SK287566B6

SK287566B6 - Derivát čiastočne desulfátovaných glykózaminoglykánov, spôsob jeho prípravy a použitie

Info

Publication number: SK287566B6
Application number: SK1067-2002A
Authority: SK
Inventors: Benito Casu; Giangiacomo Torri; Anna Maria Naggi; Giuseppe Giannini; Claudio Pisano; Sergio Penco
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2011-02-04
Also published as: ES2277911T3; CY1108001T1; US8222231B2; CA2397964A1; CN100540570C; US7790700B2; JP5371167B2; CZ303030B6; DE60125154T2; US20100298263A1; PT1268558E; AU782632B2; EP1268558A1; JP2003523460A; CA2397964C; CN1396930A; US20050222084A1; PL357209A1; EP1268558B1; US20050107331A1

Abstract

Sú opísané čiastočne desulfátované glykózaminoglykánové deriváty, najmä heparín a zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde U, R a R1 skupiny majú význam uvedený v opise. Tieto glykózaminoglykánové deriváty majú antiangiogénnu aktivitu a nespôsobujú antikoagulačný účinok.

Description

Vynález sa týka čiastočne desulfátovaného glykózamino-glykánového derivátu, najmä heparínu, spôsobu jeho prípravy, použitia ako účinných zložiek na prípravu liečiv s antiangiogénnou účinnosťou, najmä na liečenie nádorov, ako sú napríklad metastázové formy, a farmaceutických prostriedkov s ich obsahom.

Doterajší stav techniky

Prvá molekula, ktorá má antiangiogénnu účinnosť, bola objavená v chrupavke Henry Bremom a Judahom Folkmanom v roku 1975. Od tohto roku bolo objavených viac ako 300 nových molekúl schopných inhibovať angiogenézu.

Na počiatku osemdesiatych rokoch s objavením interferónu (o//3) ako inhibítora angiogenézy nádoru sa začalo klinické experimentovanie na základe tohto terapeutického predpokladu.

Médiá zapríčinili veľký rozruch, keď v 3. marca 1998 New York Times publikovali správu, že dve molekuly, angiostatín a endostatín, objavené v laboratóriách J. Folkamana na Harvard Medical School a Children's Hospital v Bostone, viedli k veľmi odvážnym záverom v zápase proti rakovine. Vysoký stupeň účinnosti týchto dvoch molekúl v inhibícii angiogenézy podstatne urýchlil výskum nových zlúčenín. V súčasnosti existuje okolo 30 molekúl s protirakovinovými účinkami, ktoré pôsobia cez antiangiogénny mechanizmus, ktoré vstúpili do štádia klinických pokusov [fázy I-III] a v takmer tom istom počte spoločností a inštitúcií.

V samotných Spojených štátoch amerických sa odhaduje, že približne 9 miliónom pacientov by mohla prospieť antiangiogénna terapia. V súčasnosti najmenej 4 000 pacientov využívajúcich túto terapiu je zapojených do klinických pokusov bez zaznamenania nejakých zvláštnych neželaných účinkov.

V rámci všeobecnej koncepcie angiogenézy je potrebné rozlišovať medzi vaskulogenézou, ktorá sa odohráva pri tvorbe krvných ciest počas embryonálneho vývoja a angiogenézou v pravom slova zmysle významu, čo znamená tvorbu krvných ciest (kapilár) počas postnatálneho života, ktoré vychádzajú z už existujúcich krvných ciest. Význam angiogenézy pre rast tuhých nádorov je široko zdokumentovaný. Počas posledných troch dekád sa zaznamenalo, že rast nádoru, ako aj tvorba metastáz, prísne závisia od rozvoja nových ciev schopných vaskularizovať hmotu nádoru.

Inhibícia angiogenézy podporuje tvorbu nekrotickej hmoty vnútri nádoru alebo vyvolanie apoptózy v nádorových bunkách.

Existujú jasne ohraničené rozdiely medzi neovaskularizáciou v normálnom tkanive a nádorovom tkanive. V prvom prípade vaskuláme endotélium predstavuje pokojné tkanivo s veľmi nízkym mitotickým indexom svojich stavebných buniek (čas obnovy sa meria v stovkách dní) a vaskuláma sieť je pravidelná, relatívne jednotná a vhodná na primerané okysličovanie všetkých tkanív, bez nejakého cievno-žilného prepojenia. Na druhej strane v nádorovom tkanive stimulácia proliferácie endoteliálnych buniek podporuje ich vysoký mitotický index (priemerný čas obnovy je päť dní), neovaskularizácia je zreteľne nepravidelná s oblasťami oklúzie, niekedy s uzatvorenými zakončeniami, s cievno-žilovými prepojeniami v niektorých bodoch a nakoniec bazálna membrána obsahuje trhliny, ktoré v niektorých bodoch vedú k hypoxii tkanív. Tieto rozdiely ponúkajú príležitosť identifikovať liečivá, ktoré selektívne blokujú neovaskularizáciu nádoru.

V nádore sa neovaskularizácia nie vždy vyskytuje v určitom štádiu jeho rozvoja, v skutočnosti existujú prípady, v ktorých angiogenéza začína ešte pred rozvojom nádoru (napríklad nádor krčka maternice), ďalšie v ktorých sú spojené dve fázy (napríklad rakovina močového mechúra a prsníka) a ostatné, v ktorých angiogenéza začína po neoplazme (napríklad melanóm a rakovina vaječníkov, napríklad „Manual of Medical Oncology“, IV ed. (1991) G. Bonadonna a kol.).

Angiogénna terapia zahŕňa množstvo výhod v porovnaní s tradičnou štandardnou chemoterapiou (Cancer Research 1998, 58, 1408-16):

- špecificita: jej cieľom je proces, t. j. neovaskularizácia nádoru,

- biodostupnosť: jej cieľom sú endoteliálne bunky, ktoré sú ľahko dostupné bez problémov tradičnej chemoterapie, ktorá pôsobí priamo na bunky nádoru,

- chemická odolnosť: čo predstavuje asi najvýznamnejšiu výhodu tejto terapie, pretože endoteliálne bunky sú geneticky stále oproti nádorovým bunkám, a pravdepodobne nenastáva lieková odolnosť, rozvoj metastáz: blokovanie neovaskularizácie bráni prenikaniu nádorových buniek do ostatných častí tela cez krvné riečisko, apoptóza: blokáda vaskulámej siete v nádore znižuje prísun kyslíka a živín do nádorových buniek, apoptóza je v týchto podmienkach uprednostňovaná,

- znížená systemická toxicita: toxické účinky, ako je myelosupresia, gastrointestinálne účinky a dočasná strata vlasov, ktoré sú najčastejšie prítomné v tradičnej chemoterapii, sa nepozorujú v angiogénnej terapii.

Je známe množstvo molekulových prvkov, ktoré je zahrnuté v angiogenéze nádorov (Onkológia 1997, 54, 177-84). V tvorbe ciev sú známe pro- a anti- angiogénne vonkajšie faktory, ktoré sú zahrnuté v tvorbe nových ciev.

Medzi stimulátory angiogenézy je potrebné zahrnúť: rastový fibroblastový faktor (RFF), vaskulámy endoteliálny rastový faktor (VEGF), angiogenín, transformačný rastový faktor-α, nádorový nekrotický faktor-a (TNF-α), doštičkový endoteliálny bunkový rastový faktor, transformačný rastový faktor-/3, in vitro inhibítor, in vivo stimulátor, placentálny rastový faktor, interleukín-8, hepacytový rastový faktor, doštičkový rastový faktor, granulocytové črevné stimulačné faktory, proliferín, prostaglandíny (PGE_b PGE₂), GMl-GTlb, látka P, bradykiníny a oxid dusičný.

Oproti tomu inhibítory angiogenézy zahŕňajú: rozpustný receptor bFGF, interferóny (a, β, y), angiostatín, trombospondín 1, prolaktín (16 kDa terminálny aminofŕagment), doštičkový faktor 4 (PF4), tkanivové metaloproteázové inhibítory (TIMP), placentálny proliferínový peptid, gliómový angiogenézový inhibičný faktor, angiostatické steroidy, chrupavkový inhibítor (CDI), heparinázy, interleukín 12, plasminogénny aktivátorový inhibítor, retinoidy, endostatín, angiopoietín 2, geniteín, oxid dusičný a GM3.

Integríny predstavujú širokú oblasť transmembránových proteínov, ktoré podporujú interakcie bunkabunka a bunka-extraceluláma matrica. Všetky integríny sú schopné rozpoznať spoločnú peptidovú sekvenciu Arg-Gly-Asp („univerzálne rozpoznávacie miesto bunky), čím každý integrín prednostne rozpoznáva rôznu konformáciu tohto tripeptidu. Inhibícia špecifických subtypov integrínov sa tiež teší veľkej pozornosti z farmakologického hľadiska na rozvoj inhibítorov angiogenézy.

Kontrola proteínkinázy-C (PK-C) tiež umožňuje reguláciu angiogenézy. Skutočne tu existujú klasické inhibítory PK-C schopné úplne alebo čiastočne blokovať angiogenézu.

Napriek enormnému výskumu a zapojeniu veľkého množstva ústavných a súkromných výskumných centier, je problém rakoviny v celosvetovom meradle ešte veľmi vzdialený od svojho riešenia. Hoci sa zlepšuje prognóza obetí rakoviny s pomermi prežitia, ktoré vzrástli za posledných 30 rokov v priemere z 30 na 50 % a genetické, bunkové a biochemické mechanizmy pôsobiace v rozvoji nádoru sú teraz dobre známe, možnosť zničenia alebo aspoň obmedzenia tohto typu patológie je stále predmetom veľkého úsilia a mnohé aspekty sú stále nevyriešené, ako je pravdepodobnosť návratu, úplná remisia a rozšírenie metastáz primárneho nádoru.

Od konca sedemdesiatych rokov, keď sa zistenia Folkmana začali potvrdzovať medzinárodnou vedeckou spoločnosťou, boli izolované stovky molekúl, ktoré majú antiangiogénnu účinnosť, z prírodných zdrojov (rastliny, huby, biologické tekutiny) a syntetizované v laboratóriu.

Množstvo liečiv je už vo fáze III, ako je Marimastat (British Biotech.), 1AG3340 (Prinomast-Agouron) a Neovastat (Aetema), všetky z nich pôsobia na pulmonámej úrovni (SNCL) s mechanizmom umožňujúcim interferenciu s metaloproteinázami. Tiež vo fáze III sú RhuMad VEGF (čo je protilátka anti-VEGF od Genetech) a interferón a (komerčný), ktoré sú účinné proti tuhým nádorom vďaka svojej interferencii s proangiogénnymi rastovými faktormi alebo TNP-470 (TAP Pharm.), ktorý pôsobí priamo na endoteliálne bunky. Nakoniec lieky ako CAI (NCI) a IM862 (Cytran) sú účinné ako antiangiogénne činidlá, ale s nešpecifickým a málo známym mechanizmom.

Tieto uvedené liečivá, sa môžu v najbližších rokoch stať súčasťou liečebných zbraní onkológov, ale existujú iné molekuly, ktoré sa v poslednom čase dostali do fázy I/II klinických pokusov, ako je Combretastatin (OxiGene), metoxyestradiol a endostatín (EntreMed), ktoré sú na báze predklinických štúdií veľmi sľubné. Spoločnosti, ako je Bristol Myers-Squibb (s BMS-275291), Novartis (s CGS27023A) alebo Parke-Davis (so Suraminom) sú zahrnuté v tejto liečebnej stratégii.

Heparín

Heparín je heterogénna zmes prirodzene sa vyskytujúcich polysacharidov s rôznou dĺžkou a rôznymi stupňami sulfatácie, ktorý má antikoagulačnú účinnosť a je vylučovaný žírnymi bunkami spojivových tkanív prítomných v pečeni (z ktorej sa prvýkrát izoloval), vo svaloch, pľúcach, štítnej žľaze a slezine.

Navyše k pravidelnej sekvencií, sa v heparíne zistila sekvencia zodpovedajúca aktívnemu miestu pre antitrombínovú aktivitu.

Protinádorová a protimetastázová účinnosť heparínu a jeho derivátov existuje vďaka jeho schopnosti inhibovať heparanázu kvôli blokovaniu rastových faktorov a na riadenie angiogenézy.

Heparánsulfáty (HS)

Heparánsulfáty sú všadeprítomné proteínové ligandy. Proteíny sa viažu k HS reťazcom kvôli rôznym pôsobeniam, od jednoduchej imobilizácie alebo ochrane pred proteolytickým degradačným pôsobením k špecifickým moduláciám biologických aktivít, ako je angiogenéza.

Uhľovodíková kostra heparínu a heparánsulfátu (HS) pozostáva striedavo z D-glukózamínu (GlcN) a hexurónových kyselín (Glc.A alebo IdO.A.).

V heparíne sú zvyšky GlcN hlavne N-sulfátované, zatiaľ čo v HS sú aj N-sulfátované, aj N-acetylované, s malým množstvom nesubstituovaného N-.

HS je tiež v priemere menej O-sulfátovaný ako heparín.

Použitie heparínu pri liečení porúch angiogenézy, ako sú nádory, najmä metastázy, je v podstate obmedzené antikoagulačným pôsobením heparínu.

Uskutočňujú sa chemické modifikácie heparínu tak, aby sa znížila jeho antikoagulačná schopnosť a súčasne sa ochránili jeho protinádorové vlastnosti.

Otvorenie jednotky kyseliny glukurónovej v antitrombínovom mieste znižuje afinitu heparínu k antitrombínu: takto sa môžu použiť heparíny so zníženými antikoagulačnými účinkami, ale ešte stále so zachovalými antiangiogénnymi vlastnosťami.

Heparanázy

Heparanázy sú enzýmy patriace do rodiny endoglykozidáz, ktoré hydrolyzujú vnútorné glykozidové väzby reťazcov heparánsulfátov (HS) a heparínu.

Tieto endoglykozidázy sú zahrnuté v proliferácii nádorových buniek, v metastázach a neovaskularizácii nádorov. Toto naznačuje, že môžu byť aj zahrnuté v nádorovej angiogenéze ako výsledok uvoľňovania, z extracelulámej matrice, rastových faktorov naviazaných k heparínu, ako je FGF (tiež nazývaný FGF-1), bFGF (tiež nazývaný FGF-2) a VEGF.

Tieto enzýmy sú biologickými cieľmi pre antiangiogénnu aktivitu. Vo vedeckej literatúre je veľké množstvo štruktúmych/aktivitných korelačných štúdií (pozri napr. Lapierre F. a kol., Glycobiology, vol. 6, (3), 355-366, 1996). Hoci mnohé aspekty sa musia ešte objasniť, štúdie sa uskutočnili vzhľadom na inhibíciu heparanáz heparínom a jeho derivátov s použitím špecifických testov, ktoré viedli k prípadným úvahám o štruktúre, ktorá by mohla slúžiť ako vzor na získame nových selektívnejších derivátov.

V uvedenej práci Lapierra a kol. sa opísané heparínové deriváty získali 2-0 desulfáciou alebo „glykolovým štiepením“ (oxidácia s jodistanom a následná redukcia s borovodíkom). Tieto deriváty tu definované ako „2-O-desulfátovaný heparín“ a prípadne „RO-heparín“ majú čiastočne zachovanú antiangiogénnu aktivitu heparínu, ako sa určilo pomocou testu CAM v prítomnosti kortikosteroidov, ako je uvedené v tab. III (ibid. str. 360).

Heparíny a FGF

FGF regulujú viaceré fyziologické procesy, ako je rast bunky a diferenciácia, ale tiež funkcie zahrnuté v patologických procesoch, ako je nádorová angiogenéza.

FGF sú rastové faktory (rodina viac ako 10 polypeptidov), z ktorých kyslé (FGF-1) a zásadité (FGF-2) sú tie, ktoré sa najviac študovali, a ktoré vyžadujú polysacharidový kofaktor, heparín alebo HS, na viazanie k FGF receptoru (FGFR) a jeho aktiváciu.

Hoci presný mechanizmus, ktorým heparín a HS aktivujú FGF je neznámy, je však známe, že heparín/FGF/FGFR tvoria trimolekulový a terciámy komplex.

Jedným z postulovaných mechanizmov, je že heparín a HS indukujú tzv. sendvičovú dimerizáciu FGF, čím sa vytvára stabilný komplex s FGFR.

Antimetastatická aktivita heparínových derivátov

Schopnosť primárneho nádoru vytvárať metastatické bunky je asi hlavným problémom, ktorému čelí protinádorová liečba.

Heparínové deriváty s výraznou schopnosťou blokovať heparanázu sa považujú za rovnocenné pri inbibícii angiogenézy v primárnych nádoroch aj v metastázach.

Navyše inhibícia heparanázy znižuje migračnú schopnosť nádorových buniek z primárneho nádoru do iných orgánov.

Nasledujúca tabuľka poskytuje príklad štruktúmych/anti-metastatických aktivitných vzťahov v prípade heparínu:

	% inhibície
Heparín	97
N-sukcinyl-heparín	60
N-sukcinyl-RO-heparín	58
Heparín s nízkou MH	86
N-sukcinyl-heparín s nízkou MH	61
Heparín s veľmi nízkou MH	83

MH = molekulová hmotnosť

Údaje v tejto tabuľke ukazujú, že veľmi krátke fragmenty heparínu stále ešte vykazujú dobrú antimetastatickú aktivitu, zatiaľ čo táto aktivita je znížená, keď sa amínová skupina glukózamínu viaže ku kyseline sukcínovej.

Štruktúrne skupiny molekúl podobných heparínu, ktoré podporujú inhibíciu angiogenézy sa môžu rozdeliť do dvoch kategórií na základe zamýšľaného blokovaného cieľa:

a) blokáda heparanázy, enzýmu, ktorý hydrolyzuje glykozidové väzby heparánsulfátov, ktoré uvoľňujú rastové faktory.

Zlúčeniny podobné heparínu výhodne obsahujú sekvencie s aspoň ôsmimi monosacharidovými jednotkami, ktoré obsahujú kyselinu N-acetylglukózamín-glukurónovú (alebo N-sulfátovaný glukózamín (pozri napríklad D. Sandback-Pikas a kol., J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) a citované referencie).

b) blokáda angiogénnych rastových faktorov (fibroblastový typ: FGF-1 a FGF-2, vaskulámy endoteliálny typ: VEGF, vaskulámy permeabilitný typ: VPF).

Zlúčeniny podobné heparínu majú výhodne sekvencie s aspoň piatimi monosacharidovými jednotkami, ktoré obsahujú 2-sulfátovanú idurónovú kyselinu a glukózamín N,6-sulfátovaný (pozri napríklad M. Maccarana a kol. J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).

V literatúre malé peptidy (5-13 aminokyselín) s antiangiogénnou aktivitou (americký patent US 5,399,667 od University of Washington), ktoré pôsobia viazaním k trombospondínovému receptoru alebo k dlhším peptidom (približne 50 aminokyselín).

Sú známe modifikované doštičkové faktory - (EP 0 589 719, Lilly), schopné inhibovať endoteliálnu proliferáciu s IC₅₀= 7 nm.

Oligosacharidové fragmenty s antiangiogénnou aktivitou boli tiež rozsiahlo opísané: zistilo sa, že skutočne striedaním uhľovodíkovej sekvencie sa zvyšuje selektivita interakcie.

Navyše sa môže heparín použiť ako vehikulum pre látky, ktoré sú samotné antiangiogénne, ako sú niektoré steroidy, využívaním afinity heparínu k vaskulámym endoteliálnym bunkám, pozri napríklad WO 93/18793 od University of Texas a Imperiál Cancer Research Technology, kde sa nárokujú heparíny so skupinami labilnými v kyslom prostredí, ako je hydrazín kyseliny adipovej naviazaný ku kortizolu. Antinagiogénny účinok konjugovaných molekúl je väčší ako nekonjugovaných molekúl, aj keď sa podávajú súčasne.

V Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96, sú opísané heparíny, ktoré sa viažu k steroidom (napr. kortizol) s hydrazónovou skupinou na uhlíku C-20, ktoré predstavujú vyššiu antiangiogénnu aktivitu ako majú dve nekonjugované molekuly.

EP 0 246 654 od Daiichi Sc. opisuje sulfátované polysacharidy s antiangiogénnou aktivitou v štúdiách fáze II.

EP 0 394 971 od Pharmacia & Upjohn - Harvard Coli. opisuje hexasacharidy - heparínové fragmenty - s nízkou sulfatáciou, ktoré sú schopné inhibovať rast endoteliálnych buniek a angiogenézu stimulovanú FGF-1.

EP 0 618 234 od Alfa Wasserman opisuje spôsob prípravy semisyntetických glykózaminoglykánov s heparínovou alebo heparánovou štruktúrou nesúcou nukleofílnú skupinu.

WO 95/05182 od Glycomed opisuje rôzne sulfátované oligosacharidy s antikoagulačnou, antiangiogénnou a protizápalovou aktivitou.

US 5,808,021 od Glycomed opisuje spôsob prípravy v podstate ne-depolymerizovaných 2-O, 3-0 desulfátovaného heparínu s desulfatačným percentom v pozíciách 2- kyseliny idurónovej (I, 2-O) a v pozícii 3glukózaminovej jednotky (A, 3-O) v rozsahu približne od 99 do približne 75 % pôvodného percenta. Tento spôsob ukazuje desulfatáciu prevedenú v prítomnosti katiónu dvojmocného kovu, ktorým je napríklad vápnik alebo meď, potom nasledovala lyofílizácia získaného produktu. Desulfátované heparíny majú antinagiogénnu aktivitu.

Cieľom opísaného vynálezu je nájsť optimálne glykózaminoglykánové štruktúry na vyvolanie antiangiogénnej aktivity založenej na mechanizmoch inhibície heparanázy a/alebo FGF rastového faktom. Ďalším cieľom tu opísaného vynálezu je poskytnúť liečivo s antiangiogénnou aktivitou, ktoré sa vyhýba typickým vedľajším účinkom heparínových derivátov, ako napríklad antikoagulačnú aktivitu.

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že pri podrobení glykozaminoglykánu, ako je glykozaminoglukán podobný heparínu, heparín alebo modifikovaný heparín, obsahujúci glukózamínové zvyšky s rôznym stupňom N-desulfatácie a prípadne následnou alebo čiastočnou N-acetyláciou, kontrolovanému 2-O-desulfatačnému spracovaniu idurónových skupín po stupeň desulfatácie najviac 60 % z celkových uránových jednotiek, sa zachovajú väzbové vlastnosti angiogénneho rastového faktom. Prekvapujúco 2-O-desulfátovaný heparín do najviac 60 % z jeho celkových uránových jednotiek je výrazne antiangiogénny.

Desulfatácia uskutočňovaná v podmienkach opísaných v predloženom vynáleze tiež poskytuje tvorbu idurónových jednotiek s oxyránovým kruhom v pozícii 2,3. Otvorenie oxyránového kruhu v podmienkach opísaných v predloženom vynáleze dáva vznik L-idurónovým alebo L-galakturónovým jednotkám.

Jedným z predmetov vynálezu je glykozamínoglykánový derivát, najmä čiastočne desulfátovaný heparín, selektívne čiastočne desulfátovaný so stupňom desulfatácie najviac 60 % celkových uránových jednotiek, tieto desulfátované medzery zmenšujú dĺžku pravidelných sekvencií vytváraných postupnosťou disacharidových trisulfátových jednotiek.

V jednom zvláštnom uskutočnení sa tu opísaný vynález týka zlúčeniny vzorca (I)

kde U kruh má nasledujúce významy:

X a X', ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sú aldehydovou skupinou alebo -CH₂-D skupinu, kde D je hydroxyl alebo aminokyselina, peptid alebo uhľovodíkový alebo oligosacharidový zvyšok,

R a R¹, ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sú SO₃ alebo acetylový zvyšok, n a m, ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sa menia od 1 do 40, súčet n+m je v rozsahu 6 až 40, pomer m : n je v rozsahu 10 : 2 až 1 : 1. Výhodne m je väčšie alebo sa rovná n. Výhodne n je v rozsahu 40 až 60 % súčtu m+n. Symbol znamená, že jednotky označené s m a n sú štatisticky rozmiestnené pozdĺž polysacharidového reťazca a nie sú nevyhnutné v sekvencií.

Zlúčeniny, ktoré sú predmetom vynálezu, majú zaujímavé antiangiogénne vlastnosti a preto sú vhodné ako účinné látky na prípravu liečiv na liečenie patológií založených na abnormálnych angiogenézach, a najmä na liečenie metastáz.

Výhodne zlúčeniny podľa vynálezu predstavujú znížené, ak nie neexistujúce antikoagulačné vlastnosti, čím sa predchádza alebo sa znižujú vedľajšie účinky typické pre heparíny. Ďalšia výhoda vyplýva zo skutočnosti, že zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu definovať s inštrumentálnymi analytickými technikami, ako je NMR spektroskopia, čo umožňuje kontrolu procesu, čo je absolútne nevyhnutné z priemyselného hľadiska.

Tiež v prípade modifikovaných heparínov má molekulová hmotnosť (MH) veľmi významnú funkciu pri vytváraní inhibítorov angiogenézy. Je veľmi dobre známe, že zníženie molekulovej hmotnosti (MH) na hodnoty korešpondujúce s pentasacharidovými jednotkami nevedie k strate angiogénnej aktivity. Oproti tomu sa zistilo, že pod určitou dĺžkou heparínové reťazce uprednostňujú skôr inhibíciu dimerizácie a tak aktivujú FGF.

Stupeň desulfatácie znamená percento nesulfátovaných idurónových kyselín vzhľadom na celkové idurónové kyseliny pôvodne prítomné v počiatočnom heparíne. Jeden počiatočný rozsah pre percento desulfatácie je približne 40 až približne 60 %. V rámci všeobecného vzorca (I) je výhodnou zlúčeninou: heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný s molekulovou hmotnosťou (ΜΗ) 11200 D, indexom polydisperzity D

1,3 a stupňom desulfatácie 1,99 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃' : COO'), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami približne 50 % (tu tiež nazývaná ako STÍ 514). Táto zlúčenina je zahrnutá vo vzorci (I), kde, medzi inými zodpovedajúcimi definíciami, m : n = 1 : 1 a jednotky označené m a n sú rozmiestnené pozdĺž polysacharidového reťazca pravidelne, striedavo.

Zlúčeniny podľa vynálezu sa pripravujú spôsobom, ktorý zahŕňa:

- základné spracovanie pri teplote v rozsahu od izbovej teploty do približne 100 °C, výhodne 50 až 70 °C, a výhodnejšie pri približne 65 °C, čo vedie k eliminácii kontrolovaného percenta sulfátových skupín v polohe 2 kyseliny idurónovej a k tvorbe epoxidových skupín, a ak sa to vyžaduje

- otvorenie epoxidového kruhu pri pH 7 a teplote v rozsahu približne 50 °C až približne 100 °C, výhodne pri približne 70 °C za získania zvyškov kyseliny galakturónovej, alebo alternatívne

- otvorenie epoxidového kruhu pri teplote približne 0 °C až 30 °C, výhodne pri približne 25 °C, za získania zvyškov kyseliny idurónovej, a ak sa to vyžaduje

- oxidáciu diolov s jodistanom sodným za otvorenia glykozidového kruhu a za tvorby dvoch aldehydových skupín na modifikovaný zvyšok,

- redukciu aldehydových skupín na primárny alkohol a, ak sa to vyžaduje, transformáciu skupiny D na skupinu inú ako hydroxyl, ako je uvedené v rozdielnych významoch uvedených vo vzorci (I),

- prípadnú kyslú hydrolýzu za získania oligosacharidov zodpovedajúcich pravidelným sekvenciám, alebo alternatívne

- čiastočnú enzýmovú hydrolýzu s enzýmom vybraným zo skupiny pozostávajúcej z lyázy, heparinázy, heparitinázy, alebo ekvivalentom produktov získaných v kroku e) za získania oligosacharidov, výhodne tetra- alebo oktasacharidov, s neredukujúcim terminálnym zvyškom, ktorý pozostáva z nenasýtenej kyseliny idurónovej, redukujúceho zvyšku pozostávajúceho z N-sulfoglukózamínu a obsahujúceho aspoň jeden zvyšok otvorenej kyseliny idurónovej, alebo alternatívne

- zlúčenina získaná v kroku a) alebo produkt získaný v kroku b) sa spracuje čiastočnou enzýmovou hydrolýzou, a ak sa to vyžaduje

- podrobenie produktov získaných v krokoch a), b) a e) čiastočnej 6-O-desulfatácii, alebo prípadne

- podrobenie počiatočného heparínu čiastočne alebo úplne 6-desulfátovaného krokom a), b) a e).

Podľa vynálezu je výhodnou zlúčeninou:

čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín získateľný opísaným spôsobom, kde krok a) sa uskutočňuje 45 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a majúci molekulovú hmotnosť (ΜΗ) 11200 D a index polydisperzity D 1,3, stupeň desulfatácie 1,99 (vyjadrené ako mólový pomer SOý : COO ), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami približne 50 % (tu tiež nazývané ST 1514).

Molekulové hmotnosti sa stanovia HPLC-GPC (vysoko účinná kvapalinová chromatografia - gélová permeačná chromatografia). Stupeň desulfatácie sa stanoví konduktometricky a percento modifikovaných uránových kyselín pomocou ¹³C-NMR.

MH je molekulová hmotnosť a D je index polydisperzity vyjadrený ako MH/Mn.

Podľa vynálezu počiatočné produkty sú glykózaminoglykány rôzneho pôvodu, výhodne prírodné sa vyskytujúce heparíny. Je tiež možné použiť chemicky modifikované heparíny s percentuálnym obsahom N,6 disulfátu 0 až 100 %. Pri vychádzaní z produktov s rôznym obsahom 6-O-sulfátovaného glukózamínu, je možné modulovať dĺžku pravidelných sekvencií medzi jednou a druhou otvorenou kyselinou idurónovou. Glykózaminoglykány podľa vynálezu, ktoré predstavujú otvorenie glykozidového kruhu sú konvenčné nazývané RO deriváty, čo znamená, že glykozidový kruh sa otvoril oxidačným pôsobením, po ktorom nasleduje redukcia (Redukcia - oxidácia - RO). Toto otvorenie glykozidového kruhu sa tiež bežne nazýva „glykolové štiepenie“, takzvane preto, že nastáva tvorba dvoch primárnych hydroxyskupín prítomných na otvorenom kruhu. Zlúčeniny tu uvedené sa tiež nazývajú „RO“ deriváty alebo deriváty „glykolového štiepenia“.

V ďalšom uskutočnení vynálezu aldehydy a primáme hydroxyderiváty odvodené z opísanej reakcie otvorenia („glykolové štiepenie“) tiež vedú k ich následnej funkcionalizácii. Preto vzorec (I) zlúčenín môže tiež niesť rovnaké alebo rôzne skupiny, ako je definované pre X a X', na primárnych hydroxyskupinách odvodených z glykolového štiepenia, napríklad oligosacharidové alebo peptidové skupiny, v rozsahu od jedného sacharidu alebo aminokyseliny k viac ako jednej jednotke s dĺžkou výhodne 2 alebo 3 jednotky.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde X a X' sú -CH₂OH sa tiež môžu použiť ako vehikulá pre iné typy liečiv prostredníctvom vhodnej väzby s časťou heparínu, ktorá je schopná poskytnúť stabilnú väzbu v normálnych podmienkach výroby a skladovania vyrobených liečiv, ktorá však je schopná uvoľniť transportované liečivo v tele, výhodne v blízkosti cieľového orgánu. Príklady liečiv, ktoré sa môžu transportovať sú stero idné a nesteroidné protizápalové liečivá, kortikosteroidy a iné liečivá s antimetastatickým pôsobením, pričom v tomto prípade bude výhodné zvýšenie antimetastatického účinku ako výsledok súčtu oddelených vnútorných aktivít zlúčenín podľa vynálezu a antimetastatického činidla na ne naviazaného so spojenými výhodami väčšej cieľovej selektivity a nižšej systémovej toxicity. Príklady týchto liečiv sú metaloprotázové inhibítory. Iné liečivá, ktoré sa môžu výhodne transportovať, sú také, ktoré pôsobia na endoteliálnej úrovni. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde X a X' sú iné ako hydroxy alebo aldehyd, sa tiež môžu použiť ako vehikulá liečiv, pričom X a X' skupiny budú pôsobiť ako „oddeľovače“ medzi transportovanou molekulou, ktorou je glykózaminoglykán podľa vynálezu, a molekulou pôsobiacou ako vehikulum, toto môže byť užitočné z dôvodov farmakokinetiky alebo farmakodynamiky.

Zlúčeniny podľa vynálezu odvodené od heparínu sa pripravujú vychádzajúc zo samotného heparínu pomocou desulfatačných techník, ktoré sú známe odborníkom v oblasti techniky. Napríklad sa desulfatácia uskutočňuje v prítomnosti alkalických činidiel, ako je hydroxid sodný, pri teplotách v rozsahu od teploty okolia do 100 °C, výhodne 50 až 70 °C, napríklad pri 60 °C, počas dostatočne dlhého času na získanie požadovanej desulfatácie. Desulfatácia sa kontroluje pôsobením na parametre procesu, ako sú koncentrácia reaktantov, teplota a reakčné časy. Jeden výhodný príklad spočíva v zachovaní konštantných koncentrácií východzej látky (glykózaminoglykán) pri 80 mg/ml a hydroxidu sodného NaOH pri 1 M, konštantnej teplote 60 °C a kontrole desulfatácie s reakčným časom 15 až 60 min. Odborník môže meniť podmienky, napríklad zvyšovať teplotu a skrátiť reakčný čas, na základe normálneho pokusu a omylu v experimentálnej praxi a na základe jeho/jej všeobecných znalostí.

Spracovanie s alkalickými činidlami poskytuje medziprodukt, ktorý je charakterizovaný prítomnosťou epoxidového kruhu na desulfátovanej jednotke. S prekvapením sa dokázalo, že tieto medziprodukty majú antiangiogénne vlastnosti podobné tým, ktoré sa zistili pri zlúčeninách všeobecného vzorca (I). Preto ďalším predmetom vynálezu je derivát čiastočne desulfátovaného heparínu, čo je heparín so zníženým nábojom, najmä heparín desulfátovaný najviac na 60 %, ktorý je charakterizovaný epoxidovaným kruhom na desulfátovom mieste. Zlúčeniny charakterizované epoxidovým kruhom tiež patria k predmetom, ktoré patria pod tento vynález, ako aj farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú a ich použitie na prípravu liekov s antiangiogénnou aktivitou.

Nasledujúce zlúčeniny sú uprednostňované: heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný s molekulovou hmotnosťou (MH) 12900 D, indexom polydisperzity D

1,5 a stupňom desulfatácie 2,05 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov (tu tiež nazývaná ako STÍ513), heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný s molekulovou hmotnosťou (MH) 11000 D, indexom polydisperzity D

1,5 a stupňom desulfatácie 2,05 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov, heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný s molekulovou hmotnosťou (MH) 9200 D, indexom polydisperzity D

1,5 a stupňom desulfatácie 2,05 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO ), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov.

V jednom z možných uskutočnení vynálezu sú uprednostňované: heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný, získateľný spôsobom opísaným skôr, kde krok a) sa uskutočňuje počas 15 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (MH) 12900 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 2,05 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃' : COO'), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov (tu tiež nazývané ako STÍ513), heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný, získateľný spôsobom opísaným skôr, kde krok a) sa uskutočňuje počas 30 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7 (tu tiež nazývaná ako STÍ516), a s molekulovou hmotnosťou (MH) 11000 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 1,8 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: : COO ), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov, heparín čiastočne 2-O-desulfátovaný, získateľný spôsobom opísaným skôr, kde krok a) sa uskutočňuje počas 60 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (MH) 9200 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 1,8 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘ : COO ), percento modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných (štiepených) uránových zvyškov (tu nazývaná ako STÍ515).

Následne po tvorbe epoxidového kruhu sa tento otvorí podľa známych techník. Percento vytvoreného epoxidu sa vypočíta z pomeru plôch ¹³C-NMR signálov pri približne 55 ppm, ktoré charakterizujú uhlíky 2 a 3 kruhu kyseliny uránovej obsahujúcej epoxid, a celkového množstva anomémych signálov (Cl glukózamínových zvyškov a zvyškov kyseliny uránovej). Keď sa otváranie uskutočňuje za horúca, získa sa zvyšok ky seliny galakturónovej, zatiaľ čo pri otváraní epoxidového kruhu uskutočňovaného za studená, získa sa zvyšok kyseliny idurónovej. Výhodné príklady zlúčenín s obsahom epoxidového kruhu sa dajú získať spôsobom opísaným skôr a tieto zlúčeniny obsahujú 14 % epoxidovanej kyseliny uránovej ( ST1509), 24 % (ST1525) alebo 30 % (1526).

Čiastočne desulfátovaný heparín sa potom podrobil „glykolovému štiepeniu“ (RO), podľa opísaného spôsobu a Smithovej degradácie (SD).

Alternatívne zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa tiež môžu získať bez prechádzania cez epoxidový medziprodukt, teda pomocou priameho glykolového štiepenia a následnou Smithovou degradáciou.

Opísaný spôsob doteraz viedol k zlúčeninám všeobecného vzorca (I), v ktorom skupiny X a X' sú obidve -CH₂OH.

Pre X a X' iné ako -CH₂OH sú odborníkom dostupné metódy na premenu hydroxylovej skupiny s inými skupinami uvedenými v definíciách uvedených skôr. Napríklad konjugácia s aminokyselinami alebo peptidmi sa môže uskutočniť spracovaním aldehydového medziproduktu odvodeného z reakcie glykolového štiepenia s redukčnou aminačnou reakciou (Hoffmann J. a kol. Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)), ktorá sa môže uskutočniť vo vodnom roztoku a je v súlade so zachovaním heparínovej štruktúry.

Ak sa to vyžaduje, a toto tvorí ďalší predmet vynálezu zlúčeniny vzorca (I,) sa môžu ďalej degradovať s kyslými činidlami v vhodných pH podmienkach, napr. pri pH 4, za získania oligosacharidov, ktoré majú zachovalé antiangiogénne vlastnosti.

Tak isto predmetmi predloženého vynálezu sú zlúčeniny získané jedným z krokov g), h), i) a j) spôsobu opísaného skôr.

Predmetmi opísaného vynálezu sú farmaceutické prostriedky obsahujúce ako účinnú zložku aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca (I), samotnú alebo v kombinácii s jednou alebo viacerými zlúčeninami všeobecného vzorca (I), alebo zlúčeninu všeobecného vzorca (I) alebo zlúčeniny v kombinácii s desulfátovanými opísanými heparínmi, napr. epoxidovanými medziproduktami, ktoré sa tiež môžu použiť samotné ako účinné zložky vo farmaceutických prostriedkoch. Účinná zložka podľa vynálezu bude v zmesi s vhodnými vehikulami a/alebo excipientmi, ktoré sa bežne používajú vo farmaceutickej technológii, ako je napríklad opísané v „Remington 's Pharmaceutical Sciences Handbook“, posledné vydanie. Prostriedky podľa vynálezu budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo účinnej zložky. Dávky sa stanovia odborníkmi v odbore, napr. klinickým alebo primárnym lekárom podľa typu ochorenia, ktoré sa má u pacienta liečiť, alebo pri súčasnom podávaní iných účinných zložiek. Príkladom môžu byť dávky v rozsahu 0,1 až 100 mg/kg.

Príkladmi farmaceutických prostriedkov sú prostriedky podávané orálne alebo parenterálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, transdermálne, alebo prostriedky vo forme nosných alebo orálnych sprejov. Farmaceutické prostriedky vhodné na podávanie sú tabletky, tvrdé a mäkké kapsuly, púdre, roztoky, suspenzie, sirupy a tuhé formy na prípadné kvapalné prípravky. Prostriedky na parenterálne podávanie sú napríklad všetky intramuskuláme, intravenózne a subkutánne injektovateľné formy ako aj roztoky, suspenzie a emulzie. Tiež je možné uviesť lipozómové formulácie. Tabletky tiež zahŕňajú formy, na kontrolované uvoľňovanie účinnej zložky, či už ako orálne formy podávania, tablety potiahnuté s vhodnými vrstvami, mikrozapuzdrené prášky, komplexy s cyklodextrínmi, vkladacie formy, napríklad subkutánne formy, ako sú injekcie alebo implantáty.

Zlúčeniny podľa vynálezu majú antiangiogénnu aktivitu. Preto sú vhodné na prípravu liekov vhodných na liečenie jedincov, vo všeobecnosti cicavcov, a najmä ľudských jedincov, ktorí trpia na premenlivú angiogenézu. Príkladmi chorôb liečených s liekom, ktorý je predmetom vynálezu, sú primáme nádory, metastázy, diabetické retinopatie, psoriáza, retrolentikuláma fibroplázia, restenóza po angioplastike a koronárny by-pass.

Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu sú v podstate schopné predchádzať vedľajším účinkom, ktoré sú typické pre heparín. Najmä sú zlúčeniny podľa vynálezu schopné v podstate zabrániť antikoagulačnej aktivite. V podstate zabránenie takej aktivite pre odborníka znamená žiadnu alebo iba zanedbateľnú aktivitu z hľadiska klinického použitia.

Jeden z prvých zistených rastových faktorov, ktorý mal angiogénnu úlohu bol bFGF (alebo FGF-2), po ktorom v krátkom čase nasledoval aFGF (alebo FGF-1) (kvôli prehľadu pozri Christofori, Oxford University, 1996). Obidva proteíny sú členmi triedy rastových faktorov charakterizovaných vysokým stupňom afinity k heparínu. Iné účinné angiogénne induktory sú VEGF, VEGF-B a VEGF-C. Všetky tri faktory, sú exprimované všade v tele. Obidva typy faktorov, a/bFGF (FGF-1 a FGF-2) a VEGF, sa viažu k špecifickým vysoko afinitným receptorom s transmembránovou oblasťou, ktorá má tyrozín-kinázovú aktivitu. Tri faktory pre VEGF - VEGF-1 (flt-1), VEGF-2 (kdr/flk-1) a VEGF-3 (flt-4) - sú špecificky exprimované v endoteliálnych bunkách, zatiaľ čo štyri FGF receptory sú exprimované v mnohých orgánoch a tkanivách (pozri Risau a Fláme 1995 Annu. Rev. Celí Dev: Biol. 11: 73-91). bFGF, ktorý viaže k heparínu alebo k fragmentom heparánsulfátu, zapríčiňuje ich dimerizáciu a možnosť viazania k ich vlastným receptorom aktiváciou transdukčnej cesty signálu, ktorý aktivuje endoteliálnu bunku v mitogenéze, ako aj pri diferenciácii.

Inhibícia viazania FGF na heparín alebo fragmenty heparánsulfátu predstavuje platný terapeutický cieľ v boji proti patologickej neoangiogenéze, ktorá bola vyvolaná zvýšenou alebo systémovou hladinou rastových faktorov.

Na tento účel sa zostrojil model in vitro na stanovenie interferencie rôznych derivátov heparínu s bFGF, ktorý sa viaže na svoj vlastný receptor.

Použili sa najmä bunky vaječníkov čínskych škrečkov (CHO-K1), ktoré obsahujú heparánsulfáty na svojom povrchu, ale neobsahujú FGF receptor 1. Použili sa tiež bunky CHO označené CHO-745flg, ktoré exprimujú FGF receptor 1, ale ktoré sa líšia od pôvodnej skupiny, neobsahujú membránové heparánsulfáty. Tieto bunky sa stabilne transfektovali s cDNA pre zelený fluorescentný proteín a preto sa môžu pozorovať pod flouroescenčným mikroskopom s kombináciou filtrov na detekciu zelenej emisie. V stručnosti je technika založená na možnosti, že dva typy buniek môžu interagovať (tvoriť stabilné väzby), iba keď FGF sa pridá k dvom typom buniek. V skutočnosti v tomto prípade heparánsulfáty CHO-754flg buniek sa budú viazať na FGF, ktorý sa naopak bude viazať k CHO-K1 bunkám za vytvorenia mostíka. Viazanie, ktoré prebieha je možné detegovať ako výsledok zelenej fluorescencie emitovanej bunkami CHO-745flg.

Navyše sa zlúčeniny testovali na ich inhibičnú aktivitu proliferácie buniek. V skutočnosti jeden z hlavných účinkov FGF je stimulovať rast buniek v neprítomnosti séra v bunkách exprimujúcich FGF receptor 1 (FGFR-1).

Na tento účel sa použili dve bunkové línie, obidve exprimujúce FGFR-1 (L6WT1 a bunky hovädzej aorty), ktorých rast sa uskutočnil v prítomnosti FGF s pridaním alebo bez pridania derivátov heparínu, pre ktoré sa očakávala inhibičná aktivita.

Inhibícia FGF-2 mediovanej medzibunkovej adhézie

Bunky CHO-K1 sa naniesli na hustotu 90 000 buniek/cm² na 24 jamkových platniach. Po 24 hodinách sa bunky fixovali v 3 % glutaralaldehyde v PBS počas 2 hodín pri 4 °C a premyli sa s 0,1 M glycínom/PBS. Na fixovaných monovrstvách buniek CHO 745/flg transfektovaných s FGFR-1, pri hustote 50 000 buniek/cm² v DMEM s obsahom 10 mM EDTA, 30 ng/ml FGF-2 a pri náraste dávok testovaných zlúčenín. Po 2 hodinách inkubácie pri 37 °C sa spočítali priľnuté bunky pod invertným mikroskopom. Výsledky sa vyjadrili ako percento množstva priľnutých buniek v porovnaní s výsledkami získanými v neprítomnosti testovaných zlúčenín. Zlúčeniny sa testovali trikrát pri 6 koncentráciách v rozsahu 1 ng/ml až 100 μ/ml a ID₅₀ sa vypočítal pre každú zlúčeninu (tabuľka 1).

Tabuľka 1

Inhibícia medzibunkovej adhézie (ID₅₀) buniek CHO-K1 a CHO-745flg

Zlúčenina	Inhibícia (ID₅₀)
Heparín	100
RO heparín	8
ST1513	80
ST1516	110
ST1514	105
ST1515	120
STÍ 525	50
STÍ 528	75
ST1507	125

Inhibícia syntézy DNA v L6 bunkách transfektovaných s FGFR-1

L6-WT1 bunky (potkanie myoblasty transfektované s FGFR-1) sa naniesli na hustotu 25000 buniek/cm²na 48 jamkových platniach v DMEM+ 10 % FCS. Po 24 hodinách sa bunky premyli s médiom bez obsahu séra a inkubovali počas 48 hodín s DMEM+ 0,5 % FCS. Bunky sa potom inkubovali počas 16 hodín s FGF-2 pri koncentráciách 15 a 30 ng/ml v prítomnosti alebo neprítomnosti testovaných zlúčenín (všetky pri 100 pg/ml). Na konci inkubácie sa pridal 3H-tymidín (0,25 pCi/jamka) bez zmeny média. Po 6 hodinách sa meral zrážateľný TCA. Každý experimentálny bod je priemerom troch stanovení. Výsledky sú dané v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Inhibícia syntézy DNA v bunkách L6 transfektovaných s FGFR-1

Zlúčenina	Zavedenie ^JH-tymidínu (% v porovnaní s kontrolou)
Heparín (FGF-2 15 ng/ml)	50
Heparín (FGF-2 30 ng/ml)	74
Heparín RO (FGF-2 15 ng/ml)	41
Heparín RO (FGF-2 30 ng/ml)	80
ST1513 (FGF-2 15 ng/ml)	93
ST1513 (FGF-2 30 ng/ml)	102
G3025B (FGF-2 15 ng/ml)	68
G3025B (FGF-2 30 ng/ml)	71
ST1514 (FGF-2 15 ng/ml)	58
ST1514 (FGF-2 30 ng/ml)	99
ST1515 (FGF-2 15 ng/ml)	79
ST1515 (FGF-2 30 ng/ml)	100

Účinok syntézy DNA v endoteliálnych bunkách hovädzej aorty (BAEC)

Bunky BAEC sa naniesli pri hustote 2500 buniek/cm² na 48 jamkových platniach v úplnom médiu EMG Bulletovej súpravy. Po 24 hodinách sa bunky kultivovali v neprítomnosti séra v EMG médiu bez extraktu z hovädzieho mozgu a hEGF. Po ďalších 24 hodinách sa bunky spracovali s 30 ng/ml bFGF v prítomnosti vzrastajúcich koncentrácií testovaných zlúčenín. Po 16 hodinách sa pridal 1 pCi/ml 3H-tymidínu k médiu. Po 6 hodinách sa zmerala zrážacia TCA aktivita. Každý experimentálny bod je priemerom 8 stanovení. Výsledky sú dané v tabuľkách 3 až 6.

Tabuľka 3

Účinok syntézy DNA v endoteliálnych bunkách hovädzej aorty (BAEC)-ST1514

Koncentrácia (ng/ml)	Zavedenie ³H-tymidínu (% v porovnaní s kontrolou)
1	80
10	78
100	42
1000	33
10000	22
100000	5

Tabuľka 4

Účinok syntézy DNA v endoteliálnych bunkách hovädzej aorty (BAEC)-ST1528

Koncentrácia (ng/ml)	Zavedenie ³H-tymidínu (% v porovnaní s kontrolou)
1	85
10	73
100	85
1000	32
10000	28
100000	5

Tabuľka 5

Účinok syntézy DNA v endoteliálnych bunkách hovädzej aorty (BAEC)-ST1525

Koncentrácia (ng/ml)	Zavedenie ^JH-tymidínu (% v porovnaní s kontrolou)
1	75
10	67
100	26

1000	21
10000	7
100000	2

Tabuľka 6

Účinok syntézy DNA v endoteliálnych bunkách hovädzej aorty (BAEC)-ST1507

Koncentrácia (ng/ml)	Zavedenie ³H-tymidínu (% v porovnaní s kontrolou)
1	92
10	92
100	45
1000	40
10000	18
100000	12

Test bunkovej proliferácie v BAEC

Bunky BAEC pri siedmom prechode sa naniesli pri hustote 2500 buniek/cm² na 96 jamkových platniach v médiu EBM bez extraktu hovädzieho mozgu a hEGF. K tomuto médiu sa pridalo 30 ng/ml FGF-2 a každá z testovaných zlúčenín pri 5 koncentráciách v rozsahu 10 ng/ml až 10 pg/ml. Po 3 troch dňoch sa bunky fixovali a zafarbili s kryštálovou fialovou a optická hustota sa stanovila pomocou ELISA mikroplatňovým čítačom. Každý experimentálny bod sa stanovil štyrikrát a vypočítal sa ID₅₀. Výsledky sú dané v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Test bunkovej proliferácie v BAEC

Zlúčenina	Inhibícia (ID₅₀) pg/ml
Heparín	100
STÍ 509	0,02
STÍ 525	10
STÍ526	0,02
ST1527	100
ST1528	0,1

Test bunkovej proliferácie vo fetálnom BAEC GM 7373

Bunky GM7373 sa naniesli pri hustote 70000 buniek/cm² na 96 jamkových platniach v MEM + 10 % FCS média. Po 24 hodinách sa bunky premyli médiom neobsahujúcim sérum a spracovali sa s 10 ng/ml FGF-2 v médiu s obsahom 0,4 % FCS. Po 8 hodinách sa testované zlúčeniny pridali k médiu pri 5 koncentráciách v rozsahu 10 ng/ml až 100 pg/ml. Po ďalších 16 hodinách sa bunky trypsinizovali a spočítali v Burkerovej komore. Pre každú zlúčeninu sa vypočítali ID₅₀ a výsledky sú priemermi 2 experimentov v 3 opakovaniach. Výsledky sú uvedené tabuľke 8.

Tabuľka 8

Test bunkovej proliferácie vo fetálnom BAEC GM 7373

Zlúčenina	Inhibícia (ID₅₀) pg/ml
Heparín	2
ST1509	0,3
STÍ525	2
STÍ526	1
STÍ527	20
STÍ528	0,2
ST1514	0,1

Inhibícia angiogenézy

Použitým modelom na štúdium angiogenézy bol model chorioalanoinovej membrány kuracieho embrya (CAM) (Ribatti a kol. Int. J. Dev. Biol. 40, 1189 (1996)).

300 embryonovaných slepačích vajíčok sa inkubovalo pri 37 °C v konštantných vlhkostných podmienkach. Na tretí deň inkubácie po vysatí 2 až 3 ml albumínu z ostrého konca vajca na oddelenie CAM zo škrupiny, otvor sa vystrihol s nožnicami v škrupine. Cievy, ktoré ležia pod CAM sa takto obnažili. Otvor sa uzatvoril s priehľadným skleneným panelom a vajcia sa vložili naspäť do inkubátora. Na 8 deň inkubácie v sterilných podmienkach, sa CAM ošetrili s podľa protokolu opísanéno neskôr s použitím nedávno vyvinutej techniky (Ribatti a kol., J. Vasc. Res. 34, 455 (1997)), ktorá zahŕňa použitie sterilných želatínových špongií s veľkosťou 1 mm². Každá molekula sa resuspendovala v 3 μΐ PBS pri koncentrácii 50 alebo 100 pg/embryo. Ako pozitívna kontrola sa použil FGF-2 (1 pg/špongia), pre ktorý sa preukázala výrazná angiogénna aktivita na CAM (Ribatti a kol., Dev. Biol. 170, 39, (1995)). Najskôr sa špongie ponechali na povrchu CAM a potom sa 3 pl roztoku testovanej látky pipetovali na povrch špongie. CAM sa denne sledovali so stereomikroskopom Zeiss SR vybaveným s fotografickým zariadením. Experimenty sa prerušili na 12 deň inkubácie, keď sa uskutočnilo celkové stanovenie angiogénnej aktivity molekúl, vyjadrené ako percento inhibicie vo vzťahu k počtu začatých a ukončených experimentov (tabuľka 9). Navyše sa pre zlúčeninu ST1514 pri koncentrácii 100 pg/embryo uskutočnilo makroskopické kvantitatívne vyjadrenie angiogénnej aktivity podľa techniky navrhnutej Brooksom a kol. (Science, 264, 569, (1994)), počítaním počtu ciev obklopujúcich špongiu. Množstvo ciev sa porovnalo s množstvom pri kontrolných špongiách s PBS (vehikulum testovanej zlúčeniny) a s FGF-2 (pozitívna kontrola). Výsledky sú uvedené v tabuľke 10.

Tabuľka 9

Angiostatická aktivita na modeli CAM

Zlúčenina	Koncentrácia (pg/embryo)	Počet pokusov	Inhibícia (%)
N-acetylovaný heparín	50	10	0
RO heparín (ox-red 19,6 %)	50	10	20
ST1514 (RO 56 %)	50	10	50
ST1514 (RO 56 %)	100	10	80

Prírodné sa vyskytujúci heparín nemal žiadnu účinnosť.

Tabuľka 10

Angiostatická aktivita: kvantitatívne vyjadrenie mikroskopie (Brooks)

Zlúčenina	Počet embryí	Počet ciev na špongii/povrch CAM
STÍ514 (100 pg/embryo)	10	2+1
PBS (3 pl)	5	7+2
FGF-2 (1 pg/embryo)	5	50+4

Prírodné sa vyskytujúci heparín nemal žiadnu účinnosť.

Vyjadrenie toxicity heparínu u myší Balb/c samíc myší starých 6 týždňov s hmotnosťou 20 g (Harlan), sa náhodne rozdelilo do skupín, ošetrilo s heparínom sodným, ako referenčnou zlúčeninou a so zlúčeninou podľa predloženého materiálu nazývanou STÍ514. Ošetrovanie sa uskutočnilo podľa plánu q2dx5, t. j. 5 celkových podávaní v intervaloch 2 dní, podávaním subkutánne 200 pl/myš 50 mg/kg/10 a 25 mg/kg/10 ml roztokov.

Látky sa rozpúšťali nasledujúcim spôsobom:

Heparín sodný: roztok sa pripravil rozpúšťaním 160 mg prášku v 4 ml PBS bez obsahu Ca⁺⁺ a Mg⁴³ 1 x pH

7,4, rozdelil sa na 243 μΐ podiely, ktoré sa uskladnili pri - 20 °C. V čase spracovania sa roztok zriedil lx v PBS bez obsahu Ca⁺⁺ a Mg⁺⁺ (Dulbecco, upravené zloženie), pri pH 7,4 tak, aby sa získali konečné koncentrácie 50 mg/kg/10 ml a 25 mg/kg/10 ml.

ST1514: roztok sa pripravil rozpustením 160 mg prášku v 4 ml PBS neobsahujúceho Ca⁺⁺ a Mg⁺⁺ lx, pri pH 7,4 rozdelil sa na 243 μΐ podiely, ktoré sa uskladnili pri - 20 °C. V čase spracovania sa roztok zriedil lx v PBS bez obsahu Ca^,+ a Mg⁺⁺ (Dulbecco, upravené zloženie), pri pH 7,4 tak, aby sa získali konečné koncentrácie 50 mg/kg/10 ml a 25 mg/kg/10 ml.

hodín po poslednom podaní testovaných látok sa odobrala krvná vzorka pre úplný krvný výpočet a hematologickú analýzu.

Krvné vzorky: myši sa umiestnili do hermeticky uzatvorených boxov, do ktorých sa dodával CO₂ v množstvách dostatočných na uspatie zvieraťa. Potom sa odobrala krv zo siete zo zadnej časti očnej jamky každého zvieraťa (približne 1 ml/myš), ktorá sa dodávala v množstvách 0,4 ml krv/myš v Eppendorfových testovacích trubiciach s obsahom 20 μΐ Visterovho heparínu (5000 U/ml) na uskutočnenie úplných krvných výpočtov a hematologickej analýzy, a to isté množstvo krvi sa dodávalo do iných Eppendorfových testovacích trubíc s obsahom 50 μΐ 3,8 % citrátu sodného na uskutočnenie časových stanovení protrombínu. Po odobratí krvi sa každé zviera usmrtilo oddelením mozgu.

Množstvo vzoriek: zobrali sa 2 krvné vzorky/myš, s ktorými sa uskutočnili úplné krvné výpočty a dva diapozitívy a vytvorili sa dve vzorky, ktoré sa uskladňovali pri -20 °C.

Úplný krvný výpočet: použil sa prístroj (Celí Analyzer 580 A, DELCON) podľa štandardnej procedúry opísanej v návode na použitie. Krvná vzorka (25 μΐ) sa zriedila na objem 10 ml (zriedenie 1 : 400) s izotonickým roztokom (PLTA soľný roztok, DELCON). Z tohto roztoku (nazývaného ako roztok A), zried’ovač odoberá automaticky vzorku 100 pm a riedi ju na objem 10 ml (zriedenie 1 : 100) za získania roztoku B. K roztoku A sa pridali 3 kvapky Emosolu (DELCON) na lýzu červených krvných buniek. Tento roztok sa použil na čítanie WBC. Roztok B, na druhej strane sa používa na RBC a čítanie doštičiek (PLT). Každá vzorka je odčítala 2-krát.

Získané údaje sa analyzovali s použitím ANOVA.

Skupiny zvierat ošetrené s heparínom sodným v dávkach 50 mg/kg/10 ml a 25 mg/kg/10 ml vykázali významný hematóm v mieste vpichu; tento jav neprebieha v skupinách podrobených ošetreniu s ST1514. Autopsie v štúdii zvierat ukazujú, že skupiny podrobené ošetreniu s heparínom sodným pri dávkach 50 mg/kg/10 ml a 25 mg/kg/10 ml predstavuje obličky s abnormálnymi charakteristikami, zatiaľ čo sa nezistil žiaden takýto jav v skupinách ošetrených s STÍ514.

Údaje týkajúce sa hematologickej analýzy ukazujú pokles červených krviniek v obidvoch skupinách s heparínom sodným v dávkach 50 mg/kg a 25 mg/kg v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo sa nezaznamenal žiaden detegovateľný rozdiel v skupinách ošetrených s STÍ514.

Skupina ošetrená s heparínom sodným v dávke 25 mg/kg predstavuje výrazný nedostatok doštičiek v porovnaní s kontrolnou skupinou. Žiadna zo študovaných ošetrených skupín nepredstavovala výrazné rozdiely v množstvách bielych krviniek v porovnaní s kontrolnou skupinou.

Nasledujúce príklady ďalej ilustrujú vynález.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 g heparínu sa rozpustil v 12,5 ml NaOH IN. Roztok sa zohrial a miešal pri 60 °C počas 45 minút. Reakcia sa ukončila rýchlym ochladením a neutralizáciou. Roztok sa potom zohrial na 70 °C pri pH 7, až kým sa epoxidový kruh úplne otvorí (reakcia sa kontrolovala NMR). Desulfátovaná vzorka (tu nazývaná G2999H) sa rozpustila v 20 ml vody a ochladila sa na 4 °C. Po pridaní 20 ml 0,2 M roztoku NaIO₄, roztok sa miešal v tme počas 20 hodín a reakcia sa zastavila pridaním etylénglykolu a soli sa eliminovali tangenciálnou ultrafiltráciou. 400 mg NaBH₄ rozdelených na niekoľko častí sa pridalo k odsolenému roztoku (30 - 40 ml). Roztok sa miešal počas 3 hodín pri teplote okolia, potom sa neutralizoval so zriedenou kyselinou chlorovodíkovou a odsolil sa s tangenciálnou ultrafiltráciou. Získalo sa 710 mg produktu tu nazývaného ako ST1514.

Molekulová hmotnosť (ΜΗ): 11200 D, index polydisperzity D 1,3, stupeň desulfatácie 1,9 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘ : COO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami je približne 50 %. Zlúčenina sa charakterizovala pomocou NMR spektroskopie (obr. 1).

Príklady 2 až 4

S použitím postupu podľa príkladu 1 s výnimkou toho, že sa základný roztok zohrieval počas 15, 30 a 60 minút, sa získali nasledujúce zlúčeniny:

- ST1513: molekulová hmotnosť (MH): 12900 D, index polydisperzity D 1,5, stupeň desulfatácie 2,05 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných (štiepených) urónových zvyškov,

- ST1516 molekulová hmotnosť (MH): 12900 D, index polydisperzity D 1,5, stupeň desulfatácie 1,8 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃': COO), percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných (štiepených) urónových zvyškov,

- ST1515: molekulová hmotnosť (MH): 9200 D, index polydisperzity D 1,5, percento modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných (štiepených) urónových zvyškov.

Claims

1. 2-O-Desulfátovaný glykózaminoglykánový derivát, najmä 2-O-desulfátovaný heparín, so stupňom 2-O-desulfatácie najviac 60 % z celkového množstva uránových jednotiek.

2. Derivát podľa nároku 1, ktorým je heparínu podobný glykózaminoglykán.

3. Derivát podľa nároku 1, ktorým je modifikovaný heparín, obsahujúci glykózamínové zvyšky s rôznym stupňom N-desulfatácie a prípadne s následnou celkovou alebo čiastočnou N-acetyláciou.

4. Derivát podľa nároku 1, ktorý má nasledujúci všeobecný vzorec (I):

(I), v ktorom kruh U má nasledujúce významy:

X a X', ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sú aldehydovou skupinou alebo -CH₂-D skupinou, kde D je hydroxyl alebo aminokyselina, peptid alebo uhľovodíkový alebo oligosacharidový zvyšok,

R a R¹, ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sú SO₃ alebo acetylový zvyšok, n a m, ktoré sú rovnaké alebo rozdielne, sa menia od 1 do 40, súčet n+m je v rozsahu 6 až 40, pomer m : n je v rozsahu 10 : 2 až 1 : 1, symbol znamená, že jednotky označené s m a n sú štatisticky rozmiestnené pozdĺž polysacharidového reťazca a nie sú nevyhnutné v sekvencií.

5. Derivát podľa nároku 4, ktorým je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 11200 D, indexom polydisperzity D 1,3 a stupňom desulfatácie 1,99, vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘ : COO', percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami približne 50 %.

6. Derivát podľa nároku 4, ktorým je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 12900 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 2,05, vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO‘, percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných urónových zvyškov.

7. Derivát podľa nároku 4, ktorým je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 11000 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 1,93, vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO', percentom modifikovaných urónových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných urónových zvyškov.

8. Derivát podľa nároku 4, ktorým je čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín s molekulovou hmotnosťou (MH) 9200 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 1,93, vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO, percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov.

9. Spôsob prípravy derivátov podľa nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:

a) základné spracovanie pri teplote v rozsahu od teploty okolia do 100 °C, výhodne 50 až 70 °C, a výhodnejšie pri 65 °C, ktoré vedie k eliminácii kontrolovaného percenta sulfátových skupín v polohe 2 kyseliny idurónovej a k tvorbe epoxidových skupín, a ak sa vyžaduje

b) otvorenie uvedeného epoxidového kruhu pri pH 7, pri teplote v rozsahu 50 °C až 100 °C, výhodne pri 70 °C za získania zvyškov kyseliny galakturónovej, alebo alternatívne

c) otvorenie epoxidového kruhu pri teplote v rozsahu 0 °C až 30 °C, výhodne pri 25 °C, za získania zvyškov kyseliny idurónovej, a ak sa vyžaduje

d) oxidácia diolov s jodistanom sodným za otvorenia glykozidového kruhu a tvorby dvoch aldehydových skupín na modifikovaný zvyšok,

e) redukcia uvedených aldehydových skupín na primárny alkohol a, ak sa vyžaduje, transformácia D skupiny na skupinu inú ako hydroxy, ako je v uvedené v rozdielnych významoch podľa nároku 4,

f) prípadná kyslá hydrolýza za získania oligosacharidov zodpovedajúcich pravidelným sekvenciám, alebo alternatívne

g) čiastočná enzýmová hydrolýza s enzýmom vybraným zo skupiny pozostávajúcej z lyázy, heparinázy, heparitinázy alebo ekvivalentných produktov získaných v kroku e) za získania oligosacharidov, výhodne tetraalebo oktasacharidov, s neredukujúcim koncovým zvyškom, ktorý pozostáva z nenasýtenej kyseliny idurónovej, redukujúcim zvyškom, ktorý pozostáva z N-sulfoglukózamínu a obsahuje aspoň jeden zvyšok otvorenej kyseliny idurónovej, alebo alternatívne

h) zlúčenina získaná v kroku a), alebo produkt získaný v kroku b) sa spracuje parciálnou enzýmovou hydrolýzou, a, ak sa vyžaduje,

i) podrobenie produktov získaných v jednom z krokov a), b) a e) parciálnej 6-O-desulfatácii, alebo alternatívne,

j) podrobenie východiskového heparínu čiastočne alebo úplne 6-desulfátovaného krokom a), b) a e).

10. Čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín, pripraviteľný spôsobom podľa nároku 9, kde krok a) sa uskutočňuje 45 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (ΜΗ) 11200 D, s indexom polydisperzity D 1,3, stupňom desulfatácie 1,99, vyjadrené ako SOý : COO', percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami 50 %.

11. Čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín, pripraviteľný spôsobom podľa nároku 9, kde krok a) sa uskutočňuje 15 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (MH) 12900 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 2,05, vyjadrené ako mólový pomer SOý : COO’, percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov.

12. Čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín, pripraviteľný spôsobom podľa nároku 9, kde krok a) sa uskutočňuje 30 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (MH) 11000 D, indexom polydisperzity D 1,5 a stupňom desulfatácie 1,8 (vyjadrené ako mólový pomer SO₃‘: COO), percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 5 % epoxidových skupín, 29 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov.

13. Čiastočne 2-O-desulfátovaný heparín, pripraviteľný spôsobom podľa nároku 9, kde krok a) sa uskutočňuje 60 minút pri 60 °C a krok b) pri 70 °C pri pH 7, a s molekulovou hmotnosťou (MH) 9200 D, indexom polydisperzity D 1,5, percentom modifikovaných uránových kyselín v porovnaní s celkovými uránovými kyselinami: 11 % epoxidových skupín, 27,5 % oxidovaných a redukovaných uránových zvyškov.

14. Farmaceutické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú aspoň jednu zlúčeninu podľa nárokov 1 až 8 a/alebo 10 až 13 ako účinnú zložku v zmesi s farmaceutický prijateľnými vehikulami a excipientmi.

15. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva s antiangiogénnou aktivitou.

16. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva na liečenie patologických stavov kvôli abnormálnej angiogenéze.

17. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva na liečenie nádorov, prípadne spojených s metastázami.

18. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva na liečenie diabetickej retinopatie.

19. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva na liečenie retrolentikulámej fibroplázie.

20. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13, na prípravu liečiva na liečenie psoriázy.

21. Použitie zlúčenín podľa nárokov 1 až 8 a 10 až 13 na prípravu liečiva na liečenie restenózy po angioplastike a po koronárnom by-passe.