JP2005336145A

JP2005336145A - リポソーム型筋ジストロフィー治療薬

Info

Publication number: JP2005336145A
Application number: JP2004161330A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Kamioka; 龍一上岡; Yoko Matsumoto; 陽子松本; Shigemi Kimura; 重美木村
Original assignee: Kimigafuchi Gakuen
Current assignee: Kimigafuchi Gakuen
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2005-12-08

Abstract

【課題】安全性が高く、筋ジストロフィーの治療に有効な筋ジストロフィー治療薬を提供すること。
【解決手段】 L-α-ジミリストイルホスファチルコリンなどのリン脂質とミセル形成性界面活性剤を含有するリポソーム内に硫酸ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質が収容されてなるリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。
【選択図】なし

Description

本発明は、リポソームに活性成分を収容してなるリポソーム型筋ジストロフィー治療薬に関する。

病気の診断や病巣の状態は把握できていても、治療方法や有効な治療薬が見つからない難治性の疾患も数多くある。その難治性疾患のひとつに、筋ジストロフィーがある。
筋ジストロフィーとは、「筋繊維の壊死を主病変とする遺伝性疾患である」と定義されている。筋ジストロフィーで共通している症状、その遺伝形式や臨床的特徴から現在では、筋ジストロフィーは次のように分類される。
第１は、X連鎖劣性遺伝に関係するものであって、次の２つに分類されている。
(1) Duchenne型筋ジストロフィー
頻度に人種差はなく、男児出生3500人に当たり1人といわれている。X連鎖劣性遺伝をとり、遺伝子座はX染色体短腕(Xp21)にあり、cDNAで14kb, 79のエクソンから成る。患者の約50~60%はジストロフィン遺伝子の欠失で、10%が重複、残りは点変異などと考えられている。
遺伝子産物は分子量427kDのジストロフィンという蛋白で、筋細胞膜に局在する。患者では筋細胞膜にジストロフィンが全く存在しない。このことは筋ジストロフィーの壊死を説明する「膜説」を支持するものとされている。
症状としては、1歳で少し歩き始めが遅くなり、6〜10歳で歩行不能となり、20歳前後で呼吸不全（80%）、あるいは心不全（20%）で死亡する。しかし最近では人工呼吸器の普及により寿命は大幅に延長している。

(2) Becker型筋ジストロフィー
Duchenne型：Becker型の頻度は2：1〜3：1といわれている。Duchenne型筋ジストロフィーと比べ、ジストロフィン遺伝子に変異があり、ジストロフィン蛋白は量的には少ないが存在する。
症状としては、Duchenne型筋ジストロフィーと比較し、発症も進行も遅く、15歳を過ぎても歩行が可能である。
第２は、常染色体劣性遺伝に関係するものであって、これも次の２つに分類されている。
(3) 肢体型筋ジストロフィー
筋ジストロフィーで、Duchenne型や先天型のように臨床的特徴に欠けるものを総称している。本症のごく一部のみが常染色体優性遺伝をとり、残りの大多数は弧発性で常染色体劣性遺伝と考えられている。また、肢体型の70%前後は依然として、その原因が不明である。

(4) 福山型先天性筋ジストロフィー
現在まで、本症は日本人に限られており、頻度は日本人10万人に1〜2人で、保因者は日本人70~80人に1人である。第９染色体長腕（9q31）に遺伝子座がある。cDNAは約8kb, 461個のアミノ酸から成る未知のタンパク（フクチン）をコードしている。
Duchenne／Becker型筋ジストロフィーの患者はジストロフィン遺伝子を欠損しており、生検筋の凍結切片を抗ジストロフィン抗体を用いて免疫組織染色をすると、正常筋では、筋形質膜に一致して明瞭な免疫反応が認められる。一方Duchenne型筋ジストロフィーではジストロフィンの免疫反応が陰性であり、Becker型筋ジストロフィーでは量的、質的に不完全ながらも筋表面膜に存在する。
ジストロフィンはアミノ末端基でアクチンと結合しており、またその一方で、サルコグリカン複合体、ジストログリカン複合体、シントロフィン複合体との結合を通じて細胞外マトリックスであるラミニンと結合している。
タンパク質の生合成はmRNAがリボソームに結合するところから始まる。リボソームにはコドン2個分の読み取りスペースがあり、そこに２つのコドンに対応するtRNAが結合する。2つのコドンにtRNAが結合すると、左側のアミノ酸がペプチド結合する。このようにコドン1つ分ずつずれることでタンパク質が合成される。

Duchenne型筋ジストロフィーは点突然変異により1つのコドンがタンパク質の合成終了を意味するストップコドンに変化し、ジストロフィンタンパク質が合成されない病気である。
上記種々の原因による筋ジストロフィーの治療には、抗生物質であるゲンタマイシンが用いられており、これを投与すると、ストップコドンを読みとばすRead-through(Figure.1-1)という現象を起こし、ジストロフィンの発現を生じることが報告されている。
しかしながら、ジストロフィンを発現させるためには、高濃度のゲンタマイシンの投与が必要であり、それによる腎毒性や聴覚障害、細胞死などの副作用が生じてしまうとの問題がある。
一方、筋ジストロフィーの治療薬の活性成分として、これまでに多数の化合物が提案されている。例えば、チオールプロテアーゼインヒビター（特許文献１及び２）、ニューロン活性を有する特定の構造のＮ−ヘテロ環誘導体（特許文献３）、特定のキヌクリジン誘導体（特許文献４）などである。

特開昭５９−１５５３２４号公報特開昭５９−１９９６３１号公報特開2003−503480号公報特開2003−503500号公報

本発明は、安全性が高く、筋ジストロフィーの治療に有効な筋ジストロフィー治療薬を提供することを目的とする。

本発明は、特定の成分で構成されたリポソーム内にアミノグリコシド系抗生物質を収容した形態とすると、上記課題を効果的に解決できるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、リン脂質とミセル形成性界面活性剤を含有するリポソーム内にアミノグリコシド系抗生物質が収容されてなることを特徴とするリポソーム型筋ジストロフィー治療薬を提供する。

本発明によれば、安全性が高く、筋ジストロフィーの治療に有効な筋ジストロフィー治療薬が提供される。

本発明で用いるリン脂質としては、L-α-ジアシルホスファチジルコリン、L-α-ジアシルホスファチジルグリセロール、L-α-ジアシルホスファチジルセリン、L-α-ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、L-α-ジアシルホスファチジン酸、L-α-ジアシルホスファチジルイノシトールおよびカルジオリピン等の１種又は２種以上の混合物が挙げられる。ここで、各２つのアシル基は安定なハイブリッド型リポソームを形成する限り同じであっても異なっていてもよく、アシル基部分の炭素数は約10〜約22のものが好ましい。特に好ましいのは、以下の式で表されるL-α-ジミリストイルホスファチルコリン(DMPC)及びL-α-ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)である。

DMPC

DMPG

これらのリン脂質は、リポソームにおいてベシクルとして用いられる。

本発明で用いるミセル形成性界面活性剤としては、ミセルを形成できる界面活性剤であれば、何れも使用することができる。このうち、非イオン界面活性剤が好ましく、特に通常「ツイーン」の名称で販売されている界面活性剤、例えば、ツイーン20〜ツイーン80等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、または、通常「スパン」の名称で販売されている界面活性剤、例えば、スパン20〜スパン80等のソルビタン脂肪酸エステル、または、以下の一般式(I)で表されるアルキル若しくはアリールポリオキシエチレングリコールが好ましい。

（I）
（式中ｎ＝10〜25、ｍ＝12〜20、Ｚ＝Ｃ₁〜Ｃ₁₂のアルキル基）

より具体的には、ポリキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン20（Tween20））および、一般式（I）中、ｍが12〜14でかつｎが10〜23であるアルキルポリオキシエチレングリコールである。特に好ましいのは、ｍが12または14でｎが10または12のアルキルポリオキシエチレングリコールである。
さらに、特開2000−290170号公報の第４頁に記載の一般式（II）で表されるアルキルグルコシド、一般式（III）で表されるアルキルチオグルコシド、一般式（IV）を有するガラクトセレブロシド、または糖部分がグルコースであるグルコセレブロシドなどの単糖のほか、一般式（V）で表されるアルキルマルトピラノシド、一般式（VI）で表されるフルクトフラノシルアルキルグルコピラノシド、一般式（VII）で表されるアルキルラクトピラノシドなどの二糖、アミロース、イヌリンなどの多糖を用いることができる。これらの糖ミセル形成性界面活性剤中、β-D-フルクトフラノシル-α-D-グルコピラノシドが好ましい。アルキル基はミセルを形成し得る限り分枝または非分枝状でよく、炭素数はいずれの糖ミセル形成性界面活性剤においても一般に８から18が好ましく、より好ましくは８〜16、更に好ましくは８〜10である。特に好ましいのは、β-D-フルクトフラノシル-α-D-グルコピラノシドモノデカノエート(DeFG)（一般式（VI）中、n=８）および、β-D-フルクトフラノシル-α-D-グルコピラノシドモノドデカノエート(DoFG)（一般式（VI）中、n=10）である。

本発明では、リン脂質及びミセル形成性界面活性剤を用いてリポソームを形成する。ここで、「リポソーム」とは、生体膜の構成成分であるリン脂質を水中に比較的低濃度で分散させたときに形成される閉鎖小胞体である。ここで形成されるリポソームは、複合脂質膜とも、又２成分系ハイブリッド型リポソーム又は３成分系ハイブリッド型リポソームなどともいわれる。「ハイブリッド型リポソーム」とは、１種以上のリン脂質と１種以上の界面活性剤、および必要に応じて更に他の成分を含むリポソームをいう。本明細書において、1種以上のリン脂質と1種以上の非糖ミセル形成性界面活性剤を含み、糖ミセル形成性界面活性剤を含まないリポソームを特に「２成分系ハイブリッド型リポソーム」と呼び、1種以上のリン脂質と1種以上の非糖ミセル形成性界面活性剤と１種以上の糖ミセル形成性界面活性剤を含むリポソームを特に「３成分系ハイブリッド型リポソーム」と呼ぶことがある。

本発明のハイブリッド型リポソームにおけるリン脂質とミセル形成性界面活性剤との使用量はリポソームを形成することができる限り任意とすることができるが、リン脂質濃度を１ｘ10^-5〜５ｘ10^-3M、ミセル形成性界面活性剤濃度を1x10^-6〜１ｘ10^-3Mとするのが適切である。また、リン脂質とミセル形成性界面活性剤との使用比率は任意とすることができるが、リン脂質とミセル形成性界面活性剤とを50:50〜98:2（重量比）とするのがよく、70:30〜95:5とするのがより好ましい。

本発明で用いるアミノグリコシド系抗生物質としては、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシンなどがあげられる。これらのうち、ゲンタマイシン又はその酸付加塩が好ましく、特に硫酸ゲンタマイシンが好ましい。
アミノグリコシド系抗生物質の量は任意とすることができるが、リポソーム１００質量部当たり、0.07〜0.70質量部とするのがよい。

本発明のアミノグリコシド系抗生物質を含有するハイブリッド型リポソームは前述のようなリン脂質、ミセル形成性界面活性剤及びアミノグリコシド系抗生物質を前述したような適切な量と比率で緩衝水溶液中で混合し、適切な温度にて比較的短時間超音波処理することによって得られる。また、本発明の３成分系ハイブリッド型リポソームは、前述のような超音波処理をした後、糖ミセル形成性界面活性剤を添加し、さらに同様な条件で超音波処理をすることによって調製できる。緩衝水溶液としては、ハイブリッド型リポソームが形成される範囲で任意に選択できるが、生体と共存可能な緩衝水溶液、例えばpH7.0〜8.0の範囲のリン酸緩衝液等を使用することが好ましく、具体的にはPBS（リン酸緩衝生理食塩水）等を使用することができる。

本発明のハイブリッド型リポソーム製剤であるリポソーム型筋ジストロフィー治療薬は筋ジストロフィー患者に対して直接投与することができ、例えば、患者体重１kgあたり50〜300μg／１日を腹腔内、静脈内投与することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１
複合脂質膜をキャリアーとして用い、それにゲンタマイシンを封入したゲンタマイシン封入複合脂質膜の筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）に対する治療効果および安全性について検討を行った。また、ゲルろ過法によるゲンタマイシン封入複合脂質膜と未封入ゲンタマイシンの分離を行った。
試料
リン脂質：L-α-dimyristoylphosphatidylcholine（DMPC）；市販品（日本油脂）をそのまま使用した。構造式は、上述した通りである。
界面活性剤：Poly(oxyethyene(23)) lauryl ether（C₁₂(EO)₂₃）；市販品（シグマ）をエーテル再結晶したものを使用した。以下に構造式および元素分析の結果を示す。
ＣＨ₃（ＣＨ₂）₁₁−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂₃Ｈ
mp.40.2〜41.0℃
分析値 C 57.78%, H 9.98%
理論値 C 58.04%, H 9.94%
抗生物質：硫酸ゲンタマイシン（Gentamicin ; GM）；試験研究用（シェリング・プラウ）をそのまま使用した。以下に構造式を示す。（Mw : C1=477, C2=463, C1a=449）,（617μg力価/mg 含水物）

ゲンタマイシン封入複合脂質膜の調製法
リン脂質30mMおよび界面活性剤16mM、さらにゲンタマイシン0.02mMを加え、緩衝水溶液(PBS(-))中で、バス型超音波照射器(VELVO-CLEAR-ULTRASON VS-N300, 300W)による超音波照射によって均一で透明な溶液を得た後、0.20μmフィルターで濾過滅菌したものを試料溶液として用いた。
ジストロフィン抗体を用いた免疫組織染色法
筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）に1日に2回、14日間サンプルを投与した後、組織分離を行い、ジストロフィン抗体を用いて免疫組織染色を行い、蛍光顕微鏡により観察を行った。組織でのジストロフィン染色は、1次抗体をDys-2 (NOVOCASTWERA)を使用し、バックを減らすためにM.O.M (Vector社)を用いてブロッキングをし、2次抗体をビオチン抗マウスIgG抗体で標識し、次いでABCキット (Vector社)を用いてペルオキシダーゼを標識し、DABで発色させた。ジストロフィンの陽性線維率は無作為に３ヶ所を選びその平均をそのマウスでの陽性率とした。

筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）を用いた血液検査
筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）に1日に2回、14日間サンプルを投与した後、採血を行い、筋ジストロフィー発症の際、上昇するクレアチンキナーゼ（CK）および腎不全マーカー（クレアチニン(Cre), β2-MG）の測定を行った。
結果と考察
筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）を用いた治療実験
ゲンタマイシン封入複合脂質膜およびゲンタマイシンのみをmdxマウスに投与後、採血, 組織分離を行い、ジストロフィン抗体を用いた免疫組織染色、クレアチンキナーゼ（CK）量, ジストロフィン発現率の測定し、mdxマウスに対する治療効果について検討した。結果を図1〜3に示す。
ゲンタマイシンのみの投与に比べ、ゲンタマイシン封入複合脂質膜を投与した場合は、約2倍のジストロフィン発現率が確認され(図1及び2)、CK量が正常値に近づくことが明らかとなった(図3)ので、本発明のゲンタマイシン封入複合脂質膜の筋ジストロフィーに対する顕著な治療効果が明らかになった。

筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）を用いた安全性試験
mdxマウスにゲンタマイシン封入複合脂質膜およびゲンタマイシンのみを投与後、採血を行い、腎不全マーカー（クレアチニン（Cre））値を測定した。結果を図４に示す。
図４の結果から、ゲンタマイシンのみの投与後のmdxマウスに比べ、ゲンタマイシン封入複合脂質膜投与後のmdxマウスは、正常値に近い値が得られるので、ゲンタマイシン封入複合脂質膜は副作用を軽減し、高い安全性を有することが明らかとなった。

ゲンタマイシン含有ハイブリッドリポソーム投与後の筋ジストロフィーマウスの筋肉組織の蛍光顕微鏡写真を示す。未治療（1）、DMPC/5mol%C₁₂(EO)₂₃(ゲンタマイシン) 投与（2）及びゲンタマイシンのみ投与（3）の場合のジストロフィン発現率を示す。正常筋（1）、未治療（2）、ゲンタマイシンのみ投与（3）及びDMPC/5mol%C₁₂(EO)₂₃(ゲンタマイシン) 投与（4）の場合のクレアチンキナーゼ(CK)量を示す。未治療（1）、ゲンタマイシンのみ投与（2）及び DMPC/5mol%C₁₂(EO)₂₃(ゲンタマイシン) 投与（3）の場合のクレアチニン値を示す。

Claims

リン脂質とミセル形成性界面活性剤を含有するリポソーム内にアミノグリコシド系抗生物質が収容されてなることを特徴とするリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。
リン脂質がL-α-ジアシルホスファチジルコリン、L-α-ジアシルホスファチジルグリセロール、L-α-ジアシルホスファチジルセリン、L-α-ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、L-α-ジアシルホスファチジン酸、L-α-ジアシルホスファチジルイノシトールおよびカルジオリピンよりなる群から選ばれる請求項1記載のリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。
ミセル形成性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびアルキル若しくはアリールポリオキシエチレングリコールよりなる群から選ばれる、請求項１または２記載のリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。
アミノグリコシド系抗生物質が、ゲンタマイシン又はその酸付加塩である請求項１〜３の記載のリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。
アミノグリコシド系抗生物質が、硫酸ゲンタマイシンである請求項４記載のリポソーム型筋ジストロフィー治療薬。