JP2005532421A

JP2005532421A - 生物学的活性を有するグリコデンドリマー

Info

Publication number: JP2005532421A
Application number: JP2003585761A
Authority: JP
Inventors: シャウナク，スニル; ジアナシ，エリサベッタ; ダンカン，ルース
Original assignee: ポリテリクスリミテッド
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-03-18
Publication date: 2005-10-27
Also published as: GB0209022D0; AU2003214422A1; WO2003089010A1; US8058344B2; EP1496941A1; AU2003214422B2; US20050214247A1

Abstract

【課題】生物学的活性を有するグリコデンドリマーを提供する。
【解決手段】本発明は、生物学的活性を有する新規なアニオン性グリコデンドリマー、その製造方法、及び動物薬を包含する医薬におけるその使用方法に関するものである。

Description

本発明は、新規生物学的活性を有する新規グリコデンドリマー、その製造方法及び動物薬を包含する医薬におけるその使用に関するものである。

グリコデンドリマーは、その高度に分岐しているがしかし環状で且つ対称的構造により、慣用の直鎖状ポリマーと区別され得るポリマー状化合物の一種である（図１ａ及び図１ｂを参照）。それらは、直鎖状ポリマーに対して可能であるよりもより一層正確に定義され得る分子構造を有している［トマリアディーエイ（ＴｏｍａｌｉａＤＡ）、ネイラーエイエム（ＮａｙｌｏｒＡＭ）、ゴダードＩＩＩダブリュエイ（ＧｏｄｄａｒｄＩＩＩＷＡ）、１９９０年、「星形デンドリマー：寸法、形状、表面化学、トポロジー及び原子から巨視的物質までのフレキシビリティー（Ｓｔａｒｂｕｒｓｔｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｉｚｅ，ｓｈａｐｅ，ｓｕｒｆａｃｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｏｐｏｌｏｇｙａｎｄｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙｆｒｏｍａｔｏｍｓｔｏｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍａｔｔｅｒ）」、英語でのアンゲヴァンテヒェミー国際版２９、第１３８〜１７５頁］。星形ポリマー［ＳＴＡＲＢＵＲＳＴｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｒ）］［ミシガン州、ミッドランドのデンドリテックインコーポレイテッド（ＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈＩｎｃ．）の登録商標］は、密集した星形ポリマーである。それらは、分岐された層の世代的付加によりコアから形成された特定の型のデンドリマーである。典型的には、それらは世代１．５、２．５、３．５、５．５、７．５及び９．５について入手可能である。世代は、分子が合成される方法及びそれらの重量に関する表現である。それらは、１６個（世代１．５）から４０９６個（世代９．５）までの末端カルボン酸基を有する。
トマリアディーエイ（ＴｏｍａｌｉａＤＡ）、ネイラーエイエム（ＮａｙｌｏｒＡＭ）、ゴダードＩＩＩダブリュエイ（ＧｏｄｄａｒｄＩＩＩＷＡ）、１９９０年、「星形デンドリマー：寸法、形状、表面化学、トポロジー及び原子から巨視的物質までのフレキシビリティー（Ｓｔａｒｂｕｒｓｔｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｓｉｚｅ，ｓｈａｐｅ，ｓｕｒｆａｃｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｏｐｏｌｏｇｙａｎｄｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙｆｒｏｍａｔｏｍｓｔｏｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍａｔｔｅｒ）」、英語でのアンゲヴァンテヒェミー国際版２９、第１３８〜１７５頁。

国際特許公開第９５／２４２２１号パンフレット（ダウケミカルカンパニー）は、生物学的な応答調整剤と錯体化又は結合した、密集した星形ポリマーを含む樹木状ポリマー接合体を開示している。
国際特許公開第９５／２４２２１号パンフレット

デンドリマーの反応性末端基は分子の外面に存在し、そしてこれらの基は、カチオン性又はアニオン性で有り得る［ニューコムジーアール（ＮｅｗｋｏｍｅＧＲ）、ナヤックエイ（ＮａｙａｋＡ）、ベヘラアールケイ（ＢｅｈｅｒａＲＫ）、モアフィールドシーエヌ（ＭｏｏｒｅｆｉｅｌｄＣＮ）、ベイカージーアール（Ｂａｋｅｒ
ＧＲ）及びジョンソンエイエル（ＪｏｈｎｓｏｎＡＬ）、１９９２年、「ミセルシリーズの化学、第２２回、カルケードポリマー−アダマンタンをベースとする４方向性球状樹木状高分子の合成及びキャラクタリゼーション（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｍｉｃｅｌｌｅｓｓｅｒｉｅｓ．２２．ｃａｓｃａｄｅｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ４−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｓｐｈｅｒｉｃａｌｄｅｎｄｒｉｔｉｃｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｒｓｂａｓｅ
ｄｏｎａｄａｍａｎｔａｎｅ）」、ジャーナルオブオーガニックケミストリー第５７号、第３５８〜３６２頁］。末端基変性は通常、分岐アプローチにより製造されたデンドリマー、即ち、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭデンドリマー）及びポリ（プロピレンイミン）デンドリマー（ＤＡＢデンドリマー）において用いられる。デンドリマーの外面上の官能性基のこのような変性は、協調効果（ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓ）の帰結として、これらの分子の生物学的性質を非常に変更し得る［ジャンセン
ジェイエフジーエイ（ＪａｎｓｅｎＪＦＧＡ）、デブラバンダー−フォンデベルクイーエムエム（ｄｅＢｒａｂａｎｄｅｒ−ｖａｎｄｅＢｅｒｇＥＭＭ）及びメイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、１９９４年、「樹木状ボックス内へのゲスト分子の封止（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｕｅｓｔｍｏｌｅｃｕｌｅｒｓｉｎｔｏａｄｅｎｄｒｉｃｂｏｘ）」、サイエンス第２６６号、第１２２６〜１２２９頁］。協調効果を生じさせることが可能な化合物は、免疫系における生物学的制御機序を調節する際に非常に重要である。
ニューコムジーアール（ＮｅｗｋｏｍｅＧＲ）、ナヤックエイ（ＮａｙａｋＡ）、ベヘラアールケイ（ＢｅｈｅｒａＲＫ）、モアフィールドシーエヌ（ＭｏｏｒｅｆｉｅｌｄＣＮ）、ベイカージーアール（ＢａｋｅｒＧＲ）及びジョンソンエイエル（ＪｏｈｎｓｏｎＡＬ）、１９９２年、「ミセルシリーズの化学、第２２回、カルケードポリマー−アダマンタンをベースとする４方向性球状樹木状高分子の合成及びキャラクタリゼーション（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｍｉｃｅｌｌｅｓ．２２．ｃａｓｃａｄｅｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ４−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｓｐｈｅｒｉｃａｌｄｅｎｄｒｉｔｉｃｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｒｓｂａｓｅｄｏｎａｄａｍａｎｔａｎｅ）」、ジャーナルオブオーガニックケミストリー第５７号、第３５８〜３６２頁ジャンセンジェイエフジーエイ（ＪａｎｓｅｎＪＦＧＡ）、デブラバンダー−フォンデベルクイーエムエム（ｄｅＢｒａｂａｎｄｅｒ−ｖａｎｄｅＢｅｒｇＥＭＭ）及びメイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、１９９４年、「樹木状ボックス内へのゲスト分子の封止（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｕｅｓｔｍｏｌｅｃｕｌｅｒｓｉｎｔｏａｄｅｎｄｒｉｃｂｏｘ）」、サイエンス第２６６号、第１２２６〜１２２９頁

従来、新規で且つ独自の生物学的活性を持つ新規化合物を造るために、アニオン性デンドリマーに生物学的分子を共有結合させることは可能でなかった。

本発明は今や、アニオン性デンドリマーに分子、例えば生物学的に活性な分子を共有結合させる方法であって、前記デンドリマーをカップリング剤、例えば、カルボジイミドカップリング剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の存在下で、前記生物学的に活性な分子と反応させる方法を提供する（図２を参照）。反応は好ましくは、水性媒体中で行う。デンドリマー、例えば生物学的活性剤に結合される分子は、ドラッグ、核酸（特にＤＮＡ）、蛋白質、ペプチド、炭水化物及び、天然又は合成起源の抗体を包含する。

本発明の方法は、室温（即ち、典型的には４０℃以下）で行うことができる単一段階の水を基礎とする化学的手法を含むという利点を有する。本発明の方法は、生体内でしばしば毒性である有機溶媒の必要がないという別の利点を有する。更に、有機溶媒は、付加的
な煩雑で且つ費用がかかる、有機溶媒からの生成物の精製を必要とする。水性環境における結合、即ち、成分の共有結合は、最終生成物の精製を促進する。これは、新規ドラッグに対する工業的製造の観点において重要である。本発明の方法の特別な利点は、室温で接合を行うことができ、そして外部エネルギー源の使用を必要としないことである。

本発明の方法は、アニオン性グリコデンドリマーの製造のために特に有用である。

１９９６年に、ロイ（Ｒｏｙ）は、「マルチアンテナ形炭水化物を含む低分子量バイオポリマーの新規種類”としてグリコデンドリマーを定義した［ページディー（Ｐａｇｅ
Ｄ）及びロイアール（ＲｏｙＲ）、１９９７年、「マンノシル化された星形ポリ（アミドアミン）デンドリマーの合成及び生物学的性質（ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄＳｔａｒｂｕｒｓｔｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）」、バイオコンジュゲートケミストリー第８号、第７１４〜７２３頁］。それらは、最終段階で種々の炭水化物構造を取り込みに伴う分岐アプローチにより合成された。

グリコデンドリマーは、糖類残基が錯体又は接合体としてその中に取り込まれている、下記の二種類のうちの一種類として説明された［アシュトンピーアール（Ａｓｈｔｏｎ
ＰＲ）、ボイドエスイー（ＢｏｙｄＳＥ）、ブラウンシーエル（ＢｒｏｗｎＣＬ）、ネポゴディヴエスエイ（ＮｅｐｏｇｏｄｉｅｖＳＡ）、メイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、ピアーリングスエイチダブリュアイ（ＰｅｅｒｌｉｎｇｓＨＷＩ）及びシュトッダートジェイエフ（ＳｔｏｄｄａｒｔＪＦ）、１９９７年、「ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーの変性によるグリコデンドリマーの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｙｃｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓｂｙｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）」、ケミストリーアヨーロピアンジャーナル（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ）第３巻（第６号）、第９７４〜９８４頁］：
（ｉ）デンドリマーの末端基に結合した糖類残基の存在により特徴付けられる、炭水化物がコートされたデンドリマー、
（ｉｉ）全体的に炭水化物であるデンドリマーを生じさせるために、糖類が多官能性構築ブロックとして使用される完全な炭水化物デンドリマー。

糖類をキャリアに結合させることによりネオグリココンジュゲートが製造され得ることが知られているけれども、それらの外面上に第一級アミノ基を持つ予備形成されたデンドリマーのみが、炭水化物の結合用の高分子支持体として研究されていた［アシュトンピーアール（ＡｓｈｔｏｎＰＲ）、ボイドエスイー（ＢｏｙｄＳＥ）、ブラウンシーエル（ＢｒｏｗｎＣＬ）、ネポゴディヴエスエイ（ＮｅｐｏｇｏｄｉｅｖＳＡ）、メイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、ピアーリングスエイチダブリュアイ（ＰｅｅｒｌｉｎｇｓＨＷＩ）及びシュトッダートジェイエフ（ＳｔｏｄｄａｒｔＪＦ）、１９９７年、「ポリ（プロピレンイミン）デンドリマーの変性によるグリコデンドリマーの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｙｃｏｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ
ｂｙｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ）」、ケミストリーアヨーロピアンジャーナル（ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ）第３巻（第６号）、第９７４〜９８４頁］。この場合では、第一級アミンにより末端閉鎖されたデンドリマーは、種々の試薬を用いて比較的容易に変性され得る。これに対して、デンドリマーに異なる官能性活性を与えるため、カルボン酸により末端閉鎖されたアニオン性デンドリマーの表面上のカルボン酸基を変性することは可能でなかった。これが導いた生物学的問題は、アミンにより末端閉鎖されたデンドリマーは、生体内で、カルボン酸により末端閉鎖されたデンドリマーよりも甚だしく毒性であることである［マリクエヌ（ＭａｌｉｋＮ）、ウィワタナパ
タピアール（ＷｉｗａｔｔａｎａｐａｔａｐｅｅＲ）、クロプシュアール（ＫｌｏｐｓｃｈＲ）、ロレンズケイ（ＬｏｒｅｎｚＫ）、フレイエイチ（ＦｒｅｙＨ）、ウィーナージェイダブリュ（ＷｅｅｎｅｒＪＷ）、メイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、パウラスダブリュ（ＰａｕｌｕｓＷ）及びダンカンアール（ＤｕｎｃａｎＲ）、２０００年、「デンドリマー：生体外における構造と生物学的適合性との相間関係、及び生体内における¹²⁵Ｉ−標識されたポリアミドアミンデンドリマーの生物学的分布に関する初歩的な研究（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎ
ｔｈｅｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ ¹²⁵Ｉ−ｌａｂｅｌｌｅｄｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓｉｎｖｉｖｏ）」、ジャーナルオブ
コントロールドリリース第６５号、第１３３〜１４８頁］。従って、出発物質としてカルボン酸により末端閉鎖されたデンドリマーをベースとする新規グリコデンドリマーを開発することが重要であった。

別の観点において、本発明は今や、共有結合的に結合したカルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーを含む新規アニオン性グリコデンドリマーを提供する。本発明のグリコデンドリマーは、アニオン性デンドリマー、特にカルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーに共有結合的に結合した炭水化物部分を含む。用語‘グリコデンドリマー’は、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーの一種に共有結合的に結合した炭水化物部分を一種より多く含むグリコデンドリマー、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマー種の混合物に共有結合的に結合した炭水化物部分を一種含むグリコデンドリマー、及びカルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマー種の混合物に共有結合的に結合した炭水化物部分を一種より多く含むグリコデンドリマーを包含するために、本明細書中で使用される。

カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーは、例えば、１．５世代ないし９．５世代、例えば２．５世代又は３．５世代の何れかからの、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーである。カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマー種の混合物は、例えば、異なる世代、例えば１．５世代ないし９．５世代からの、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーの混合物である。例えば、２．５世代又は３．５世代のデンドリマーは、単独又は、他の世代のデンドリマーの何れかの一種又はそれより多くと組み合わせて使用され得る。

カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーは、例えば、カルボキシル基により末端閉鎖されたポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。例えば、１．５世代ないし９．５世代からのＰＡＭＡＭデンドリマー一種又はそれより多くが使用され得、例えば、１．５世代ないし９．５世代からのＰＡＭＡＭデンドリマーの世代混合物が使用され得る。例えば、デンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマー世代２．５又は３．５であるか、又は、ＰＡＭＡＭデンドリマー世代２．５又は３．５を含み得る。

好ましくは、デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、特に好ましいＰＡＭＡＭデンドリマーは、６４個までの末端閉鎖カルボキシル基を有する世代３．５のものである。

炭水化物部分は、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーに共有結合的に結合している。炭水化物基は、例えば、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖又は多糖、或いは１種又はそれより多くのそれらの組み合わせである。炭水化物基は、通常、一つ又はそれより多くのアミン基を含む。

炭水化物部分は好ましくは、アミノ糖又は硫酸化アミノ糖であり、該アミノ糖又は硫酸化アミノ糖は変性され得、例えば、アシル化、例えばＮ−アシル化され得る。炭水化物基は、例えば、グルコース、マンノース又はガラクトースから誘導され得る。前記炭水化物基は、例えば、グルコサミン、グルコサミンスルフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンスルフェート基である。グルコサミンスルフェートは、例えば、３位、４位及び６位の何れかの一つ又はそれより多くに、一つ又はそれより多くのスルフェート基を有し得る。グルコサミンスルフェートは、例えば、グルコサミン６−スルフェート、グルコサミン３，６−ジスルフェート又はグルコサミン３，４，６−トリスルフェートである。グルコサミンスルフェートはアセチル化、例えば、Ｎ−アセチル化されていてよい。Ｎ−アセチルグルコサミンスルフェートは、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン３，６−ジスルフェート又はＮ−アセチルグルコサミン３，４，６−トリスルフェートである。

マンノサミン及びガラクトサミン及びその誘導体、例えば、上記グルコサミン誘導体に対応する硫酸化及び／又はアシル化された誘導体、例えば、グルコサミンスルフェート及びＮ−アシル化グルコサミンであり、そしてＮ−アシル化グルコサミンスルフェートを使用してもよい。

本発明のグリコデンドリマーは、例えば、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、或いはデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルグルコサミン又はデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルグルコサミンスルフェート、或いはデンドリマー世代３．５−マンノサミン又はデンドリマー世代３．５−マンノサミンスルフェート又はデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルマンノサミン、或いはデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルマンノサミンスルフェート、或いはそれらのあらゆる組み合わせである。

好ましくは、デンドリマーは、例えば、アミン基、例えば第一級アミン基を包含するアミノ基を含む化合物、例えばアミノ糖又は硫酸化糖である。好ましい糖はグルコサミン又は硫酸化グルコサミンである。

本発明の一段階反応は、アミノ基を含む糖に対する及びアミノ基を含む硫酸化糖に対する、ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマーの共有結合のために使用され得る。

環状構造を含まない分子である直鎖状分子も、同様の化学的手法を使用して、アニオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーに結合し得る。これは、例えば、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸において成功裏に達成される。

典型的には共有結合は、少なくとも９０日間にわたって安定である。

生成物のその後の精製も、簡単且つ直接に行われた。今まで、分子をＰＡＭＡＭデンドリマーに共有結合させることは、多段階の有機化学的手法の後、多数の精製段階を使用してのみ可能であった。

カルボン酸により末端閉鎖されたアニオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カチオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーに比較して生体内及び生体内の両方において、毒性が著しく低い［ツツミウチエム（ＴｓｕｔｓｕｍｉｕｃｈｉＭ）、アオイケイ（ＡｏｉＫ）及びオカダケイ（ＯｋａｄａＫ）、１９９９年、「グローブ状炭水化物高分子“糖ボール”ＩＶ、表面上に分子認識部位を持つ樹木状のナノカプセル（Ｇｌｏｂｕｌａｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ“ＳｕｇａｒＢａｌｌｓ”ＩＶ．
Ｓｕｎｔｈｅｓｉｓｏｆｄｅｎｄｒｉｃｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｎｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）」、ポリマージャーナル第３１号、第９３５〜９４１頁］。カチオン性デンドリマーは１０μｇ／ｍＬの濃度で赤血球溶血を引き起し、他方、アニオン性デンドリマーは２０００μｇ／ｍＬの濃度でさえもこのような効果を有しない。アニオン性デンドリマーはカチオン性デンドリマーよりも体血管循環における一層長い循環時間を持ち、そしてこれは、肝臓内への分子の蓄積一層低い程度に関連している。より高い世代のカチオン性デンドリマーのこの本質的な毒性は、それらが、高投与量の静脈内投与のために又は繰り返しの静脈内投与のために適するか又は安全である見込みが無いことを意味する［マリクエヌ（ＭａｌｉｋＮ）、ウィワタナパタピアール（ＷｉｗａｔｔａｎａｐａｔａｐｅｅＲ）、クロプシュアール（ＫｌｏｐｓｃｈＲ）、ロレンズケイ（ＬｏｒｅｎｚＫ）、フレイエイチ（ＦｒｅｙＨ）、ウィーナージェイダブリュ（ＷｅｅｎｅｒＪＷ）、メイジャーイーダブリュ（ＭｅｉｊｅｒＥＷ）、パウラスダブリュ（ＰａｕｌｕｓＷ）及びダンカンアール（ＤｕｎｃａｎＲ）、２０００年、「デンドリマー：生体外における構造と生物学的適合性との相間関係、及び生体内における¹²⁵Ｉ−標識されたポリアミドアミンデンドリマーの生物学的分布に関する初歩的な研究（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆ
¹²⁵Ｉ−ｌａｂｅｌｌｅｄｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓｉｎｖｉｖｏ）」、ジャーナルオブコントロールドリリース第６５号、第１３３〜１４８頁］。

本発明の好ましい観点において、アニオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーへの分子、例えば非−生物学的活性分子の結合は、デンドリマー並びにグルコサミン及びグルコサミン６−スルフェートのような分子が、それ自体抗炎症性又は抗血管新生活性を有すと証明されている訳ではないにも係わらず、ケモカイン及び次いでサイトカインの効果的な取り扱い並びに新たな血管形成を可能にする。

グルコサミンは、アニオン性デンドリマーの表面上に存在するカルボキシレート基と反応するアミん基の能力を介してデンドリマーコアに結合し得る糖部分である。これは安定なアミド結合の形成を導く。グルカン部分の３’位、４’位及び６’位においてスルフェート部分の種々の組み合わせを含むグルコサミンも、同様の化学的手法を使用する結合のために適する。これは、免疫調節性及び抗血管新生性を持つ新たな抗血管新生グリコデンドリマーの形成をもたらす。

デンドリマーの表面に共有結合した糖又は硫酸化糖の分子数は、デンドリマーの表面上に存在するカルボキシル基の数に比例して増加する。転換されたカルボキシル基のパーセンテージとして表わされる、デンドリマーに結合したグルコサミンの量は、例えば、１．５％から１０．１％まで変化し得る。硫酸化デンドリマーの場合において、硫黄含有率は下記の順に増加した：モノ硫酸化糖（２．７９％ｍ：ｍＳ）；ジ硫酸化糖（５．７８％ｍ：ｍＳ）；トリ硫酸化糖（７．９３％ｍ：ｍＳ）。結合体中に存在するスルフェートの量は、グルコサミン６−スルフェートでは６％、グルコサミン３，６−ジスルフェートでは１１％、そしてグルコサミン３，４，６−トリスルフェートでは１５％であった。

本発明は、医薬として使用するための本発明のグリコデンドリマー、及び更に、このような治療が必要な際に、患者、一般的にヒトに、本発明のグリコデンドリマーの有効量を投与することからなる、種々の疾患及び症状の治療方法を提供する。医薬としての使用のために、又は医学的治療の際に、本発明のグリコデンドリマーは、水性媒体を使用する本
発明の方法に従って、好ましく製造される。用語‘治療’は、適切であれば、治療及び／又は防止を意味するために、本明細書中で使用される。本発明は、動物薬における本発明のグリコデンドリマーの使用を包含する。

これらの新規なアニオン性グリコデンドリマーは、最も特記すべきマクロファージ炎症性蛋白質（ＭＩＰ）１β、ＭＩＰ−１α及びインターロイキン８（Ｉ０Ｌ−８）であるケモカインの放出に関して最初に且つ最重要に活動することにより、免疫システムを低下させる。前記化合物は、炎症促進性ケモカインの放出を阻止し、次いで、最も特記すべき組織壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６である炎症促進性サイトカインの放出を阻止する。本発明の化合物は抗血管新生性も有する。

従って、本発明は、ケモカイン及びサイトカインが増加する疾患の治療用医薬として使用するための本発明のグリコデンドリマーも提供し、そして、このような治療の方法、及び、このような治療用医薬の製造のための本発明のグリコデンドリマーの使用も提供する。

本発明の化合物は、例えば、敗血症、重度の敗血症、敗血症性ショック、敗血症に関連する全身炎症反応、リウマチ性疾患、湿疹、乾癬、創傷治癒中の組織収縮、創傷治癒中の過大な傷跡形成、移植拒絶、移植片対宿主病及び、動物及びヒトにおける抗血管新生に関連する種々の症状の治療の際に特に有用である。本発明のグリコデンドリマーは、治療的に又は予防的に使用され得る。

リウマチ性及び炎症性の症状は、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、乾癬性関節炎、感染後発症する反応性関節炎、急性強直性脊椎炎、炎症性腸疾患に関連する関節炎、汎ブドウ膜炎及び／又は網膜血管炎を併発するベーチェット病を包含するベーチェット病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を包含する。

別の症状は、異質遺伝子型の器官及び組織移植、移植片対宿主病を包含する。移植物は角膜、腎臓、心臓、肺、心臓−肺、皮膚、肝臓、内臓又は骨髄移植物であってよい。脈管形成を含む疾患及び症状は、多くの癌及び糖尿病性網膜症を包含する転移性腫瘍細胞成長に関連する疾患を包含する。移植の場合、本発明のグリコデンドリマーは、移植が行われる前に移植者に投与されてよい。これとは別に又は更に加えて、移植用の組織又は器官は、移植前に生体外で、本発明のグリコデンドリマーを用いて処理されてよく、例えば、角膜移植物の場合は、本発明のグリコデンドリマーは、移植前に角膜が貯蔵されている溶液に添加し得る。

用語‘敗血症症候群’は、敗血症に加え損なわれた器官潅流に関するものである。菌血症から敗血症、重度の敗血症、敗血症性ショック、難治性の敗血症性ショック及び全身炎症反応症候群まで含む臨床的な症候群のスペクトルは、局部的炎症が一端にあり、複数器官の損傷を導く、激しく発症した炎症反応が該スペクトルの多端にある連続状態を示す。重度の場合は、二三時間以内に死亡が起こり得る。

本発明の好ましい観点において、前記化合物は、バクテリア感染又はカビ感染に関連する全身炎症反応症候群に対して活性を有する。本発明のグリコデンドリマーは、グラム陰性菌からのリポ多糖、又はグラム陽性菌からの超抗原毒素により起る敗血症、例えば、重度の敗血症、敗血症性ショック、或いはグラム陰性菌からのリポ多糖又はグラム陽性菌からの超抗原毒素により引き起こされる敗血症を関連する全身炎症反応を治療するために使用され得る。

別の観点において、本発明は、本発明のグリコデンドリマー及び所望により、医薬にお
いて許容され得るキャリアを含む医薬製剤を提供する。

本発明の化合物及び製剤は、静脈内に、経口的に、腹膜内に、局所（皮膚）に、頬側に、直腸に、皮膚表面に、経皮的（遅延放出製剤）に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、エアロゾルにより、肺投与により、及び直接眼に、投与するために適する。

本発明の特に好ましい化合物は、有用であることが証明されたデンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートである。

例えば、ヒト細胞株において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、１８２５ないし３０００μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ50毒性値を示し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、２４６ないし３０７μｇ／ｍＬの範囲のＩＣ50毒性値を示した。新たに採取されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）において、及び、新たに採取されたヒト単球−誘導−マクロファージ（ＭＤＭ）において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンについてのＩＣ50毒性値は３４０ないし３６０μｇ／ｍＬであった。新たに採取されたヒト末梢血単核細胞及び新たに採取されたヒト単球−誘導−マクロファージ（ＭＤＭ）において、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、デンドリマー世代３．５−グルコサミン３，６−ジスルフェート及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン３，４，６−トリスルフェートについてのＩＣ50毒性値は２３０ないし２６０μｇ／ｍＬであった。

シングルドナーＭＤＭは、濃度１５０μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと一緒に７２時間培養された。細胞生存性の低下は見られなかった。シングルドナーＨＵＶＥＣは、濃度１００μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと一緒に７２時間培養された。細胞生存性の低下は見られなかった。デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、３０ｍｇ／ｋｇまでの濃度で静脈注射されたとき、ウィスターラットに毒性を示さなかった。

デンドリマー世代３．５−グルコサミンのみならずデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートもまた、通常休眠状態にある免疫細胞から、ケモカイン又はサイトカインの放出に作用しなかった。これら二つの化合物の活性は、これら化合物が、何らかの方法で抗原により免疫学的に刺激された細胞と一緒に培養されたときにのみ見出された。従って、これら二つの化合物は、主にヒト細胞が日々機能する下で、通常のホメオスタティック・コントロールを妨げない。従って、それらは、他の全ての硫酸化多糖と異なる。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞が１００μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと一緒に培養されるとき、５ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）によるマクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α；ケモカイン）、マクロファージ炎症性蛋白質−１β（ＭＩＰ−１β；ケモカイン）、インターロイキン−８（ＩＬ−８；ケモカイン）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α；サイトカイン）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β；サイトカイン）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６；サイトカイン）の放出は非常に低減した。シングルドナーＰＢＭＮ細胞が２００μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと一緒に培養されるとき、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の放出は非常に低減した。１００μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミンの添加の前に、シングルドナーＰＢＭＮ細胞が５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと３０分、又は１時間、又は２時間、又は３時間、又は４時間培養されるとき、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の放出は非常に低減した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、これらの実験において使用されたＬＰＳと結合することにより、その活性をメディエート
（ｍｅｄｉａｔｅ）しないことが示された。デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、樹木状の細胞の及びリンパ球の免疫調節機能の多価結合阻害剤として機能することにより、その効果をメディエート（ｍｅｄｉａｔｅ）すると信じられている。この作用は、タル状レセプターである、ケモカイン及びサイトカインを通してメディエート（ｍｅｄｉａｔｅ）される。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞が、グルコサミンによるその負荷が（他の全ての実験において使用された７％でなく）３％のみであるデンドリマー世代３．５−グルコサミン３００μｇ／ｍＬのと一緒に培養されるとき、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の放出は非常に低減する。２人又は３人の個人からのシングルドナーＰＢＭＮ細胞が一緒に混合され、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン５０μｇ／ｍＬが添加されるとき、ＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αの放出は非常に低減する。２人又は３人の個人からのシングルドナーＰＢＭＮ細胞が一緒に混合され、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン１００μｇ／ｍＬ、その後ＬＰＳ５ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬが添加されるとき、ＭＩＰ−１βの放出は非常に低減する。

記載された化合物（即ち、デンドリマー世代３．５−グルコサミン、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、デンドリマー世代３．５−グルコサミン３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン３，４，６−トリスルフェート）は、下記の生体外分析：カオリンパーシャルトロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、トロンビン時間及び因子Ｘａ分析、を使用して決定された何らの抗凝血活性も有しない。試験された化合物全てにおいて分析された最大濃度２００μｇ／ｍＬにおいて、抗凝血活性は見出されなかった。デンドリマー世代３．５−グルコサミンについては、濃度３００μｇ／ｍＬにおいてもこれが確認された。本発明の化合物は、抗凝血活性を有しない合成された硫酸化多糖の第一の群れをなす。従って、それらは、動物における及びヒトにおける静脈内投与のために特に適する。

新規血管形成は、健常な内皮細胞に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートの直接効果により阻害される。その効果は、内皮細胞が一体化して新規内皮体管を形成し、そして新規血管を形成するのを妨げる。抗血管新生化合物として開発された他の全ての硫酸化多糖とは対照的に、合成されたデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、抗凝血活性を有しない。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、細胞培養液中に１５０μｇ／ｍＬまでの濃度で存在し、５日目まで維持されるるとき、ＰＢＭＮ細胞又はＭＤＭの細胞生存性又は成長特性に影響を及ぼさない。

デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート構成物は、７２時間目まで、濃度１００μｇ／ｍＬまで前記細胞の培養液に添加されるとき、ＨＵＶＥＣに毒性を示さない。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞が、１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒に培養されるとき、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによるＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αの放出は非常に低減した。

４人の個人からのシングルドナーＭＤＭが混合され、そして２５μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが添加されるとき、ＭＩＰ−１βの放出は非常に低減した。

血管新生の生体外モデルとしてヒト臍静脈内皮細胞マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）分
析を使用すると、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、新規体管形成を阻害し、そして新規血管形成；即ち、血管新生を妨げる。

ヒト胎盤からの新規血管の成長に基づく生体外血管新生分析を使用すると、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、それが２５μｇ／ｍＬ存在するとき、形成される新規体管の数の減少を引き起こす。この効果は、５０μｇ／ｍＬにおいて非常に、より大きい。

本発明の化合物は、動物における及びヒトにおける敗血症症候群の重症度を低減するために適している。これらは、静脈内に、経口的に又は腹膜内に、濃度範囲２．５μｇ／ｍＬないし２５００μｇ／ｍＬで投与される。好ましい濃度は２５μｇ／ｍＬないし２５０μｇ／ｍＬである。

リウマチ様関節炎において、本発明の化合物は、前記疾患に見られる急性ないし慢性の組織損傷を遅延させ、中断させ又は妨げさえする。リウマチ様関節炎（疾患の進行におけるとりわけ初期）における前記化合物の投与は、炎症促進性ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＩＬ−８）の放出を低減させ、次いで、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６）の放出を低減又は中断させる。

炎症促進性ケモカインの放出を阻害し、次いで、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６）の放出を阻害し、そして同時に血管新生を阻害するための本発明の化合物２種又はそれより多くの混合物の同時投与は、最小の毒性で、大きな相乗効果を得ることができる。例えば、デンドリマー世代３．５−グルコサミンとデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートの同時投与は、少ない投与量で大きな相乗効果を提供し、そして投与頻度の低下を可能にする。

乾癬又は湿疹又は創傷治癒中の過大な傷跡形成若しくは組織収縮の活性プラーク病変に対する本発明の化合物の局所（即ち、皮膚）製剤の適用（疾患の進行におけるとりわけ初期での適用）は、内皮細胞増殖及び血管新生応答を低減するか又は妨げることにより、これらの病変を治癒する。

初期段階において体管への新規な内皮細胞形成を低減するか又は妨げるための本発明の化合物の適用は、乾癬又は湿疹又は創傷治癒中の過大な傷跡形成若しくは組織収縮の皮膚病変の治療のために有益である。特に、デンドリマー世代３．５−グルコサミンのような化合物の投与は、炎症促進性ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＩＬ−８）の放出を低減させ、次いで、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６）の放出を低減するために適している。

血管新生を阻害し、そして炎症促進性ケモカインの放出、次いで、炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、デンドリマーグルコサミン及びデンドリマーグルコサミン６−スルフェートのような混合物による同時投与は、乾癬において、最小の毒性で大きな相乗効果を得ることができる。特に、これは、皮膚の及びリウマチの症状の治療に対して、治療上の利益を提供する。

本発明の化合物は、静脈内に、経口的に、頬側に、腹膜内に、関節腔内に、直腸に、皮膚表面に、経皮的に（遅延開放製剤）、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、点眼剤として眼に、硝子体内（即ち、眼内部への）注射により、或いはエアロゾル（例えば、局所的には肺に対して）により、濃度範囲２．５μｇ／ｍＬないし２５００μｇ／ｍＬで投与するために適している。好ましい濃度は２５μｇ／ｍＬないし２５０μｇ／ｍＬである。

クローン病、潰瘍性大腸炎は炎症性腸疾患の主要な形態である。デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートのような化合物の経口的又は静脈内投与は、疾患の進行の初期にとりわけ適している。ドラッグは、小腸及び大腸に関連する組織内に蓄積する。

体管への新規な内皮細胞形成（即ち、血管新生）をその最初期段階において低減するか又は妨げるための本発明の化合物を用いる干渉は、炎症性腸疾患の治療のために有益である。

体管への新規な内皮細胞形成（即ち、血管新生）をその最初期段階において低減するか又は妨げるための本発明の化合物を用いる干渉は、炎症性腸疾患の臨床経過中に発症し得る破壊性関節炎を妨げるために有益である。

本発明の化合物の投与は、炎症性腸疾患において、炎症促進性ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＩＬ−８）の放出、次いで、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６）の放出を非常に低減し得る。

同時に、血管新生を阻害し且つ炎症促進性ケモカインの放出及び、次いで、炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、デンドリマーグルコサミン及びデンドリマーグルコサミン６−スルフェートのような化合物の同時投与は、最小の毒性で大きな相乗効果を提供する。

前記化合物は、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患及び乾癬に対する中心である炎症を起こした組織中に蓄積する。炎症領域に関連する内皮細胞及び血管新生の発現により生じる増大した血管分布像は、炎症領域内への前記化合物の蓄積を促進する。

本発明の特別な利点は、自系の、異質遺伝子型の、同系又は異系器官移植物の拒絶を起すケモカイン、次いでサイトカインの放出の阻害、自系の、異質遺伝子型の、同系又は異系器官移植の拒絶を与えるケモカイン、次いでサイトカインの放出及び血管新生の阻害、移植された器官への拒絶を妨げるために必要とされる抗炎症環境の有効な維持、且つ移植片対宿主病の発症を妨げるために必要とされる抗炎症環境の有効な維持、を包含する。

好ましい観点において、本発明は、器官又は組織移植物のあらゆる形態におけるデンドリマー世代３．５−グルコサミン及び／又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン−スルフェートの使用も提供する。これは、角膜、腎臓、心臓、肺、肝臓、内臓及び骨髄移植物を包含する。

デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは健常な内皮細胞に対して直接効果を有し、これは新規な体管形成の阻害を導く。患者に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートの投与は、とりわけ、疾患の進行における初期に投与されるとき、悪性細胞の発生及びその後の腫瘍への成長及び転移性蓄積に必要な血管新生を妨げる方法を提供する。

内皮細胞の増殖を低減するか又は妨げ、そして転移性病変の成長の最も初期段階における血管新生を妨げるデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート又は、デンドリマー世代３．５−グルコサミンとデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートとの組み合わせのようなドラッグは、転移性病変の発展を中断させるか又は妨げさえする方法を提供する。

患者に使用するために特に好ましい製剤は、１００μｇ／ｍＬないし２００μｇ／ｍＬで使用されるデンドリマー世代３．５−グルコサミン（７％）及びデンドリマー世代３．
５−グルコサミン６−スルフェート（７％）である。

特に好ましいポリマーは、アニオン性デンドリマーに共有結合したグルコサミン又は硫酸化グルコサミンである。デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、ケモカインマクロファージ炎症性蛋白質−１α、マクロファージ炎症性蛋白質−１β及びインターロイキン−８の放出を低下させ、次いで、ヒト末梢血単細胞からのサイトカイン腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１β及びインターロイキン−６の放出を低下させることが見出された。

デンドリマー世代３．５−グルコサミンのような本発明の化合物は、アジュバント療法のような、既存の受け入れられている治療アプローチと組み合わせて使用することもできる。例えば、敗血症症候群において、それらは抗バクテリア剤又は抗カビ剤と共に使用することができる。リューマチ様関節炎及び関連する症状、ベーチェット病、炎症性腸疾患及び乾癬において、それらはステロイド及び、メトトレキサートのような疾患軽減剤又は疾患軽減治療用抗体と共に使用することができる。癌転位の治療において、それらは抗−分裂剤と共に使用することができる。器官移植物拒絶及び移植片対宿主病の治療において、それらはステロイド及び／又はシクロスポリン及び／又はＦＫ５０６及び／又はアザチオプリン及び／又はタクロリムス及び／又はシロリムス及び／又はバシリキシマブ及び／又はデクリズマブと共に使用することができる。

デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、抗炎症性及び抗血管新生性を有する。従って、それは、リューマチ様関節炎及び関連する症状、ベーチェット病、炎症性腸疾患及び乾癬において、また癌転位、器官移植における拒絶及び移植片対宿主病の治療において、単独で又はアジュバント療法として有用である。更にまた、デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、これら疾患のそれぞれの治療のために組み合わせて使用することができる。デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートの同時投与は、少ない投与量で大きな相乗効果を提供し、そして必要な投与頻度を少なくし、それにより、薬物毒性を低下させる。

本発明のグリコデンドリマーの別の利点は、それらが大きい分子であることである。炎症応答性を誘発するものに無関係に、炎症の組織ベース部位は、健常組織よりも循環する分子及び細胞に対して一層透過性である。大きい分子は、それらが健常組織に蓄積するよりも一層迅速に、炎症領域に蓄積する。従って、本発明のグリコデンドリマーは、炎症部位に蓄積する傾向がある。

本発明を下記の実施例により更に説明する。
Ａ）化学的手法及び毒性：
実施例Ａ１）化学合成
分岐的アプローチにより合成された星形ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代２．５及び３．５（図１ａ及び図１ｂを参照）が使用された［米国、ミシガン州、ミッドランドのデンドリテックインコーポレイテッド（ＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈＩｎｃ．）又は、イギリス国、イングランド、ドーセット、ギリンガムのシグマ／アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）社から入手可能］。Ｄ−グルコサミン塩酸塩、Ｄ−グルコサミン６−スルフェート塩酸塩、Ｄ−グルコサミン３，６−ジスルフェート及びＤ−グルコサミン３，４，６−トリスルフェートをナトリウム塩として使用した。メタノール溶液中にナトリウム塩として貯蔵されたデンドリマー（世代１．５又は世代２．５又は世代３．５）の既知量を、窒素流下で蒸発させ、デンドリマーナトリウム塩１ｍｍｏｌを得た。その後、このデンドリマーを二重脱イオン水に溶解し、そして塩酸（ＨＣｌ）でｐＨを低下させ、非反応性カルボン酸ナトリウム（ＣＯＯ^-Ｎａ⁺）からの表面基を反応性カルボン酸（ＣＯ
ＯＨ）に転換した。グルコサミン塩酸塩、グルコサミン６−スルフェート、グルコサミン３，６−ジスルフェート又はグルコサミン３，４，６−トリスルフェートの既知量を二重脱イオン水に溶解し、そしてトリエチルアミンを用いてｐＨを上昇させ、反応性遊離塩基（ＮＨ2 ）を得た。デンドリマー−グルコサミン結合体の製造の際に、反応を追跡し、且つデンドリマーに結合したグルコサミンの量を決定するために、二重脱イオン水中の¹⁴Ｃ−グルコサミン溶液の既知量を用いて反応をスパイク( ｓｐｉｋｅ) した。グルコサミン及び¹⁴Ｃ−グルコサミン水溶液又は硫酸化グルコサミン溶液を、その後、デンドリマー溶液に添加し、そしてＨＣｌを用いて酸性ｐＨを維持した。その後、縮合試薬１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の過剰量を水に溶解し、そして反応溶液に添加した（図２を参照）。反応混合物を室温で撹拌した。注意すべきは、この反応は室温（即ち、４０℃未満）で起り得、そして外部エネルギー源の適用を必要としないことである。

デンドリマー−グルコサミン結合体の製造の際に、反応混合物の幾つかはＰＤ−１０カラムを通過し、そして捕集されたフラクションは、β−カウンターで読み、高分子量結合化合物の存在を確認した。反応混合物をその後精製し、未反応のグルコサミン、過剰の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及び、反応中に生成した尿素を除去した。デンドリマー世代３．５の場合、反応混合物を水に対して透析し、その後、凍結乾固した。低分子量世代デンドリマーの場合、反応混合物を凍結乾固し、脱イオン水に再溶解し、その後、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ１５カラムを通過させた。精製された結合体を含む高分子量のフラクションを捕集し、一緒に貯蔵し、そして凍結乾固した。

精製後、デンドリマー−グルコサミン結合体の一部はＰＤ−１０カラムを通過し、そして捕集されたフラクションは、未結合のグルコサミンの存在を監視するため、β−カウンターで読んだ。デンドリマーの表面に結合したグルコサミンの全量も、β−カウンターを使用して決定した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンに対する合成データのキャラクタリゼーション及び再現性を表１に示す。デンドリマー−グルコサミンスルフェート結合体の場合、ポリマーに結合した硫酸化糖の量は、硫黄分析により決定した：試料の既知量を、ショニガー（Ｓｃｈｏｎｉｇｅｒ）酸素フラスコ中、酸素雰囲気下で燃焼させた。燃焼生成物を二重脱イオン水を用いて５０ｍＬフラスコ中で洗浄し、同ボリュームにした。この溶液を、ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）１００イオンクロマトグラフィーを使用するイオンクロマトグラフィーにより、硫黄含有率に関して分析した。製造された結合体の全ては、赤外線分光光度計によっても分析した。デンドリマー世代３．５−硫酸化グルコサミン構造体に対する合成データのキャラクタリゼーション及び再現性を表２に示す。

この結合体の全てを、その生物学的評価の前に活性炭で処理してエンドトキシン（即ち、ＬＰＳ）を除去した。エンドトキシンは、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ）Ｂを充填したカラムを使用して、合成された化合物から除去することもできる。凍結乾固し、精製した吸湿性生成物を密封条件下で貯蔵した。エンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ状細胞溶解物分析（ｌｉｍｕｌｕｓａｍｅｂｏｃｙｔｅｌｙｓａｔｅａｓｓａｙ）を使用して決定した。生物学的データ全ては、そのエンドトキシンレベルが０．１ＥＵ／ｍＬ未満である化合物のバッチを用いて導き出された。

実施例Ａ２：デンドリマー−グルコサミン結合体及びデンドリマー−硫酸化グルコサミン結合体の化学的キャラクタリゼーション
グルコサミンがデンドリマーに結合したとき、反応混合物のゲル濾過（ＰＤ−１０カラム）によりフラクションを捕集し、その後、β−カウンターで分析したものは、捕集されたフラクション７、８、９及び１０においてピークを示した（図３を参照）。このピークは¹⁴Ｃ−グルコサミンを含む高分子量構造体の存在を示し、デンドリマー−グルコサミン
結合体の形成を確証している。１６４０ｃｍ^-1及び１５６０ｃｍ^-1のＦＴ−ＩＲスペクトルピークは、３２６０ｃｍ^-1のピークと合わせて、アミド結合の形成を示している（図４及び図５を参照）。デンドリマー−硫酸化グルコサミン結合体の場合、１２１０ｃｍ^-1での別のピーク（デンドリマー−硫酸化グルコサミン結合体に対しては図６を参照）は、結合体中の硫酸の損失の防止した硫酸化グルコサミンの存在を示している。

転換されたカルボキシル基のパーセンテージとして表わされる、デンドリマーに結合したグルコサミンの量は、１．５％から１０．１％までの範囲にある。硫酸化デンドリマーの場合において、硫黄含有率は下記の順に増加した：モノ硫酸化糖（２．７９％ｍ：ｍ
Ｓ）；ジ硫酸化糖（５．７８％ｍ：ｍＳ）；トリ硫酸化糖（７．９３％ｍ：ｍ
Ｓ）。硫黄含有率から、結合体中に存在するスルフェートの量を、グルコサミン６−スルフェート結合体では６％、グルコサミン３，６−ジスルフェート結合体では１１％、そしてグルコサミン３，４，６−トリスルフェート結合体では１５％であると計算することが可能である。

ａ）アミノ基を含む分子に対する並びにグルコサミン６−スルフェートに対する、ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代２．５の結合のために適した方法として、一段階反応も研究された。アミド結合に対する特徴的なピーク（３２７０ｃｍ^-1、１６４０ｃｍ^-1及び１５５０ｃｍ^-1）の存在は、世代３．５デンドリマーにも見られるように、デンドリマーとグルコサミン又は硫酸化グルコサミンの間の結合体の形成を示している。

上記の分子は、同様の化学的手法を使用して、アニオン性ＰＡＭＡＭデンドリマーに結合し得る。これは、例えば、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸及びアミノメタンスルホン酸において成功裏に達成された。

ゲスト分子は、デンドリマーのコア内に捕捉され得ることが知られている［ケムペン
エイチジェイエム（ｋｅｍｐｅｎＨＪＭ）、ホーシー（ＨｏｅＣ）、フォンボームジェイエム（ｖａｎＢｏｏｍＪＭ）、シュパンジャーエイチエイチ（ＳｐａｎｊｅｒＨＨ）、デラングジェイ（ｄｅＬａｎｇｅＪ）、ランゲンデンエイ
（Ｌａｎｇｅｎｄｏｅｎ）及びフォンバーケルティージェイシー（ｖａｎＢｅｒｋｅｌＴＪＫ）、１９８４年、「水溶性コレステリル含有トリスガラクトサイド−合成、性質、及び肝臓に脂質含有粒子を導くための用途（Ａｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ
ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒｉｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ −
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄｕｓｅｉｎｄｉｒｅｃｔｉｎｇｌｉｐｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｏｔｈｅｌｉｖｅｒ）」、ジャーナルメディシナルケミストリー第２７号、第１３０６〜１３１２頁］。従って、樹木状構造内部の未結合グルコサミンの量を決定することが重要であった。これは、溶液中の結合体の既知量をある期間維持し、その後、ゲル濾過により、存在する未結合グルコサミンの量を決定することにより行われた。図７（ｉ）は、遊離グルコサミンと比較した、水溶液中に貯蔵された結合体のゲル濾過プフィールを示す；未結合グルコサミンの量は、４℃で貯蔵直後の３．１重量％から９０日後の７．５重量％まで、経時的に僅かに増加した。従って、共有アミド結合は安定であり、そして、デンドリマー内に遊離グルコサミンはあまり捕捉されなかったと結論した。同様の結果は、同様の条件下での貯蔵３０日目のデンドリマー−グルコサミン世代２．５から得られた（図７（ｉｉ）を参照）。

グルコサミン又は硫酸化グルコサミンの全ての分子はデンドリマーの外面に結合しているので、これらの観察は、デンドリマー１分子に結合したグルコサミン又は硫酸化グルコサミンの分子の数の計算を可能にする。デンドリマー１分子に結合した硫酸化糖の分子の数が、グルコサミン部分に結合した硫酸化基の数を増加させても変化しなかったことは、
硫酸化グルコサミン誘導体をデンドリマーに結合させるための標準法として、一段階反応が使用され得ることを示している。デンドリマー世代２．５の１分子に結合したグルコサミン又は硫酸化グルコサミンの分子の数は、デンドリマー世代３．５と比較したとき、前者には３２個のカルボキシル末端基が、そして後者には６４個のカルボキシル末端基が存在するので、小さい。従って、世代３．５デンドリマーのより高い負荷及び最小の毒性に起因して、これらの結合体が、更なる生物学的研究のための候補として選択された。

実施例Ａ３：反応溶媒としてＤＭＳＯを用いる、デンドリマー世代３．５へのグルコサミンの結合
試験管にＰＡＭＡＭデンドリマー世代３．５メタノール溶液を投入し、そしてこの溶液を、窒素の急速な流れの下で除去した。得られた透明な固体残渣を更に約３時間、真空オーブン中で乾燥した。その後、単離された固体を脱イオン水に溶解し、そして得られた溶液を、０．１ＮＨＣｌを使用して約ｐＨ３に酸性化した。その後、この溶液を２日間脱イオン水で透析するにより、精製／脱塩した［ビスキング（Ｖｉｓｋｉｎｇ）透析管、メディセルインターナショナル社（ＭｅｄｉｃｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．）製、ＭＷＣＯ３５００］。透析した溶液の冷凍乾燥は、プロトン化デンドリマーを透明な画家素性の固体として生じた。

プロトン化したデンドリマー（１５０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（９．６ｍｇ）、グルコサミン塩酸塩（１２．６ｍｇ）及び磁気撹拌棒を１．５ｍＬバイアルに添加し、そしてこのバイアルを、隔膜が中央に入ったスクリューキャップ蓋で封止した。その後、窒素雰囲気をバイアルに導入し、その後、シリンジを使用して無水ＤＭＳＯ（０．７ｍＬ）を投入した。得られた混合物を、均質な溶液が形成されるまで撹拌した。別途、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１７．１ｍｇ）を、１．５ｍＬバイアル中窒素雰囲気下で、無水ＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）に溶解した。均質な溶液を形成せしめ、その後これをシリンジにより、撹拌したデンドリマー反応溶液に添加した。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドバイアルを新鮮なＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）で洗浄し、そしてこの溶液もデンドリマーバイアルに添加した。１５分後、トリエチルアミン（１２μＬ）をシリンジによりデンドリマー溶液に添加し、そして得られた溶液を、室温で一晩撹拌した。その後この反応混合物に、１Ｎ水酸化ナトリウム（８００μＬ）を添加した。得られた混合物を、より大きいバイアルに移し、脱イオン水約３ｍＬで稀釈し、その後、フィルターとして機能するコットン−ウール片を備えたガラスピペットを通して濾過した。均質な上澄みを脱イオン水で約１００ｍＬまで稀釈し、その後３日間脱イオン水で透析し［ビスキング（Ｖｉｓｋｉｎｇ）透析管、メディセルインターナショナル社（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ
ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．）製、ＭＷＣＯ３５００］、その後、凍結乾燥により、固体生成物を得た。

もう一つの方法において、グルコサミン塩酸塩（１８．０ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）中のトリエチルアミン（２３μＬ）と共に、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１７．１ｍｇ）で１時間活性化したＤＭＳＯ（０．７ｍＬ）中の撹拌したデンドリマー（１５０ｍｇ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（９．６ｍｇ）に添加した。このもう一つの方法も、透析及び凍結乾燥により、固体生成物を与える。デンドリマー世代３．５に対するグルコサミン結合が確認され、そして重水中で、プロトン核磁気共鳴分光分析により量した。グルコサミン結合ｍｏｌ％は３．８±０．４であると計算された。

実施例Ａ４：ヒト細胞株における化合物の毒性
合成された化合物を、下記細胞株：ヒトＴ−細胞株（Ｓｕｐ−Ｔ１）、ＨＴＬＶ−１で形質転換されたヒトＴ−細胞株（Ｃ８１６６）、ヒト単球細胞株（Ｕ９３７）、ヒトＣＤ４及びヒトケモカインレセプターＣＣＲ５で形質転換された脳細胞株（Ｕ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５）及び、ネズミメラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）におけるそれらの毒性に関し
て評価した。

デンドリマー、グルコサミン、グルコサミン６−スルフェート及び、デンドリマー結合体を各細胞株と共に培養した。ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ペニシリン［２５０ＩＵ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［２５０μｇ／ｍＬ］及びウシ胎仔血清１０％を含む媒体中、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、Ｓｕｐ−Ｔ１、Ｃ８１６６、Ｕ９３７、Ｕ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５及びＢ１６Ｆ１０の各細胞を密度２×１０⁵細胞／ｍＬでシードし、そしてＢ１６Ｆ１０細胞を１×１０⁵細胞／ｍＬでシードした。前記結合体又は対照を、濃度範囲０〜５０００μｇ／ｍＬの細胞と共に６７時間培養した。その後、細胞生存率を決定するためにＭＴＴ分析を使用し、そして結果を、如何なる化合物も存在しないときの細胞成長に対するパーセンテージとして表わした。

デキストラン及びポリ（Ｌ−リシン）をそれぞれ、陰性及び陽性の対照として使用した。グルコサミン及びグルコサミン６−スルフェートは、濃度１０００μｇ／ｍＬまで毒性を示さなかった。これらの化合物のより高い濃度は、グルコサミンがその濃度で上記ＭＴＴ分析を妨害するので、評価することができなかった。デンドリマー世代３．５及びデンドリマー世代２．５は濃度５０００μｇ／ｍＬまで毒性を示さなかった。デンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体は異なる細胞株において、範囲１８２５〜３０００μｇ／ｍＬのＩＣ50値を示した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート結合体は、範囲２４６〜３０７μｇ／ｍＬのＩＣ50値を有していた（表３を参照）。

実施例Ａ５：生体外における一次ヒト細胞に対する化合物の毒性
デンドリマー及びデンドリマー結合体を、新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）及び新たに単離されたヒト単球−誘導−マクロファージ（ＭＤＭ）と共に培養した。

ヒトＰＢＭＮ細胞及びヒトＭＤＭを、密度勾配遠心により捕集２４時間以内に、軟膜残渣から分離した。その後細胞を、燐酸塩で緩衝化した生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ヒト組み換えインターロイキン−２（ＩＬ−２、２０ＩＵ／ｍＬ）を含むリンパ球成長媒体（ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ペニシリン［２５０ＩＵ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［２５０μｇ／ｍＬ］及びウシ胎仔血清１５％）に３日間再懸濁し、その後、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに付着させた。ＭＤＭを分離するため、残りの細胞をマクロファージ−成長媒体（ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ペニシリン［２５０ＩＵ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［２５０μｇ／ｍＬ］及びヒト血清１０％）中に懸濁し、そしてプラスチック皿に２時間付着させた。その後ＭＤＭをすくい取り、洗浄し、そして密度１×１０⁶細胞／ｍＬで９６ウェルプレートに付着した。更に３日間付着させることにより、単球をＭＤＭと分化した。その後この化合物をＰＢＭＮ細胞又はＭＤＭ（１×１０⁶細胞／ｍＬ）に添加し、そして６７時間培養した。７２時間ＭＴＴ分析を使用して、細胞生存率を評価した。

デンドリマー世代３．５及びグルコサミン６−スルフェートは、評価した最大濃度１０００μｇ／ｍＬまで、ＰＢＭＮ細胞又はＭＤＭに毒性を示さなかった。デンドリマー世代３．５−グルコサミンについてのＩＣ50値は、ＭＴＴ分析を使用して決定したとき、一次細胞において３４０〜３６０μｇ／ｍＬであった。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート構造体デンドリマー世代３．５−グルコサミン３，６−ジスルフェート構造体及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン３，４，６−トリスルフェート構造体についてのＩＣ50値は、ＭＴＴ分析を使用して決定したとき、一次細胞において２３０〜２６０μｇ／ｍＬであった。

実施例Ａ６：シングルドナーヒトＰＢＭＮ細胞、ＭＤＭ及び腹膜のマクロファージからの
ＭＩＰ−１βの放出に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体及びデンドリマー世代３．５硫酸化グルコサミン結合体の効果
最近の研究は、マクロファージ炎症性蛋白質−１β（ＭＩＰ−１β）は、マクロファージ起源の細胞により、該細胞が炎症性刺激に暴露された後に放出される最も初期の炎症促進性ケモカインであることを示した［ワンゼット−エム（ＷａｎｇＺ−Ｍ）、リュー
シー（ＬｕｅＣ）及びドジアルスキーアール（ＤｚｉａｒｓｋｉＲ）、「ケモカインは、黄色ブドウ球菌、ペプチドグリカン及びエンドトキシンにより活性化されたヒトの単球において、主な炎症促進性メディエイターである。（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓａｒｅｔｈｅｍａｉｎｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｍｅｄｉａｔｏｒｓｉｎ
ｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｅｓａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ，ａｎｄｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．）、２０００年、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー第２７５号、第２０２６０〜２０２６７頁」］。現在までに研究された全てのポリマーは、それらが天然源から誘導されたか又は合成的に得られたかに無関係に、免疫細胞からの炎症促進性サイトカイン及びケモカインの放出を誘発する大きい能力を示していた。従って、我々は、シングルドナーヒトＰＢＭＮ細胞、シングルドナーヒトＭＤＭ及びシングルドナーヒト腹膜マクロファージを、それらが前記細胞から何らかの炎症促進性応答を誘発するかどうかを決定するために、合成された化合物に暴露した。

先述のように、捕集４時間以内に細胞を単離し、その後１×１０⁶細胞／ｍＬで付着した。その後、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、デンドリマー世代３．５−グルコサミン３，６−ジスルフェート、デンドリマー世代３．５−グルコサミン３，４，６−トリスルフェートを、濃度５０〜２００μｇ／ｍＬで、細胞に添加した。細胞遊離群の上澄みを３６時間後に採取し、そしてＭＩＰ−１βについて分析した。

以下の場合において、対照ウェルにおいて見られた上記ＭＩＰ−１βの放出異常の放出は起らなかった。
ａ）ＰＢＭＮ細胞と、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（図８（ｉ）を参照）。
ｂ）ＭＤＭと、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（図８（ｉｉ）及び図８（ｉｉｉ）を参照）。
ｃ）ＭＤＭと、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，４，６−トリスルフェート（図９を参照）。
ｄ）それぞれの分子において２５μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後（図１０（ｉ）及び図１０（ｉｉ）を参照）及び７２時間後（図１０（ｉｉｉ）を参照）の腹膜マクロファージ。
ｅ）それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージ（図１１（ｉ）及び図１１（ｉｉ）をそれぞれ参照）。
ｆ）それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージ（図１２（ｉ）及び図１２（ｉｉ）をそれぞれ参照）。
ｇ）それぞれの分子において１００μｇ／ｍＬ（図１３（ｉ）及び図１３（ｉｉ）を参照
）及び２００μｇ／ｍＬ（図１３（ｉｉｉ）及び図１３（ｉｖ）を参照）での、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージ。

従って、結論として、デンドリマー世代３．５−グルコサミン、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，４，６−トリスルフェートは、健常休眠状態にある免疫細胞（即ち、一次ヒト末梢血単核細胞、ヒト単球から誘導されたマクロファージ又はヒト腹膜マクロファージ）からのケモカイン又はサイトカインの放出に影響しないことに注意することが重要である。グリコデンドリマーが健常休眠状態にあるヒト一次細胞に影響を及ぼさないことが示されたのは、これが最初である。従って、医薬として投与されたとき、これらの分子は、疾患のあるヒト細胞に対してのみドラッグメディエイトされた効果を有する。これら二つの化合物は、健常なヒト細胞が日々機能する下で、通常のホメオスタティック・コントロールを妨げない。

実施例Ｂ：リポ多糖（ＬＰＳ）を用いた実施例
シングルドナーヒトＰＢＭＮ細胞からのＬＰＳによるケモカイン、次いでサイトカインの放出に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体の効果
ＰＢＭＮ細胞は、密度勾配遠心により、シングルドナーからの新鮮な血液から単離された。この細胞を成長媒体（ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ペニシリン［２５０ＩＵ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［２５０μｇ／ｍＬ］及びエンドトキシンを含まないヒト血清１０％）に再懸濁し、そして細胞密度を２×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。細胞懸濁物のアリクウォットを１２ウェル組織培養プレートに移し、そして３７℃で１５分間培養した。これらのＰＢＭＮ細胞に、エンドトキシンを含まないデンドリマー世代３．５−グルコサミンの添加の前又は後に、ＬＰＳ（通常、５ｎｇ／ｍｌ）を添加した。実験の第一組において、デンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体を添加の３０分ないし２４時間後に、ＬＰＳ［サルモネラミネソタ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社のカタログ番号Ｌ９７６４］を添加した。実験の第二組において、デンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体を添加の３０分、１時間、２時間、３時間又は４時間前にＬＰＳを添加した。添加したデンドリマー世代３．５−グルコサミンの濃度は、１５０〜２００μｇ／ｍＬであった。その後細胞を、５％ＣＯ2 と共に３７℃に維持した。細胞を含まない上澄みを一定時間ポイントで最大９６時間後まで捕集し、そしてマクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性蛋白質−１β（ＭＩＰ−１β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）を分析した。

実験Ｂ１：
前記のようにシングルドナーＭＤＭを製造し、そして濃度１５０μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと共に７２時間培養した。媒体中で７２時間単独培養したＭＤＭと比較したとき、細胞生存性における低下は見られなかった（図１４（ｉ）を参照）。

シングルドナーであるヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）も、以下のように製造した。臍帯は、出産４時間以内に、ハマースミス病院及びクイーンチャーロッツ病院の妊婦病棟からの胎盤から得た。外側をマッサージすることにより、胎盤から過剰の血液を除去した。その後、胎盤に７０％アルコールを噴霧し、そして拭き取った。鋭利なハサミで端部を切断し、そして臍帯血管を確認した。ルアーロック端部を持つ１４ゲージカニューレを臍帯血管のそれぞれの端部内に挿入し、そして緊縛した。その後、カニューレに装着された２０ｍＬシリンジを使用して、血管にＨＢＳＳ（ドーセット州、プールのシグマ社製）を瞬間的に通した。ＨＢＳＳ（２０ｍＬ）中２０ｍｇ／ｍＬコラーゲナーゼＡ（シグマ社
製）の溶液を使用して、血管から内皮細胞を除去し、そして２０μｍメンブレンを使用して滅菌濾過した。第二２０ｍＬシリンジを使用して、この溶液を臍帯血管に導入し、そして各シリンジに順に穏やかに圧力を適用することにより、慎重に撹拌した。その後、臍帯を、３７℃の水浴中で２０分間培養し、１０分間、二番目の撹拌をした。コラーゲナーゼＡ溶液を臍帯から除去し、そしてＦＣＳ２０％を含む媒体２０ｍＬを添加して酵素をクエンチし、そして別の媒体２０ｍＬを血管に瞬間的に通して、残存する内皮細胞を全て除去した。遠心により細胞をペレットにし（４００ｇ／５分）、ＦＣＳ２０％、Ｌ−グルタミン（２０ｍＭ）、ペニシリン２００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン２００μｇ／ｍＬ及び臨床グレードのヘパリン［バックスのレオラボラトリーズ（ＬｅｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製］５０μｇ／ｍＬを含む成長媒体［ＭＥＭアルファ（シグマ社製）］５ｍＬに再懸濁した。その後、これらを、コラーゲンをコートした２５ｃｍ²組織培養フラスコに移し、そして５％ＣＯ2 と共に３７℃で培養した。４８時間培養後、５μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント（ＥＳＧＳ−シグマ社製）を添加した。

倒立顕微鏡を使用して、培養物を毎日検査した。密集した場合成長媒体を吸引し、３７℃で、等容積のＨＢＳＳで置換した。その後、トリプシニゼーションにより細胞を除去した。ＨＢＳＳを吸引し、そしてＨＢＳＳ［イギリス国、ペイズリーのライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製］中のトリプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）／ＥＤＴＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）溶液２ｍＬで置換し、そしてフラスコの底から全ての細胞が除去されるまで、３７℃で５〜１０分間培養した。その後、細胞を、ＥＣＧＳ（５μｇ／ｍＬ）を含む新鮮な成長媒体を用いて１：２ないし１：３の比率に分割し、そして行う分析に応じて、適切なフラスコ又は組織培養プレートに移した。

ＨＵＶＥＣを、濃度１００μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンと共に７２時間培養した。媒体のみの中で72時間に渡り培養したＨＵＶＥＣに比べた場合、細胞生存性に現象は見られなかった（１４（ｉｉ）を参照）。

実験Ｂ２：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 と共に３７℃で１５分間培養した。その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、そして図１５に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。

実験Ｂ３：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を一個人から単離し、ＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 と共に３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１６（ｉ）に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、これらの実施例において使用されたエンドトキシンに結合することにより、それらの活性をメディエイトしないことが確認された。

実験Ｂ４：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１６（ｉｉ）に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ５：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で２４時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１６（ｉｉｉ）に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ６：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間ないし２４時間の範囲の期間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１６（ｉｖ）に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、検査した時間ポイントの全てにおいて、ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ７：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、そして図１７に示されるように、ＴＮＦ−αを分析した。

実験Ｂ８：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１８（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図１８（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図１８（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図１８（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図１８（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図１８（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それ
らの放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ９：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを２００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図１９（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図１９（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図１９（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図１９（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図１９（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図１９（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

デンドリマー世代３．５をＥＤＣリンカーと反応させるが、しかしその後、グルコサミン又はグルコサミンスルフェートの添加を省略することにより水性溶液中で製造されたデンドリマー世代３．５構成物も検査した。このデンドリマー世代３．５−ＥＤＣ構成物は、５ｎｇ／ｍＬにおいて、それらがリポ多糖にチャレンジされたとき、末梢血単核細胞からのケモカイン（ＭＩＰ−１β）又はＴＮＦ−αの放出を低減しなかった。これは、デンドリマー−グルコサミン構成物を用いて見出されたケモカイン及びサイトカインにおける低減が、デンドリマー自体とＥＤＣリンカー基との副反応に起因されなかったことを意味する。

更なる実施例において、反応溶媒としてＤＭＳＯを使用してグルコサミンに結合されたデンドリマー世代３．５も評価した。このデンドリマー世代３．５−グルコサミン構成物は、５ｎｇ／ｍＬにおいて、それらがリポ多糖にチャレンジされたとき、末梢血単核細胞からのケモカイン（ＭＩＰ−１β）又はサイトカイン（ＴＮＦ−α）の放出を低減しなかった。従って、水性溶液中におけるデンドリマー世代３．５−グルコサミンの合成は、生物学的な活性分子を製造するための方法の重要な要素であった。

実験Ｂ１０：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、その後、５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを２００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を５％ＣＯ2 中で３７℃で１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間ごに採取し、そして図２０（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、そして図２０（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ１１：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、そして５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、そしてこの細胞を、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加する前に、
５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間、又は１時間、又は２時間、又は３時間、又は４時間培養した。ＬＰＳの添加後、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図２１（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図２１（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図２１（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図２１（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図２１（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図２１（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

実験Ｂ１２：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、そして５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンに対するグルコサミンの負荷が３％（他の全ての実験において使用された７％でなく）であるデンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度１５０μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を、５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２２時間権に採取し、そして図２２（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、又は図２２（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

実施例Ｃ：異なるドナーからのヒト細胞の混合を用いた実施例
複数のドナーからのヒトＰＢＭＮ細胞の混合後のケモカイン、次いでサイトカインの放出に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体の効果
実験Ｃ１３：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人３人から単離し、そして細胞密度を１×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。その後、ドナー３人からの細胞全てを、１２ウェル組織培養プレートで７２時間一緒に混合した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを５０μｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを１日後、３日後及び４日後に採取し、そしてＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αを分析した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−α放出における大きい低減が、図２３（ｉ）及び図２３（ｉｉ）にそれぞれ示されるように、分析された三つの時間ポイント全てにおいて見出された。

実験Ｃ１４：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、そして細胞密度を１×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。前記細胞を別々に２４時間培養し、その後、１２ウェル組織培養プレートで７２時間一緒に混合した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを５０μｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを１日目、３日目及び４日目に採取し、そしてＭＩＰ−１βを分析した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、図２３（ｉｉｉ）に示されるように、分析された三つの時間ポイント全てにおいて見出された。

実験Ｃ１５：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、そして細胞密度を１×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。前記細胞を一緒に混合し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。その後、即座に、ＬＰＳを１０ｎｇ／ｍＬで添加し、そして細胞を含まない培養物上澄みを一定間隔で４８時間目まで採取した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、図２４（ｉ）に示されるように、２４
時間以降見出された。

実験Ｃ１６：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、そして細胞密度を１×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。前記細胞を一緒に混合し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。２４時間後に、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを一定間隔で９６時間目まで採取した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、図２４（ｉｉ）に示されるように、２４時間以降見出された。

実施例Ｄ：サイトカイン及びケモカイン分析
組織培養物上澄み中のＭＩＰ−１β及び他のケモカイン並びにサイトカインの定量
市販の酵素免疫分析［ＥＩＡ；クオンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）、アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）社製］を使用して、ＭＩＰ−１βのレベルを、細胞を含まない培養物上澄みに関して測定した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体は、成長媒体中の最終濃度２００μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体にｒｈＭＩＰ−１βを最終濃度１２５ｐｇ／ｍＬで混合することにより、前記分析を妨害しないことが最初に確認された。この溶液を３７℃で４時間培養し、その後、ＥＩＡにおける試料として使用した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンのＭＩＰ−１β分析妨害は存在しなかった（表４ａを参照）。

デンドリマー世代３．５−グルコサミンのＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１β及びＩＬ−６分析妨害は存在しなかった（表４ａを参照）。ＴＮＦ−αの場合、低レベルの妨害が見出され、そしてこれは、図に示された結果に対して補正された（表４ｂを参照）。

実施例Ｅ：他の生物学的データ：
実施例Ｅ１：予備的な動物毒性学：
アニオン性デンドリマー世代３．５は、９０ｍｇ／ｋｇでマウスに対して毒性を示さなかった。四匹のウィスターラットに、濃度３０ｍｇ／ｋｇで、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを静脈注射した。これは、６ｍｇ／２００ｇラットと等価である。全ての動物は２４時間健常であった。その後これらを殺し、そして検査した。何れの器官においても、著しい病状は見出されなかった。

実施例Ｅ２：抗凝血活性：
それぞれの化合物（即ち、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５グルコサミン、デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェート、デンドリマー世代３．５グルコサミン３，６−ジスルフェート及びデンドリマー世代３．５グルコサミン３，４，６−トリスルフェート）の抗凝血活性を、下記の生体外試験：カオリンパーシャルトロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、トロンビン時間及び因子Ｘａ分析、を使用して決定した。試験された化合物全てにおいて分析された最大濃度２００μｇ／ｍＬにおいて、抗凝血活性は見出されなかった。デンドリマー世代３．５−グルコサミンについて、これは濃度３００μｇ／ｍＬにおいても確認された。結果を表５に示す。生物学的活性を有するが、しかし抗凝血活性を有しない硫酸化多糖が製造されたのは、これが最初である。

実施例Ｅ３：デンドリマー−硫酸化グルコサミン構成物の抗−ＨＩＶ−１活性：
合成されたデンドリマー世代３．５グルコサミン及び硫酸化グルコサミン構成物の抗−ＨＩＶ−１活性を、Ｃ８１６６細胞及び濃度１００μｇ／ｍＬのＨＩＶ−１．ＩＩＩｂウィルスを使用して決定した。抗−ＨＩＶ活性は見られなかった。

実施例Ｆ：デンドリマー硫酸化グルコサミンの生物学的活性：
実施例Ｆ１：デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェートは、使用された濃度において、ヒトＰＢＭＮ細胞、ヒトＭＤＭ又はＨＵＶＥＣの成長特性に影響を及ぼさない
デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェートは、５日目まで維持された培養物中に濃度１５０μｇ／ｍＬまでで存在するとき、ＰＢＭＮ細胞（図２５（ｉ）及び図２５（ｉｉ）を参照）又はＭＤＭ（図２６を参照）の細胞生存率又は成長特性に影響を及ぼさなかった。細胞生存率は、トリパンブルー排除及びＭＴＴ分析により決定した。更に、デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェート構成物は、７２時間目まで濃度１００μｇ／ｍＬまでで、これらの細胞に添加したとき、ＨＵＶＥＣに毒性を示さなかった（図２７（ｉ）及び図２７（ｉｉ）及び図２７（ｉｉｉ）を参照）。

実施例Ｆ２：ＬＰＳによるシングルドナーヒトＰＢＭＮ細胞からのケモカイン及びサイトカインの放出に対するデンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェートの効果：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、ＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、そして５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートを、１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を、５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、そして、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を含まない培養物上澄みを２４時間後に採取し、そして図２８（ｉ）に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが存在するとき、ＭＩＰ−１β放出における大きい低減が見出された。

図２８（ｉｉ）に示されるようなＴＮＦ−α分析のためにも細胞を含まない培養物上澄みを採取し、分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬで存在するとき、ＴＮＦ−α放出における大きい低減が見出された。

実施例Ｆ３：ドナー４人からのヒトＭＤＭを混合した後の、ケモカイン及びサイトカインの放出に対するデンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェートの効果：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を、密度勾配遠心により個人４人から単離し、その後、２４時間一緒に混合した。この細胞を成長媒体（ＲＰＭＩ１６４０、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ペニシリン［２５０ＩＵ／ｍＬ］、ストレプトマイシン［２５０μｇ／ｍＬ］及びヒト血清１０％）に再懸濁し、そして細胞密度を２×１０⁶細胞／ｍＬに調節した。ＭＤＭを分離するため、この細胞をプラスチック皿に２時間付着させ、その後ＭＤＭをすくい取り、洗浄し、そして成長媒体に再懸濁した。その後、それらを密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再付着させ、そして、濃度２５μｇ／ｍＬでデンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートを添加する前に、７２時間培養液に放置した。細胞を含まない培養物上澄みを３６時間後に採取し、そして図２９に示されるように、ＭＩＰ−１βを分析した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、並びにデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが存在するとき、ＭＩＰ−１β放出における大きい低減が見出された。

実施例Ｆ４：化合物の抗血管新生活性を決定するための内皮微小管形成分析：
クボタ（Ｋｕｂｏｔａ）らは、ヒト臍帯血管内皮細胞は、基底膜蛋白質からなる再構成ゲル［マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）；べクトン−ディキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製］上で培養されたとき、体管形成を伴う形態的分化を進めることを報告した［クボタワイ．（ＫｕｂｏｔａＹ．）、エイチ．ケイ．クラインマン（Ｈ．Ｋ．Ｋｌｅｉｎｍａｎ）、ジー．アール．マーチン（Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ）及びティー．ジェイ．ロウリー（Ｔ．Ｊ．Ｌａｗｌｅｙ）、１９８８年、「ヒト内皮細胞の毛細管状構造物への形態的分化におけるラミニン及び基底膜の役割（Ｒｏｌｅｏｆｌａｍｉ
ｎｉｎａｎｄｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｎｂｒａｎｅｉｎｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｔｏｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１０７号、第１５８９〜１５９８頁］。これは生体内の状況においても同じで、この場合、内皮細胞は血管管腔の内側を覆い、そしてコラーゲン、ヘパランスルフェートプロトグリカン並びに糖蛋白質及びニドゲン／エンタクチンＩＶからなる基底膜の細胞外マトリックスと接触している。

基底膜の分化を促す能力ゆえに、ゲルに付着した細胞は急速に定着した。１時間ないし２時間以内に、継続的プロセスが観察された。８時間後、内皮細胞培養物は、細胞の糸からなる分岐し且つ接合した多量のネットワークを示した。１８時間で、内皮細胞は、接合した細胞の相互接続したネットワークを形成し、これは、低出力光学顕微鏡によると、ハニカム状の外観を有していた。マトリゲル上に内皮細胞により形成された管状構造物は、数日間存続した。管状構造物の形成は、細胞外成長因子又は培養媒体中のヘパリンの存在と無関係である。ヒトの皮膚の繊維芽細胞のみならずヒトの平滑筋細胞もまた、マトリゲル上で培養されたとき管を形成しないので、管形成は、内皮細胞において比較的特異であるようにも思われる。

超構造的ＥＭ検査は、形態的に分化した内皮細胞の接合した細胞質延長部は、断面において１個又は２個の内皮細胞で完全に取り巻かれている管腔を含むことを確証した。再生された細胞質の種々の量を含む前記管腔は、管形成中に細胞の非常に急速な改造が起ることを示唆している。マトリゲル上で培養された内皮細胞の生存率検査は、細胞死が管形成において重要な役割を演じることを示唆しない。更に、これらの分化した細胞は、内皮細胞で特徴的なワイベル−パラド（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）体を保持する。

内皮微小管形成分析は、帝王切開による出産より６時間以内に臍帯からヒト臍帯血管内皮細胞を単離することにより行われた。臍帯血管にカニューレを挿入し、そしてコラーナーゼ０．１％を含む燐酸塩で緩衝化された生理的食塩水を導入し、そして２０分間培養した。メディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９で臍帯血管を洗浄することにより、コラーナーゼにより遊離させられた内皮細胞が得られた。この細胞をメディウム１９９で３回洗浄し、その後、フィブロネクチンでコートされた組織培養フラスコ中で培養した。成長媒体は、ウシ胎仔血清２０％、内皮細胞成長サプリメント３０μｇ／ｍＬ、ヘパリン１０ＩＵ／ｍＬ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ及びＬ−グルタミン２ｍＭを含むメディウム１９９からなる。トリプシン−ＥＤＴＡで処理した後、ヒト臍帯血管内皮細胞を合流して継代接種させた。全ての細胞は、３ないし６の継代で使用した。

マトリゲルのアリクウォットを氷上の直径３５ｍｍの組織培養皿内に分け取り、その後、３７℃で１０分間培養してゲルを準備した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートをＨＵＶＥＣ成長媒体中で製造し、そして複数の異なる濃度において、前記皿に添加した。継代３ないし６におけるＨＵＶＥＣを、トリプシンを使用して採取し、そして密度２〜３×１０⁵細胞／ｍＬで成長媒体に懸濁した。この細胞懸濁液のアリクウォット１ｍＬを、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートを含むプレートに添加し、そして３７℃、５％ＣＯ2 で培養した。８〜２４時間からの種々の時間ポイントにおいて、このプレートを検査し、そして刊行物に記載の０〜４の判定基準を使用して評価したが、ここで、０＝付着細胞全てがシングルで残存する、そして４＝付着細胞全てが管状構造物に含まれる、ことを意味する。新たな体管形成を、１８時間目で３人の異なる観察者により盲検定量した。観察者内における及び観察者間における変動率は１０％未満であった（ｎ＝４）。結果を表６に、そして分析の写真を図３０及び図３２示す。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは体管形成のレベルを、１２μｇ
／ｍＬにおいて非常に低減し、そして７５μｇ／ｍＬないし１００μｇ／ｍＬにおいて形成を完全になくした。

デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートを検査するために使用された、移動及び微細血管形成の生体外モデルは、血管新生の二つの特徴、即ち内皮細胞増殖及び毛管小新芽を満たした。我々の生体外観察は、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが健常な内皮細胞による新規体管形成を阻害し、且つこれが新規血管形成、即ち血管新生を妨げることを示している。

実施例Ｆ５：生体外血管新生分析：
血管（直径約１〜２ｍｍ）を、人工帝王切開出産から６時間以内に、ヒト胎盤の先端表面から摘出した。胎盤の使用は、ロンドンのエシクスコミッティーオブハマースミスホスピタルズトラスト（ＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈＨｏｓｐｉｔａｌｓＴｒｕｓｔ）により認可された。血管をハンクの調整塩（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔ）溶液内に入れ、そして小さい解剖用鉗子及び切除ハサミを使用して１〜２ｍｍのフラグメントに切断した。残存する血餅を除去し、その後、血管をハンクの調整塩溶液に浸漬した。

新規血管形成に対する各化合物の効果を、２４ウェル組織培養プレート中でフィブリンクロット内の血管を培養することにより決定した。ウシトロンビン（０．１５Ｍ塩化ナトリウム中５０ＮＩＨＵ／ｍＬ）３０μＬをそれぞれのウェルに添加し、その後、メディウム１９９中のウシフィブリノーゲン３ｍｇ／ｍＬを１ｍＬ／ウェル適用した。トロンビン及びフィブリノーゲンは急速に混合され、そして血管フラグメントをウェルの中央に配置した。フィブリンゲル形成が急速に起こり、そしてこの血管をゲル内に懸濁放置した。ウシ胎仔血清２０％、ペニシリン２５０ＩＵ／ｍＬ及びストレプトマイシン２５０μｇ／ｍＬを補足した１ｍＬ／ウェルのメディウム１９９を、その後、それぞれのウェルに添加した。ε−アミノ−ｎ−カプロン酸（３００μｇ／ｍＬ）も、最初の４日間及び、フィブリンクロットの溶解を妨げるため、その二週間後（５０μｇ／ｍＬ）に添加した。

新規血管形成の程度を、０＝成長なし、１＝非常に僅かな新規血管形成、２＝かなりな新規血管形成及び３＝高密度の新規血管形成を意味する目視アナログ尺度を使用して、一週間に２回、３人の異なる観察者により盲検定量した。血管新生スコアは、合計スコアを可能な最大スコアで割り、その後、結果をパーセンテージとして表わすことにより、それぞれのウェルについて得られたカウントから誘導された。二つの異なる場合において、それぞれの化合物を、四重反復ウェルで検査した。ＭＣＤＢ１３１（即ち、血清を含まない媒体）中で血管が培養された実験は、新規血管形成のために血清因子が必要でないことを示した。フィブリンクロットの幾つかを１０％ホルマリン中に一晩固定し、パラフィンを埋め込み、組織学的に区分し、その後、内皮細胞マーカー因子ＶＩＩＩ及びＣＤ３１を染色した。

分析コース２８日を通じて、微細血管の複雑なアーケイドが、フィブリンクロット内に固定された血管の切断部分から、発現した。非常に僅かな新規血管形成が、区分されなかった血管の領域に見出された。最初の血管は４日目に発現し、そして通常、平滑末端であった。その後１８日間にわたり、それらは分岐し、そして血管の複雑なアーケイドを生じた。最初の２週間成長は急速であり、その後、かなり遅くなった。これらの新規血管は、因子ＶＩＩＩ及びＣＤ３１に対して免疫組織化学的に陽性であることにより示される如く、表皮細胞により内側が覆われていた。

行われた六つの実験において、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが２５μｇ／ｍＬ存在するとき形成された新規血管の数が低減した（図３３を参照）。
デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが５０μｇ／ｍＬ存在するとき、新規血管形成の阻害はより著しく且つ大きかった（ｐ＜０．０５）。この効果は、差はあるが最初に１８日目に見出され、２８日目まで、継続し且つより大きくなった。実験は３２日で終了した。

実施例Ｇ：混雑したリンパ球反応に対するモデルシステム：
本発明は、同種移植器官拒絶の複雑なプロセスを阻害する化合物を評価するために使用することができる、混雑（入り交じった）リンパ球反応に対するモデルシステムを提供する。これら実験からの結果は、図２３（ｉ）、図２３（ｉｉ）、図２３（ｉｉｉ）、図２４（ｉ）及び図２４（ｉｉ）に示されている。我々の実験のデルシステムの使用をして、我々は、デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートによる抗炎症活性を評価した。我々の結果は、混合されたリンパ球反応は、デンドリマー世代３．５−グルコサミンにより、並びにデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートにより、成功裏に阻害され得、従って、それらは、同系の、自系の、異質遺伝子型の、又は異系の器官移植の拒絶が起るとき見出される炎症性応答を防止する際に、治療的に使用され得ることを示している。それは、移植された器官への拒絶を防止すること、並びに移植片対宿主病の発症を防止するために必要とされる抗炎症環境の維持にも有効である。

混雑リンパ球反応は、ドナー細胞において発現した抗原に対する臓器移植者リンパ球の感応性を検査するために使用することができる。臓器移植者の抗ドナーの低いリンパ球反応は、優れた移植生存率に関連する。この検査は、ドナー骨髄細胞が臓器移植者の抗原に応答し、そして移植片対宿主病を引き起こすかどうかも評価されるので、とりわけ骨髄移植の際に重要である。

実施例Ｈ：樹木状の細胞源の細胞に対するデンドリマー世代３．５−グルコサミンの生物学的活性：
未熟な単核誘導樹木状細胞は、以下のように製造された。シングルドナーからの新たに単離されたＰＢＭＮ細胞を得、そしてゼラチンでコートされたフラスコ中に１時間接着させることにより、単核を単離した。単離された単核を、ペニシリン及びストレプトマイシン及びＬ−グルタミン並びに、インターロイキン−４（１０００ＩＵ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１５０ＩＵ／ｍＬ）を持つ１０％自系熱不活性化ヒト血清を含むＲＰＭＩ中で５日間培養した。これらの細胞は、ＦＡＣＳ分析に対する下記の表現型：ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ２５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−及びＨＬＡ−ＤＲ＋により、未熟な単核誘導樹木状細胞であると確認された。組織誘導された、ヒト腹膜樹木状細胞を、ミルテニーバイオテック（ＭｉｌｔｅｎｙＢｉｏｔｅｃｈ）ＣＤ１ｃ単離キット使用して単離した。これらの細胞は、ＦＡＣＳ分析に対する下記の表現型：ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ２５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８３−及びＨＬＡ−ＤＲ＋により、未熟な組織誘導樹木状細胞であると確認された。その後、血液−又は組織−誘導ヒト樹木状細胞（即ち、スティミュレーター細胞）を、３０Ｇｙγ線に暴露することにより、その増殖を妨げるために照射した。

混雑リンパ球反応のために、レスポンダー細胞を、シングルドナーＰＢＭＮ細胞から、最初にそれらをプラスチックに１．５時間付着させることにより、製造した。これらのＰＢＭＮ細胞からの非付着性フラクションはＴ細胞に富み、そしてそれらは、レスポンダー細胞として使用された。この細胞を、ＲＰＭＩ及びペニシリン及びストレプトマイシン及びＬ−グルタミン及び１０％不活性化ヒト血清中で培養した。照射されたスティミュレーター細胞をレスポンダーリンパ球と混合した。異質遺伝子型の混雑リンパ球反応体を３７℃で５日間培養し、その後、［³Ｈ］チミジン（１μＣｕ／ウェル）をパルスし、そして３７℃で更に１８日間培養した。その後、この細胞を採取し、そして取り込まれた［³Ｈ
］チミジンを測定した。

実験Ｈ１：
リポ多糖は、未熟な樹木状細胞の免疫学的な刺激を誘導する。単核誘導樹木状細胞を前記のように製造し、そして１×１０⁵細胞／ウェルで付着させた。デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）を１時間添加し、その後ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を含まない培養物上澄みを２１時間後に採取し、そして図３５（ｉ）に示されているようにＭＩＰ−１βについて、及び図３５（ｉｉ）に示されているようにＴＮＦ−αについて、分析した。検査したケモカイン及びサイトカインにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

実験Ｈ２：
リポ多糖は、それにより細胞表面ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の増加した発現により説明されるように、未熟な樹木状細胞の成熟を導く。樹木状細胞の前記ＬＰＳ誘発成熟を妨害するためのデンドリマー世代３．５−グルコサミンの能力を決定した。未熟な単核誘導樹木状細胞を前記のように製造し、そして１×１０⁶細胞／ウェルで付着させた。デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）を１時間添加し、その後ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。この細胞を２１時間培養し、その後、ＦＡＣＳ分析のために採取した。図３６に示されているように、デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、樹木状細胞上のＬＰＳ誘発のＣＤ２５増加を大きく低減した。

実験Ｈ３：
樹木状細胞及びＴリンパ球の共培養は、［³Ｈ］チミジン採取により測定されたように、混雑リンパ球反応を導く。リポ多糖（ＬＰＳ）も添加されるとき、更なる増殖が起る。γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、丸底の９６ウェル培養プレート中で、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、３３０μｇ／ｍＬＬ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ヒト血清を補足したＲＰＭＩ１６４０中で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間培養した。対照ウェルは媒体のみを含んでいた。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。他の対照ウェルは末梢血リンパ球のみを含んでいた。ウェル当りの全容積は２５０μＬであった。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬで２１時間、リポ多糖と共に培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。末梢血リンパ球対照ウェルに対する１分当りのカウント（ｃｐｍ）を、［³Ｈ］チミジン配合の平均ｃｐｍを決定するために、各実験の実測ｃｐｍから差し引いた。図３７は、三つの実施例の結果を示す。それぞれの場合において、混雑リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに５ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

実験Ｈ４：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、丸底の９６ウェル培養プレート中で、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、３３０μｇ／ｍＬＬ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬスト
レプトマイシン及び１０％熱不活性化ヒト血清を補足したＲＰＭＩ１６４０中で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間培養した。対照ウェルは媒体のみを含んでいた。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。他の対照ウェルは末梢血リンパ球のみを含んでいた。ウェル当りの全容積は２５０μＬであった。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬで２１時間、リポ多糖と共に培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。末梢血リンパ球対照ウェルに対する１分当りのカウント（ｃｐｍ）を、［³Ｈ］チミジン配合の平均ｃｐｍを決定するために、各実験の実測ｃｐｍから差し引いた。図３８は、二つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混雑リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに２０ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

実験Ｈ５：
増殖を低減するデンドリマー世代３．５−グルコサミンの能力を決定した。γ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞を、丸底の９６ウェル培養プレート中で、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、３３０μｇ／ｍＬＬ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ヒト血清を補足したＲＰＭＩ１６４０中で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間培養した。対照ウェルは媒体のみを含んでいた。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。他の対照ウェルは末梢血リンパ球のみを含んでいた。ウェル当りの全容積は２５０μＬであった。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬで２１時間、リポ多糖と共に培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。末梢血リンパ球対照ウェルに対する１分当りのカウント（ｃｐｍ）を、［³Ｈ］チミジン配合の平均ｃｐｍを決定するために、各実験の実測ｃｐｍから差し引いた。図３９は、三つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混雑リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに５ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

実験Ｈ６：
γ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞を、丸底の９６ウェル培養プレート中で、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、３３０μｇ／ｍＬＬ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ヒト血清を補足したＲＰＭＩ１６４０中で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間培養した。対照ウェルは媒体のみを含んでいた。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。他の対照ウェルは末梢血リンパ球のみを含んでいた。ウェル当りの全容積は２５０μＬであった。このプレートを、３７℃、
５％ＣＯ2 で５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬで２１時間、リポ多糖と共に培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。末梢血リンパ球対照ウェルに対する１分当りのカウント（ｃｐｍ）を、［³Ｈ］チミジン配合の平均ｃｐｍを決定するために、各実験の実測ｃｐｍから差し引いた。図４０は、二つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混雑リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに２０ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

実験Ｈ７：
この実施例において、リポ多糖の存在下における混雑リンパ球反応の間のＩＬ−２及びγ−インターフェロンの放出に関するデンドリマー世代３．５−グルコサミンの影響を決定した。γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞又はγ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞を、丸底の９６ウェル培養プレート中で、アリクウォットに関して二重で、３２０００ないし２０００樹木状細胞／ウェルの範囲で、３３０μｇ／ｍＬＬ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ヒト血清を補足したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）を、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間添加した。その後、リポ多糖（２０ｎｇ／ｍＬ）を２１時間添加した。その後、細胞を媒体で三回洗浄し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）で置換した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００細胞／ウェル）を添加し、そしてこれを、０日と定義した。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養し、そして、インターロイキン−２及びγ−インターフェロンの測定のために、細胞を含まない培養物上澄みを３日目及び５日目に捕集した［ＥＩＡ；アールアンドディーシステムズ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）社製］。

図４１（ｉ）はγ線照射された精製された腹膜樹木状細胞に対する結果を示し、そして図４１（ｉｉ）はγ線照射された単離され精製された単核誘導樹木状細胞に対する結果を示す。それぞれの細胞種において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、インターロイキン−２及びγ−インターフェロンの放出の大きい低減を引き起こす。

実施例Ｊ：超抗原毒素を用いた実験
バクテリア超抗原は、毒素の最も致死性のものである。黄色ブドウ球菌及び化膿連鎖球菌により産生された超抗原は、致死性の毒素性ショックをもたらし得る極度の細胞免疫応答を誘発する。超抗原の群はブドウ球菌のエンテロトキシンＳＥＡ−ＳＥＥ（このうち、ＳＥＢが最も有名である）、毒素性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）及びブドウ球菌の発熱性エキソトキシン及びＳＰＥＡ及びＳＰＥＣを包含する。ＳＥＢの場合、それはＴ細胞の３０〜４０％を活性化して、サイトカインを誘発及び産生し得る。毒性は、免疫システムの細胞からの、ケモカイン及びサイトカインの大規模な誘発から生じ得る。記載したこの実験の目的は、この経過の初期において、即ち、Ｔ細胞の活性化が起る前において、超抗原毒素の致死性効果を、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを用いて試験し且つブロックすることである。これを行う臨床的根拠は、ブドウ球菌の超抗原毒素に応答して炎症性サイトカインをより高いレベルで産生する患者は、超抗原毒素に応答して前記炎症性サイトカインをより低いレベルで産生する患者よりも、この疾患のより重度の臨床的徴候を発現することである［エイ．ノルビ−テグルンド（Ａ．Ｎｏｒｒｂｙ−Ｔｅｇｌｕｎｄ）ら、ヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー、２０００年、第３０号、
第３２４７〜３２５５頁］。

実験Ｊ１：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０％ヒト血清中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、そして、３７℃、５％ＣＯ2 で１５分間培養した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを２００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ2 で３０分間培養し、その後、超抗原ＳＥＢを１００ｎｇ／ｍＬで添加した。ＳＥＢを使用する前に、リムルス試験を使用して、前記ＳＥＢがどのようなＬＰＳも含まないことを確認した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図４２（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、そして図４２（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを、分析した。ケモカイン及びサイトカインの両方において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出における大きい低減が見出された。

図面の説明：（全ての結果平均値±sem.で表現）
図１a ないし１b:
ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代２．５の構造(a) 及び
ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代３．５の構造(b) 。
デンドリマー世代２．５：ＭＷｔ＝６, ０１１ダルトン；３２カルボン酸表面基。
デンドリマー世代３．５：ＭＷｔ＝１２, ４１９ダルトン；６４カルボン酸表面基。

図２：
グルコサミン又は硫酸化グルコサミンのＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマーへの結合の概略表示。
１は、グルコサミン（Ｒ＝Ｈ，Ｒ₁＝Ｈ，Ｒ₂＝Ｈ）又はグルコサミン６−スルフェート（Ｒ＝ＳＯ₃Ｈ，Ｒ₁＝Ｈ，Ｒ₂＝Ｈ）又はグルコサミン３, ６−ジスルフェート（Ｒ＝ＳＯ₃Ｈ，Ｒ₁＝ＳＯ₃Ｈ，Ｒ₂＝Ｈ）又はグルコサミン３, ４, ６−トリスルフェート（Ｒ＝ＳＯ₃Ｈ，Ｒ₁＝ＳＯ₃Ｈ，Ｒ₂＝ＳＯ₃Ｈ）を表す。
２は、ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代２．５（ｘ＝３２）又はＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代３．５（ｘ＝６４）を表す。
３は、縮合剤として１−エチル−３−（ヂメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を表す。ｙモルのグルコサミン又は硫酸化グルコサミンがデンドリマーに結合。

図３：
デンドリマー世代３．５−グルコサミン混合物のゲル濾過。反応時間の終わりに、混合物の０．５ｍＬ（黒円）がＰＤ−１０カラムを通過し、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。遊離グルコサミン（白三角）はＰＤ−カラムを通過し、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。同様の結果が、デンドリマー世代３．５−グルコサミンについて得られた。

図４：
デンドリマー世代３．５(a) 、グルコサミン(b) 、及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン(c) のＦＴ−ＩＲスペクトル。

図５：
デンドリマー世代３．５−グルコサミンの概略表示。

図６：
デンドリマー世代３．５(a) 、グルコサミン６−スルフェート(b) 、及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート(c) のＦＴ−ＩＲスペクトル。

図７（i ）:
貯蔵の間のデンドリマー世代３．５−グルコサミンの安定性。
デンドリマー世代３．５−グルコサミンは水溶液として貯蔵した。前記水溶液のアリクウォットを、ＰＤ−１０カラム通過０日目（白三角）、７日目（黒丸）、１５日目（黒四角）、９０日目（黒三角）に取り、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。遊離グルコサミン（白四角）はＰＤ−カラムを通過し、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。

図７(ii):
貯蔵の間のデンドリマー世代２．５−グルコサミンの安定性。
デンドリマー世代２．５−グルコサミンは水溶液として貯蔵した。前記水溶液のアリクウォットを、ＰＤ−１０カラム通過０日目（黒三角）、３０日目（黒丸）に取り、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。遊離グルコサミン（白四角）はＰＤ−カラムを通過し、収集したフラクションをベータ−カウンターを使用して読み取った。

図８(i)
ＰＢＭＮ細胞と、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図８（ii）及び（iii ）:
ＭＤＭと、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図９：
ＭＤＭと、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，４，６−トリスルフェートでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１０（ｉ）及（ｉｉ）：
それぞれの分子において２５μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１０（ｉｉｉ）：
それぞれの分子において２５μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養７２時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１１（ｉ）及び（ｉi ）:
それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１２（ｉ）及び（ｉｉ）：
それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬをでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１３（ｉ）及び（ｉｉ）：
それぞれの分子において１００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１３（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）：
それぞれの分子において２００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでは、対照ウェルにおいて見られたＭＩＰ−１βの放出以上の放出は見られなかった。

図１４（ｉ）：
デンドリマー世代３．５−グルコサミンを濃度１５０μｇ／ｍＬまで７２時間、ＭＤＭと共に培養した。細胞数又は細胞生存性（トリパンブルー及びＭＴＴ分析にて測定）における低下は見られなかった。

図１４（ｉｉ）：
濃度１００μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンをＨＵＶＥＣと共に７２時間培養した。細胞数又は細胞生存性（トリパンブルー及びＭＴＴ分析にて測定）における低下は見られなかった。

図１５：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に培養した。細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。

図１６（ｉ）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

図１６（ｉｉ）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

図１６（ｉｉｉ）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に２４時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

図１６（ｉｖ）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間、１時間、３時間、８時間又は２４時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。検査した時間ポイントの全てにおいて、ＭＩＰ−１β放出の大きい低減が見出された。

図１７：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳト共に培養した。細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、ＴＮＦ−αを分析した。

図１８（ｉ）ないし（vi）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、図１８（i ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図１８（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図１８（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図１８（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図１８（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図１８（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図１９（ｉ）ないし（vi）
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間御に採取し、そして図１９（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図１９（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図１９（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図１９（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図１９（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図１９（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図２０（ｉ）ないし（ii）：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間御に採取し、そして図２０（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、そして図２０（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図２１：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、そしてＲＰＭＩ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びヒト血清１０％中に、密度１×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁した。その後、この細胞を１２ウェル組織培養プレートに付着（１ｍＬ）させ、そして５％ＣＯ2 中で３７℃で１５分間培養した。その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、そしてこの細胞を、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加する前に、５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間、又は１時間、又は２時間、又は３時間、又は４時間培養した。ＬＰＳの添加２１時間後、細胞を含まない上澄みを採取し、そして図２１（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１αを、図２１（ｉｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、図２１（ｉｉｉ）に示されるようにＩＬ−８を、図２１（ｉｖ）に示されるようにＴＮＦ−αを、図２１（ｖ）に示されるようにＩＬ−１βを、そして図２１（ｖｉ）に示されるようにＩＬ−６を分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図２２：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を、濃度１５０μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミンに対するグルコサミンの負荷が３％（他の全ての実験において使用された７％でなく）であるデンドリマー世代３．５−グルコサミンと共に培養した。前記細胞は５％ＣＯ2 中で３７℃で３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２２時間御に採取し、そして図２２（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、又は図２２（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを分析した。検査したケモカイン及び炎症促進性サイトカインの全てにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図２３：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人３人から単離し、一緒に７２時間混合した。その後デンドリマー世代３．５−グルコサミンを５０ないし１００μｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを１日目、３日目及び４日目に採取し、そしてＭＩＰ−１β及び
ＴＮＦ−αを分析した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−α放出における大きい低減が、図２３（ｉ）及び図２３（ｉｉ）にそれぞれ示されるように、分析された三つの時間ポイントにおいて見出された。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、別々に２４時間培養した。その後、それらは７２時間一緒に混合した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを５０μｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを１日目、３日目及び４日目に採取し、そしてＭＩＰ−１βを分析した。図２３（ｉｉｉ）に示されるように、培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、分析された三つの時間ポイントにおいて見出された。

図２４：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、一緒に混合した。そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加し、その後即座に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。そして細胞を含まない培養物上澄みを一定間隔で５０時間目まで採取した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、図２４（ｉ）に示されるように、２４時間以降見出された。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、一緒に混合した。デンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加した。２４時間後に、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない培養物上澄みを一定間隔で１００時間目まで採取した。培養物上澄み内へのＭＩＰ−１β放出における大きい低減が、図２４（ｉｉ）に示されるように、２４時間以降見出された。

図２５：
デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、５日まで維持された培養物に濃度５０μｇ／ｍＬ（図２５（i ））又は濃度１５０μｇ／ｍＬ（図２５（ii））で存在するとき、ＰＢＭＮ細胞の細胞生存性又は成長特性に影響しなかった。細胞生存性はトリパンブルー排除及びＭＴＴ分析にて測定）した。

図２６：
デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、５日まで維持された培養物に濃度１５０μｇ／ｍＬまで存在するとき、ＭＤＭの細胞生存性又は成長特性に影響しなかった。細胞生存性はトリパンブルー排除及びＭＴＴ分析にて測定）した。

図２７（ｉ）及び（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）：
デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェート構成物は、７２時間目まで濃度１００μｇ／ｍＬまでで、ＨＵＶＥＣに添加したとき、これらの細胞に毒性を示さなかったを参照）。

図２８：
ＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、そして、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）
を添加した。ＭＩＰ−１β（図２８（ｉ））のために及びＴＮＦ−α（図２８（ｉｉ））のために、細胞を含まない培養物上澄みを２４時間後に採取した。１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬでデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが存在するとき、ケモカイン及び炎症促進性サイトカインの両方における大きい低減が見出された。

図２９：
ＰＢＭＮ細胞を個人４人から単離し、その後、２４時間一緒に混合した。ＭＤＭをプラスチック皿への付着により分離し、その後、１２５μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと共に培養した。細胞を含まない培養物上澄みを３６時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析した。ＭＩＰ−１β放出における大きい低減が見出された。

図３０ないし３２：
ＨＵＶＥＣによるマトリゲル上の内皮微小管の形成（４０倍）。管形成の程度を測定する為に目視アナログス尺度を使用し、前記の通り、スコア０（全ての細胞が単一のままであった）から４（全ての細胞が微小管構造に関与した）で採点した〔バウアージェイ（Bauer J ）、マルゴリスエム（Margolis M）、シュレイナーシー(Schreiner C) 、エドゲルシー−ジェイ(Edgell C-J)、アジズカンジェイ（Azizkhan J）、ラザロウスキーエイー（Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉ E）及びジュリアーノアールエル（Juliano RL）、（１９９２）「永久細胞系由来のヒト内皮細胞を使用した血管新生の生体外モデル：誘導された遺伝子発現、ジー−タンパク質及びインテグリンの貢献(In vitro model of angiogenesis using a human endothelium derived cell line: contributions of induced gene expression, G-proteins and integrins)」、J. Cellular Physiology第１５３管、第４３７〜４４９頁；リオウエル(Liau L)及びシュワルツエスエム（Schwartz SM ）、（１９９３）「微小管分裂は牛内皮細胞においてＤＮＡ合成を刺激し、基本フィビュロブラスト成長因子にたいする細胞応答を増強する（Microtubule disruption sttimulates DNA synthesis in bovine endothelial cells and potentiates cellular response to basic fibroblast growth factor）」、American Journal of Pathology 、第１４３巻，第９３７〜９４８頁〕

図３０：対照ウェル
図３１：１２. ５μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート図３２：５０μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート

図３３：
媒体のみ（△）に比べて、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（Ｏ）は、生体外血管新生分析において新規血管形成を減少させた。示した結果は、最終濃度５０μｇ／ｍＬでのデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートのものである。新規血管形成の程度を、０＝成長なし、１＝非常に僅かな新規血管形成、２＝かなりの新規血管形成及び３＝高密度の新規血管形成を意味する目視アナログ尺度を使用して、一週間に２回、盲検定量した。血管新生スコアは、合計スコア（たとえば全てのウェルの合計）を可能な最大スコアで割り、その後、結果をパーセンテージとして表わすことにより、それぞれのウェルについて得られたカウントから誘導された。1 ８日目までに、新規血管形成における非常な減少が見られた（ｐ＜０．０５）。このク゛ラフは、４回行われた実験の典型のものである。新規血管形成は、週に２回、３人の観察者により行い，観察者内における及び観察者間におる変動率は１０％未満であった。

図３４：
ケモカイン及び炎症促進サイトカインが重要な役割を果たす病変の病因を示す図。それは、デンドリマー世代３．５−グルコサミン及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが単独で或いは相乗的に作用し、臨床的に有用な治療効果を生じ得る新規標的を明かにする。

シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に三十分間培養し、その後超抗原毒素ＳＥＢを１００ｎｇ／ｍＬを添加した。細胞を含まない培養物上澄みを２１時間後に採取し、そして図３５（ｉ）に示されているようにＭＩＰ−１βについて、及び図３５（ｉｉ）に示されているようにＴＮＦ−αについて、分析した。検査したケモカイン及びサイトカインにおいて、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出の大きい低減が見出された。

図３６：
未熟な単核誘導樹木状細胞を製造し、１ｘ１０⁶細胞／ウェルで付着させた。デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）を１時間添加し、その後ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した。この細胞を２１時間培養し、その後、ＦＡＣＳ分析のために採取した。図３６に示されているように、デンドリマー世代３．５−グルコサミンは、樹木状細胞に対するＬＰＳ誘発のＣＤ２５増加を大きく低減した。

図３７：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲でデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃で１時間培養した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬのと共に２１時間培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。図３７は、三つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混合リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに５ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

図３８：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で培養した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。このプレートを５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取
し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。図３８は、二つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混合リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに２０ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

図３９：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。図４０は、二つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混合リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに５ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

図４０：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１時間培養した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加した。このプレートを３７℃で５日間培養した。加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養した。その後、細胞を三回洗浄した。その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養した。その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養した。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した。図３９は、三つの実験の結果を示す。それぞれの場合において、混合リンパ球反応により引き起こされた増殖、並びに２０ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳにより引き起こされた増殖は、非常に阻害された。

図４１：
γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞又はγ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞を、アリクウォットに関して、３２０００ないし２０００樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間添加した。その後、リポ多糖（２０ｎｇ／ｍＬ）を２１時間添加した。その後、細胞を媒体で三回洗浄し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）で置換した。その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００細胞／ウェル）を添加し、そしてこれを、０日と定義した。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ2 で５日間培養し、そして、インターロイキン−２及びγ−インターフェロンの測定のために、細胞を含まない培養物上澄みを３日目及び５日目に捕集した。図４１（ｉ）はγ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞からのインターロイキン−２及び
γ−インターフェロンの放出が非常に減じた事を示す。図４１（ｉｉ）はγ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞からのインターロイキン−２及びγ−インターフェロンの放出が非常に減じた事を示す。

図４２：
シングルドナーＰＢＭＮ細胞を密度１×１０⁶細胞／ｍＬで懸濁し、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを２００μｇ／ｍＬで添加した。この細胞を３０分間培養し、超抗原ＳＥＢを１００ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そして図４２（ｉ）に示されるようにＭＩＰ−１βを、そして図４２（ｉｉ）に示されるようにＴＮＦ−αを、分析した。ケモカイン及びサイトカインの両方において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンが存在するとき、それらの放出における大きい低減が見出された。

表１：
この表は、記載された殆どの実験のために使用されたグルコサミンの負荷７％を持つデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体の再現性を示す。実験Ｂ１２（図２２を参照）のために使用されたグルコサミンの負荷３％を持つデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体に対する結果も示す。

デンドリマーに結合したグルコサミンの全量を、β−カウンターを使用して決定した（データは、３回繰り返しにおける平均値±標準偏差として示す）。

表２：
製造されたデンドリマー世代３．５−硫酸化グルコサミン結合体の異なるバッチのキャ
ラクタリゼーション

デンドリマー世代３．５に結合した硫酸化糖の全量を、硫黄分析により決定した。
表２中、‘６Ｓ’はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートを表わし、‘３．５−Ｇ３，６Ｓ’はグルコサミン３，６−ジスルフェートを表わし、‘３．５−Ｇ３，４，６Ｓ’はグルコサミン３，４，６−トリスルフェートを表わす。

表３：
複数のヒト細胞株における及びネズミメラノーマ細胞株におけるデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート結合体の毒性

ヒト細胞株Ｓｕｐ−Ｔ１、Ｃ８１６６、Ｕ９３７、及びＵ８７−ＣＤ４−ＣＣＲ５、及びネズミメラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）に対する前記結合体及び参照対照の毒性を分析した。
ＭＴＴ分析を使用して、ＩＣ₅₀値（μｇ／ｍＬ）±ＳＥＭ（ｎ＝１６）を決定した。
‘ＤＧ３．５−Ｇ’は、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを表わす。
‘Ｄ’は、グルコサミンを表わす。
‘Ｄ６Ｓ’は、グルコサミン６−スルフェートを表わす。

表４ａ：ケモカイン及びサイトカインとデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体の干渉：

デンドリマー世代３．５−グルコサミンとＭＩＰ−１α分析、ＭＩＰ−１β分析、ＩＬ−１β分析、ＩＬ−６分析又はＩＬ−８分析との干渉は存在しなかった。

表４ｂ：ＴＮＦ−αとデンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体との干渉：
ＴＮＦ−α分析の場合において、デンドリマー世代３．５−グルコサミンによる干渉の程度が以下のように見出された。

従って、補正係数を、デンドリマー世代３．５−グルコサミンに関連することが示されたＴＮＦ−αデータの全てに適用した。

表５：デンドリマー世代３．５−グルコサミン結合体及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート結合体の抗凝血性活性：
化合物を、燐酸塩で緩衝化した生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）に溶解するか、又はＲＰＭＩ＋１５％ＦＣＳに溶解し、そして検査したか、或いは、５０：５０でヒト血漿／ベロナール緩衝液と混合し、そして検査した。ヘパリン／ｍＬ（ＨＥＰ（Ｘａ）（Ｖ／ｍＬ））単位として、抗−Ｘａ活性を表わした。

表６：デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート及び３，６−ジスルフェートを用いた内皮微細血管形成：

図１ａは、ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代２．５の構造(a) を示す図である。図１ｂは、ＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマー世代３．５の構造(b) 図２は、グルコサミン又は硫酸化グルコサミンのＰＡＭＡＭアニオン性デンドリマーへの結合を概略表示する図である。図３は、デンドリマー世代３．５−グルコサミン混合物のゲル濾過を示す図である。図４は、デンドリマー世代３．５(a) 、グルコサミン(b) 、及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン(c) のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図である。図５は、デンドリマー世代３．５−グルコサミンの概略表示を示す図である。図６は、デンドリマー世代３．５(a) 、グルコサミン６−スルフェート(b) 、及びデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート(c) のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図である。図７（ｉ）は、貯蔵の間のデンドリマー世代３．５−グルコサミンの安定性を示す図である。図７（ｉｉ）は、貯蔵の間のデンドリマー世代２．５−グルコサミンの安定性を示す図である。図８（ｉ）は、ＰＢＭＮ細胞と、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートでの、対照ウェルのＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図８（ｉｉ）は、図８（ｉ）と同様のことを示す図である。図８（ｉｉｉ）は、図８（ｉ）と同様のことを示す図である。図９は、ＭＤＭと、５０μｇ／ｍＬにおけるデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，４，６−トリスルフェートでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１０（ｉ）は、それぞれの分子において２５μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１０（ｉｉ）は、図１０（ｉ）と同様のことを示す図である。図１０（ｉｉｉ）は、それぞれの分子において２５μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養７２時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１１（ｉ）は、それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５、デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１１（ｉｉ）は、図１１（ｉ）と同様のことを示す図である。図１２（ｉ）は、それぞれの分子において５０μｇ／ｍＬをでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１２（ｉｉ）は、図１２（ｉ）と同様のことを示す図である。図１３（ｉ）は、それぞれの分子において１００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１３（ｉｉ）は、図１３（ｉ）と同様のことを示す図である。それぞれの分子において２００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミン−３，６−ジスルフェート又はデンドリマー世代３．５−３，４，６−トリスルフェートと一緒の培養３６時間後の腹膜マクロファージでの、対照ウェルにおけるＭＩＰ−１βの放出を示す図である。図１３（ｉｖ）は、図１３（ｉｉｉ）と同様のことを示す図である。図１４（ｉ）は、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを濃度１５０μｇ／ｍＬまで７２時間、ＭＤＭと共に培養したときの、細胞数又は細胞生存性（トリパンブルー及びＭＴＴ分析にて測定）における低下を示す図である。図１４（ｉｉ）は、濃度１００μｇ／ｍＬまでのデンドリマー世代３．５−グルコサミンをＨＵＶＥＣと共に７２時間培養したときの、細胞数又は細胞生存性（トリパンブルー及びＭＴＴ分析にて測定）における低下を示す図である。図１５は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に培養し、細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、ＭＩＰ−１βを分析した結果を示す図である。図１６（ｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析したときの、ＭＩＰ−１β放出を示す図である。図１６（ｉｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析したときの、ＭＩＰ−１β放出を示す図である。図１６（ｉｉｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に２４時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析したときの、ＭＩＰ−１β放出を示す図である。図１６（ｉｖ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間、１時間、３時間、８時間又は２４時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析したときの、ＭＩＰ−１β放出を示す図である。図１７は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を単離し、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳト共に培養し、細胞を含まない上澄みを一定間隔で２１時間目まで採取し、ＴＮＦ−αを分析した結果を示す図である。図１８は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（１００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、分析した結果を示す図である。図１９は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加した。細胞を含まない上澄みを２１時間御に採取し、分析した結果を示す図である。図２０は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間御に採取し、分析した結果を示す図である。図２１（ｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、ＬＰＳを５ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間御に採取し、分析した結果を示す図である。図２１（ｉｉ）は、図２１（ｉ）と同様のことを示す図である。図２１（ｉｉｉ）は、図２１（ｉ）と同様のことを示す図である。図２１（ｉｖ）は、図２１（ｉ）と同様のことを示す図である。図２１（ｖ）は、図２１（ｉ）と同様のことを示す図である。図２１（ｖｉ）は、図２１（ｉ）と同様のことを示す図である。図２２（ｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を、濃度１５０μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬでの、デンドリマー世代３．５−グルコサミンに対するグルコサミンの負荷が３％であるデンドリマー世代３．５−グルコサミンと共に培養し、分析した結果を示す図である。図２２（ｉｉ）は、図２２（ｉ）と同様のことを示す図である。図２３（ｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人３人から単離し、一緒に７２時間混合した。その後デンドリマー世代３．５−グルコサミンを５０ないし１００μｇ／ｍＬで添加し、分析した結果を示す図である。図２３（ｉｉ）は、図２３（ｉ）と同様のことを示す図である。図２３（ｉｉｉ）は、図２３（ｉ）と同様のことを示す図である。図２４（ｉ）は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を個人２人から単離し、一緒に混合した。そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミンを１００μｇ／ｍＬで添加し、その後即座に、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、そして細胞を含まない培養物上澄みを一定間隔で５０時間目まで採取し、分析した結果を示す図である。図２４（ｉｉ）は、図２４（ｉ）と同様のことを示す図である。デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートは、５日まで維持された培養物に濃度５０μｇ／ｍＬ（図２５（i ））又は濃度１５０μｇ／ｍＬ（図２５（ii））で存在するとき、ＰＢＭＮ細胞の細胞生存性又は成長特性に影響しなかった。細胞生存性はトリパンブルー排除及びＭＴＴ分析にて測定）した。図２５（ｉｉ）は、図２５（ｉ）と同様のことを示す図である。図２６は、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートが５日まで維持された培養物に濃度１５０μｇ／ｍＬまで存在するときの、ＭＤＭの細胞生存性又は成長特性を示す図である。図２７（ｉ）は、デンドリマー世代３．５グルコサミン６−スルフェート構成物を７２時間目まで濃度１００μｇ／ｍＬまでで、ＨＵＶＥＣに添加したときの分析結果を示す図である。図２７（ｉｉ）は、図２７（ｉ）と同様のことを示す図である。図２７（ｉｉｉ）は、図２７（ｉ）と同様のことを示す図である。図２８（ｉ）は、ＰＢＭＮ細胞をデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（１５０μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬ）と共に３０分間培養し、そして、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したときの分析結果を示す図である。図２８（ｉｉ）は、図２８（ｉ）と同様のことを示す図である。図２９は、ＰＢＭＮ細胞を個人４人から単離し、その後、２４時間一緒に混合し、ＭＤＭをプラスチック皿への付着により分離し、その後、１２５μｇ／ｍＬのデンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェートと共に培養し、細胞を含まない培養物上澄みを３６時間後に採取し、ＭＩＰ−１βを分析したときの結果を示す図である。図３０は、ＨＵＶＥＣによるマトリゲル上の内皮微小管の形成（４０倍）を示す図である。図３１は、ＨＵＶＥＣによるマトリゲル上の内皮微小管の形成（４０倍）を示す図である。図３２は、ＨＵＶＥＣによるマトリゲル上の内皮微小管の形成（４０倍）を示す図である。図３３は、媒体のみ（△）に比べて、デンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート（Ｏ）が生体外血管新生分析において新規血管形成を減少させた結果を示す図である。図３４は、ケモカイン及び炎症促進サイトカインが重要な役割を果たす病変の病因を示す図である。図３５は、図３４と同様のこと示す図である。図３６は、未熟な単核誘導樹木状細胞を製造し、１ｘ１０⁶細胞／ウェルで付着させ、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）を１時間添加し、その後ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、この細胞を２１時間培養し、その後、ＦＡＣＳ分析した結果を示す図である。図３７は、γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲でデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃で１時間培養し、その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを５日間培養し、加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬのと共に２１時間培養し、その後、細胞を三回洗浄し、その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加し、末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養し、その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養し。この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した結果を示す図である。図３８は、γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で培養し、その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを５日間培養し、加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養し、その後、細胞を三回洗浄し、その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加し、末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養し、その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養し、この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した結果を示す図である。図３９は、γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に１時間培養し、その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを５日間培養し、加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養し、その後、細胞を三回洗浄し、その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加した。末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養し、その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養し、この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した結果を示す図である。図４０は、γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞を、アリクウォットに関して三重で、６４０００ないし３２樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１時間培養し、その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００個／ウェル）を添加し、このプレートを３７℃で５日間培養し、加えて、末梢血リンパ球を添加する前に、このプレート（デンドリマー世代３．５−グルコサミンを含む及び含まない）を、濃度２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと共に２１時間培養し、その後、細胞を三回洗浄し、その後、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを、濃度２００μｇ／ｍＬで、再添加し、末梢血リンパ球を１０００００細胞／ウェルで添加し、そしてプレートを５日間培養し、その後、これらの培養物に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を更に１８時間で添加し、そして細胞を培養し、この後、細胞を採取し、そして、液体シンチレーションカウンターを使用して、増殖を測定した結果を示す図である。図４１は、γ線照射された精製された単核誘導樹木状細胞又はγ線照射された単離され精製された腹膜樹木状細胞を、アリクウォットに関して、３２０００ないし２０００樹木状細胞／ウェルの範囲で、デンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃、５％ＣＯ2 で１時間添加し、その後、リポ多糖（２０ｎｇ／ｍＬ）を２１時間添加し、その後、細胞を媒体で三回洗浄し、そしてデンドリマー世代３．５−グルコサミン（２００μｇ／ｍＬ）で置換し、その後、異質遺伝子型の末梢血リンパ球（１０００００細胞／ウェル）を添加し、そしてこれを、０日と定義し、このプレートを、３７℃、５％ＣＯ₂で５日間培養し、そして、インターロイキン−２及びγ−インターフェロンの測定のために、細胞を含まない培養物上澄みを３日目及び５日目に捕集したものを分析した結果を示す図である。図４２は、シングルドナーＰＢＭＮ細胞を密度１×１０⁶細胞／ｍＬで懸濁し、デンドリマー世代３．５−グルコサミンを２００μｇ／ｍＬで添加し、この細胞を３０分間培養し、超抗原ＳＥＢを１００ｎｇ／ｍＬで添加し、細胞を含まない上澄みを２１時間後に採取し、そしてＭＩＰ−１β及びＴＮＦ−αを分析した結果を示す図である。

Claims

カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーに共有結合的に結合した炭水化物部分を含むグリコデンドリマー。
カルボキシル基により末端閉鎖された前記デンドリマーがカルボキシル基により末端閉鎖されたポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである請求項１記載のグリコデンドリマー。
前記デンドリマーが１世代又は、１．５世代ないし９．５世代のより多くの世代を含む請求項１又は請求項２記載のグリコデンドリマー。
前記デンドリマーがデンドリマー世代２．５であるか又はデンドリマー世代２．５を含む請求項１ないし３の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
前記デンドリマーがデンドリマー世代３．５であるか又はデンドリマー世代３．５を含む請求項１ないし４の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
前記炭水化物部分が単糖、二糖、三糖、オリゴ糖又は多糖、或いは１種又はそれより多くのそれらの組み合わせである、請求項１ないし５の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
前記炭水化物部分が一つ又はそれより多くのアミノ基を含む、請求項１ないし６の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
前記炭水化物部分がアミノ糖又は硫酸化アミノ糖であり、該アミノ糖又は硫酸化アミノ糖は変性され得る、請求項１ないし５の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
変性されたアミノ糖又は硫酸化アミノ糖がアシル化、例えばＮ−アシル化されている、請求項８記載のグリコデンドリマー。
前記炭水化物基がグルコサミン、グルコサミンスルフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンスルフェートである、請求項１ないし９の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
前記グルコサミンスルフェートがグルコサミン６−スルフェート、グルコサミン３，６−ジスルフェート又はグルコサミン３，４，６−トリスルフェートであり、そして前記Ｎ−アセチルグルコサミンスルフェートがＮ−アセチルグルコサミン６−スルフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン３，６−ジスルフェート又はＮ−アセチルグルコサミン３，４，６−トリスルフェートである、請求項１０記載のグリコデンドリマー。
デンドリマー世代３．５−グルコサミン又はデンドリマー世代３．５−グルコサミン６−スルフェート、或いはデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルグルコサミン又はデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルグルコサミンスルフェート、或いはデンドリマー世代３．５−マンノサミン又はデンドリマー世代３．５−マンノサミンスルフェート又はデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルマンノサミン、或いはデンドリマー世代３．５−Ｎ−アセチルマンノサミンスルフェート、或いは対応するデンドリマー世代２．５、或いはそれらのあらゆる組み合わせである、請求項１記載のグリコデンドリマー。
前記デンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１２又は請求項１３記載の
グリコデンドリマー。
請求項１ないし１３の何れか一項記載のグリコデンドリマー及び医薬において許容され得るキャリアを含む医薬製剤。
前記グリコデンドリマーの濃度が２．５ないし２５００μｇ／ｍＬ、例えば２５ないし２５０μｇ／ｍＬである請求項１４記載の医薬製剤。
静脈内に、動脈内に、リンパ循環内に、経口的に、腹膜内に、局所に、頬側に、直腸に、皮膚表面に、経皮的に、皮下に、筋肉内に、関節腔内に、鼻腔内に、硝子体内に、エアロゾルにより、又は肺投与により、投与するために適する形態の、請求項１３ないし１５の何れか一項記載の医薬製剤、或いは請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
点眼剤として眼に直接に、眼の内部又は周囲へのペレットの沈積により、或いはあらゆる眼房内への注射により、或いは器官を通しての直接注入により、投与するために適する形態の、請求項１３ないし１５の何れか一項記載の医薬製剤、或いは請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
医薬としての使用のための、請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
ケモカイン及びサイトカインが増加する疾患の治療用医薬としての使用のための、請求項１８記載のグリコデンドリマー。
脈管形成が増加する疾患の治療用医薬としての使用のための、請求項１８記載のグリコデンドリマー。
ケモカイン及びサイトカインが増加し且つ脈管形成が増加する疾患の治療用医薬としての使用のための、請求項１８記載のグリコデンドリマー。
重度の敗血症、敗血症性ショック、敗血症に関連する全身炎症反応、リウマチ性疾患、湿疹、乾癬、創傷治癒中の組織収縮、創傷治癒中の過大な傷跡形成、移植物拒絶、又は移植片対宿主病の治療用医薬としての使用のための、請求項１８記載のグリコデンドリマー。
リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、乾癬性関節炎、感染後発症する反応性関節炎、急性強直性脊椎炎、炎症性腸疾患に関連する関節炎、汎ブドウ膜炎及び／又は網膜血管炎を併発するベーチェット病を包含するベーチェット病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、或いは転移性腫瘍細胞成長に関連する疾患の治療用医薬としての使用のための、請求項１８記載のグリコデンドリマー。
前記移植物が角膜、腎臓、心臓、肺、心臓−肺、皮膚、肝臓、内臓又は骨髄移植物である、請求項２２記載のグリコデンドリマー。
前記の重度の敗血症、敗血症性ショック又は敗血症に関連する全身炎症反応が、グラム陰性菌からのリポ多糖、又はグラム陽性菌からの超抗原毒素により引き起こされる、請求項２２記載のグリコデンドリマー。
請求項１９ないし２５の何れか一項において定義された疾患又は症状ための治療用医薬
の製造のための、請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマーの使用。
請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマーの、望ましい処置を達成するために有効な量を患者に投与することからなる、請求項１９ないし２５の何れか一項において定義された疾患又は症状を治療又は予防するために患者を処置する方法。
カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーに、アミノ基で官能化された炭水化物を共有結合的に結合させることからなり、前記共有結合がカップリング剤の使用により達成される、請求項１ないし１２の何れか一項記載のグリコデンドリマーの製造方法。
カップリング剤がカルボジイミドカップリング剤である請求項２８記載の方法。
カップリング剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である請求項２９記載の方法。
前記アミノ基で官能化された炭水化物が単糖、二糖、三糖、オリゴ糖又は多糖である請求項２８ないし３０の何れか一項記載の方法。
前記炭水化物が、一つ又はそれより多くの反応性アミン基で官能化された単糖、二糖、三糖、オリゴ糖又は多糖である請求項３１記載の方法。
アミン基が第一級アミン基である請求項３２記載の方法。
前記炭水化物がグルコサミン又は硫酸化されたグルコサミン、マンノサミン又は硫酸化されたマンノサミン、ガラクトサミン又は硫酸化されたガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン又は硫酸化されたＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン又は硫酸化されたＮ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又は硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン、或いはこれらのあらゆる組み合わせである請求項２８ないし３０の何れか一項記載の方法。
前記硫酸化されたグルコサミンがＤ−グルコサミン６−スルフェート、Ｄ−グルコサミン３，６−ジスルフェート又はＤ−グルコサミン３，４，６−トリスルフェート、Ｄ−グルコサミン３−スルフェート、Ｄ−グルコサミン４−スルフェート、Ｄ−グルコサミン３，４−ジスルフェート、或いはＤ−グルコサミン４，６−ジスルフェートである請求項３４記載の方法。
４０℃を越えない温度で行う請求項２８ないし３５の何れか一項記載の方法。
外部の付加的なエネルギー源の適用なしに行う請求項２８ないし３６の何れか一項記載の方法。
水性溶液中で行う請求項２８ないし３７の何れか一項記載の方法。
カップリング剤を使用して、カルボキシル基により末端閉鎖されたデンドリマーに、アミノ基で官能化された炭水化物を共有結合的に結合させることからなる方法であって、該共有結合が水性媒体中で行われる方法により得られる、請求項１ないし１２の何れか一項において定義された記載のグリコデンドリマー。
前記方法が、請求項２９ないし３７の何れか一項において定義された方法で行われる請求項３９記載のグリコデンドリマー。
グリコデンドリマーが、請求項３９又は請求項４０記載のグリコデンドリマーである請求項１３ないし１７の何れか一項記載の医薬製剤。
グリコデンドリマーが、請求項３９又は請求項４０記載のグリコデンドリマーである、請求項１８ないし２５の何れか一項記載のグリコデンドリマー。
グリコデンドリマーが、請求項３９又は請求項４０記載のグリコデンドリマーである、請求項２６記載のグリコデンドリマーの使用。
グリコデンドリマーが、請求項３９又は請求項４０記載のグリコデンドリマーである、請求項２８記載の処置方法。
移植前に生体内で、請求項１ないし１３、３９及び４０の何れか一項記載のグリコデンドリマーで、移植用の組織又は器官を処理することからなる方法。
前記組織又は器官が角膜である、請求項４５記載の処置方法。
分子、例えば生物学的に活性な分子を、アニオン性デンドリマーに共有結合的に結合させる方法であって、該デンドリマーをカップリング剤、例えばカルボジイミドカップリング剤の存在下で、前記生物学的に活性な分子と反応させる方法。