JP5371167B2 - 抗脈管形成活性を有し、かつ、抗凝固作用がない、部分脱硫酸グリコサミノグリカンの誘導体 - Google Patents
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Description
抗脈管形成活性を有する最初の分子は、1975年にヘンリー・ブレム(Henry Brem)およびユダ・フォークマン(Judah Folkman)により軟骨中で発見された。その年以来、抗脈管形成を阻害する能力を有する300種類を超える新しい分子が発見された。
a)特異性:その標的は、プロセス、すなわち、腫瘍新血管新生である;
b)生物学的利用能:その標的は、腫瘍細胞に直接作用する伝統的な化学療法の問題点を伴わずに容易に達することができる内皮細胞である;
c)化学療法抵抗性:これは、おそらくこの療法の最も重要な利点であると思われる;実際、内皮細胞は、腫瘍細胞と異なり、遺伝的に安定であるので、薬物抵抗現象が生じるとは考えられない;
d)転移性拡散:新血管新生の遮断は、血流を介する、腫瘍細胞の、身体の他の部分への増殖を制限する;
e)アポトーシス:腫瘍における血管網の遮断は、酸素および栄養素の腫瘍細胞への供給を減少させる;アポトーシスは、これらの条件下で支持される;
f)全身性毒性の低下;伝統的な化学療法に関してほとんど例外なく存在している、骨髄抑制、胃腸作用および一時的な毛髪損失などの毒物作用は、抗脈管形成療法について認められない。
ヘパリンは、種々の鎖長および種々の硫酸化度を有する天然起源多糖類の異種混合物であり、抗凝固活性を有し、肝臓(最初に単離された)、筋肉、肺、胸腺および脾臓に存在する結合組織マスト細胞によって分泌される。
規則的な配列に加えて、抗トロンビン活性についての活性部位に対応する配列がヘパリンにおいて同定された。
ヘパリンおよびその誘導体の抗腫瘍および抗転移活性は、ヘパラナーゼを阻害し、成長因子を遮断し、脈管形成を調節するその能力による。
ヘパラン硫酸(HS)は、遍在性タンパク質リガンドである。該タンパク質は、タンパク質分解性分解作用に対する単純な固定化または保護から脈管形成のような生物活性の特異的調節までの種々の作用に関してHS鎖に結合する。
ヘパリンにおいては、GlcN残基は主にN−硫酸化されているが、一方、HSにおいては、それらはN−硫酸化およびN−アセチル化の両方がなされており、非置換N−は少量である。
HSは、また、O−硫酸化が平均してヘパリンよりも少ない。
腫瘍、特に、転移、などの脈管形成障害の治療におけるヘパリンの使用は、実質的に、ヘパリンの抗凝固活性によって制限される。
ヘパリンの抗腫瘍特性を保護すると同時にその抗凝固許容量を減少させるために、ヘパリンに対して化学的修飾が行われた。
「ヘパラナーゼ」は、ヘパラン硫酸(HS)およびヘパリンの鎖の内部グリコシド結合を加水分解するエンドグリコシターゼのファミリーに属する酵素である。
これらのエンドグリコシダーゼは、腫瘍細胞の増殖、転移および腫瘍の新血管新生に関与している。このことは、それらが、また、FGF(GFG−1とも称される)、bFGF(FGF−2とも称される)およびVEGFなどのヘパリンに結合した成長因子の、細胞外マトリックスからの放出の結果として腫瘍脈管形成に関与し得ることを示唆している。
FGFは、細胞増殖および分化のような複数の生理学的プロセスを調節するが、腫瘍脈管形成のような病理学的プロセスに関与する機能もまた調節する。
FGFは、酸性(FGF−1)および塩基性(FGF−2)が最も研究されてきたものであり、FGF受容体(FGFR)に結合してそれを活性化するのに多糖コファクター、ヘパリンまたはHSを必要とする成長因子(10を超えるポリペプチドからなるファミリー)である。
ヘパリンおよびHSがFGFを活性化する正確なメカニズムは知られていないが、ヘパリン/FGF/FGFRが「三分子」または「三元」複合体を形成することは知られている。
仮定される一のメカニズムは、ヘパリンおよびHSがいわゆるFGFのサンドイッチ二量体化を誘発し、このようにして二量体化されたものがFGFRと安定な複合体を形成することである。
原発腫瘍の転移細胞発生能は、おそらく抗癌療法が直面している主要な問題である。
実質的なヘパラナーゼ遮断能を有するヘパリン誘導体は、原発腫瘍および転移の両方における脈管形成を阻害する能力を同等に有すると考えられる。
加えて、ヘパラナーゼの阻害は、原発腫瘍から他の器官への腫瘍細胞遊走能を低下させる。
ヘパリンの場合の構造/抗転移活性相関性の例を下記表に示す。
a)成長因子を放出する、ヘパラン硫酸のグリコシド結合を加水分解する酵素であるヘパラナーゼの遮断。
このために、ヘパリン様化合物は、好ましくは、N−アセチル−グルコサミン−グルクロン酸(またはN−硫酸化グルコサミンを含有する少なくとも8つの単糖単位の配列を含む(例えば、D .Sandback-Pikas et al., J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) および引用された文献を参照))。
b)脈管形成性成長因子(線維芽細胞タイプ:FGF−1およびFGF−2;血管内皮細胞タイプ:VEGF;血管透過性タイプ:VPF)の遮断。
このために、ヘパリン様化合物は、好ましくは、2−硫酸化イズロン酸およびグルコサミンN,6−硫酸化を含有する少なくとも5つの単糖単位長の配列を有する(例えば、M. Maccarana et al., J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993) を参照)。
該文献において、トロンボスポンジン受容体に結合することにより作用する抗脈管形成活性を有する低分子量ペプチド(5〜13アミノ酸)(University of Washingtonの米国特許第5,399,667号)、または長いペプチド(約50アミノ酸)。
IC50=7nMの内皮細胞増殖阻害能を有する修飾血小板因子が知られている(EP 0 589 719、Lilly)。
抗脈管形成活性を有するオリゴ糖フラグメントもまた十分に開示されている:実際、炭水化物配列を変えることによって相互作用選択性を増強させることができることが判明した。
Daiichi Sc. による EP 0 246 654 には、フェーズII試験について抗脈管形成活性を有する硫酸化多糖類が記載されている。
Pharmacia & Upjohn - Harvard Coll. による EP 0 394 971 には、(FGF−1)によって刺激される内皮細胞の増殖および脈管形成を阻害する能力を有する、低硫酸化の六糖類 − ヘパリンフラグメント − が記載されている。
Alfa Wasserman による EP 0 618 234 には、求核基を有するヘパリンまたはヘパラン構造をもつ半合成グリコサミノグリカン類の製造法が記載されている。
Glycomed による米国特許5,808,021 には、イズロン酸の2位(I、2−O)およびグルコサミン単位の3位(A、3−O)での脱硫酸パーセンテージが元のパーセンテージの約99〜約75%の範囲である、実質的に解重合されていない2−O,3−O脱硫酸ヘパリンの製造法が記載されている。この方法は、カルシウムまたは銅によって例示される二価の金属の陽イオンの存在下で行われる脱硫酸、次いで、得られた生成物の凍結乾燥を示している。該脱硫酸ヘパリンは、抗脈管形成活性を有する。
この度、ヘパリン様グリコサミノグリカン、ヘパリン、または異なる程度にN−脱硫酸し、次いで、全部または部分N−アセチル化していてもよいグリコサミン残基を含有する修飾ヘパリンなどのグリコサミノグリカンを、全ウロン酸単位の60%以下までの脱硫酸度に制御された2−O−脱硫酸処理に付して脈管形成成長因子結合特性を維持することが見出された。意外にも、その全ウロン酸単位の60%以下までのヘパリン2−O−脱硫酸は、著しく抗脈管形成性である。
XおよびX'は、同一または異なっていてよく、アルデヒド基または−CH2−D基であり、ここで、Dは、ヒドロキシルまたはアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物もしくはオリゴ糖の残基であり;
RおよびR1は、同一または異なっていてよく、SO3またはアセチル残基であり;
nおよびmは、同一または異なっていてよく、1〜40であり;n+mの合計は、6〜40の範囲であり;m:n比は、10:2〜1:1の範囲である]
で示される化合物に関する。好ましくは、mは、nよりも大きいかまたはnと等しい。好ましくは、nは、n+mの合計の40〜60%の範囲である。記号
脱硫酸度によって意味されるものは、出発ヘパリン中に元々存在する全ウロン酸に対する非硫酸化イズロン酸のパーセンテージである。脱硫酸パーセンテージについての一の初期の好ましい範囲は、約40〜約60%である。式(I)で示される化合物のうち好ましい化合物は、以下のものである:
分子量(MW)が11200Dであり、多分散指数Dが1.3であり、脱硫酸度が1.99(SO3 −:COO−モル比として表す)であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが約50%である部分的に2−O−脱硫酸されているヘパリン(以下、ST1514とも称する)。該化合物は、他の対応する定義では、m:n=1:1であり、mおよびnを付した単位が多糖鎖に沿って規則的に交互に分布している式(I)で示される化合物である。
(a)室温〜約100℃の範囲の温度で、好ましくは、50〜70℃の範囲の温度で、さらに好ましくは、約65℃で、塩基性処理して、制御パーセンテージのイズロン酸の2位における硫酸基を脱離させ、エポキシド基を形成させる工程;所望により、
(b)約pH7で、約50℃〜約100℃の範囲の温度で、好ましくは、約70℃で、該エポキシド環を開環してガラクツロン酸の残基を得る工程;または、
(c)約0℃〜30℃の範囲の温度で、好ましくは、約25℃で、該エポキシド環を開環して、イズロン酸の残基を得る工程;および、所望により、
(d)ジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してグリコシド環の開環および修飾残基1個につき2個のアルデヒド基の形成を生じる工程;
(e)該アルデヒド基を第1アルコールに還元し、次いで、所望により、D基を、式(I)における定義において考えられるヒドロキシル以外の基に転換する工程;
(f)任意の酸加水分解を行って規則的な配列に対応するオリゴ糖を得る工程;または
(g)リアーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、または工程e)で得られる生成物の等価物からなる群から選択される酵素で部分酵素加水分解して、不飽和イズロン酸からなる非還元末端残基、N−スルホグルコサミンからなっていて少なくとも1個の開環イズロン酸残基を含有する還元残基を有するオリゴ糖、好ましくは、四糖または八糖を得る工程;または
(h)工程a)において得られた化合物、または工程b)において得られた生成物を部分酵素加水分解によって処理する工程;および、所望により、
(i)工程a)、b)およびe)のうちの1つ工程において得られた生成物を部分6−O−脱硫酸に付す工程;または
(j)部分的または完全に6−脱硫酸された出発ヘパリンを工程a)、b)およびe)に付す工程
を含む方法により製造される。
工程a)が60℃で45分間行われ、工程b)がpH7で、70℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量(MW)が11200Dであり、多分散指数Dが1.3であり、脱硫酸度が1.99(SO3 −:COO−モル比として表す)であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージが約50%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン(以下、ST1514とも称する)。
分子量(MW)が12900Dであり、多分散指数Dが1.5であり、脱硫酸度が2.05(SO3 −:COO−モル比として表す)であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基5%、酸化および還元ウロン酸残基29%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン(以下、ST1513とも称する);
分子量(MW)が11000Dであり、多分散指数Dが1.5であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基5%、酸化および還元ウロン酸残基29%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン;
分子量(MW)が9200Dであり、多分散指数Dが1.5であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基11%、酸化および還元ウロン酸残基27.5%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン。
工程a)が60℃で15分間行われ、工程b)がpH7で、70℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量(MW)が12900Dであり、多分散指数Dが1.5であり、脱硫酸度が2.05(SO3 −:COO−モル比として表す)であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基5%、酸化および還元ウロン酸残基29%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン(以下、ST1513と称する);
工程a)が60℃で30分間行われ、工程b)がpH7で、70℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量(MW)が11000Dであり、多分散指数Dが1.5であり、脱硫酸度が1.8(SO3 −:COO−モル比として表す)であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基5%、酸化および還元ウロン酸残基29%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン(以下、ST1516と称する);
工程a)が60℃で60分間行われ、工程b)がpH7で、70℃で行われる上記方法により得ることができ、分子量(MW)が9200Dであり、多分散指数Dが1.5であり、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージがエポキシド基11%、酸化および還元(スプリット)ウロン酸残基27.5%である部分的に2−O−脱硫酸されたヘパリン(以下、ST1515と称する)。
CHO−K1細胞を24ウェルプレート中で90,000細胞/cm2の密度でシード添加した。24時間後、該細胞を、4℃で2時間、PBS中3%グルタルアルデヒド中で固定し、0.1Mグリシン/PBSで洗浄した。固定単層上で、CHO 745/flg細胞を、10mM EDTA、30ng/ml FGF−2および漸増量の試験化合物を含有するDMEM中にて50,000細胞/cm2の密度でFGFR−1でトランスフェクトした。37℃で2時間インキュベートした後、倒立顕微鏡下で接着細胞を計数した。結果を、試験化合物の不在下で測定したものに対する接着している細胞の数のパーセンテージとして表した。該化合物を1ng/ml〜100μg/mlの範囲の6種類の濃度で三重反復試験し、各化合物についてID50を算出した(表1)。
L6−WT1細胞(FGFR−1でトランスフェクトしたラット筋芽細胞)を、DMEM+10%FCS中、48ウェルプレート中にて25,000細胞/cm2の密度でシード添加した。24時間後、該細胞を無血清培地で洗浄し、DMEM+0.5%FCSと一緒に48時間インキュベートした。次いで、該細胞を、試験化合物の存在下(全て、100μg/ml)または不在下で15および30ng/mlの濃度のFGF−2と一緒に16時間インキュベートした。該インキュベーションの最後に、培地を交換せずに、3H−チミジン(0.25μCi/ウェル)を添加した。6時間後、沈降性TCAを測定した。各実験点は、3つの測定の平均である。結果を表2に示す。
BAEC細胞を、EGM Bullet Kit完全培地中、48ウェルプレート中にて2,500細胞/cm2の密度でシード添加した。24時間後、該細胞を、ウシ脳抽出物およびhEGFを含まないEGM培地中、血清の不在下で培養した。さらに24時間後、該細胞を、漸増濃度の試験化合物の存在下、30ng/mlのbFGFで処理した。16時間後、該培地に1μCi/mlの3H−チミジンを添加した。6時間後、沈降性TCA活性を測定した。各実験点は、8つの測定の平均である。結果を表3〜6に示す。
第7継代のBAEC細胞を、ウシ脳抽出物およびhEGFを含まないEBM培地中、96ウェルプレート中にて2,500細胞/cm2の密度でシード添加した。この培地に30ng/mlのFGF−2および10ng/ml〜100μg/mlの範囲の5種類の濃度の各試験化合物を添加した。3日後、該細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、ELISAマイクロプレートリーダーによって光学密度を測定した。各実験点を四重反復で行い、ID50を算出した。結果を表7に示す。
GM7373細胞を、MEM+10%FCS培地中、96ウェルプレート中にて70,000細胞/cm2の密度でシード添加した。24時間後、該細胞を無血清培地で洗浄し、0.4%FCSを含有する培地中、10ng/mlのFGF−2で処理した。8時間後、該培地に10ng/ml〜100μg/mlの範囲の5種類の濃度の試験化合物を添加した。さらに16時間後、該細胞をトリプシン処理し、Burkerチャンバー中で計数した。各化合物についてID50を算出した。結果は、三重反復で行った2つの実験の平均である。結果を表8に示す。
脈管形成の研究について、用いたモデルは、ニワトリ胎仔漿尿膜(CAM)モデルであった(Ribatti et al., Int. J. Dev. Biol., 40, 1189 (1996))。
体重20gの6週齢の雌性Balb/cマウス(Harlan)20匹を偶発的な無作為化により複数の群に分け、参照としてヘパリンナトリウム、および、ST1514と称される本発明の化合物で処理した。処理スケジュールは、q2dx5タイプのものであった。すなわち、溶液10ml当たり50mg/kgおよび25mg/kgのマウス1匹につき200μlの皮下投与を、2日おきに合計5回行った。
物質は、以下のとおり可溶化された。
得られたデータは、ANOVAを用いて分析する。
ヘパリン1gを1N NaOH 12.5mlに溶解する。該溶液を60℃で45分間加熱撹拌する。該反応を急冷および中和により停止させる。次いで、エポキシド環が完全に開環するまで、該溶液をpH7で70℃にて加熱する(反応の方向は、NMRによって制御する)。脱硫酸試料(ここでは、G2999Hと称する)を水20mlに溶解し、40℃に冷却する。NaIO4の0.2M溶液20mlを添加した後、該溶液を暗所で20時間撹拌し、エチレングリコールを添加することにより該反応を停止し、接線方向限外濾過により塩を除去する。NaBH4 400mgをいくつかに小分けし、脱塩溶液(30〜40ml)に添加する。該溶液を室温で3時間撹拌し、次いで、希HClで中和し、接線方向限外濾過により脱塩する。生成物710mg(ここでは、ST1514と称する)を得る。
分子量(MW): 11200D、多分散指数D 1.3;全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージは約50%である。該化合物は、NMR分光法により特徴付けられた(図1)。
塩基性溶液を、各々、15、30および60分間加熱した以外は実施例1におけると同様の方法を適用して、以下の特徴を有する化合物を得た:
ST1513: 分子量(MW)12900D、多分散指数D 1.5、脱硫酸度2.05(SO3 −:COO−モル比として表す)、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ:エポキシド基5%、酸化および還元(スプリット)ウロン酸残基29%;
ST1516: 多分散指数D 1.5、脱硫酸度1.8(SO3 −:COO−モル比として表す)、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ:エポキシド基5%、酸化および還元(スプリット)ウロン酸残基29%;
ST1515: 分子量(MW)9200D、多分散指数D 1.5、全ウロン酸に対する修飾ウロン酸のパーセンテージ:エポキシド基11%、酸化および還元(スプリット)ウロン酸残基27.5%。
Claims (5)
- 2−O−脱硫酸度が全ウロン酸単位の60%以下である2−O−脱硫酸ヘパリン誘導体であって、下記式(I)を有することを特徴とする2−O−脱硫酸ヘパリン誘導体:
【化1】
(I)
[式中、U環は、以下の意味:
【化2】
を有し;
XおよびX'は、同一または異なっていてよく、アルデヒド基または−CH2−D基であり、ここで、Dは、ヒドロキシル、アミノ酸、およびオリゴ糖からなる群から選択され;
RおよびR1は、同一または異なっていてよく、SO3またはアセチル残基であり;
nおよびmは、同一または異なっていてよく、1〜40であり;n+mの合計は、6〜40の範囲であり;m:n比は、10:2〜1:1の範囲であり、記号
【化3】
は、mおよびnを付した単位が多糖鎖に沿って統計学的に分布していることを示す]。
- 天然起源ヘパリンからの下記式の化合物の製造法であって:
【化4】
[式中、U環は、以下の意味:
【化5】
を有し;
XおよびX'は、同一または異なっていてよく、−CH2−D基であり、ここで、Dは、アミノ酸、およびオリゴ糖からなる群から選択され;
RおよびR1は、同一または異なっていてよく、SO3またはアセチル残基であり;
nおよびmは、同一または異なっていてよく、1〜40であり;n+mの合計は、6〜40の範囲であり;m:n比は、10:2〜1:1の範囲であり、記号
【化6】
は、mおよびnを付した単位が多糖鎖に沿って統計学的に分布していることを示す]、
以下の工程を含む方法:
(a)室温〜100℃の範囲の温度で、塩基性処理して、制御パーセンテージのイズロン酸の2位における硫酸基を脱離させ、エポキシド基を形成させる工程;
(b)pH7で、50℃〜100℃の範囲の温度で、該エポキシド環を開環してガラクツロン酸の残基を得る工程;
(c)ジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してグリコシド環の開環および修飾残基1個につき2個のアルデヒド基の形成を生じる工程;および、
(d)該アルデヒド基を一級アルコールに還元する工程;
ここで、該方法はさらに以下の工程を含んでいてもよい;
(e)D基を、ヒドロキシル、アミノ酸およびオリゴ糖からなる群から選択される基に転換する工程。
- さらに、リアーゼ、ヘパリナーゼ、およびヘパリチナーゼからなる群から選択される酵素で部分酵素加水分解して、不飽和イズロン酸からなる非還元末端残基、N−スルホグルコサミンからなっていて少なくとも1個の開環イズロン酸残基を含有する還元残基を有するオリゴ糖を得る工程、
を含む、請求項2に記載の方法。
- 活性成分として請求項1に記載の誘導体を医薬上許容される媒体および/または賦形剤と混合して含む医薬組成物。
- 転移を伴う腫瘍、腫瘍転移、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症および乾癬からなる群から選択される、異常な脈管形成に関連する疾患の治療用の請求項4記載の医薬組成物。
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