg/kg a 2 mg/kg, 1 mg/kg a 3 mg/kg, 1 mg/kg a 4 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 1 mg/kg a 6 mg/kg, 1 mg/kg a 7 mg/kg, 1 mg/kg a 8 mg/kg, 1 mg/kg a 9 mg/kg, 2 mg/kg a 10 mg/kg, 3 mg/kg a 10 mg/kg, 4 mg/kg a 10 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, 6 mg/kg a 10 mg/kg, 7 mg/kg a 10 mg/kg, 8 mg/kg a 10 mg/kg, 9 mg/kg a 10 mg/kg etc... Deve ser entendido ainda que as faixas intermediárias às dadas acima também estão dentro do escopo dos métodos e das composições aqui descritos, por exemplo, na faixa de 1 mg/kg a 10 mg/kg, faixas de dose tais como 2 mg/kg a 8 mg/kg, 3 mg/kg a 7 mg/kg, 4 mg/kg a 6 mg/kg, etc.

[0248] Em que o composto da invenção é mCBS ou mCBS.Na, a dosagem pode ser de 10 a 800 μg/ml. De preferência, se situa na faixa de 50 a 500 μg/ml. Mais preferencialmente, a dosagem é de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790 ou 800 μg/ml quando administrada a um sujeito humano.

[0249] Em certos exemplos da invenção, uma quantidade eficaz do composto de celobiosídeo sulfatado modificado é dada como uma dose única de administração. Em certos exemplos, a dose é dada repetidamente. Ou seja, os regimes de tratamento irão variar dependendo da gravidade e do tipo de doença, da saúde geral e idade do paciente e de várias outras condições a serem consideradas pelo médico assistente. Em relação à duração e frequência do tratamento, é típico para médicos versados monitorar sujeitos para determinar quando um tratamento está fornecendo benefício terapêutico e para determinar se deve aumentar ou diminuir a dosagem, aumentar ou diminuir a frequência de administração, interromper o tratamento, retomar o tratamento ou realizar outra alteração no regime de tratamento.

[0250] As composições aceitáveis farmacêuticas ou terapêuticas da invenção, de acordo com qualquer aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui, podem ser fornecidas numa única administração de bolus ou em múltiplas doses ou tratamentos e também podem ser aplicadas por terapia “contínua”, em que uma quantidade pequena da composição terapêutica é fornecida continuamente durante um período de tempo prolongado.

[0251] Em que a dosagem múltipla é usada no tratamento (incluindo terapia contínua), a composição terapêutica ou farmacêutica será administrada por um cronograma de dosagem que pode variar de uma vez por semana a diariamente, dependendo de vários fatores clínicos, tais como a sensibilidade do sujeito ao composto de celobiosídeo sulfatado modificado usado na composição terapêutica ou farmacêutica. A dose desejada a ser administrada em tal regime pode ser entregue como uma dose única de uma só vez ou dividida em subdoses, por exemplo, 2 a 4 subdoses e administrada durante um período de tempo, por exemplo, em intervalos adequados ao longo do dia ou outro cronograma adequado. Tais subdoses podem ser administradas como formas de dosagem unitária.

[0252] Em algumas modalidades, a administração é crônica, por exemplo, uma ou mais doses diárias durante um período de semanas ou meses. Os exemplos de cronogramas de dosagem são administração diária, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou quatro ou mais vezes ao dia durante um período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses ou mais.

[0253] A dose desejada pode ser administrada usando infusão contínua ou entrega através de uma formulação de liberação controlada. Neste caso, a composição farmacêutica contida em cada subdose precisa ser correspondentemente menor para alcançar a dose diária total.

[0254] A unidade de dosagem também pode ser composta para entrega durante vários dias, por exemplo, usando uma formulação convencional de liberação sustentada que fornece liberação sustentada da composição farmacêutica durante um período de vários dias. As formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a entrega de agentes num local, tal como poderia ser usado com os agentes aqui descritos. Nesta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.

4. REGIMES DE COMBINAÇÃO

[0255] Em certas modalidades exemplificadoras, de acordo com o quinto aspecto da invenção, a composição identificada também pode compreender uma segunda composição, composto ou agente ativo selecionado de: um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composto farmacêutico ou terapêutico que trata uma ou mais condições que o sujeito é afetado. De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece desejavelmente uma terapia adjunta para sepse, SIRS e IRI ou para uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS e IRI. De preferência, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[0256] As vantagens terapêuticas podem ser obtidas através de regimes de combinação. Em certas modalidades da invenção, os métodos descritos podem compreender ainda a etapa de: administrar a um sujeito, ao mesmo tempo ou concomitantemente com o tratamento da invenção, um segundo agente ativo que é um tratamento auxiliar para a sepse, SIRS e IRI ou a condição médica ou doença associada à sepse, SIRS e IRI que o paciente tem ou está sofrendo de ou está em risco de ter ou sofrer quando é entregue de modo preventivo.

[0257] O segundo agente ativo pode incluir, sem limitação, agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos ou outras formas de intervenção médica que são distintas do composto da invenção.

[0258] A título de ilustração, quando o método ou tratamento é dirigido ao tratamento ou melhora de um estado doentio séptico ou não séptico envolvendo patologia mediada por histona extracelular num sujeito, o método também pode compreender administrar a um sujeito, ao mesmo tempo ou concomitantemente, um segundo agente anti-inflamatório, agente antibiótico, agente antiviral, agente antifúngico ou outras formas de intervenção médica que são distintos do composto da invenção, que fornece um tratamento auxiliar para uma condição médica que envolve patologia mediada por histona extracelular.

[0259] Num exemplo, o segundo agente ativo fornece um tratamento ou prevenção auxiliar para sepse, SIRS ou IRI ou a doença ou condição médica associada à sepse, SIRS ou IRI, tal como uma sepse, SIRS ou IRI ou uma doença ou condição médica associada a sepse, SIRS ou IRI envolvendo patologia mediada por histona extracelular num sujeito.

[0260] Num outro exemplo, o segundo agente ativo fornece um tratamento ou prevenção auxiliar para uma condição médica envolvendo citotoxicidade de histona extracelular.

[0261] A título de ilustração, quando o método de tratamento é dirigido ao tratamento ou melhora de um estado doentio séptico ou não séptico associado a sepse, SIRS ou IRI envolvendo patologia mediada por histona extracelular num sujeito, o método também pode compreender administrar a um sujeito, ao mesmo tempo ou concomitantemente, um segundo agente anti- inflamatório, agente antibiótico, agente antiviral, agente antifúngico ou outras formas de intervenção médica que são distintos do composto da invenção, que fornece um tratamento adjunto para uma condição médica que envolve patologia mediada por histona extracelular.

[0262] Em alguns exemplos, o agente adicional administrado é um agente anti-inflamatório tal como um esteroide, corticosteroides, inibidor de COX-2, agente anti-inflamatório não-esteroidais (NSAIDs), aspirina ou qualquer combinação dos mesmos. Mais particularmente, o agente adicional administrado pode ser um agente anti-inflamatório, selecionado do grupo que consiste em Alclofenaco; Dipropionato de Alclometasona; Algestona Acetonida; Alfa Amilase; Amcinafal; Amcinafida; Amfenaco Sódico; Cloridrato de Amiprilose; Anakinra; Anirolaco; Anitrazafeno; Apazona; Balsalazida Dissódico; Bendazaco; Benoxaprofeno; Cloridrato de Benzidamina; Bromelainas; Broperamol; Budesonida; Carprofeno; Cicloprofeno; Cintazona; Cliprofeno; Propionato de Clobetasol; Butirato de Clobetasona; Clopiraco; Propionato de Cloticasona; Acetato de Cormetasona; Cortodoxona; Deflazacort; Desonida; Desoximetasona; Dipropionato de Dexametasona; Diclofenaco de Potássio; Diclofenaco de Sódio; Diacetato de Diflorasona; Diflumidona Sódica; Diflunisal;

Difluprednato; Diftalona, Dimetilsulfóxido; Drocinonida; Endrisona; Enlimomabe; Enolicam Sódico; Epirizol; Etodolaco; Etofenamato; Felbinaco; Fenamol; Fenbufeno; Fenclofenaco; Fencloraco; Fendosal; Fenpipalona; Fentiazaco; Flazalona; Fluazacort; Ácido Flufenâmico; Flumizol; Acetato de Flunisolida; Flunixina; Flunixina Meglumina; Fluocortina Butil; Acetato de Fluorometolona; Fluquazona; Flurbiprofeno; Fluretofeno; Propionato de Fluticasona; Furaprofeno; Furobufeno; Halcinonida; Propionato de Halobetasol; Acetato de Halopredona; Ibufenaco; Ibuprofeno; Ibuprofeno Alumínio; Ibuprofeno Piconol; Ilonidap; Indometacina; Indometacina Sódica; Indoprofeno; Indoxol; Intrazol; Acetato de Isoflupredona; Isoxepac; Isoxicam; Cetoprofeno; Cloridrato de Lofemizol; Lomoxicam; Etabonato de Loteprednol; Meclofenamato Sódico; Ácido Meclofenâmico; Dibutirato de Meclorisona; Ácido Mefenâmico; Mesalamina; Meseclazona; Metilprednisolona Suleptanato; Morniflumato; Nabumetona; Naproxeno; Naproxeno Sódico; Naproxol; Nimazona; Olsalazina Sódica; Orgoteina; Orpanoxina; Oxaprozina; Oxifenbutazona; Cloridrato de Paranilina; Pentosano Polissulfato de sódio; Glicerato de Fenbutazona de Sódio; Pirfenidona; Piroxicam; Cinamato de Piroxicam; Piroxicam Olamina; Pirprofeno; Prednazato; Prifelona; Ácido Prodólico; Proquazona; Proxazol; Citrato de Proxazol; Rimexolona; Romazarit; Salcolex; Salnacedina; Salsalato; Salicilatos; Cloreto de Sanguinário; Seclazona; Sermetacina; Sudoxicam; Sulindac; Suprofeno; Talmetacina; Talniflumato; Talosalato; Tebufelona; Tenidap; Tenidap Sódico; Tenoxicam; Tesicam; Tesimida; Tetridamina; Tiopinac; Pivalato de Tixocortol; Tolmetina; Tolmetina Sódica; Triclonida; Triflumidato; Zidometacina; Glucocorticoides; Zomepiraco Sódico, e combinações dos mesmos.

[0263] Em alguns exemplos, o agente adicional administrado é um agente antibiótico tal como canamicina, actinomicina D, doxorrubicina, bleomicina, mitramicina, aminoglicosídeos, ansamicinas, carbacefemas, carbapenemas, cefalosporinas, glicopeptídeos, lincosamidas, macrolidas, monobactamas, penicilinas, polipeptídeos, quinolonas sulfonamidas e/ou tetraciclinas.

[0264] Em alguns exemplos, o agente adicional administrado é um agente antiviral, tal como um inibidor de transcriptase reversa de não nucleosídeo, inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeo (por exemplo, análogos de nucleosídeo), inibidor de protease e/ou um inibidor de transcriptase reversa analógica de nucleotídeo.

[0265] Em alguns exemplos, o agente adicional administrado é um agente antifúngico, tal como um composto de imidazol, triazol, tiazol, alilamina e/ou equinocandina.

[0266] Em alguns exemplos, o agente adicional administrado é um agente para tratar diabetes. Tais agentes incluem aqueles agentes conhecidos na técnica para tratamento de diabetes e/ou para ter atividades anti- hiperglicêmicas, por exemplo, inibidores da dipeptidil peptidase 4 (DPP-4) (por exemplo, Alogliptina, Linagliptina, Saxagliptina, Sitagliptina, Vildagliptina e Berberina), biguanidas (por exemplo, Metformina, Buformina e Fenformina), moduladores de receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR), tais como tiazolidinadionas (TZDs) (por exemplo, Pioglitazona, Rivoglitazona, Rosiglitazona e Troglitazona), agonistas duplos de PPAR (por exemplo, Aleglitazar, Muraglitazar e Tesaglitazar), sulfonilureias (por exemplo, Aceto- hexamida, Carbutamida, Clorpropamida, Gliclazida, Tolbutamida, Tolazamida, Glibenclamida (Gliburida), Glipizida, Gliquidona, Gliclopiramida e Glimepirida), meglitlinidas (“glinidas”) (por exemplo, Nateglinida, Repaglinida e Mitiglinida), peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1) e análogos (por exemplo, Exendina-4, Exenatida, Liraglutida, Albiglutida), insulina e análogos de insulina (por exemplo, Insulina lispro, Insulina aspart, Insulina glulisina, Insulina glargina, Insulina detemir, insulina Exubera e NPH), inibidores de alfa- glucosidase (por exemplo, Acarbose, Miglitol e Voglibose), análogos de amilina (por exemplo Pramlintida), inibidores de cotransportador de glicose dependente de sódio T2 (SGLT T2) (por exemplo, Dapgliflozina, Remogliflozina e Sergliflozina) e outros (por exemplo, Benfluorex e Tolrestat).

[0267] Os versados na técnica irão observar que as composições de acordo com qualquer aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui podem ser administradas como parte de uma abordagem de terapia de combinação para o tratamento de sepse, SIRS ou IRI ou uma doença ou condição associada a sepse, SIRS ou IRI. Na terapia de combinação, os respectivos agentes podem ser administrados de modo simultâneo ou sequencial em qualquer ordem. Quando administrado sequencialmente, pode ser preferencial que os componentes sejam administrados pela mesma via.

[0268] Em alguns exemplos em que os dois agentes são aplicados separadamente, geralmente seria assegurado que um período de tempo significativo não expirasse entre o tempo de cada entrega, de modo que ambos os agentes ainda pudessem exercer um efeito vantajosamente combinado. Em tais casos, é contemplado que um indivíduo tipicamente iria administrar ambas as modalidades dentro de cerca de 12 a 24 horas uma da outra e, mais preferencialmente, dentro de cerca de 6 a 12 horas uma da outra, sendo da máxima preferência um tempo de atraso de apenas cerca de 12 horas , em algumas situações, pode ser desejável prolongar significativamente o tempo de tratamento, entretanto, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 ou 8) decorrem entre as respectivas administrações. Também é concebível que mais de uma administração de um fármaco seja desejada.

[0269] Quando as composições da invenção e um segundo agente ativo são administrados em diferentes composições, as vias de administração podem ser diferentes. Por exemplo, a composição da invenção é administrada por qualquer via adequada conhecida na técnica, incluindo, porém sem limitação, vias orais ou parenterais, incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, vias aéreas (aerossol), pulmonar, nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual), e o segundo agente farmaceuticamente ativo é a administração por uma via diferente, por exemplo, uma via comumente usada na técnica para administração do referido agente farmaceuticamente ativo. Num exemplo não limitante, as composições da invenção podem ser administradas por injeção, enquanto o segundo agente ativo pode ser administrado por via oral.

5. FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO

[0270] Num sexto aspecto da invenção, é fornecido um uso de uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para tratar uma condição médica, enfermidade ou doença que envolve histonas extracelulares. De preferência, o substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado que está presente na terminação de redução do celobiosídeo sulfatado polianiônico aprimora a estabilidade química do poliânion em relação ao mesmo poliânion que é sulfatado em sua terminação de redução. Mais preferencialmente, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0271] Por exemplo, numa modalidade do sexto aspecto da invenção, é fornecido um uso de uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de sepse ou uma IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito. De preferência, o celobiosídeo sulfatado modificado é mCBS ou, mais particularmente, é um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo tal como mCBS.Na.

[0272] Numa modalidade de tal uso, o medicamento é para o tratamento de sepse, ou SIRS ou de uma condição médica ou doença associada a sepse ou SIRS num sujeito, em que o referido tratamento melhora ou inibe a referida sepse ou SIRS ou a referida condição ou doença associada à referida sepse ou SIRS.

[0273] Numa outra modalidade de tal uso, o medicamento é para o tratamento de uma IRI ou de uma condição médica ou doença associada a uma IRI num sujeito, em que o referido tratamento melhora ou inibe a referida IRI ou a referida condição ou doença associada à referida lesão.

[0274] Em ainda outra modalidade de tal uso, o medicamento é usado para neutralizar histonas extracelulares que (i) são citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito, (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito, (iii) iniciam a coagulação mediante a ativação de plaquetas num sujeito ou (iv) induzem a fragilidade de hemácia e anemia resultante num sujeito.

[0275] Em ainda outra modalidade, o medicamento fabricado pode incluir também uma quantidade terapêutica ou farmaceuticamente eficaz de uma segunda composição, composto ou agente ativo. De acordo com esta modalidade, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece uma terapia adjunta para tratar uma condição médica, enfermidade ou doença que envolve histonas extracelulares. Desejavelmente, a segunda composição, composto ou agente ativo fornece uma terapia adjunta para o tratamento de sepse, SIRS ou IRI ou para uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI. De preferência, o segundo agente ativo é selecionado de: um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e/ou qualquer outra forma de composto farmacêutico ou terapêutico que trata uma ou mais condições que o sujeito é afetado. Mais preferencialmente, a segunda composição, composto ou agente ativo compreende um ou mais dentre agentes anti-inflamatórios.

[0276] Quando o composto de celobiosídeo sulfatado modificado é usado em qualquer um dos métodos da invenção, o composto pode ser administrado ou formulado para administração ao sujeito que precisa do mesmo, numa dose única de formulação. Em certas modalidades alternativas, o composto de celobiosídeo sulfatado modificado é administrado, ou formulado para administração ao sujeito que precisa do mesmo, como uma formulação de dose múltipla.

[0277] De preferência, para a administração a um sujeito, a composição farmacêutica ou terapêutica é fornecida como uma composição farmaceuticamente aceitável. Quando nesta forma, (1) a composição será farmacêutica formulada juntamente com um ou mais carreadores (aditivos) e/ou diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e (2) o composto de celobiosídeo sulfatado modificado na composição pode ser formulado numa forma neutra ou de sal. EXEMPLOS:

[0278] A presente invenção é descrita, ainda, no seguinte exemplo não limitante, que é fornecido a título de ilustração apenas e não deve ser interpretado como limitante à generalidade da divulgação da descrição por todo este relatório descritivo. EXEMPLO 1: MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE mCBS•Na

[0279] β-O-metil celobiosídeo é preparado conforme descrito por Jon K Fairweather et al., 2004, Aust. J. Chem., 57: 197-205.

[0280] Compostos de sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) e sulfato de β-O-metil celobiosídeo de sódio (mCBS.Na) foram preparados conforme descrito por Katrin C Probst e Hans Peter Wessel, 2001, J. Carbohydrate Chemistry, 20 (7 & 8): 549- 560, cuja divulgação está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0281] Sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) foi preparado de acordo com o esquema a seguir.

[0282] Etapa 1: À mistura de α-D-celobiose 1 (116 g, 338 mmol) e ácido acético glacial (1,6 l), foi adicionado brometo de acetila (300 ml, 500,0 g, 4065 mmol, 12,0 equiv) à temperatura ambiente. A mistura cremosa resultante foi aquecida a 60°C por 45 a 55 minutos até a mistura de reação se tornar uma solução transparente, o que indica a conclusão da reação.

[0283] Verter cuidadosamente a solução quente no béquer (10 l) contendo o gelo rachado (4 kg). Agitar a mistura até o sólido branco ter precipitado (~ 10 min). Adicionar outra porção de água fria (1 l) e manter em agitação por 10 min.

[0284] Filtrar com funil de sintetização e lavado o sólido com água fria (700 ml x 3). O sólido resultante no funil foi dissolvido em DCM (1 l) e lavado o funil com DCM (300 ml x2). A camada de DCM combinada foi lavada com salmoura (1,5 l) e extraída de volta com DCM (0,5 l). A camada de DCM final foi seca com Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida a < 35°C dentro de 2 h para obter o brometo alvo 2 (172,5 g, 74,3% de rendimento) que foi diretamente usado para a glicosilação seguinte.

[0285] Etapa 2: À mistura de brometo de celobiosila per-O- acetilado 2 (171 g, 250 mmol), DCM anidro (800 ml), MeOH anidro (800 ml) e peneiras moleculares 3A ativadas (70 g), foi adicionado carbonato de prata (Ag2CO3, 75 g, 275 mmol, 1,1 equiv). A mistura resultante foi agitada na ausência de luz por 16 h. A mistura foi purificada através de um tampão de sílica e eluída com EtOAc. As frações coletadas foram concentradas para gerar o produto cru como o sólido marrom que foi diretamente usado para a etapa seguinte. O Rf do composto 3 = 0,28 (EtOAc-Hexano, 1:1).

[0286] Etapa 3: À mistura do produto cru obtido a partir da etapa 2 e MeOH anidro (1 l), foi adicionado um pedaço pequeno de Na (1,72 g, 0,3 equiv, 75 mmol) à temperatura ambiente. Logo após, um sólido branco começou a precipitar da solução. A mistura resultante foi agitada de um dia para o outro a fim de garantir a conclusão de desacetilação. A suspensão final foi filtrada e lavada com MeOH (300 ml x 2). O sólido branco foi coletado e seco a vácuo de um dia para o outro para obter o celobiosídeo final 4 (72,5 g, 81,4% por 2 etapas).

PROCEDIMENTO SINTÉTICO E DE PURIFICAÇÃO PARA A ETAPA 4:

[0287] Etapa 4 A mistura de composto 4 (84,0 g, 236 mmol), SO3.TMA (367,4 g, 2,64 mol, 11,2 equiv), DMF anidro (3140 ml) e DCE anidro

(767 ml) foi desgaseificada sob Ar por três vezes e aquecida a 80 a 90°C por 2 h. (Monitoramento de reação: Após aquecimento por 10 min, a mistura cremosa tornou-se uma solução transparente. Após 30 min, a solução tornou- se turva novamente. Após 50 min, o sólido agregado foi observado na superfície do frasco. Mediante resfriamento, a mistura resultante foi movida ao ambiente frio (-5°C) e assentou de um dia para o outro, o que permite que o sólido se agregue completamente a partir do solvente. A conversão completa de composto 4 em 5 foi confirmada com RMN de 1H. Decantar a solução no dreno. O sólido cru foi filtrado e lavado com DCM por algumas vezes. O sólido resultante foi dissolvido em água deionizada e submetido diretamente a coluna de troca iônica [forma Na de DOWEX 50Wx8: 3 kg de resina (forma H +) foram pré-acondicionados em coluna de gravidade de vidro, regenerados por eluição de NaOH 1 M (- 6 l) e neutralizados com água deionizada (-12 l)]. As frações coletadas foram coletadas para produzir o celobiosídeo sulfatado final 6 (232,1 g, 92,0%) como o sólido vítreo. EXEMPLO 2: Estudos de estabilidade de composto de mCBS•Na

[0288] Os estudos de estabilidade foram executados em condições de 5±3°C, 25±2°C/60%RH e 40±2°C/75%RH. Os níveis tanto de mCBS quanto de sulfato de celobiose (CBS) foram rastreados em material clínico formulado (isto é, mCBS em tampão fosfato) via HPLC. Colocar em gráfico a alterações percentual (%) de mCBS e CBS em relação à sua quantidade inicial (em T=0), revelou que ao longo do tempo o nível de mCBS foi muito estável. Em contrapartida, o nível de CBS cai muito rapidamente e é quase ausente em cerca de 3 meses. O perfil de estabilidade de fato é similar em condições aceleradas (isto é, 25±2°C/60%RH e 40±2°C/75%RH), e a taxa de desaparecimento de CBS parece ser mais rápida. Um exemplo das diferenças em estabilidade de mCBS vs CBS de 2 lotes de formulações é mostrado na Figura 1. Estes dados indicam que CBS é altamente instável em soluções aquosas, mas a adição de um grupo metila à terminação de redução de CBS resulta numa molécula (mCBS) que é muito estável em soluções aquosas.

[0289] Adicionalmente, várias formulações de mCBS foram testadas em testes de estabilidade. Os dados destes experimentos revelaram que a estabilidade de mCBS não diferiu com os tampões usados. A Tabela 1 mostra a composição das várias formulações de mCBS em relação aos tampões usados. TABELA 2A Tabela 1: Composição do sistema de tampão Sistemas Concentração Ingredientes Quantidade pH de tampão de mCBS.Na Hidrogenofosfato 1,35 mg/ml Tampão de dissódico fosfato Fosfato de sódio 0,33 mg/ml monobásico Di-hidrato citrato 10 mg/ml Tampão de de sódio 7,4 a 7,6 80 mg/ml citrato q.s para ajuste Ácido cítrico 1 M de pH Acetato de sódio 1,20 mg/ml Tampão de q.s para ajuste acetato Ácido acético de pH

[0290] A Tabela 2a mostra que o pH varia ao longo do tempo dependendo da capacidade de tamponagem das várias formulações e mostra que o pH de formulação com tampão acetato não permanece em torno de pH 7,5 mesmo em torno de 5±3°C, mas os próprios dados indicam diferenças em estabilidade de mCBS durante este período.

TABELA 2B Tabela 2a: pH durante estudo de estabilidade Dia Buffer Condição Dia 0 Dia 3 Dia 7 Dia 14 Dia 28 21 5 ± 3°C 7,28 7,19 7,14 7,13 7,14 25°C/60% Tampão 7,27 7,21 7,14 7,18 7,22 de RH 7,58 de fosfato 40°C/75% 7,28 7,19 7,15 7,09 7,10 de RH 5 ± 3°C 7,27 7,24 7,15 7,15 7,17 25°C/60% Tampão 7,22 7,18 7,15 7,18 7,30 de RH 7,60 de citrato 40°C/75% 7,20 7,20 7,12 7,12 7,17 de RH 5 ± 3°C 6,97 7,02 6,94 6,93 6,92 Tampão 25°C/60% 7,00 7,02 7,10 7,15 7,38 de de RH 7,5 acetato 40°C/75% 6,87 6,89 6,81 6,81 6,84 de RH Controle 5 ± 3°C 6,81 6,81 6,84 6,79 6,89 (Isto é, 25°C/60% 7,04 7,18 7,32 7,43 7,41 não de RH 6,82 tampo- 40°C/75% 7,03 7,16 7,10 7,20 7,29 nado) de RH

[0291] A Tabela 2b compara os níveis de mCBS vs CBS num lote representativo de pó a granel quando armazenado a -20°C durante 24 meses. T é para tempo em meses. T=0 ou T0 representa resultados analíticos executados na conclusão da fabricação. A análise subsequente indicada é relativa à análise inicial do fármaco em pó ou formulação (por exemplo, T1 = um mês a partir da data de fabricação). Método analítico que emprega CAD (Detector de Aerossol Carregado) foi usado para medir o nível de pureza de mCBS e suas impurezas e expressa como CAD%. TABELA 2B T0 T1 T3 T6 T9 T12 T18 T24 mCBS 98,56% 98,45% 98,28% 98,22% 97,77% 98,00% 97,94% 98,26% de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD CBS* 0,23% 0,25% 0,28% 0,32% 0,36% 0,36% 0,36% 0,29% de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD de CAD *-calculado como a soma dos anômeros α e β.

[0292] A Tabela 2c compara os níveis de mCBS vs CBS numa batelada representativa de formulação de material de teste clínico a pH 7,5 tamponada com fosfato quando armazenada a 2 a 8°C por mais de 18 meses. TABELA 2C T0 T2 T3 T7 T10 T13 T19 mCBS 98,33 98,39 98,37 98,54 98,47 98,44 98,78 % de % de % de % de % de % de % de

CAD CAD CAD CAD CAD CAD CAD CBS* 0,25 % 0,03 % 0,07 % 0,03 % 0,04 % 0,04 % <0,03 de de de de de de % de CAD CAD CAD CAD CAD CAD CAD† *-calculado como a soma dos anômeros α e β, †- Abaixo do limite de detecção

[0293] As tabelas acima 2b e 2c mostram o nível de mCBS e CBS no pó ou solução após armazenamento em várias condições por 18 a 24 meses. CBS aparece como uma impureza de baixo nível nestas preparações. Os resultados mostram que CBS parece ser estável em pó quando armazenado a -20°C visto que o nível não parece alterar significativamente ao longo do tempo. Entretanto, em solução aquosa tamponada, CBS é altamente instável com o nível reduzido a 0,03 CAD% (isto é, limites de detecção) dentro de 3 a 6 meses de armazenamento a 2 a 8°C. Em contrapartida, os níveis de mCBS não aprecem variar significativamente ao longo do tempo e parece mostrar alta estabilidade quando armazenado em pó ou solução.

[0294] A análise por HPLC após 28 dias (Tabela 3) de mCBS em várias formulações de tampão foi também executada. mCBS parece variar em apenas -/+ ~2% de nominal após 28 dias em tampão fosfato ou citrato mesmo em condição acelerada 25±2°C/60%RH e 40±2°C/75%RH, indicando boa estabilidade. TABELA 2C Tabela 3: Resultados de análise por HPLC Sistema de Concentração Quantidade de % tampão e condição Dia indicada de amostra Detectado de estabilidade* mCBS.Na (mg/ml) analisada (µl) (n=3) Tampão de fosfato 97,53 ± 28 80 50 (40°C) 2,42 Tampão de fosfato 98,68 ± 28 80 50 (25°C) 3,69 Tampão de citrato 101,25 ± 28 80 50 (40°C) 3,18 Tampão de citrato 102,53 ± 28 80 50 (25°C) 3,57 Tampão de 28 80 acetato (40°C) 50 -* Tampão de 28 80 acetato (25°C) -*: Não feito;. 25°C e 40°C denota 25±2°C/60% de RH e/ou 40±2°C/75% de RH (respectivamente) Estudos pré-clínicos em animais de perfil de toxicidade e farmacocinética de compostos de sulfato de β-O-metil celobiosídeo

[0295] Os Exemplos de trabalho a seguir 3 a 10 representam estudos pré-clínicos exemplificativos em animais conduzidos pelos inventores do perfil de toxicidade e farmacocinética (PK) de compostos de sulfato de β-O- metil celobiosídeo usados na presente invenção. Exemplo 3: Composto de mCBS•Na empregado em estudos em animais

[0296] Este exemplo demonstra propriedades do composto de sulfato de β-O-metil celobiosídeo de sódio (mCBS·Na) empregado nos estudos de toxicidade e PK subsequentemente descritos conduzidos em animais.

[0297] Os estudos de STX descritos abaixo foram executados, inter alia, para fornecer um entendimento preliminar do perfil de toxicidade e PK de compostos de sulfato de β-O-metil celobiosídeo, tal como mCBS·Na utilizado na presente invenção. Estes estudos foram executados usando o mesmo lote de composto, cujas propriedades são resumidas na Tabela 4 abaixo. Tabela 4: Propriedades de composto de mCBS·Na usado em estudos de toxicidade e PK em animais Sulfato de β-O-Metil celobiosídeo de sódio Nome: (mCBS·Na) Peso molecular 1070,6 daltons Fórmula molecular C13 H17 Na7 O32 S7 Pureza >96% Descrição Condições de 2 a 8°C (pó) armazenamento Solubilidade em ~ 250 mg/ml em água/aquoso Veículo

Estabilidade em As formulações de item de teste foram descartadas Veículo após o uso.

Exemplo 4: Dose e concentrações de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo

[0298] Em geral, o sal de sódio de mCBS foi usado nos estudos em animais de toxicidade e PK descritos no presente documento. Deve ser observado, entretanto, que a medição bioanalítica representada no presente documento detectou e relatou a forma de base livre de mCBS. Consequentemente, para clareza, dose/concentrações também foram relatadas no presente documento como a base livre para tornar clara a relação com os resultados bioanalíticos. As doses de base livre de mCBS foram derivadas por correção para teor de sódio (com base na razão de MW entre base livre e forma de sal) e pureza do Item de Teste. Entretanto, nenhuma dose(isto é, sal de sódio ou base livre) considerou a potência do composto na batelada. EXEMPLO 5: POTÊNCIA DE sulfato de β-O-METIL

CELOBIOSÍDEO

[0299] Conforme mencionado acima, as doses relatadas administradas aos animais ou concentrações de mCBS não foram corrigidas para potência (isto é, teor de água e outras impurezas) visto que a análise de potência do sal de sódio de mCBS (isto é, mCBS·Na) na batelada usada não foi determinada durante o tempo em que os estudos estavam sendo executados. Análise subsequente da batelada usada nestes estudos mostrou, então, que a potência do sal de sódio foi ~74,5%. É muito provável que a dose real usada nestes exemplos de trabalho fosse menor do que aquela indicada. EXEMPLO 6: TOXICIDADE DE mCBS APÓS ADMINISTRAÇÃO

INTRAVENOSA A RATOS SPRAGUE DAWLEY

[0300] Este exemplo demonstra uma avaliação da toxicidade aguda de mCBS após administração intravenosa de uma dose em bolus única a ratos Sprague Dawley num estudo de Determinação de Faixa de Dose (DRF)

de uma semana, assim como avaliação da toxicidade de mCBS após administração intravenosa diária de uma dose em bolus a ratos Sprague Dawley por sete dias.

[0301] Estes estudos originalmente examinaram a dose de mCBS·Na e mCBS como base livre. A partir da avaliação de potência, é provável que a estimativa de Dose Máxima Tolerada (MTD) fosse ~ 745 mg/kg de sal de sódio de mCBS ou ~600 mg/kg de base livre de mCBS. Avaliação da toxicidade aguda de sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) após administração intravenosa de uma dose em bolus única a ratos Sprague Dawley num estudo de Determinação de Faixa de Dose (DRF) de uma semana.

[0302] Este estudo examinou a toxicidade aguda de administração IV única de mCBS em ratos com doses até 1000 mg/kg.

[0303] A toxicidade aguda de sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) foi avaliada em ratos Sprague Dawley após administração intravenosa de uma dose em bolus única. Um total de cinco grupos de n=3 ratos fêmeas adultos foram tratados com doses de 10, 30, 100, 300 e 1000 mg/kg de item de teste de mCBS na forma do sal de sódio (mCBS·Na) neste estudo de determinação de faixa de dose. Com correção para pureza e teor de sódio, estes níveis de dose corresponderam a aproximadamente 8,2, 24,5, 81,5, 244,5 e 815 mg/kg da base livre de mCBS. Os ratos foram, então, observados por 7 dias antes da terminação sem necrópsia. Os tratamentos de item de teste de mCBS foram bem tolerados em todos os níveis de dose, até e incluindo a dose de 1000 mg/kg. Não houve conclusões consideradas como estando relacionadas ao tratamento.

[0304] Portanto, a Dose Máxima Tolerada (MTD) ou a dose aguda tolerada para mCBS·Na deste estudo foi identificada como 1000 mg/kg que corresponde a 815 mg/kg de base livre de mCBS. Nenhuma conclusão anormal ou alteração em pesos corporais (em comparação com animais de controle) foi observada.

Avaliação da toxicidade de sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) após administração intravenosa diária de uma dose em bolus a ratos Sprague Dawley por sete dias.

[0305] Este estudo examinou a toxicidade de administração IV repetida de mCBS em ratos durante 7 dias com doses até 1000 mg/kg.

[0306] A tolerabilidade aguda e a toxicidade de sulfato de β-O- metil celobiosídeo foram avaliadas em ratos Sprague Dawley após administração de dose intravenosa diária por um período de sete dias. Um total de quatro grupos de n=3 ratos fêmeas adultos foram tratados com doses de 0, 100, 300 e 1000 mg/kg de mCBS na forma do sal de sódio (mCBS·Na) neste estudo de dose repetida. Com correção para pureza e teor de sódio, estes níveis de dose correspondem a aproximadamente 81,5, 244,5 e 815 mg/kg da base livre de mCBS. Os ratos foram, então, observados por 7 dias antes do término com necropsia bruta e análises de hematologia e bioquímica terminais. Um grupo adicional de n=3 ratos machos foi também tratado na dose mais alta de 1000 mg/kg de acordo com o mesmo projeto de estudo.

[0307] mCBS foi bem tolerado em todos os níveis de dose, até e incluindo a dose de 1000 mg/kg. Não houve conclusões adversas consideradas como estando relacionadas ao tratamento. Os parâmetros de hematologia e bioquímica em animais tratados foram normais. Os efeitos observados em necropsia bruta e patologia não foram considerados como estando relacionados ao tratamento.

[0308] Portanto, MTD neste estudo é identificado como 1000 mg/kg, que corresponde a 815 mg/kg de base livre de mCBS. EXEMPLO 7: FARMACOCINÉTICA DE mCBS APÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA A RATOS SPRAGUE DAWLEY

[0309] Este exemplo demonstra uma avaliação da farmacocinética (PK) de mCBS administrado por via intravenosa a ratos Sprague Dawley.

[0310] Os estudos a seguir documentam as doses de mCBS relatadas tanto como o sal de sódio quanto a base livre de mCBS. O anterior é considerado importante especialmente em relação aos níveis plasmáticos medidos de mCBS (base livre) até a dose administrada e para determinar o parâmetro de PK de fase terminal, tal como liberação (Cl) e volume de distribuição (Vz). O estudo STX-09 documenta a concentração plasmática de mCBS durante 5 horas de infusão contínua em ratos a ~25 e 50 mg/kg/h. Um estudo farmacocinético de sulfato de β-O-metil celobiosídeo administrado via a rota intravenosa a ratos Sprague Dawley

[0311] Este estudo examina o perfil de PK de administração IV em bolus (20 mg/kg) de mCBS em ratos Sprague Dawley e demonstra que a maior parte do composto é rapidamente excretada com mais de 90% da dose administrada sendo removidos do compartimento central nas primeiras 4 horas e a dose administrada de mCBS restante lentamente é removida durante um período de tempo mais longo. O grande volume de distribuição indica que o composto de mCBS é rapidamente movido do compartimento central aos tecidos.

[0312] A farmacocinética de sulfato de β-O-metil celobiosídeo (mCBS) foi avaliada em ratos Sprague Dawley após administração intravenosa de uma dose em bolus de 20 mg/kg como sal de sódio de mCBS na forma do sal de heptassódio (mCBS·Na) (ou 16,3 mg/kg da base livre após ajuste ao teor de sódio e pureza).

[0313] Considerando-se a potência, a dose administrada aos ratos estimada foi provavelmente 14,9 mg/kg e 12,65 mg/kg do sal de sódio e base livre, respectivamente. Visto que a dose de base livre de mCBS corrigida foi aproximadamente 20% mais baixa, isto efetivamente reduziu os valores de liberação calculada (Cl) e volume de distribuição (Vz) por uma proporção similar.

[0314] Um total de dez amostras de sangue foram coletadas de três ratos em pontos no tempo na faixa de pré-dose a 48 horas pós-dose. As amostras de sangue resultantes foram processadas para plasma e subsequentemente analisadas acerca da concentração de mCBS (base livre)

usando um método baseado em LC-MS/MS. Os dados de concentração plasmática versus tempo foram usados para cálculo de parâmetros farmacocinéticos.

[0315] O valor médio (±SEM) para a concentração de mCBS em tempo zero (C0) foi 73400 (±8560) ng/ml. Os valores médios (±SEM) para a área sob a curva a partir do tempo zero até o último ponto no tempo medido (AUCúltimo,) e até infinito (AUCinf) foram 34300 (±2460) ng.h/ml e 35000 (±2940) ng.h/ml, respectivamente. O valor médio (±SEM) para a meia-vida de eliminação evidente (T1/2) foi 77,5 (±54,5) h, mas o valor médio (±SEM) para o tempo de permanência médio (MRT) foi relativamente curto a 5,58 (±3,99) h. O valor médio (±SEM) para o volume de distribuição (Vz) foi alto e 46,9 (±30,7) l/kg, enquanto o valor médio (±SEM) para a liberação corporal total (Cl) foi baixo a 0,472 (±0,0377) l/h/kg. A alta variabilidade entre sujeitos para T1/2 (122% CV), Vz (113% CV) e MRT (124% CV) mais provavelmente resultou da caracterização incompleta da porção de eliminação terminal da curva de concentração linear logarítmica versus tempo. Um estudo farmacocinético de mCBS administrado via a rota intravenosa a ratos Sprague Dawley

[0316] Este estudo examinou a PK de mCBS após administração IV em bolus (100 mg/kg) em ratos Sprague Dawley.

[0317] A farmacocinética de mCBS foi avaliada em ratos Sprague Dawley após administração intravenosa de uma dose de 100 mg/kg em bolus de mCBS na forma do sal de sódio (ou 81,5 mg/kg da base livre – após correção para o teor de sódio e pureza) a um grupo de 6 ratos.

[0318] Considerando-se a potência, a dose administrada aos ratos foi estimada como sendo 74,5 mg/kg e 63,25 mg/kg do sal de sódio e base livre, respectivamente. Visto que a dose de base livre de mCBS corrigida foi aproximadamente 20% mais baixa, isto efetivamente reduziu os valores de liberação calculada (Cl) e volume de distribuição (Vz) por uma proporção similar.

[0319] Um total de nove amostras de sangue foram coletadas de cada rato em pontos no tempo na faixa de pré-dose a 192 horas pós-dose. Amostras de urina foram também coletadas durante as primeiras 48 horas. As amostras de sangue resultantes foram processadas para plasma. As amostras de urina e plasma foram subsequentemente analisadas acerca da concentração de mCBS (base livre) usando métodos baseados em LC-MS/MS.

[0320] As estimativas de parâmetro farmacocinético de plasma para mCBS foram derivadas dos dados de concentração média agrupada versus tempo. A concentração em tempo zero (C0) foi 308000 ng/ml. A área sob a curva a partir do tempo zero até o tempo da última concentração medida (AUCúltimo) e quando extrapolado até infinito (AUCinf) foi 135000 ng.h/ml. A meia-vida de eliminação terminal evidente (T1/2) foi 56,1 h, em contrapartida ao tempo de permanência médio (MRT) de 1,43 h. O composto mostrou um volume de distribuição relativamente alto (Vz) de 49,0 l/kg enquanto a liberação corporal terminal (Cl) foi relativamente baixa a 0,605 l/h/kg.

[0321] As estimativas de equilíbrio farmacocinético de massa urinárias para base livre de mCBS foram derivadas dos dados de quantidade de urina excretada. Os valores médios (±SEM) para porcentagem de dose total de mCBS excretado nos intervalos de coleta pós-dosagem de 0 a 4 h, 0 a 24 h e 0 a 48 h foram 52,0 (±5,0) %, 65,0 (±7,0) % e 69,2 (±10,8) %, respectivamente. A excreção urinária é identificada como uma rota principal para eliminação do composto nas primeiras 48 horas após a administração.

[0322] O estudo confirmou que mCBS é rapidamente eliminado do compartimento central imediatamente após a administração e absorvido pelos tecidos conforme mostrado pelo grande volume de distribuição. A meia-vida de distribuição do composto (que é um determinante principal de eliminação) foi estimada como sendo 0,65 h. A amostragem múltipla da fase terminal melhorou a caracterização de meia-vida de eliminação terminal que foi calculada como sendo ~56 h. Um estudo farmacocinético em ratos Sprague Dawley com mCBS administrado por Infusão intravenosa

[0323] Este estudo examinou a concentração plasmática de mCBS durante 5 horas de infusão contínua em ratos a ~25 e 50 mg/kg/h.

[0324] A farmacocinética (PK) de mCBS foi estudada após administração intravenosa como uma infusão durante um período de 5 horas a ratos Sprague Dawley machos. Neste estudo, a farmacocinética do composto de mCBS foi investigada após infusão intravenosa. O composto foi formulado usando solução de Hartman e administrado a um grupo de n=3 ratos na taxa de 25,3 mg/kg/h (dose total: 126,5 mg/kg; Grupo 1) e a um segundo grupo de n=3 ratos na taxa de 50,6 mg/kg/h (dose total: 253 mg/kg; Grupo 2).

[0325] Neste estudo, a dose nominal de sal de sódio de mCBS usado para infusão contínua durante 5 horas foi 40 e 80 mg/kg/h (ou 34 e 68 mg/kg/h, respectivamente, como a base livre).

[0326] Um total de seis amostras PK de sangue foram coletadas de cada rato em pontos no tempo na faixa de pré-dose a 5 horas após o início da infusão. As amostras de sangue resultantes foram processadas para plasma e subsequentemente analisadas acerca da concentração de mCBS usando um método baseado em LC-MS/MS. O software Phoenix 64 WinNonlin® foi usado para estimar os valores de área sob curva de concentração versus tempo (AUC) durante o intervalo de infusão de 0 a 5 h. Os valores para concentração em estado de equilíbrio (Css) e equilíbrio (Cl) também foram estimados.

[0327] As concentrações de mCBS estavam abaixo do limite inferior de quantificação do ensaio em amostras de plasma coletadas antes da administração de dose e as concentrações foram quantificáveis em todas as amostras de plasma coletadas de 30 min a 5 horas após a dose. Valores de AUC médios (±SEM) para o intervalo de infusão de 0 a 5 h foram 260000 (±30200) ng.h/ml e 532000 (±25500) ng.h/ml para os Grupos 1 e Grupo 2, respectivamente. Os valores médios (±SEM) de Css e Cl para Grupo 1 foram 58400 (±6920) ng/ml e 0,601 (±0,081) l/h/kg para o Grupo 1, enquanto os valores médios (±SEM) de Css e Cl para o Grupo 2 foram 120000 (±5560)

ng/ml e 0,571 (±0,025).

[0328] Estes resultados demonstram que mCBS atingiu nível plasmático em estado de equilíbrio (Css) após 2 h de infusão. Tanto Css quanto AUC nos ratos tratados com 50 mg/kg/h são 2 vezes mais altos em comparação com os ratos tratados com 25 mh/kg/h, indicando que a exposição sistêmica é proporcional à dose usada no estudo. Os testes de coagulação mostraram que os ratos tratados com dose mais alta de mCBS tiveram pontuação de APTT mais alta em comparação com a faixa de referência, indicando que a presença de mCBS nesta dose aumenta o tempo de coagulação. EXEMPLO 8: INVESTIGAÇÃO IN VITRO DE LIGAÇÃO DE mCBS

A PROTEÍNAS PLASMÁTICAS PLASMA E METABOLISMO EM SERES HUMANOS, CÃES E RATOS

[0329] Este exemplo demonstra estudos in vitro executados para observar o metabolismo e a ligação de proteína plasmática de mCBS. Especificamente, este estudo observou o metabolismo de mCBS em microssomas de fígado de ser humano, cão e rato e concluiu que nenhum metabolismo de mCBS foi detectado. O estudo também observou a ligação de mCBS a proteínas plasmáticas de ser humano, rato e cão usando técnica de ultrafiltração e concluiu que houve cerca de 20% de ligação a proteínas plasmáticas em todas as espécies testadas. Metabolismo in vitro de sulfato de β-O-Metil celobiosídeo em microssomas de fígado de ser humano, cão e rato

[0330] Em resumo, este estudo foi uma investigação in vitro projetada para observar o metabolismo de Fase I e Fase II de mCBS por microssomas de fígado de ser humano, cão e rato. Os testes indicam que nenhum metabolismo de mCBS foi detectado. (I) METABOLISMO DE FASE I DE SULFATO DE β-O-METIL CELOBIOSÍDEO EM MICROSSOMAS DE FÍGADO DE SER HUMANO, RATO

E CÃO

[0331] Uma concentração de estoque de mCBS 25 µM dissolvida em 50% de metanol em água foi adicionada aos tubos de reação (10 µl). A mistura de reação (volume final de 250 µl) compreende o seguinte: Tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), 2'-fosfato de dinucleotídeo de β-nicotinamida e adenina (NADPH) (1 mM) e microssomas de fígado de ser humano, rato ou cão agrupados (0,3 mg/ml). A reação foi iniciada adicionando-se NADPH após um período de pré-incubação de 5 min e incubada a 37°C num banho-maria sob agitação antes de interrupção com 500 µl de acetonitrila gelada. As amostras foram, então, misturadas em vórtice e centrifugadas por 10 min a 14000 rpm. Metade das amostras (375 µI) foi transferida para tubos de vidro e evaporada sob uma corrente de nitrogênio e a 37°C. As amostras foram, então, reconstituídas em fase móvel A (250 µl). A concentração final de mCBS foi 1 µM no meio de incubação.

[0332] As misturas de reação foram incubadas por 1 hora com amostragem em triplicata nos pontos no tempo de 0, 15, 30, 45 e 60 min. Um controle negativo (sem NADPH) foi usado em paralelo com as amostras de estudo. Um controle positivo; midazolam, 25 µM (10 µl) foi incubado na mesma condição por 1 h. A concentração final de midazolam foi 1 µM no meio de incubação. TABELA 5: SUMÁRIO DE CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO DE

REAÇÃO DE MICROSSOMA Estabilidade Metabólica Estabilidade Metabólica de Fase I de Fase II Concentrações de 1 µM 100 µM substrato Volume de incubação 250 µl 250 µl Tampão fosfato 100 mM Tampão fosfato 100 mM Meio de incubação pH 7,4 pH 7,4

Tempo total de incubação 1h 2h Concentrações de proteína de microssoma 0,3 mg/ml 0,3 mg/ml do fígado Concentrações de cofator 1 mM (NADPH) 5 mM (UDPGA) Reação de bloqueio 500 µl de acetonitrila 500 µl de acetonitrila fria (II) BIOANÁLISE: CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA mCBS

[0333] Uma mistura de soluções de estoque de mCBS (30 µg/ml- como base livre) e midazolam (10 µg/ml) em 50% de metanol em água foram diluídos a 25, 20, 12,5, 6,25, 2,5, 1,25, 0,25 e 0,125 µg/ml para mCBS, e 8333, 6667, 4167, 2083, 833, 417, 83,3, 41,7 ng/ml usando 50% de metanol em água, e alíquotas das soluções padrão para trabalho (10 µl) foram adicionadas a tubos plásticos. Em seguida, alíquotas (190 µl) de tampão fosfato (100 mM, pH 7,4) e soluções de microssoma em tampão fosfato (100 mM, pH 7,4) (50 µl) foram adicionadas aos tubos, seguidas por alíquotas de 500 µl de acetonitrila. Os tubos foram misturados em vórtice e centrifugados por 10 min a 14000 rpm. As alíquotas de sobrenadante (375 µl) foram evaporadas sob uma corrente de nitrogênio e reconstituídas em fase móvel A (250 µl) e injetadas diretamente no sistema de LC-MS/MS (10 µl). (III) METABOLISMO DE FASE II DE mCBS EM MICROSSOMAS DE FÍGADO DE SER HUMANO, RATO E CÃO

[0334] As concentrações de estoque de 1 mg/ml de mCBS dissolvido em metanol (50 µl) foram evaporadas até secar no tubo de reação e ressuspensas na mistura de reação a uma concentração final de 100 µM. As misturas (volume final de 250 µl) compreendem o seguinte: Tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), MgCl2 (1 mM), ácido uridina 5'-difosfoglucurônico (UDPGA) (5 mM), microssomas de fígado (0,3 mg/ml) e alameticina (25 µg/mg de proteína). As misturas reação foram iniciadas adicionando-se UDPGA após um período de pré-incubação de 5 min e incubada a 37°C num banho-maria sob agitação antes de interrupção com acetonitrila gelada (500 µl). As amostras foram, então, misturadas em vórtice e centrifugadas por 5 min a 14000 rpm.

[0335] As misturas de reação foram incubadas por 2 horas em microssomas de fígado (n=3). Um controle negativo (sem UDPGA) e um controle positivo (paracetamol 100 µM) foram incubados juntamente com as amostras de estudo. (IV) CONDIÇÕES DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0336] Os parâmetros de LC-MS/MS usados para a análise de mCBS e midazolam são resumidos na Tabela 6. TABELA 6: CONDIÇÕES DE HPLC E ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA ANALITOS DE INTERESSE.

HPLC Temperatura do 4°C Autoamostrador Coluna X-Terra MS C18 5 µm 2,1 x 150 mm Temperatura Mistral 40°C (Forno de coluna) Fase móvel A 80% de acetato de amônio 10 nM. pH=5 / 20% de Acetonitrila / 0,1% de Hexilamina / 0,1% de Hexafluoro-2-propranolol Fase móvel B 80% de acetonitrila em água Solvente de lavagem 1 0,2% de ácido fórmico em água (R2) Solvente de lavagem 2 20% de acetonitrila em água (R0)

Gradiente Tempo (min) Fluxo de Fração de bomba bomba B% 01:00 0,4 0 02:00 0,4 50 02:30 0,4 50 02:36 0,4 0 04:00 0,4 0 MS/MS Analito Massa de Q3 Tempo de DP CE CXP Q1 Massa perma- nência Sulfato de β- 709,7 256,9 150 -95,00 -88,00 -17,00 O-Metil celobiosídeo (base livre) Midazolam 325,8 291,1 150 136,0 39,00 22,00 (V) RESULTADOS

[0337] A estabilidade metabólica de mCBS na presença de microssomas de fígado de ser humano, rato e cão em condições permissivas ao metabolismo de fase I é mostrada nas Figuras 2 a 4. Os resultados demonstram que não houve metabolismo significativo do composto de teste sob estas condições. A Figura 2 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado humano conforme mostrado pela medida (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado humano sob condições permissivas para metabolismo de fase I. A Figura 3 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado de rato conforme mostrado pela medida (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado de rato sob condições permissivas para metabolismo de fase I. A Figura 4 é uma representação gráfica que demonstra a estabilidade metabólica de mCBS em microssomas de fígado de cão conforme mostrado pela medida (média ± SEM) da concentração (em µM) de mCBS na presença de microssomas de fígado de cão sob condições permissivas para metabolismo de fase I. (VI) METABOLISMO DE FASE II

[0338] Não há íons correspondentes ao metabólito de ácido glicurônico de mCBS detectados em amostras de reações após incubação do composto com microssomas de fígado de ser humano, rato e cão sob condições permissivas para metabolismo de fase II. A formação de glicuronídeo de paracetamol no meio de incubação foi confirmada tanto por perda neutra quanto por varredura MRM.

[0339] Neste estudo in vitro, o metabolismo de mCBS foi avaliado medindo-se as alterações dos níveis de forma de base livre no meio de reação.

[0340] Sob condições permissivas para metabolismo de fase I, não houve diminuição em concentração de mCBS após incubação por 1 h com microssomas de fígado das três espécies avaliadas. Sob as mesmas condições, o composto de controle positivo midazolam foi quase completamente metabolizado na presença de microssomos para as três espécies.

[0341] Nota-se que a concentração de mCBS foi menor que 0,6 µM no tempo zero na reação com os microssomas de fígado humano (enquanto a concentração adicionada foi 1 µM). Uma observação similar foi notada nas amostras de controle negativo contendo microssoma de fígado e nenhum NADPH, mas não nas amostras de controle negativo contendo NADPH e nenhum microssoma. Os microssomas de fígado são tecidos complexos contendo misturas de proteínas, fosfolipídios e ácidos graxos. Os componentes dos tecidos de microssomas de fígado podem afetar a ionização de espectrômetro de massa e suprimir o sinal. Como os componentes dos microssomas de fígado variam entre espécies, a supressão de íon pode ser mais forte em microssomas humanos e resultar numa diminuição evidente em concentração de composto que é independente do tempo e da presença de NADPH.

[0342] Em resumo, metabolismo de fase I nulo/mínimo do item de teste foi detectado em reações microssômicas com microssomas de ser humano, rato e cão. No segundo estudo de metabolismo in vitro (fase II), o metabolismo de glicuronídeo também foi detectado após 2 horas de incubação com microssomas de fígado de cada espécie na presença de ácido uridina 5'- difosfoglicurônico (UDPGA).

[0343] Sem se ater a qualquer teoria ou modo de ação específico, os depositantes especularam que a falta de mCBS de metabolismo in vitro extensivo pode ser explicada pela presença de sete grupos sulfato (S03) que impedem o acesso de enzimas à molécula. Entretanto, os resultados não podem excluir a possibilidade de dessulfação in vivo seguida por metabolismo de fase I ou II. Investigação de ligação de mCBS a proteínas plasmáticas de ser humano, rato e cão usando técnica de ultrafiltração

[0344] Em resumo, este estudo foi um estudo in vitro projetado para observar a ligação de mCBS a proteínas plasmáticas de rato, cão e ser humano. Os resultados obtidos indicam que houve cerca de 20% de ligação às proteínas plasmáticas em todas as espécies testadas.

[0345] No estudo descrito aqui, o método existente foi modificado para incluir o uso de mCBS deuterado (mCBS-d3) como o padrão interno. Este método bioanalítico foi usado para avaliar a ligação de proteína plasmática de mCBS com plasma de rato, cão e ser humano.

[0346] A ligação de proteína foi avaliada por um método de ultrafiltração usando dispositivos de ultrafiltração Centrifree® com um ponto de corte de peso molecular de 30000 dalton. Em resumo, concentrações conhecidas de mCBS (como base livre) foram adicionadas a amostras de plasma de ser humano, rato e cão e incubadas por 20 min a 37°C. As amostras foram, então, submetidas a ultrafiltração para separar o fármaco ligado e não ligado à proteína. A extensão de ligação à proteína foi, então, definida como a diferença percentual entre a concentração total e não ligada do fármaco (com subtração de ligação não específica ao dispositivo de ultrafiltração na presença de tampão fosfato apenas).

[0347] Os reagentes usados são detalhados na Tabela 7 abaixo. Os parâmetros de LC-MS/MS usados para a análise de mCBS e mCBS-d3 são resumidos na Tabela 8. TABELA 7: DESCRIÇÃO DE REAGENTES USADOS PARA INVESTIGAR A LIGAÇÃO DE mCBS a proteínas plasmáticas de RATO, CÃO E SER HUMANO.

Item Descrição Sulfato de 0-metil TQ no 1829, Data de validade: 16 de abril de 2016, celobiosídeo de sódio Batelada no: IG-01-327 (3), Pureza:96% (mCBS·Na) Padrão interno: mCBS- TQ no 1886, Data de validade: 17 de novembro de d3 2020, Lote no: AML-Sra- 016i, Pureza: 90,1%, Pureza de isótopo: 99,5% Solução de estoque de Preparada dissolvendo-se mCBS em pó em 50% de mCBS (200 µg/ml) metanol em água e, adicionalmente, diluição em água para preparar uma solução com concentração de 200 µg/ml (com ajuste para o teor de sódio e % de pureza do analito).

Solução de estoque de Preparada dissolvendo-se mCBS-d3 em pó em 50%

mCBS-d3 (1 de metanol em água e, adicionalmente, diluição em µg/ml) água para preparar uma solução com concentração de 1 µg/ml (com ajuste para o % de pureza do analito).

Plasma de ser humano, Plasma de ser humano, rato e cão em branco rato e cão agrupado (Li-Hep como o anticoagulante), pH ajustado a 7,40 usando NaH2P04 Tampão de fosfato 2,50 mM; pH 7,40 Dispositivos de Millipore Item nº 4104 - 30000 NMWL Ultrafiltração Centrifree® (I) PARÂMETROS DE MÉTODO ANALÍTICO TABELA 8: CONDIÇÕES DE HPLC E ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA ANALITOS DE INTERESSE.

Analito Massa de Q3 Tempo DP CE CXP Q1 Massa de perma- nência mCBS 709,7 256,9 150 -75,00 -74,00 -19,00 mCBS-d3 711,2 258,5 150 -75,00 -74,00 -16,00

HLPC Temperatura de 4°C autoamostras Coluna X-Terra MS C18 5 µm 2,1 x 150 mm Temperatura Mistral 40°C (Forno de coluna)

Fase móvel A 80% de acetato de amônio 10 nM, pH=5 / 20% de Acetonitrila / 0,1% de Heilamina / 0,1% de Hexafluoro-2-propranolol

Fase móvel B 80% de acetonitrila em água

Solvente de lavagem (S1) 20% de acetonitrila em água

Tabela de parâmetros mCBS mCBS-d3

CUR 35,00 35,00

CAD Meio Meio

IS -2000 -2000

TEM 450 450

GS1 60,00 60,00

GS2 60,00 60,00

EP -10,0 -10,0

Solvente de lavagem 1 20% de acetonitrila em água (S1) Solvente de lavagem 2 50% de acetonitrila em água (S2) Solvente de lavagem 3 0,1% de ácido fórmico em 50% de metanol (S3) Gradiente Tempo (min) Fluxo de Fração de bomba bomba B% 01:00 0,45 0 02:30 0,45 50 02:50 0,45 50 03:00 0,45 0 04:30 0,45 0

Parâmetros de MS/MS: Q1 — primeiro filtro de massa; Q3 — analisador de massa; Tempo de permanência - quantidade de instrumento de lima gasta em cada transição; DP: potencial de desaglomeração; EP: potencial de entrada; CE: energia de colisão. CXP: potencial de saída de célula de colisão para íons de produto (II) PREPARAÇÕES DE AMOSTRA

[0348] Soluções de estoque de mCBS (10 µl) foram adicionadas às soluções de cada matriz de teste (490 µl) conforme listado abaixo na Tabela 9 para ter uma concentração final de 200 ng/ml e 2000 ng/ml. TABELA 9: Tabela 9: amostras com adição de mCBS DE CADA

MATRIZ DE TESTE Concentração de mCBS nas Concentração final de Matriz soluções de estoque mCBS (ng/ml) adicionadas à matriz (µg/ml) Tampão de fosfato 10 200 Tampão de fosfato 100 2000 Plasma (ser humano, 10 200 rato, cão) Plasma (ser humano, 100 2000 rato, cão)

[0349] As amostras adicionadas foram, então, incubadas a 37°C por 20 minutos num banho-maria. As alíquotas das amostras de cada grupo de teste (500 µl) foram transferidas para os dispositivos de ultrafiltração (n=3) e centrifugadas por 20 minutos a 1000 g. Após a centrifugação, as alíquotas dos ultrafiltrados (50 µl) foram transferidas para tubos de teste separados para extração, juntamente com alíquotas duplicadas das amostras antes da ultrafiltração de cada grupo de teste.

(III) PREPARAÇÃO DE CURVA DE CALIBRAÇÃO

[0350] Alíquotas de solução de padrão de mCBS a 200 µg/ml foram diluídas conforme mostrado abaixo. ID de Padrão I Conc. Detalhes de Preparação Padrão A 200 µg/ml Padrão B 100 µg/ml Mistura 500 ul de A + 500 µl de água Padrão C 75 µg/ml Mistura 750 ul de B + 250 µl de água Padrão D 50 µg/ml Mistura 600 ul de C + 300 µl de água Padrão E 25 µg/ml Mistura 500 ul de D + 500 µl de água Padrão F 10 µg/ml Mistura 400 ul de E + 600 µl de água Padrão G 5 µg/ml Mistura 500 ul de F + 500 µl de água

[0351] As alíquotas das soluções padrão resultantes (10 µl) foram, então, adicionadas a 490 µl de cada uma das matrizes relevantes (plasma de ser humano, rato e cão e tampão fosfato 2,5 mM, pH=7,4) e bem misturadas. (IV) EXTRAÇÃO

[0352] As alíquotas dos padrões e amostras adicionados (50 µl) (após incubação e ultrafiltração) foram misturadas com 50 µl de solução padrão interna 1 µg/ml. Acetonitrila (150 µl) foi adicionada e as amostras submetidas a vórtice imediatamente. As soluções de sobrenadante foram transferidas para tubos de vidro e evaporadas a 37°C sob uma corrente de ar. As amostras secas, então, foram reconstituídas em 150 µl de fase móvel A.'

[0353] Para quantificação de amostras antes da ultrafiltração, as amostras foram analisadas contra uma curva padrão recém-preparada em plasma. As amostras com pouca proteína coletadas após ultrafiltração foram quantificadas contra a curva de calibração recém-preparada em tampão fosfato 2,5 mM, pH=7,4. Para estimativa de ligação não específica, tanto antes quanto depois da ultrafiltração, as amostras foram quantificadas contra curvas de calibração em tampão fosfato. (V) RESULTADOS: LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA

[0354] A ligação não específica aos dispositivos de ultrafiltração foi estimada a 0,5% e -1,97% a 200 e 2000 ng/ml, respectivamente (Tabela 10 abaixo). A ligação do composto ao dispositivo de ultrafiltração foi, portanto, considerada como sendo desprezível. TABELA 10: LIGAÇÃO NÃO ESPECÍFICA DE mCBS AO

DISPOSITIVO DE ULTRAFILTRAÇÃO Matriz: Tampão fosfato pH 7,4 Concentrações de mCBS 200 ng/ml Pré- 200 ng/ml Pós- 2000 ng/ml Pré- 2000 ng/ml Pós- Réplica filtro filtro filtro filtro 1 195 207 2090 1860 2 209 194 1970 2190 3 202 2160 Média 202 201 2030 2070 Cálculos: Ligação não específica 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂çã𝒐 𝒑ó𝒔−𝒇𝒊𝒍𝒕𝒓𝒂çã𝒐 Ligação não específica (NSB %): 𝟏𝟎𝟎 − [ 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝐩𝐫é−𝐟𝐢𝐥𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝒙 𝟏𝟎𝟎] 201 200 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 0,50% 202 2070 2000 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] -1,97% 2030 (VI) LIGAÇÃO DE PROTEÍNA PLASMÁTICA

[0355] A ligação de proteína plasmática foi calculada por comparação da concentração de mCBS adicionado ao plasma de ser humano,

rato e cão antes e depois da filtração.

A extensão de ligação foi similar para todas as três espécies na faixa de 16 a 23%. (consulte as Tabelas 11 a 13 abaixo). A ligação de proteína plasmática de mCBS foi similar em ambas as concentrações testadas.

TABELA 11: Ligação de mCBS A PLASMA HUMANO

Matriz: Plasma humano

Concentrações de mCBS

200 ng/ml Pré- 200 ng/ml Pós- 2000 ng/ml Pré- 2000 ng/ml Pós- Réplica filtro filtro filtro filtro 1 213 169 2070 1770 2 217 181 2190 1860

3 150 1750

Média 215 167 2130 1793

Cálculos: Ligação de proteína plasmática 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂çã𝒐 𝒑ó𝒔−𝒇𝒊𝒍𝒕𝒓𝒂çã𝒐 Ligação de proteína plasmática (%): 𝟏𝟎𝟎 − [ 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝐩𝐫é−𝐟𝐢𝐥𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝒙 𝟏𝟎𝟎]

167 200 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 22,5% 215 1793 2000 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 15,8% 2130

TABELA 12: ligação de mCBS A PLASMA DE RATO

Matriz: Plasma de rato Concentrações de mCBS 200 ng/ml 200 ng/ml Pós- 2000 ng/ml Pré- 2000 ng/ml Réplica Pré-filtro filtro filtro Pós-filtro

1 205 179 2090 1740

20 (2) 217 167 2180 1690

3 164 1710

Média 211 170 2135 1713

Cálculos: Ligação de proteína plasmática 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂çã𝒐 𝒑ó𝒔−𝒇𝒊𝒍𝒕𝒓𝒂çã𝒐 Ligação de proteína plasmática (%): 𝟏𝟎𝟎 − [ 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝐩𝐫é−𝐟𝐢𝐥𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝒙 𝟏𝟎𝟎]

170 200 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 19,4% 211 1713 2000 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 19,8% 2135

TABELA 13: ligação de mCBS A PLASMA DE CÃO

Matriz: Plasma de cão Concentrações de mCBS 200 ng/ml Pré- 200 ng/ml Pós- 2000 ng/ml Pré- 2000 ng/ml Réplica filtro filtro filtro Pós-filtro

1 225 186 2330 1900

20 (2) 0,25 (230) 194 2490 1970

3 169 1840

Média 228 183 2410 1903

Cálculos: Ligação de proteína plasmática 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂çã𝒐 𝒑ó𝒔−𝒇𝒊𝒍𝒕𝒓𝒂çã𝒐 Ligação de proteína plasmática (%): 𝟏𝟎𝟎 − [ 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝐩𝐫é−𝐟𝐢𝐥𝐭𝐫𝐚çã𝐨 𝒙 𝟏𝟎𝟎]

183 200 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 19,6% 228 1903 2000 ng/ml 100 − [ 𝑥 100] 21,0% 2410

[0356] Neste estudo, a ligação de mCBS a proteínas plasmáticas de ser humano, rato e cão foi aproximadamente 20%. A extensão de ligação foi similar a 200 e 2000 ng/ml e a ligação não específica ao dispositivo de ultrafiltração foi desprezível. EXEMPLO 9: INVESTIGAÇÃO IN VIVO DE DOSAGENS E TOXICIDADE DE mCBS APÓS INFUSÃO IV CONTÍNUA DURANTE UM

PERÍODO PROLONGADO DE SETE DIAS CONSECUTIVOS EM RATOS

[0357] Este exemplo representa estudos in vivo de faixas de dose e investigação de toxicidade de mCBS quando administrada via infusão IV a ratos Sprague-Dawley continuamente (24 horas/dia) durante um período de sete dias consecutivos. Este exemplo demonstra que, sob este regime de administração intensivo de mCBS em ratos, não houve níveis de efeito adverso observáveis para mCBS a uma dosagem de 1394 mg/kg/dia (base livre; após correção para potência e teor de sal) quando dada ao rato.

[0358] O objetivo destes estudos foi determinar a toxicidade do item de teste, mCBS, quando administrado por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) através de um cateter implantado cirurgicamente por 7 dias consecutivos a ratos Sprague-Dawley.

[0359] As formulações de dose de item de teste e controle de mCBS (na forma do sal de heptassódio mCBS·Na) foram administradas aos grupos de ratos por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) por 7 dias consecutivos conforme descrito na Tabela 14 abaixo. TABELA 14: FORMULAÇÕES DE DOSAGEM DE MCBS (NA FORMA DE SAL DE HEPTASSÓDIO mCBS·Na) ADMINISTRADAS A RATOS SPRAGUE-DAWLEY POR INFUSÃO INTRAVENOSA ATRAVÉS DE UM CATETER CIRURGICAMENTE IMPLANTADO POR 7 DIAS CONSECUTIVOS. Núme- Designa- Nível de Concen Nível de Concen- Taxa de Dura- Número de ro do ção de Dose tração Dose tração de infusão ção de Animais grupo Grupo (mg kg de Corrigido Dose (mlkgh) Infusão dia)** Dose (mg kg Corrigida (dias) Ma- Fê- (mg dia)*** (mgml)*** chos meas ml)** 1 Controle* 0 0 0 0 2,5 7 3 3 Baixa 2 1920 32 1394 23,2 2,5 7 3 3 dose Dose 3 3000 50 2178 36,3 2,5 7 3 3 média 4 Dose alta 4800 80 3484 58,1 2,5 7 3 3 Controle 5 0 0 0 0 4 7 3 3 2* Alta dose 6 7680 80 5575 58,1 4 7 3 3 2 *Os animais do Controle e do Controle 2 receberam 0,9% de NaCl para Injeção. USP apenas **Níveis e concentrações de dose não corrigidos para potência ***Níveis e concentrações de dose são expressos em termos de mCBS (base livre) após correção para potência e teor de sal com um fator de correção de 0,726.

[0360] Os parâmetros monitorados durante este estudo incluíram mortalidade, observações clínicas, pesos corporais e consumo de alimentos. Adicionalmente, parâmetros de hematologia, coagulação e química clínica foram avaliados no Dia 9. Amostras de sangue foram coletadas dos animais em pontos no tempo em relação ao início da infusão para análise de concentração de item de teste em plasma. No térmico (Dia 9), todos os animais sofreram eutanásia e foram submetidos a um exame de necrópsia bruta. Os pesos dos órgãos foram medidos em órgãos selecionados e uma lista selecionada de tecidos, incluindo lesões brutas, foi retida e preparada para avaliação microscópica.

[0361] A administração de mCBS·Na por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) através de um cateter cirurgicamente implantado por 7 dias consecutivos a ratos Sprague-Dawley resultou na morte de uma fêmea a 5575 mg/kg/dia de mCBS (base livre) após correção para potência e nível de sal.

[0362] Os dados de concentração plasmática versus tempo indicam que concentrações em estado de equilíbrio de mCBS foram mantidas durante o intervalo de infusão de 5 h a 96 h (ou 168 h). Os valores médios (±SEM) para AUC5-96 h e Css aumentaram linearmente com a dose.

[0363] Diminuições em ganho de peso corporal, correlacionadas a uma diminuição em consumo de alimentos, foram percebidas nos animais de ambos os sexos tratados com mCBS (base livre) a 5575 mg/kg/dia. Aumentos em linhagens de glóbulos brancos foram observados nos animais de ambos os sexos em doses ≥ 3484 mg/kg/dia, enquanto diminuições em contagens de glóbulos vermelhos, hematócritos, volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina corpuscular média assim como aumentos nos reticulócitos foram observados nos machos a 5575 mg/kg/dia. Aumentos em tempo de tromboplastina parcial ativada foram observados nos machos em doses ≥ 2178 mg/kg/dia e nas fêmeas em doses ≥ 3484 mg/kg/dia. Enzimas do fígado, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase, assim como colesterol e triglicerídeos, foram aumentados em machos em que receberam dose de 5575 mg/kg/dia. Adicionalmente, houve um aumento em ureia e diminuições em proteína e albumina totais nos animais de ambos os sexos a 5575 mg/kg/dia.

[0364] Nos rins, vacuolação/rarefação tubular proximal foi bilateralmente observada em animais tratados com ≥ 2178 mg/kg/dia mCBS (base livre). Esta conclusão (vacuolação/rarefação tubular simples) não foi associada a qualquer alteração patológica. As conclusões microscópicas nos rins se correlacionaram a aumentos em peso renal.

[0365] No baço, acúmulo de macrófagos espumosos associados a células apoptóticas aumentadas na polpa vermelha foi observado em animais tratados com ≥ 1394 mg/kg/dia de mCBS (base livre). Estas alterações esplênicas foram ocasionalmente acompanhadas por hiperplasia de célula estromal, celularidade/tamanho aumentado de polpa branca (centro germinal), fibrose capsular e hematopoese aumentada. As conclusões microscópicas no baço se correlacionaram a aumentos em peso esplênico.

[0366] No fígado, o acúmulo de células de Kupffer espumosas frequentemente associadas a células do revestimento sinusoidal aumentadas (a ≥ 1394 mg/kg/dia), hematopoese extramedular (a 5575 mg/kg/dia) foi observado em animais tratados com ≥ 1394 mg/kg/dia de mCBS (base livre). Adicionalmente, necrose de célula única foi vista em animais tratados com ≥ 2178 mg/kg/dia de mCBS (base livre) e necrose focal ou focal múltipla foi observada em animais tratados com 2178 e 5575 mg/kg/dia. No grupo de 5575 mg/kg/dia, alterações hepáticas foram mais pronunciadas e/ou frequentes em machos em comparação com fêmeas, com ambos os animais machos adequadamente expostos a mCBS mostrando alterações hepáticas mínimas a moderadas.

[0367] Em vários nódulos linfáticos (bronquial, mandibular, mediastinal, mesentérico, pancreático, hepático e/ou auricular), acúmulo de macrófagos espumosos foi observado em diversos animais tratados com ≥ 1394 mg/kg/dia de mCBS (base livre).

[0368] As conclusões sobre o acúmulo de macrófagos espumosos (no baço e nódulos linfáticos), células de Kupffer espumosas (no fígado) e vacuolação/rarefação tubular proximal (nos rins) sugerem que o item de teste, mCBS, e/ou seu produto (ou produtos) de degradação foram mais provavelmente capturados pela corrente de fagócitos mononucleares (no baço, fígado e nódulos linfáticos) e absorvidos pelo epitélio tubular renal. Portanto, sem se ater a qualquer teoria específica ou modo de ação particular, os depositantes ponderaram que estas conclusões mais provavelmente representam uma alteração adaptativa do sistema fagocítico e rins, como resultado da fagocitose e liberação do item de teste e/ou seu produto (ou produtos) de degradação. Adicionalmente, outras conclusões sobre o baço [células apoptóticas aumentadas, hiperplasia de célula estromal, celularidade/tamanho aumentado de polpa branca (centro germinal), hematopoese aumentada e fibrose capsular] e fígado (células do revestimento sinusoidal aumentadas e hematopoese extramedular) foram também ponderadas pelos depositados como sendo uma resposta adaptativa ao sistema de fagócitos ativados.

[0369] Entretanto, a necrose de célula única do fígado observada em 2178, 3484 e 5575 mg/kg/dia (base livre) foi considerada como sendo potencialmente adversa. Adicionalmente, necrose focal ou focal múltipla do fígado foi observada em 2178 e 5575 mg/kg/dia. Embora a necrose focal não tenha sido vista em animais tratados com 3484 mg/kg/dia e possa ocorrer espontaneamente, dado o fato de que esta conclusão foi observada em animais tratados com mCBS apenas, a relação com o item de teste não pode ser excluída.

[0370] Consequentemente, o Nível de Nenhum Efeito Adverso Observável (NOAEL) para mCBS foi determinado como sendo 1394 mg/kg/dia (base livre) neste estudo devido às alterações histopatológicas observadas no fígado e ≥2178 mg/kg/dia (base livre). EXEMPLO 10: INVESTIGAÇÃO IN VIVO DE DOSAGENS E TOXICIDADE DE mCBS APÓS INFUSÃO IV CONTÍNUA DURANTE UM PERÍODO PROLONGADO DE ATÉ 14 DIAS CONSECUTIVOS EM CÃES

[0371] Este exemplo representa estudos in vivo de faixas de dose e investigação de toxicidade de mCBS quando administrados via infusão IV contínua a cães da raça Beagle durante um período de 14 dias. Este exemplo demonstra que, sob este regime de administração intensivo de mCBS em cães, a infusão intravenosa contínua (24 horas/dia por 48 horas) de mCBS a 2788 mg/kg/dia por 14 dias foi bem tolerada sem efeitos sobre a mortalidade, observações clínicas, pesos corporais, consumo de alimentos, patologia clínica (hematologia, coagulação e química clínica), peso dos órgãos ou avaliações macroscópicas. INFUSÃO CONTÍNUA DE mCBS EM CÃES

[0372] Em resumo, este estudo examinou as faixas de dose de mCBS em cães via infusão contínua com o auxílio para selecionar a dose máxima de mCBS para uso num estudo em cães de infusão contínua por 14 dias. Similarmente, a dose selecionada foi a MTD ou aquela que resulta no nível plasmático de mCBS (base livre) de pelo menos 300 ug/ml (isto é, ~3x do nível plasmático humano alvo).

[0373] Este estudo foi também conduzido, entre outros, para determinar a dose máxima tolerada (MTD) do item de teste, mCBS, quando administrada por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) através de um cateter implantado cirurgicamente por 48 horas por nível de dose até 4 níveis de dose a cães da raça Beagle. Fase 1: Escalonamento de dose

[0374] Formulações de dose de mCBS foram administradas a cães da raça Beagle por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) por 48 horas por nível de dose até 4 níveis de dose, conforme descrito na Tabela 15 abaixo. TABELA 15: FORMULAÇÕES DE DOSAGEM DE MCBS (NA FORMA DO SAL DE HEPTASSÓDIO mCBS·Na) ADMINISTRADAS A CÃES

DA RAÇA BEAGLE POR INFUSÃO INTRAVENOSA CONTÍNUA ATRAVÉS DE UM CATETER IMPLANTADO CIRURGICAMENTE. Concen Concen- Nú- Nível de Dura- anim Nº Dias Nível de tração tração mero Designa- Dose Taxa de ção de ais do de Dose de de Dose de ção de Corrigido Infusão Infu- Gru- Es- (mg/kg/ Dose, Corrigi- Grupo (mgkgdia) (ml/kgh) são Ma- Fê- po tudo dia)* (mg/ml) da ** (horas) chos meas * (mg/ml)** Baixa 1 1a3 480 20 348 14,5 1 48 1 1 Dose

Dose 3a5 960 40 697 29,0 1 48 média Alta Dose 5 a 7 1920 80 1394 58,1 1 48 Alta Dose 7a9 3840 80 2788 58,1 2 48 2 *Níveis e concentrações de dose não coletados para potência **Níveis e concentrações de dose são expressos em termos de mCBS (base livre) após correção para potência e teor de sal com um fator de correção de 0,726.

[0375] Os parâmetros monitorados durante esta fase do estudo incluíram mortalidade, observações clínicas, pesos corporais e consumo de alimentos. Amostras de sangue em série foram coletadas de cada animal para confirmar os níveis plasmáticos de mCBS nos seguintes pontos no tempo: 24 e 48 horas após o início da infusão de cada nível de dose. Amostras de sangue foram também coletadas de cada animal para avaliações de patologia clínica (hematologia, coagulação e química clínica) no Dia 1, antes da administração do novo nível de dose nos Dias 3, 5 e 7 e no Dia 9.

[0376] Nenhuma toxicidade limitante de dose (sinal clínico adverso) foi observada após uma administração em etapas até o nível de dose mais alto, portanto, a dose máxima tolerada (MTD) foi considerada como sendo 2788 mg/kg/dia de mCBS administrado por infusão intravenosa contínua (24 horas/dia) por 48 horas. A dose não foi adicionalmente escalonada devido ao fato de que a concentração plasmática em estado de equilíbrio (Css) foi mais alta que 300 μg/ml, que é 3 vezes mais alta que a concentração plasmática alvo em seres humanos.

[0377] Níveis quantificáveis de mCBS foram detectados nas amostras de plasma coletadas de todos os animais em cada ponto no tempo, o que indicou que os animais receberam administração adequada de mCBS. As concentrações médias plasmáticas em estado de equilíbrio (Css) variaram de 53,8 a 358 μg/ml, enquanto mCBS foi eliminado (Cl) a uma taxa de 222 a 450 ml/hora/kg. INFUSÃO CONTÍNUA DE mCBS EM CÃES

[0378] Em resumo, este estudo examinou a infusão contínua de mCBS em cães usando a dose máxima tolerada (MTD) que foi identificada no estudo STX-102 acima.

[0379] Após confirmação da MTD (2788 mg/kg/dia), os cães foram, então, transferidos para a Fase 2 do estudo, e a administração de dosagem foi retomada na MTD por 6 dias adicionais de infusão contínua conforme indicado na Tabela 16 abaixo. TABELA 16: FORMULAÇÃO DE DOSAGEM DE mCBS (NA FORMA DO SAL DE HEPTASSÓDIO mCBS·Na) IDENTIFICADO NO ESTUDO STX-102 COMO SENDO A DOSE MÁXIMA TOLERADA

ADMINISTRADA POR INFUSÃO INTRAVENOSA CONTÍNUA A CÃES DA RAÇA BEAGLE USADOS EM STX 102 POR 6 DIAS ADICIONAIS.

Núme de Concentra- Nível de Concentra- Nº do Nível de Taxa de Duração ro Animais ção de Dose ção de Dose Gru- Dose Infusão de Dose Coletado Coletado po (mg/kg)* (ml/kg/h) Infusão Ma- (mg/ml)* (mg/kg)** (mg/ml)** Fê-meas chos 6 dias 1 3840 80 2788 58,1 20 (2) (144 1 1 horas) *Nível e concentração de dose não corrigidos para potência. **Níveis e concentrações de dose são expressos em termos de mCBS (base livre) após correção para potência e teor de sal com um fator de correção de 0,726.

[0380] Os parâmetros monitorados durante esta fase do estudo incluíram mortalidade, observações clínicas, pesos corporais, consumo de alimentos, patologia clínica (hematologia, coagulação e química clínica) e alterações de peso corporal. Amostras de sangue em série para análise toxicocinética foram coletadas de cada animal nos seguintes pontos no tempo:

24 e 48 horas após o início da infusão, imediatamente antes do final da infusão, 15, 30 minutos e 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 24 horas após o final da infusão.

[0381] Após a conclusão dos 6 dias adicionais de infusão contínua e coleta das últimas amostras de sangue toxicocinéticas, todos os animas sofreram eutanásia e foram submetidos a exame de necrópsia no Dia 8. Exame histológico foi realizado no fígado e rins de todos os animais.

[0382] A infusão intravenosa contínua (24 horas/dia por 48 horas) de mCBS a 2788 mg/kg/dia por 6 dias (144 horas) foi bem tolerada sem efeitos sobre a mortalidade, observações clínicas, pesos corporais, consumo de alimentos, patologia clínica (hematologia, coagulação e química clínica), peso dos órgãos ou avaliações macroscópicas.

[0383] As conclusões microscópicas incluíram vacuolação/rarefação tubular proximal renal dos rins e acúmulo de células de Kupffer espumosas do fígado, entretanto, foram consideradas como não adversas ou adaptativas.

[0384] A análise toxicocinética mostrou que as concentrações plasmáticas em estado de equilíbrio (Css) variaram de 223 a 246 μg/ml, enquanto a AUC0- 144 (AUC0- 168) variou de 43800 (44100) a 48300 (48800) h*μg/ml. Após o final da infusão, as concentrações plasmáticas de mCBS declinaram rapidamente a um valor de t1/2 estimado de aproximadamente 1 hora para ambos os animais. O mCBS foi eliminado (Cl) a uma taxa de 472 a 522 ml/hora/kg. O volume de distribuição (Vz) variou de 740 a 741 ml/kg, sugerindo que mCBS é amplamente distribuído entre os tecidos. Não houve diferenças notáveis relacionadas ao sexo. EXEMPLOS 11 A 22: COMPARAÇÃO DE SULFATO DE CELOBIOSE E mCBS

[0385] Nos estudos a seguir, sulfato de celobiose (CBS) e mCBS são comparados. mCBS é quimicamente muito mais estável que CBS e, consequentemente, representa um melhor candidato a fármaco. As metodologias usadas nos Exemplos 11 a 22 são apresentadas abaixo.

MÉTODO E MATERIAIS PARA OS EXEMPLOS A SEGUIR (11 A 22)

[0386] Sujeitos humanos: Toda pesquisa relacionada a ser humano foi aprovada pelo ANU Health Human Research Ethics Committee. Doadores adultos saudáveis foram usados como uma fonte de eritrócitos e plaquetas para estudos in vitro .

[0387] Animais. Todos os experimentos em animais. Foram aprovados pelo Australian National University Animal Experimentation Ethics Committee. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas sem patógeno (6 a 8 semanas de vida), camundongos BALB/c fêmeas (5 a 6 semanas de vida) e ratos Wistar machos (pesando entre 250 a 350 g) foram obtidos junto à Australian Phenomics Facility na Universidade Nacional da Austrália.

[0388] Linhagens celulares e condições de cultura celular. Células endoteliais microvasculares humanas 1 (HMEC-1), portanto o grupo sanguíneo tipo O e, assim, não reativas a anticorpos antigrupo sanguíneo em soro humano, foram fornecidas pela ATCC e foram cultivadas em meio MCDB 131 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado por aquecimento (FCS), L-glutamina 2 mM, 100 IU ml−1 de penicilina e 100 μg ml−1 de estreptomicina. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram estabelecidas de culturas primárias conforme anteriormente descrito Jaffe, E. A. Biology of endothelial cells. (Martinus Nijhoff Publishers; Distributors for the United States and Canada, Kluwer Boston, 1984) e cultivadas em meio 199 suplementado com 20% de FCS, L-glutamina 2 mM, 100 IU ml−1 de penicilina, 100 μg ml−1 de estreptomicina, 130 μg ml−1 de heparina e 1,2 mg ml−1 de suplemento de proliferação de célula endotelial (Sigma-Aldrich). Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)-K1 e células CHO-K1 com deficiência de xilotransferase-1 (células pgsA-745) que são deficientes em HS e GAG foram fornecidas pela ATCC e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FCS e antibióticos. Todas as linhagens celulares foram incubadas em 5% de CO2 e O2 ambiente a 37°C e foram repetidamente testadas para micoplasma usando um kit de ensaio MycoAlert (Lonza).

[0389] Ensaios de Citotoxicidade mediada por histona. Para determinar a citotoxicidade de histonas do tipo de bezerro (Sigma-Aldrich), várias concentrações de histonas (100 a 800 μg ml−1) foram adicionadas às suspensões de HMEC-1 ou HUVEC (1 x 106 ml−1) em placas de 96 poços e incubadas por 1 h a 37°C. As células foram, então, incubadas por 5 min a 37°C com iodeto de propídio (PI; 2,5 μg ml−1) (ThermoFisher Scientific), para detectar células mortas, e calceína-AM (0,04 μM)(ThermoFisher Scientific), para detectar células viáveis, colocadas em gelo e a porcentagem de células mortas e viáveis determinada por citometria de fluxo usando as estratégias de comutação representadas na Figura 1 de Dados Estendidos. Em ensaios de inibição, HMEC-1 foram incubadas com histonas (400 μg ml−1) por 1 h a 37°C na presença de diferentes concentrações de compostos (12,5 a 400 μg ml−1) antes da adição de PI e calceína-AM. A citotoxicidade de HMEC-1 em cada concentração de composto foi, então, determinada com base na fórmula: Morto (composto & histonas)– Morto (apenas células) x 100 Citotoxicidade (%) = Morto (apenas histonas)– Morto (apenas células) e o valor de IC50 para cada poliânion, então, determinado com base na linhagem de melhor ajuste. Em alguns experimentos, monocamadas de confluente de HMEC-1 em placas de 96 poços foram incubadas em meio MCDB 131 sem soro por 1 h com diluente apenas (solução salina), histonas apenas (400 μg ml−1) ou histonas na presença de mCBS (100 μg ml−1) e, então, células viáveis e mortas detectadas por absorção de calceína-AM ou PI, respectivamente, usando um microscópio confocal Leica SP5. Suspensões de HMEC-1 foram também depletadas de HS da superfície celular com heparinises de Flavobacterium (HPNSE) I, II e III (Sigma-Aldrich) ou heparanase de plaqueta humana (HPSE) (Freeman, C. & Parish, C. R. Human platelet heparanase: purification, characterization and catalytic activity. Biochem J 330 (Pt 3), 1341- 1350 (1998)) conforme relatado em outra parte (Khanna, M., Ranasinghe, C., Jackson, R. & Parish, C. R. Heparan sulfate as a receptor for poxvirus infections and as a target for antiviral agents. J Gen Virol, doi:10.1099/jgv.0.000921 (2017)) e, então, examinadas quanto à sensibilidade à citotoxicidade mediada por histona conforme descrito acima para HMEC-1. Similarmente, suspensões de células CHO-K1 do tipo selvagem e CHO-K1 pgsA-745 com deficiência de HS/GAG foram comparadas quanto à sua sensibilidade à citotoxicidade mediada por histona.

[0390] Ensaios de bicamada de lipídio. Bicamadas de lipídio artificiais, preparadas conforme anteriormente descrito (Rebbeck, R. T. et al.. The beta(1a) subunit of the skeletal DHPR binds to skeletal RyR1 and activates the channel via its 35-residue C-terminal tail. Biophys J 100, 922- 930, doi:10.1016/j.bpj.2011.01.022 (2011).), separaram soluções de KCl 150 mM ou 250 mM simétricas (pH ~5,5). Histonas (1 µM, 15,2 µg ml−1) foram adicionadas às bicamadas sozinhas ou após 0,5 a 3 h de incubação com CBS 10 µM (3,5 µg ml−1) ou MTS 10 µM (5,1 µg ml−1) a ~20°C. A corrente foi registrada continuamente após a adição de histona até as bicamadas quebrarem ou o experimento ter sido terminado.

[0391] Estudos de fluxo de cálcio em células endoteliais. HMEC-1 (2 x 107 ml−1) em meio RPMI-1640 foram incubadas com Indo-1 AM (5 μM)(ThermoFisher) a 37°C por 60 min. (Tellam, R. L. & Parish, C. R. The effect of sulfated polysaccharides on the free intracellular calcium ion concentration of lymphocytes. Biochim Biophys Acta 930, 55-64 (1987) & Weston, S. A., Tellam, R. L. & Parish, C. R. Dextran sulfate induces changes in the free intracellular calcium ion concentration of a subpopulation of immature thymocytes. Immunol Cell Biol 69 (Pt 6), 369-376, doi:10.1038/icb.1991.53 (1991).) Após 3 lavagens com meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FCS, as células foram ressuspensas a 4 x 106 ml−1 em solução salina tamponada com HEPES resfriado em gelo (NaCl 8 g l−1, KCl 0,4 g l−1, CaCl2 0,2 g l−1, MgCl2.6H2O 0,2 g l−1, D-glicose 1,8 g l−1, pH 7,4) suplementado com HEPES 10 mM. A suspensão de células foi mantida em gelo e usada dentro de 3 h. O fluxo de Ca 2+ intracelular foi monitorado usando citometria de fluxo. As células foram pré-

equilibradas e mantidas a 37°C durante análise usando uma bainha externa conectada a um banho de água aquecida. Após a exclusão de detritos celulares e células aglomeradas (com base em dispersão de luz FSC/SSC), o nível de Ca2+ basal foi monitorado por 2 min antes da adição de histona na presença/ausência de compostos inovadores. Os níveis de Ca2+ foram medidos em 1, 4 e 10 min após a adição de histona com uma taxa de fluxo constante (~300 eventos/segundo). O fluxo de Ca2+ foi determinado como um aumento na razão de intensidade de fluorescência em média geométrica (GMFI) de Indo-1 ligado a Ca2+ em relação a não ligado a Ca2+.

[0392] Ensaios in vitro de deformabilidade, fragilidade, agregação, microscopia de eritrócito. A agregação mediada por histona de eritrócitos humanos e sua inibição por vários compostos foi detectada por citometria de fluxo, com base em parâmetros de difusão para frente e lados ou autofluorescência de eritrócitos, conforme relatado por alguns dos inventores anteriormente (consultar Kordbacheh, F., O'Meara, C. H., Coupland, L. A., Lelliott, P. M. & Parish, C. R. Extracellular histones induce erythrocyte fragility and anemia. Blood 130, 2884-2888, doi:10.1182/blood-2017-06-790519 (2017)) e microscopia eletrônica de varredura, conforme descrito anteriormente (Yabas, M. et al. Mice deficient in the putative phospholipid flippase ATP11C exhibit altered erythrocyte shape, anemia, and reduced erythrocyte life span. J Biol Chem 289, 19531-19537, doi:10.1074/jbc.C114.570267 (2014)). Similarmente, a fragilidade de eritrócitos induzida por histonas, na presença ou ausência de inibidores, foi quantificada usando um ensaio de tensão de cisalhamento conforme relatado por alguns dos inventores anteriormente (consultar Kordbacheh, F., O'Meara, C. H., Coupland, L. A., Lelliott, P. M. & Parish, C. R. Extracellular histones induce erythrocyte fragility and anemia. Blood 130, 2884- 2888, doi:10.1182/blood-2017-06-790519 (2017)). Finalmente, a deformabilidade reduzida de eritrócitos na presença de histonas e o efeito de inibidores sobre este processo foram avaliados medindo-se a passagem de eritrócitos através de um baço humano artificial (consultar Deplaine, G. et al..

The sensing of poorly deformable red blood cells by the human spleen can be mimicked in vitro. Blood 117, e88-95, doi:10.1182/blood-2010-10-312801 (2011).).

[0393] Ensaios In vitro de agregação e desgranulação de plaquetas. Para estudos de agregação, as plaquetas g foram isoladas de sangue total coletado em Vacutainers de citrato de Na através de centrifugação em 2 etapas à temperatura ambiente (200 xg por 20 min, então, o plasma rico em plaquetas 800 xg por 15 min), o pélete de plaqueta ressuspenso em solução salina equilibrada de Hank contendo cálcio e magnésio e histonas adicionadas e incubadas na presença/ausência de compostos nas concentrações de cada um, conforme indicado. As amostras foram avaliadas quanto ao grau de agregação de plaquetas após 15 min de exposição às histonas por citometria de fluxo usando a identificação de FSC logarítmico vs SSC logarítmico característico de plaquetas, com aumentos na média geométrica de FSC logarítmico indicativo de agregação de plaquetas.

[0394] Para o ensaio de ativação de plaqueta, sangue total coletado em Vacutainers de citrato de Na foi monitorado quanto à desgranulação de plaquetas usando o modo de luminescência no Modelo Chrono-Log 700 com reagente Chrono-Lume (Chrono-Log Corp). Solução salina (300 µl) foi adicionada a sangue pré-aquecido (420 µl) com uma barra agitadora in situ. Reagente Chromo-Lume (100 µl) foi, então, adicionado e incubado por 2 min antes de histonas ± compostos diluídos em água terem sido adicionados num volume total de 180 µl nas concentrações indicadas. Os resultados expressos como liberação de ATP foram calculados como uma porcentagem do controle de histona + solução salina.

[0395] Ensaios de toxicidade de histona in-vivo. Camundongos fêmeas BALB/c (5~6 semanas de vida), que são mais propensos à anemia induzida por histona e mais fáceis de aplicar injeção i.v. nesta idade jovem do que camundongos C57BL/6, receberam injeção i.p. com compostos de teste em concentrações indicadas 10 min antes da injeção i.v. de histonas (50 mg kg−1) em solução salina tamponada com fosfato. Sangrias retro-orbitais foram realizadas em 10 min após a injeção de histona e o sangue coletado foi adicionado a ácido citrato dextrose (ACD), em que a amostra de sangue de 10 min foi submetida a análises hematológicas quanto ao teor de plaqueta e eritrócitos usando um Analisador de Hematologia ADVIA 2120i. Os baços foram também coletados em 10 min após injeção de histona e teor de hemoglobina esplênico quantificado usando um kit de ensaio de hemoglobina (Sigma-Aldrich). No caso de amostras de sangue de 4 h, camundongos C57/BL/6 machos (6 a 8 semanas de idade) receberam injeção de compostos de teste e histonas conforme acima e plasma isolado e armazenado congelado para teste bioquímico subsequente, com marcadores para dano no fígado (alanina aminotransferase, ALT), rim (Creatinina, Crea) e tecido geral (lactato desidrogenase, LDH) sendo determinados pelo Department of Pathology, The Canberra Hospital.

[0396] Modelo murino de trombose de veia profunda (DVT). O procedimento usado é amplamente conforme descrito anteriormente (consultar Brill, A. et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost 10, 136-144, doi:10.1111/j.1538-7836.2011.04544.x (2012)). Em resumo, camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de vida foram anestesiados, uma incisão de laparatomia realizada, os intestinos exteriorizados e, então, separação suave da aorta abdominal, a veia cava inferior (IVC) imediatamente abaixo das veias renais foi ligada a ~10% de patência e todos os afluentes da IVC associados foram ligados. O peritônio e a pele foram fechados, após o qual todos os camundongos receberam uma injeção i.v. de histonas via a veia da cauda (10 mg kg−1) ou um volume equivalente de solução salina após 5 min por injeção i.v. de compostos de teste (50 mg kg−1) ou solução salina. Os camundongos foram monitorados por 48 h, após as quais os mesmos foram anestesiados novamente, abertos novamente e quaisquer trombos que tenham se desenvolvidos distalmente à estenose da IVC foram removidos para análise. Animais de controle simuladamente operados receberam laparotomia e 90% de ligação da IVC, entretanto, a ligação foi removida imediatamente após a oclusão da IVC.

[0397] Ensaio de ligação e punção cecal em ratos (CLP) para sepse. O ensaio de CLP foi realizado em ratos Wistar machos, conforme anteriormente descrito (consultar Hubbard, W. J. et al. Cecal ligation and puncture. Shock 24 Suppl 1, 52-57 (2005).). Os compostos de teste (50 mg kg−1) dissolvidos em solução salina ou um volume equivalente de solução salina apenas (coorte de controle) foram administrados i.p. 5 min pré-CLP e 5, 10 e 15 h pós-op até a cessação do experimento em 20 h. Ratos de CLP simulado passaram pelo mesmo procedimento, no entanto, o ceco não foi ligado ou perfurado e estes ratos receberam solução salina nos mesmos tempos, como acima. Na conclusão do período de tempo experimental (20 h) ou quando a morbidade exigiu eutanásia ética, os ratos foram anestesiados e sangue foi coletado via punção cardíaca em EDTA para análise subsequente de função do fígado (ALT) e rim (creatinina) pelo Departamento de Patologia do Hospital Canberra. A propensão à formação de coágulos dentro das amostras de sangue dos animais de CLP de controle tratados com solução salina (a despeito da presença de EDTA) impediu a análise bem-sucedida de amostras de plasma de todos os animais.

[0398] Modelo de IRI cardíaco de rato. O método usado é baseado numa combinação de procedimentos publicados (consultar Takada, Y., Hashimoto, M., Kasahara, J., Aihara, K. & Fukunaga, K. Cytoprotective effect of sodium orthovanadate on ischemia/reperfusion-induced injury in the rat heart involves Akt activation and inhibition of fodrin breakdown and apoptosis. J Pharmacol Exp Ther 311, 1249-1255, doi:10.1124/jpet.104.070839 (2004) & Hale, S. L., Dae, M. W. & Kloner, R. A. Hypothermia during reperfusion limits 'no-reflow' injury in a rabbit model of acute myocardial infarction. Cardiovasc Res 59, 715-722 (2003)). Ratos Wistar machos foram anestesiados com isofluorano, intubados via traqueostomia e ventilados com um volume periódico de 1 ml 150 g−1 e uma taxa respiratória de 65 respirações min −1. Oxigênio suplementar foi distribuído a um FiO2 de ~30%. Uma semitoracotomia esquerda foi realizada para possibilitar a visualização do ventrículo esquerdo. O plexo arterial coronário esquerdo (LCA) foi ocluído usando um laço atraumático por 30 min antes da reperfusão por 30 min. Isquemia foi confirmada por hiperemia do miocárdio. Os compostos de teste (30 mg kg−1) ou um volume equivalente (200 μl) de solução salina foram injetados no lúmen do ventrículo esquerdo (confirmado com aspiração) 5 min antes da liberação do laço para a fase de reperfusão.

[0399] Na conclusão da reperfusão (30 min), Tioflavina S (1 ml 200 g−1 de peso corporal) foi lentamente injetada no lúmen do ventrículo esquerdo, para definir o território de obstrução microvascular (MVO) dentro da isquêmica (IZ). O território de IZ foi determinado pela reoclusão do laço atraumático e infusão de microesferas azuis no ventrículo esquerdo (Unisperse Blue, BASF) distribuída dentro das soluções via ultrassonicação usando um sonicador CD-6800 (Unisonics). O coração foi, então, excisado do tórax, enxaguado em solução salina isotônica e seções de 2 mm foram cortadas distalmente ao laço atraumático em ângulos retos em relação à linha interventricular. Este método produziu 4 seções de miocárdio que foram pesadas e fotografadas (Sony Handycam, Zeiss 60x optical zoom) sob luz ultravioleta (território de MVO) e luz brilhante (território de IZ), antes de serem incubadas em cloreto de tetrazólio (TTC) para determinar a região de miocárdio necrótico. Planimetria (Image J, Freeware) foi usada para quantificar as áreas da IZ, MVO e necrose.

[0400] Modelo de retalho de tecido de isquemia e reperfusão de rato. O procedimento empregado é amplamente baseado num método anteriormente descrito (Askar, I., Oktay, M. F., Gurlek, A. & Bac, B. Protective effects of some antineoplastic agents on ischemia-reperfusion injury in epigastric island skin flaps. Microsurgery 26, 193-199, doi:10.1002/micr.20193 (2006)). Em resumo, ratos Wistar machos foram anestesiados, localmente depilados e um retalho fasciocutâneo de 3 cm por 6 cm foi excisado, deixando o pedículo vascular intacto. A artéria epigástrica inferior foi grampeada, uma folha de borracha fina foi colocada sob o retalho, impedindo a difusão de oxigênio dos tecidos abaixo e o retalho foi suturado novamente no local. O grampo foi removido 10 h após a aplicação, permitindo o retorno do fluxo de sangue ao retalho. Compostos teste (50 mg kg−1) ou solução salina foram administrados i.p. 5 min antes da aplicação de pinça e 5 min após sua remoção. Os ratos foram monitorados durante um período experimental total de 72 h, durante o qual os ratos receberam composto adicional ou solução salina i.p. em 24 e 48 h pós-operatório. Os ratos do “Controle Sem Grampo” tiveram o retalho de tecido excisado e borracha colocada por baixo antes da ressutura, entretanto, o vaso não foi grampeado e receberam solução salina nos mesmos pontos no tempo que os outros ratos. Ao final do período de experimento, a viabilidade dos retalhos foi determinada pela porcentagem de áreas avermelhadas ou necróticas pretas vs áreas visíveis rosas. A despeito da aplicação de colares elizabetanos e do uso de analgesia como um agente de assentamento, um pequeno número de ratos teve que ser submetido a eutanásia prematuramente quando autocanibalizaram repetidamente seus retalhos.

[0401] Modelo EAE de Esclerose Múltipla. EAE foi induzido em camundongos C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de vida por imunização subcutânea com 115 μg/camundongo de glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG35-55 genscript) em adjuvante completo de Freund (Sigma) no dia 1. 300 ng/camundongo de toxina de Pertussis (List Biological Laboratories) em PBS foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) nos dias 0 e 2. 50 mg/kg de mCBS em PBS ou PBS sozinho (veículo) foram dados i.p. diariamente no dia 0 a 9. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto a sinais de doença e foram pontuados numa escapa de 0 a 5 com base em manifestações físicas de doença. Os camundongos foram pontuados conforme segue: 0, clinicamente normal; 1, cauda flácida e/ou ataxia; 2, fraqueza do membro traseiro; 3, paralisia do membro traseiro; 4, paralisia do membro traseiro e dianteiro; e 5,

moribundo.

[0402] Análise estatística. O software Prism (Graphpad Software) foi usado para realizar testes estatísticos e para gerar gráficos, com detalhes do teste usado incluídos as legendas da Figura. Evidência in vitro dos efeitos biológicos de mCBS

[0403] Os seguintes Exemplos 11 a 14 fornecem evidência in vitro do efeito biológico de mCBS em histonas extracelulares livres neutralizantes. Exemplo 11: mCBS protege células endoteliais contra toxicidade de histona

[0404] Este exemplo demonstra que mCBS protege células endoteliais humanas contra danos por histona, e que este efeito protetor de mCBS contra danos induzido por histona a células endoteliais é dependente de concentração. Este exemplo também demonstra que mCBS pode reverter o dano numa proporção de células endoteliais expostas a histonas.

[0405] Células endoteliais revestem o lúmen de vasos sanguíneos e são essenciais para a integridade do sistema vascular, fornecendo muitos sinais entre os tecidos subjacentes para passagem de células sanguíneas e atuação como uma superfície anticoagulante contra a qual o sangue flui. As histonas danificam as membranas celulares de células endoteliais que induzem sua morte, assim, a integridade da microvasculatura e as propriedades anticoagulantes do endotélio são perdidas. Isto resulta em formação de coágulos amplamente distribuída, uma distribuição comprometida de oxigênio e fluido contendo nutriente a órgãos vitais e seu dano e falha subsequentes.

[0406] Para avaliar se mCBS protege as células endoteliais microvasculares humanas (HMECs) contra danos por histona, a situação de saúde das células endoteliais foi determinada in vitro usando 2 corantes fluorescentes, calceína-AM e iodeto de propídio (PI). Células viáveis saudáveis absorveram calceína-AM e excluíram PI, enquanto o contrário foi verdadeiro para células danificadas ou mortas. A absorção/exclusão destes corantes foi medida usando citometria de fluxo e visualizada usando microscopia confocal,

conforme mostrado na Figura 5.

[0407] Em referência à Figura 5, HMECs cultivadas foram tratadas por 60 min com equivalente de volume de água (painéis A e E na Figura 5), histonas 400 μg/ml (painéis B e F na Figura 5), mCBS 100 μg/ml e histonas 400 μg/ml (painéis C e G na Figura 5) ou mCBS 25 μg/ml e histonas 400 μg/ml (painel D na Figura 5), então, identificadas com os corantes calceína-AM e PI e analisadas acerca da extensão de absorção de corante usando citometria de fluxo (painéis A, B, C e D) ou microscopia confocal (painéis E, F e G). Conforme mostrado na Figura 5, células endoteliais microvasculares humanas não tratadas cultivadas (HMECs) foram predominantemente viáveis com 76% contendo calceína-AM e 19% PI (Figura 5A). Quando expostas a histonas (400 µg/ml), entretanto, 37% permaneceram viáveis, enquanto 56% absorveram PI (Figura 5B). Quando mCBS (100 μg/ml) foi adicionado às HMECs antes da exposição a histonas, 74% permaneceram viáveis e 20% morreram com base na absorção de PI, portanto, mCBS pode proteger as HMECs contra lesão mediada por histona (Figura 5C). Este efeito protetor é dependente de concentração com uma quantidade inferior de mCBS (25 μg/ml) fornecendo um nível reduzido de proteção (Figura 5D). Os efeitos de histonas e mCBS sobre HMECs pode ser também visto usando microscopia confocal, em que células endoteliais não tratadas saudáveis (Figura 5E) e tratadas com mCBS expostas a histonas acumulam o corante calceína-AM verde fluorescente (Figura 5G), enquanto células endoteliais expostas a histona não tratadas absorveram o corante fluorescente vermelho PI (Figura 5F).

[0408] As HMECs cultivadas foram expostas a 400 μg/ml de histonas após a adição de concentrações crescentes de mCBS, então, analisadas acerca da absorção de calceína-AM (viáveis) ou PI (mortas) usando citometria de fluxo. O efeito protetor dependente de dose de mCBS contra os efeitos danoso de histonas para HMECs é mostrado na Figura 6, que demonstra que um aumento em concentração de mCBS resultou num aumento em células viáveis (absorção de calceína-AM) e uma redução em células mortas (absorção de PI). Consequentemente, estes resultados demonstram que o efeito protetor de mCBS contra danos induzidos por histona a HMECs é dependente de concentração.

[0409] Para avaliar se mCBS pode reverter o dano em células endoteliais após exposição a histonas, as HMECs cultivadas foram expostas a 400 μg/ml de histonas por 60 min, então, tratadas com mCBS (100 μg/ml) por 10 min, e, então, calceína-AM e PI foram adicionados pelos últimos 5 min. As células foram, então, analisadas acerca da absorção de PI usando citometria de fluxo, com os resultados mostrados na Figura 7. Os resultados mostram que, de modo importante, particularmente no contexto clínico, mCBS também teve capacidade de reverter os efeitos danosos de histonas numa subpopulação de HMECs. Nesta situação (em que histonas foram adicionadas às HMECs cultivadas, então, 60 min depois mCBS foi adicionado por 10 min, calceína-AM e PI pelos últimos 5 min), aproximadamente 30% as HMECs reverteram de absorção de PI para exclusão de PI e absorção de calceína-AM após tratamento com mCBS. EXEMPLO 12: mCBS E CBS IMPEDEM, REDUZEM E, ATÉ MESMO, REVERTEM AGREGAÇÃO E LISE DE GLÓBULO VERMELHO

INDUZIDAS POR HISTONA

[0410] Este exemplo demostra que mCBS impede a agregação de RBC induzida por histona e inibe a agregação de RBC induzida por histona de uma maneira dependente de dose. Além disto, este exemplo demonstra que mCBS inibe a fragilidade de RBC induzida por histona, um efeito que é exacerbado por taxa de fluxo de cisalhamento e duração de exposição a cisalhamento mais altas. Além disto, este exemplo demostra que mCBS pode quase completamente reverter a suscetibilidade de RBC induzida por histona à lise e agregação.

[0411] Os glóbulos vermelhos (RBCs) são responsáveis pelo transporte de oxigênio aos tecidos e contribuem para a formação de coágulos fornecendo proteínas membrânicas que atuam como arcabouço para a formação de trombo. Seu formato discoide e estrutura flexível permitem que as RBCs se espremam através de capilares estreitos e resistam a forças de cisalhamento experimentadas dentro da corrente sanguínea de fluxo rápido. Como carecem de um núcleo, as RBCs não podem responder ao dano através de reparo ou apoptose e, em vez disto, são eliminadas por macrófagos dentro do baço quando se tornam deformadas. As RBCs danificadas, no entanto, perdem seu formato discoide e, portanto, a flexibilidade, antes de atingir o baço, tornando, assim, as mesmas suscetíveis à lise intravascular devido à exposição à força de cisalhamento. Em doenças em que os níveis de histona se tornam elevados, tal como sepse, anemia é frequentemente observada.

[0412] Os efeitos danosos de histonas sobre as RBCs foram estudados juntamente com a capacidade de mCBS de anular estes efeitos. Estudos iniciais de RBCs humanas isoladas incubadas com histonas demonstraram agregação significativa usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica. Conforme mostrado na Figura 8, este efeito de agregação de RBCs de histonas poderia ser impedido por tratamento com mCBS (dados similares vistos com CBS). Neste caso, as RBCs humanas isoladas foram analisadas usando citometria de fluxo usando parâmetros de FSC logarítmico vs autofluorescência logarítmica (canal de FL-1) (Figura 8, painéis A a C) e visualizadas usando microscopia eletrônica de varredura (Figura 8, painéis D a F) para extensão de agregação após nenhum tratamento (painéis A e D), incubação com histonas (400 μg/ml) por 60 min (painéis B e E) e imediatamente após adição de mCBS (200 μg/ml) (painéis C e F), então, exposição a histonas (400 μg/ml) por 60 min. Conforme pode ser claramente observado a partir dos resultados na Figura 8, a agregação de RBC induzida por histona é impedida por mCBS.

[0413] Foram conduzidos experimentos subsequentes que confirmaram adicionalmente que a agregação induzida por histonas de RBCs de uma maneira dependente de dose, e, além disto, que mCBS e CBS poderiam reduzir significativamente esta agregação novamente de uma maneira dependente de dose, conforme mostrado na Figura 9. Especificamente, neste caso, as RBCs humanas isoladas foram expostas a concentrações variáveis de histonas (0, 1,25, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 µg/ml) por 60 min e a extensão de agregação de RBC medida pelo nível de autofluorescência (FL-1) conforme mostrado na Figura 9A. Isto foi, então, repetido exceto pelo fato de que concentrações variáveis de mCBS e CBS (0, 12,5, 25, 50, 100 e 200 µg/ml) foram adicionadas às RBCs antes da adição de 400 μg/ml de histonas. Novamente, a extensão de agregação de RBC foi medida pelo nível de autofluorescência (FL-1) conforme mostrado na Figura 9B. Os resultados demonstram que tanto mCBS quanto CBS inibem a agregação de RBC induzida por histona de uma maneira dependente de dose.

[0414] Adicionalmente, a suscetibilidade de RBCs à lise sob forças de cisalhamento crescente (taxa de pipetagem) e exposição de cisalhamento (repetições de pipetagem) quando incubadas por 60 min com concentrações crescentes de histonas foi determinada usando um sistema robótico de pipetagem. Os resultados são mostrados na Figura 10. Especificamente, as RBCs humanas isoladas diluídas numa solução salina 60% (razão normal entre solução salina:água de 6:4) foram incubadas com concentrações crescentes de histonas (0, 1,25, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 µg/ml) por 60 min, então, expostas a taxas de fluxo crescentemente rápidas (mm/s) a repetição 40X (Figura 10A), e repetições variáveis de pipetagem em taxa de fluxo de 100 mm/s (Figura 10B), ou tratadas com concentrações variáveis (0, 12,5, 25, 50, 100 e 200 µg/ml) de mCBS (Figura 10C), então, expostas a 400 μg/ml de histonas por 60 minutos e uma taxa de fluxo de cisalhamento de 100 mm/s e repetições de pipetagem 40 X, dentro de um sistema robótico. O sobrenadante a partir de cada amostra foi, então, medido acerca do teor de hemoglobina a A540 nm como uma indicação da extensão de lise de RBC.

[0415] Estes experimentos foram realizados numa solução salina de 60% de tonicidade para induzir um estresse de linha de base às RBCs. A lise foi determinada medindo-se o nível de hemoglobina no sobrenadante a 540 nm. Estes resultados demonstram que concentrações crescentes de histona aumentam drasticamente a suscetibilidade à lise de RBCs sob exposição e forças de cisalhamento crescentes (Figura 10A e B). O tratamento de RBCs com mCBS (e CBS, não mostrado) antes da exposição à histona pode inibir a lise induzida por histona sob cisalhamento de uma maneira dependente de dose (Figura 10C). Consequentemente, os resultados demonstram que mCBS (e CBS) inibiu a fragilidade de RBC induzida por histona, mesmo quando o efeito de histona foi exacerbado por taxas de fluxo de cisalhamento mais altas e duração de exposição a cisalhamento.

[0416] Para replicar de modo mais próximo um cenário clínico, foi demonstrado que o tratamento de RBCs por 5 min com mCBS subsequente à sua exposição a histonas por 55 min resultou na inibição quase completa de suscetibilidade à lise sob forças de cisalhamento e à agregação (Figura 11). Especificamente, as RBCs humanas isoladas foram expostas a 400 μg/ml de histonas por 55 min, então, concentrações variáveis de mCBS por 5 min antes (Figura 11A) da aplicação de forças de cisalhamento (100 mm/s de taxa de fluxo e repetições de pipetagem 40 X) e medição de hemoglobina no sobrenadante via A540 nm, e (Figura 11B) análise da extensão de agregação de RBC conforme medido pelo nível de autofluorescência em FL1 usando citometria de fluxo. Os resultados indicam que mCBS teve capacidade de reverter a suscetibilidade de RBC induzida por histona à lise e agregação. EXEMPLOS 13: SULFATAÇÃO DE mCBS

[0417] Conforme indicado acima, mCBS é quimicamente muito mais estável que CBS e, consequentemente, representa um melhor candidato a fármaco. Consequentemente, os inventores testaram a sulfatação necessária em CBS para atividade. Ao testar estes diferentes estados de sulfatação (Figura 12a) de compostos de CBS usando ensaios de citotoxicidade de HMEC-1 (Figura 12b) e ensaios de fragilidade de RBC (Figura 12c), foi determinado que CBS altamente sulfatado foi necessário para atividade anti- histona já que mCBS subsulfatado teve atividade inibitória de histona mínima,

mesmo quando 5 de 7 sítios de O-sulfatação estavam ocupados. EXEMPLO 14: mCBS E CBS REDUZEM A AGREGAÇÃO E A

DESGRANULAÇÃO DE PLAQUETAS INDUZIDAS POR HISTONA

[0418] Este exemplo demonstra que mCBS e CBS inibem a agregação e a desgranulação de plaquetas induzidas por histona.

[0419] As plaquetas exercem um papel seminal na interação de formação de coágulos com proteínas plasmáticas de coagulação para formar um tampão efetivo após lesão vascular. As plaquetas também interagem com células imunes que auxiliam em sua ativação e migração a áreas de infecção.

[0420] Consequentemente, os presentes inventores estudaram o efeito de histonas sobre plaquetas e a capacidade de mCBS e CBS de inibir estes efeitos. Especificamente, plaquetas humanas isoladas e lavadas foram incubadas com concentrações variáveis de histonas (por exemplo, de 0 a 1000 μg/ml) por 1 h antes da análise de agregação por citometria de fluxo usando FSC e SSC para discriminar entre plaquetas únicas e agregadas (cujos resultados são mostrados na Figura 13A). Isto foi, então, repetido com exceção do fato de que uma faixa de concentrações de mCBS e CBS foi adicionada antes da adição de histonas (a uma concentração de 150 µg/ml) (Figura 13B). Plaquetas humanas em sangue total foram analisadas acerca da desgranulação após a adição de concentrações crescentes de histonas usando quimioluminometria para detectar a liberação de ATP, com trombina incluída como um controle positivo (Figura 13C). Esta última etapa foi repetida com exceção do fato de que concentrações crescentes de mCBS e CBS foram adicionadas antes da adição de histonas (400 µg/ml) (mostrado na Figura 13D).

[0421] Os resultados fornecidos demonstram que plaquetas isoladas quando expostas a concentrações crescentes de histonas demonstraram uma propensão aumentada a se agregar, conforme medido por citometria de fluxo (Figura 13A) e se desgranular, conforme medido usando liberação de ATP via luminometria de plaqueta (Figura 13C). Quando preparações de plaqueta foram pré-tratadas com mCBS e CBS, no entanto, a agregação (Figura 13B) e a desgranulação (Figura 13D) foram significativamente reduzidas. Em contrapartida, celobiose não sulfatada (CB) não teve atividade inibitória.

[0422] Consequentemente, os resultados confirmam que as histonas induzem a agregação e a desgranulação de plaquetas, e estes efeitos são inibidos por mCBS e CBS. EXEMPLO 15: mCBS IMPEDE O ROMPIMENTO DE BICAMADA

DE LIPÍDIO POR HISTONAS

[0423] Os inventores em seguida investigaram como as histonas mediam sua citotoxicidade e, consequentemente, CBS e mCBS protegem as células contra danos mediados por histona. Visto que as histonas se ligam a GAGs, notavelmente HS, que são expressos ubiquamente em superfícies celulares, pareceu exequível que as histonas iniciam sua função efetora citotóxica por ligação a HS da superfície celular.

[0424] Para testar esta ideia, as células HMEC-1 foram depletadas de HS da superfície celular por incubação com uma mistura de três heparinases bacterianas ou heparanase de plaqueta humana antes da exposição a histonas, com a remoção de HS sendo 86% e 97%, respectivamente, para os dois tratamentos enzimáticos conforme monitorado por citometria de fluxo.

[0425] Os inventores concluíram que o pré-tratamento de células HMEC-1 com enzimas de degradação de HS bacterianas ou humanas não tiveram efeito sobre a sensibilidade das células à citotoxicidade mediada por histona, em que os dois pré-tratamentos com enzima também não têm efeito sobre a viabilidade de HMEC (Figura 14a). Para conformar esta conclusão, os inventores usaram uma linhagem de células CHO (pgsA-745) que carece de GAGs de superfície celular devido a uma mutação na xilotransferase que inicia a biossíntese de cadeia de GAG. Em comparação com a linhagem de células CHO-K1 original, a perda de GAGs de superfície celular teve pouco efeito sobre a citotoxicidade de histona, havendo apenas uma redução pequena, mas significativa em citotoxicidade nas concentrações de histona mais altas testadas (Figura 14b). Assim, GAGs de superfície celular não são necessários para citotoxicidade mediada por histona.

[0426] As histonas mostraram anteriormente interagir com e danificar bicamadas de lipídio e também atuam como proteínas de penetração em célula. Assim, os inventores investigaram se as histonas mediam sua citotoxicidade rompendo diretamente as bicamadas de lipídio.

[0427] Para examinar esta possibilidade, bicamadas de lipídio artificiais foram preparadas e sua suscetibilidade à ruptura de histona detectada por alterações em corrente através das bicamadas.

[0428] As bicamadas de lipídio têm uma vida útil finita, normalmente da ordem de 30 a 120 min. Nos experimentos dos inventores, as bicamadas de lipídio de controle, contendo a proteína de canal de íon do receptor 1 de rianodina (RyR1), tiveram uma vida útil média de 46±4 min, adição de histonas (1 μM), reduzindo marcadamente a vida útil a 5,7±1,2 min (Figura 15a). De fato, 13 de 47 bicamadas (28%) se romperam dentro de 0,3 a 0,5 min de adição de histona, enquanto apenas 2 de 125 bicamadas de controle (1,6%) se romperam no mesmo período de tempo, com concentrações de histona mais altas (≥50 μM) resultando na ruptura rápida da maioria das bicamadas (não mostrado). As bicamadas foram menos propensas à ruptura por histonas quando CBS estava presente, em que a vida útil média da bicamada aumenta significativamente a 18±4 min e 36±5 min para CBS (Figura 15a). Em comparação com histonas sozinhas (28%), a incidência de ruptura rápida de bicamada diminuiu a 3 de 52 bicamadas (5,8%) para CBS.

[0429] Estudos anteriores também demonstraram que as histonas podem induzir nas células despolarização da membrana plasmática e canais de Ca2+ não seletivos. Estas conclusões sustentam, ainda, o conceito de que as histonas interagem diretamente com fosfolipídios da superfície celular e rompem a integridade da membrana.

[0430] Para investigar se mCBS protege as células contra um fluxo de Ca2+ induzido por histona, as HMEC-1 foram carregadas com corante sensível a Ca2+, Indo-1, desafiadas com histonas na presença ou ausência de absorção de mCBS e Ca2+ medida por citometria de fluxo (Figura 15b). As histonas induziram um aumento de quase 6 vezes na população de células que exibem altos níveis de Ca2+ intracelular, em que esta resposta entrou em platô 4 a 10 min após a adição de histona. A presença de mCBS inibiu substancialmente a resposta (Figura 15c). As conclusões dos inventores indicam que as histonas danificam as membranas celulares rompendo diretamente a bicamada de lipídio das células, com mCBS neutralizando esta propriedade indesejável de histonas. EXEMPLO 16: mCBS TEM ATIVIDADE ANTICOAGULANTE

INERENTE MÍNIMA E REDUZ A PERTURBAÇÃO DE COAGULAÇÃO PLASMÁTICA INDUZIDA POR HISTONA

[0431] Este exemplo demonstra que as histonas reduzem a coagulação sanguínea e que mCBS tem efeitos anticoagulantes mínimos e pode reduzir a perturbação de coagulação plasmática induzida por histona.

[0432] A despeito de mostrar que as histonas podem promover a agregação e a desgranulação de plaquetas, os presentes inventores também concluíram que as histonas reduziram o nível de coagulação de sangue total inibindo a coagulação plasmática especificamente através de fatores envolvidos na trajetória intrínseca.

[0433] Isto foi demonstrado usando tromboelastometria rotacional (ROTEM) (Figura 16A) e o ensaio de tempo de trombina parcial ativado baseado em plasma tradicional (APTT) (Figura 16B).

[0434] Especificamente, usando ROTEM (Figura 16A), a adição de concentrações de histona crescentes (0 a 1000 µg/ml) a sangue total resultou num prolongamento do tempo de coagulação (medido em segundos) em todos os ensaios, mas particularmente, os ensaios NATEM e INTEM. O mesmo efeito anticoagulante de histonas sobre a coagulação foi demonstrado usando o ensaio de coagulação baseado em plasma, APTT (A Figura 16B).

[0435] Como mCBS é um dissacarídeo sulfatado, os inventores ponderaram que o mesmo poderia ser considerado como sendo um primo muito menor da heparina anticoagulante de baixo peso molecular e não fracionada. Consequentemente, as propriedades de coagulação de mCBS (200 μg/ml) foram estudadas usando ROTEM. Dois trissacarídeos sulfatados, melezitose e maltotriose, foram incluídos como comparadores (Figura 17). Especificamente, sangue total foi suplementado com mCBS, maltotriose ou melezitose (200 μg/ml) imediatamente antes de ensaios NATEM (não ativado), EXTEM (ativação de trajetória extrínseca), INTEM (ativação de trajetória intrínseca) e FIBTEM (ativação de trajetória extrínseca com plaquetas neutralizadas) serem realizados. Os dados representam o tempo de coagulação expresso como aumento em vezes acima do controle de água e são mostrados na Figura 17A. Sangue total, suplementado com concentrações variáveis (0 a 100 µg/ml) de mCBS, melezitose ou maltotriose, foi analisado usando o ensaio NATEM para tempo de coagulação, com os resultados mostrados na Figura 17B. O mesmo foi, então, repetido (como no painel B) com exceção do fato de que os dados representam a amplitude de coágulo em 20 min. Os resultados do mesmo são mostrados na Figura 17C. Foi observado que nenhum coágulo foi detectado com dois trissacarídeos a 50 e 100 μg/ml.

[0436] Os resultados mostrados na Figura 17 demonstraram que mCBS teve impacto mínimo a nulo sobre a coagulação de sangue total enquanto 2 compostos de trissacarídeo sulfatados tiveram atividade anticoagulante significativa detectada nos ensaios NATEM (tromboelastometria não ativada (TEM)) e INTEM (TEM ativada de trajetória intrínseca). Como o ensaio NATEM foi o mais sensível a alterações induzidas por estes compostos, concentrações mais baixas dos 3 compostos sulfatados foram adicionadas a sangue total para definir melhor sua potência como anticoagulantes. Esta análise demonstrou que trissacarídeos sulfatados dobraram o tempo de coagulação de controle a 25 μg/ml, enquanto 100 μg/ml de mCBS foram necessários para atingir o mesmo resultado (Figura 17B).

[0437] Além disto, uma comparação do efeito anticoagulante de mCBS com heparina e a heparina de baixo peso molecular, Enoxaparina, foi conduzida. Especificamente, usando o ensaio NATEM, a coagulação de sangue total foi medida após a adição de heparina (a uma concentração de 1 µg/ml ou 10 µg/ml), enoxaparina (a uma concentração de 1 µg/ml ou 10 µg/ml), o trissacarídeo sulfato de maltotriose (a uma concentração de 25 µg/ml) ou mCBS (a uma concentração de 25 µg/ml). Os resultados são mostrados na Figura 18. Uma comparação de mCBS com heparina não fracionada e heparina de baixo peso molecular (LMWH) demonstrou uma redução de 110 vezes na atividade anticoagulante de mCBS em comparação com a LMWH, Enoxaparina, e uma redução de >750 vezes em comparação com heparina não fracionada.

[0438] Como as histonas mostraram aumentar o tempo de coagulação no ensaio EXTEM, enquanto mCBS não teve impacto sobre o mesmo parâmetro, a capacidade de mCBS de inibir a perturbação de coagulação foi também testada usando o ensaio NATEM. Os resultados do mesmo são mostrados na Figura 19. Conforme demonstrado, a adição de 200 μg/ml de mCBS teve capacidade de inibir os efeitos anticoagulantes tanto de 400 quanto de 800 μg/ml de histonas. Em comparação, o mesmo volume de água não teve efeito (Figura 19). Consequentemente, os resultados demonstram que mCBS inibe perturbações induzidas por histona de coagulação de sangue total. EVIDÊNCIA IN VIVO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DE mCBS E

CBS EXEMPLO 17: mCBS E CBS PROTEGEM ÓRGÃOS CONTRA

LESÃO MEDIADA POR HISTONA

[0439] Este exemplo demonstra que mCBS e CBS podem proteger os camundongos contra danos a órgãos induzido por histona.

[0440] A injeção intravenosa de camundongos com histonas demonstrou resultar em formação de microtrombos em órgãos, lesão celular e disfunção de órgãos (Xu et al., Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. Novembro de 2009; 15(11):131821. 2009). Usando o modelo de camundongo para sepse como em Xu et al., 2009, os presentes inventores investigaram se mCBS e CBS podem proteger os camundongos contra danos a órgãos induzido por histona. Os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de mCBS ou CBS, em concentrações de 6,25, 25 e 100 mg/kg, ou um volume equivalente de PBS 10 min antes de uma injeção intravenosa de 50 mg/kg de histonas (ou um volume equivalente de PBS). Sangue foi coletado por via retro-orbital 4 h depois para análise de marcadores de lesão celular (lactato desidrogenase, LDH), disfunção hepática (alanina aminotransferase, ALT) e disfunção renal (creatinina, Creat) conforme escrito anteriormente. Os resultados são mostrados na Figura 20. Especificamente, usando estes resultados, os inventores puderam mostrar que mCBS e CBS, de uma maneira dependente de dose protegem animais contra lesão mediada por histona com preservação significativa de função hepática e renal demonstrada (Figura 20) enquanto CB não sulfatado foi inativo. EXEMPLO 18: mCBS PROTEGE CÉLULAS DENTRO DA

CORRENTE SANGUÍNEA CONTRA LESÃO MEDIADA POR HISTONA

[0441] Este exemplo demonstra que mCBS reduz e/ou impede reduções mediadas por histona em leucócitos, plaquetas e eritrócitos em circulação em camundongos.

[0442] A injeção de histonas em camundongos também mostrou induzir trombocitopenia grave. Consequentemente, os inventores neste exemplo investigaram o efeito protetor de mCBS em células dentro da corrente sanguínea após injeção intravenosa de histonas. Usando o modelo de camundongo como no exemplo anterior, os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de mCBS (ou um volume equivalente de PBS) 10 min antes de uma injeção intravenosa de 50 mg/kg de histonas (ou volume equivalente de PBS), então, 10 min depois foram sangrados retro- orbitalmente. O sangue total foi analisado acerca de números de leucócito,

plaqueta e eritrócito e concentração de hemoglobina usando um sistema de hematologia ADVIA 2120. Os resultados são mostrados na Figura 21. Os resultados demonstraram que não apenas os números de plaquetas em circulação são reduzidos significativamente dentro de minutos de injeção de histona, mas também leucócitos, eritrócitos (glóbulos vermelhos) e níveis plasmáticos de hemoglobina. Além disto, quando mCBS foi injetado antes de histonas, estes efeitos mediados por histona foram significativamente inibidos se não completamente abolidos (Figura 21).

[0443] Consequentemente, estes resultados indicam que mCBS protege as células dentro da corrente sanguínea contra lesão mediada por histona. EXEMPLO 19: CBS E mCBS INIBEM SEPSE Os inventores em seguida examinaram a eficácia de mCBS e CBS em modelos de punção de ligação cecal em ratos (CLP) de sepse moderada e grave. No exemplo de sepse moderada em que algumas mortes ocorreram (Figura 22A), mas uma resposta de SIRS é produzida, foi demonstrado que o tratamento com mCBS reduziu significativamente os níveis de LDH em circulação em comparação com o grupo de CLP de controle (0,6 ± 0,1 e 1,1 ± 0,2 U/l x 103, p=0,03; Figura 22B). Nenhuma diferença foi encontrada em níveis de ALT ou creatinina entre os grupos, confirmando a indução de uma forma mais branda de sepse (dados não mostrados).

[0444] No exemplo de sepse grave em que a morbidade foi muito mais pronunciada, a mortalidade de roedor foi significativamente menor em animais que recebem CBS em comparação com controles de PBS, de fato, não houve mortalidade no grupo de Tratamento com CBS (Figura 23A). De modo importante, os altos níveis de ALT e creatinina detectados no grupo não tratado, indicativos de dano extensivo no fígado e rins, não foram vistos nos animais tratados com CBS (Figura 23B).

[0445] Coletivamente, estes resultados indicam que CBS e o mCBS mais estável podem limitar os efeitos mediados por histona de sepse e

SIRS, portanto, limitante dano a tecido e preservando a função do órgão final. EXEMPLO 20: CBS E mCBS INIBEM IRI

[0446] Para investigar a capacidade de CBS e mCBS de inibir IRI, um modelo de IRI cardíaco de rato (cIRI) foi empregado. A zona isquêmica foi igual entre grupos (Figura 24A). O tratamento com CBS reduziu significativamente a área de obstrução microvascular (Figura 24B) e necrose do miocárdio na zona isquêmica em 50% (Figura 24C). Além disto, num modelo de IRI de retalho de pele de rato, mCBS aumentos de modo consistente e significativo a área viável do retalho de pele (Figura 25). EXEMPLO 21: CBS INIBE TROMBOSE VENOSA

[0447] Para examinar se CBS controla os efeitos vasculares localizados de histonas, um modelo mediado por histona de trombose de veia profunda (DVT) foi estabelecido e mostrou ser quase totalmente inibido por CBS (Figura 26).

[0448] Estes dados são consistentes com patologias vasculares tanto sistêmicas quanto localizadas mediadas por histonas livres que são suscetíveis à inibição por CBS/mCBS. EXEMPLO 22: mCBS INIBE AUTOIMUNIDADE

[0449] Os inventores em seguida avaliaram a capacidade de mCBS de inibir um modelo de animal de autoimunidade chamada encefalomielite autoimune experimental (EAE) que se assemelha à esclerose múltipla em seres humanos. Os dados são mostrados na Figura 27 e revelaram que mCBS, quando administrado diariamente, resultaram em proteção substancial dos camundongos contra desenvolvimento de EAE durante um intervalo de 35 dias.

[0450] Nos exemplos acima, os inventores descrevem o desenvolvimento de moléculas polianiônicas pequenas como inibidores in vitro muito eficazes de diversos processos patológicos mediados por histonas livres, tal como citotoxicidade, fragilidade/deformabilidade de eritrócito e ativação de plaquetas.

[0451] Estes dados também fornecem dados de prova de conceito de que CBS/mCBS podem inibir enfermidades mediadas por histona, incluindo sepse, IRI, trombose e autoimunidade.

[0452] Em seres humanos e animais, mCBS é altamente estável e bem tolerado em altas doses, em que a única característica limitante de dose é a atividade autocoagulante, entretanto, esta atividade é 110 vezes menor que heparina LMW e 750 vezes menor que heparina não fracionada. Assim, mCBS representa uma nova classe de produto terapêutico com potencial clínico considerável.

Claims (53)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um composto para o tratamento ou prevenção de uma enfermidade mediada por histona extracelular caracterizado pelo fato de que o composto compreende um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enfermidade mediada por histona extracelular é selecionada do grupo que compreende, porém sem limitação: (a) respostas inflamatórias sistêmicas à infecção tal como, por exemplo, sepse (incluindo sepse induzida por bactérias, vírus, fungos, parasita, prião) ou a indutores não infecciosos incluindo cirurgia, trauma, hemorragia, queimaduras, pancreatite aguda e lesão renal aguda. (b) hipoxia no nível de tecido localizado , por exemplo, após o bloqueio de uma artéria devido à aterosclerose, ruptura espontânea de um vaso, dano traumático a um vaso e incluindo IRI cardíaca e associada ao transplante; ou no nível de corpo inteiro após a interrupção da respiração, por exemplo, devido a afogamento, exposição a gases ou parada cardiorrespiratória e inclui doenças tais como, por exemplo, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar obstrutiva crônica e lesão tecidual mediada por fármaco; (c) hemostase ou obstrução vascular tal como, por exemplo, doença cardiovascular ou doença cardiovascular crônica, tal como aterosclerose, coagulação e trombose (por exemplo, trombose venosa profunda), (d) estados de doença autoimune e estados de doença de inflamação tais como, por exemplo: esclerose múltipla, estados de doença hiper-inflamatória, lúpus eritematoso sistêmico, espondiloartropatia, espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa, artrite enteropática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino irritável, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, vasculite associada (AAV) a anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo (ANCA), tal como granulomatose com poliangite, granulomatose eosinofílica com poliangite e poliangite microscópica, caracterizada por destruição e inflamação de pequenos vasos, febre familiar do Mediterrâneo, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Sjögren, artrite precoce, artrite viral, psoríase, fibrose de órgão relacionada à idade, fibrose pulmonar idiopática, diabetes juvenil (Tipo I), diabetes mellitus (Tipo 2), síndrome antifosfolipídeo e diversas doenças do sistema nervoso central tais como doença de Huntington.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enfermidade mediada por histona extracelular é sepse, SIRS ou IRI, ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o celobiosídeo sulfatado modificado com um substituinte pequeno não carregado em sua terminação de redução tem a estrutura geral de: sendo que: R1 é um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado; e R2 a R8 são, cada um, um substituinte pequeno ligado a O não carregado ou um grupo sulfato.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R1 é O ou S-(C1-6)alquila.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que R1 é um grupo metóxi ou etóxi.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6,

caracterizado pelo fato de que R2 a R8 são, cada um, selecionados a partir de: O-sulfato ou N-sulfato.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o composto é dissacarídeo de β-O-metil celobiosídeo sulfatado.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto é sulfato de β-O-metil celobiosídeo de sódio.

10. Método para tratar ou prevenir uma enfermidade mediada por histona extracelular caracterizado pelo fato de que o referido método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a enfermidade mediada por histona extracelular é selecionada do grupo que compreende, porém sem limitação: (a) respostas inflamatórias sistêmicas à infecção tal como, por exemplo, sepse (incluindo sepse induzida por bactérias, vírus, fungos, parasita, prião) ou a indutores não infecciosos incluindo cirurgia, trauma, hemorragia, queimaduras, pancreatite aguda e lesão renal aguda. (b) hipoxia no nível de tecido localizado , por exemplo, após o bloqueio de uma artéria devido à aterosclerose, ruptura espontânea de um vaso, dano traumático a um vaso e incluindo IRI cardíaca e associada ao transplante; ou no nível de corpo inteiro após a interrupção da respiração, por exemplo, devido a afogamento, exposição a gases ou parada cardiorrespiratória e inclui doenças tais como, por exemplo, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar obstrutiva crônica e lesão tecidual mediada por fármaco; (c) hemostase ou obstrução vascular tal como, por exemplo, doença cardiovascular ou doença cardiovascular crônica, tal como aterosclerose, coagulação e trombose (por exemplo, trombose venosa profunda), (d) estados de doença autoimune e estados de doença de inflamação tais como, por exemplo: esclerose múltipla, estados de doença hiper-inflamatória, lúpus eritematoso sistêmico, espondiloartropatia, espondilite anquilosante, artrite psoriática, artrite reativa, artrite enteropática, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença do intestino irritável, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, vasculite associada (AAV) a anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo (ANCA), tal como granulomatose com poliangite, granulomatose eosinofílica com poliangite e poliangite microscópica, caracterizada por destruição e inflamação de pequenos vasos, febre familiar do Mediterrâneo, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Sjögren, artrite precoce, artrite viral, psoríase, fibrose de órgão relacionada à idade, fibrose pulmonar idiopática, diabetes juvenil (Tipo I), diabetes mellitus (Tipo 2), síndrome antifosfolipídeo e diversas doenças do sistema nervoso central tais como doença de Huntington.

12. Método para tratar ou prevenir sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito caracterizado pelo fato de que o referido método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada à patologia mediada por histonas extracelulares no sujeito, e o referido método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo suficiente para tratar ou prevenir a referida doença ou condição de sepse, SIRS ou IRI no sujeito.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a condição médica ou doença é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada a uma liberação de histonas extracelulares no sujeito.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz do celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado é suficiente para reduzir, minimizar ou inibir a patologia mediada por histona extracelular no sujeito.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para reduzir, minimizar ou inibir histonas extracelulares que são (i) citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito, ou (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito, ou (iii) iniciam a coagulação mediante a ativação de plaquetas num sujeito, ou (iv) induzem a fragilidade de hemácia e anemia resultante num sujeito.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo numa dose única.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em doses múltiplas.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito, ao mesmo tempo ou concomitantemente, um segundo agente ativo selecionado do grupo que consiste em: um agente anti-inflamatório, agente antibiótico, agente antiviral, agente antifúngico ou uma outra forma de intervenção médica como um tratamento adjunto para condição médica ou doença que é tratada.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo compreende um ou mais agentes anti- inflamatórios.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende tratar sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito que tem ou é suspeito de ter sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 21, caracterizado pelo fato de que o método compreende prevenir sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito em risco de desenvolver sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

23. Uso de uma composição terapêutica que compreende pelo menos um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que se destina ao tratamento ou prevenção de uma enfermidade mediada por histona extracelular.

24. Uso de uma composição terapêutica que compreende pelo menos um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador, excipiente e/ou diluente farmaceuticamente aceitável caracterizado pelo fato de que se destina ao tratamento ou prevenção de uma enfermidade mediada por histona extracelular.

25. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que se destina à fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a sepse ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada à patologia mediada por histona extracelular no sujeito.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS ou IRI ou condição médica ou doença é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada a uma liberação de histonas extracelulares no sujeito.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS ou IRI ou condição médica ou doença é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada a uma liberação de histonas extracelulares após uma inflamação ou uma resposta inflamatória no sujeito.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que as histonas extracelulares são citotóxicas em direção ao endotélio no sujeito e/ou contribuem para a disfunção de endotélio no sujeito.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que o medicamento reduz, minimiza ou inibe a patologia mediada por histona extracelular no sujeito.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o medicamento reduz, minimiza ou inibe a patologia mediada por histona extracelular em direção ao endotélio no sujeito.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30,

caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para administração de dose única ao sujeito.

33. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para administração de dose múltipla ao sujeito.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para a administração ao sujeito ao mesmo tempo ou concomitantemente, um segundo agente ativo selecionado do grupo que consiste em: um agente anti- inflamatório, agente antibiótico, agente antiviral, agente antifúngico ou uma outra forma de intervenção médica como um tratamento adjunto para a sepse, SIRS ou IRI ou a condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

35. Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo compreende um ou mais agentes anti- inflamatórios.

36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 35, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para tratar sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito que tem ou é suspeito de ter sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 35, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para tratar sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito em risco de desenvolver sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

38. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo caracterizado pelo fato de que se destina ao tratamento ou à prevenção de sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito.

39. Uso, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS o IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada à patologia mediada por histona extracelular no sujeito.

40. Uso, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS ou IRI ou condição médica ou doença é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada a uma liberação de histonas extracelulares no sujeito.

41. Uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a sepse, SIRS ou IRI ou condição médica ou doença é causada por e/ou mediada por e/ou envolve e/ou associada a uma liberação de histonas extracelulares após uma inflamação ou uma resposta inflamatória no sujeito.

42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que as histonas extracelulares são (i) citotóxicas em direção ao endotélio num sujeito, (ii) contribuem para a disfunção endotelial num sujeito, (iii) iniciam a coagulação mediante a ativação de plaquetas num sujeito ou (iv) induzem a fragilidade de hemácia e anemia resultante num sujeito.

43. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é suficiente para reduzir, minimizar ou inibir a patologia mediada por histona extracelular no sujeito e/ou em que o referido uso reduz, minimiza ou inibe a patologia mediada por histona extracelular no sujeito.

44. Uso, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para reduzir, minimizar ou inibir a patologia mediada por histona extracelular em direção ao endotélio no sujeito e/ou em que o referido uso reduz, minimiza ou inibe a patologia mediada por histona extracelular em direção ao endotélio no sujeito.

45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 44, caracterizado pelo fato de que o referido uso compreende o uso de uma dose única da quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, no tratamento ou prevenção da sepse, SIRS ou IRI ou a condição médica ou doença associada à sepse, SIRS ou IRI no sujeito.

46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 44, caracterizado pelo fato de que o referido uso compreende o uso de doses múltiplas da quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, no tratamento ou prevenção da sepse, SIRS ou IRI ou a condição médica ou doença associada à sepse, SIRS ou IRI no sujeito.

47. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende o uso da quantidade terapeuticamente eficaz de um celobiosídeo sulfatado polianiônico modificado com um substituinte pequeno ligado glicosidicamente não carregado em sua terminação de redução ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e uma quantidade de um segundo agente ativo selecionado do grupo que consiste em: um agente anti-inflamatório, agente antibiótico, agente antiviral, agente antifúngico ou uma outra forma de intervenção médica como um tratamento adjunto para a sepse, SIRS ou IRI ou a condição médica ou doença associada à sepse, SIRS ou IRI.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo compreende um ou mais agentes anti- inflamatórios.

49. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 48,

caracterizado pelo fato de que o referido uso compreende tratar sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito que tem ou é suspeito de ter sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

50. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 48, caracterizado pelo fato de que o referido uso compreende prevenir sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI num sujeito em risco de desenvolver sepse, SIRS ou IRI ou uma condição médica ou doença associada a sepse, SIRS ou IRI.

51. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, método, de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 21 ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende melhorar sepse, SIRS ou IRI ou a doença ou a condição médica associada a sepse, SIRS ou IRI.

52. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, método, de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 22 ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende inibir sepse, SIRS ou IRI ou a doença ou a condição médica associada a sepse, SIRS ou IRI.

53. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, método, de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 22 ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizado pelo fato de que a doença ou a condição médica associada a sepse, SIRS ou IRI é um estado doentio diferente de SIRS, IRI ou não séptico.