JPH02108624A - 抗ｈｉｖ作用を有するヘパリンフラグメント及びフラクション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（［Ｖ）の複製を阻害
又は予防する医薬としての、ヘパリンフラグメント及び
フラクションの新規適用法に係る。

ヘパリン及び他のムコ多糖類（例えばデキストランＦａ
酸）はｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）に対する抗ウイルス効果を有することが知られてい
る。これらの物質はＭＴ−４及びＭｏ１ｔ−４細胞に対
するＨＩＶの細胞病原性を著しく低下させる（Ｍ！ｔｏ
他、＾ｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７　（
１９８７）、　３６１−７＞。

この型の物質はＨＩＶに対する有効な化学治療剤であり
得、従って、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）及び八
ＲＣ（＾ＩＤＳ関連症候群）の治療に使用できる。該ム
コ多糖類は細胞毒性が低い点で３゛−アジド−２°。

３′−ジデオキシチミジン（＾ＺＴ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ
（登録商標））のようなヌクレオチドよりも有利であり
、従って、＋１［Ｖ復製の選択的阻害剤として使用でき
る。しかしながら、ＨＩＶ複製の予防のためにヘパリン
及びデキストラン硫酸を使用する場合、（［酸化グリコ
サミノグリカンが）出血を引き起こす特徴及び／又は血
液凝固過程を妨害する特徴を有するという重大な欠点が
あり、このことが抗ＡＩＤＳ薬としての実用化を阻んで
いることは明らかである。

さて、より小さいヘパリンフラグメント及び低親和性ヘ
パリンは出血及び／又は抗凝血作用の危険が低いことが
知られているが、これらのフラグメントは旧Ｖ複製の阻
害剤としての活性をかなりの程度まで維持することが知
見された。これらのヘパリンフラグメントは低用量でＨ
ＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対して強い活性を示し、ＨＩ
Ｖ−２に対しては標準ヘパリンよりも著しく有効である
。

全種類のヘパリンフラグメントは分子量及び分解方法に
関係なくこの抗旧Ｖ活性を示すことが知見された。これ
らの物質の選択基準は、出血及び凝血特性によって決定
される。５０１Ｊ／Ｂ未満、好ましくは２０１１７Ｂ未
満の抗トロンビン活性を有するヘパリンフラグメント又
はヘパリンフラクションを選択するならば、出血及び抗
凝血作用の危険は低い、１υ／１ｇ未満の最小抗トロン
ビン活性を有する物質は抗旧Ｖ活性が低下せず、しかも
副作用が極めて少ないため、特に有用である。

新規生成物は高用量（４００ｚＩ？／ｉ／日）でも突然
変異誘発性及び毒性をもたないことが知見された。

ヘパリンフラクション及びフラグメントは種々の方法で
得られる。原料としては肺、膵臓、肝臓、腸、特に腸粘
膜のような開孔動物組織を使用できる。まず自己分解又
はタンパク質分解酵素（例えばブタの膵臓に由来する酵
素、又はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからのプロ
テアーゼのような細菌性酵素）により哺乳動物組織から
産物を取り出す。

次に、有機溶媒、通常はアルコールのような水混和性溶
媒（例えばメタノール）で沈降させることにより産物を
単離する。他の単離方法としては、第四脂肪族アンモニ
ウム塩基又は塩基性イオン交換体との結合を利用する方
法がある６分画沈降により産物を更に精製してもよい。

その後、例えば＾Ｔ−Ｉ１１セファロースカラム上で分
離することにより、ヘパリンを高親和性と低親和性のフ
ラクションに分離してもよい。低親和性フラクションを
そのまま使用してもよいし、又は更に分解してもよい。

高親和性フラクションを分解し、得られるフラグメント
を再び高親和性及び低親和性フラクションに分離し、低
親和性フラグメンＩ・を抗［１１Ｖ医薬として使用する
。

ヘパリンを＾Ｔ−１１上で分離せずに分解させることも
できる０分解したヘパリンフラグメントをそのまま使用
してもよいし、＾Ｔ−１セファロースカラム上で高親和
性及び低親和性フラクションに更に分離してもよい。

ヘパリンフラグメント及びフラクションの共通の特徴は
、二糖類α−Ｄ−（１→４）−グルコサミン−βロー（
１→４）−グルクロン酸及び／又はα−Ｄ−（１→４）
−グルコサミンーα−Ｌ−（１→４）−イズロン酸から
構成される反復単位のオリゴマー又はポリマーである点
である０種々のヒドロキシ及びアミン基は硫酸化できる
。アミノ基はアセチル化も可能である。

フラグメントの場合、選択される分解方法に依存して非
還元性末端単位は二重結合を含み得、及び／又は還元性
グルコサミン末端はアンヒドロマンノースに変換され得
る。

使用できる分解方法は亜硝酸塩分解、過ヨウ素酸塩分解
、γ線照射、アスコルビン酸分解、ヘパリン化学分解の
ようなヘパリン化学で既知の全方法である。

過ヨウ素酸塩で分解したヘパリン及び亜硝酸塩で分解し
た低親和性ヘパリンは望ましい治療指数を有するので特
に適当である。

過ヨウ素酸塩によるヘパリン分解は、例えばＦｒａｎｓ
ｓｏｎ及びＬｅｗｉｓ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　９７
（１）、　（１９７９）１１９）により記載されている
ような方法により実施され得る。約２５００〜６５００
　Ｄの分子量を有する過ヨウ素酸塩分解フラグメントが
好適である。

これらのヘパリンフラクション及びフラグメントの作用
は正確には解明されていないが、ヘパリンとＴリンパ球
との間に特異的相互作用が生じ、その結果としてウィル
スとリンパ球との間の結合が阻害されるものと仮定され
る。このことが、ヘパリンフラクション又はフラグメン
トの分子量及び特定の組成があまり重要でないことの理
由であろう。

ヘパリンについて一般的な方法で、フラグメント及びフ
ラクションを医薬投与形態に加工することができる。例
えば注射用として適当な水中に溶解させ、必要に応じて
医薬上許容可能な助剤（保存剤、所定の塩）をこれに加
える。臨床使用は好ましくは皮下又は静脈内（場合によ
っては周期的な）注射又は注入により実施される。デボ
−剤又は長期放出型調製物としての使用も十分可能であ
る。噴霧吸入による肺内投与又は坐剤による投与のよう
な他の投与手段も可能である。

本発明の物質は広い用量範囲で使用することができる０
通常の用量は０．１〜４００ｘｇ／ｋｇ１日であり、０
．５〜１５０Ｂ／Ａｙ／日の用量が好適である。

以下、非限定的な実施例及び試験により本発明を説明す
る。

夫１」［し ゛・・ヨウ、　塩几埋 ２ｇのヘパリンを４０ｍ１の水に溶解し、４０ｘ（ｌの
０．２ＭＮａｒｄ、溶液を加えた。混合物を遮光下に室
温でｐＨ７で６時間及び３７℃でインキュベ−１−した
。次に２１１１のエチレングリコールを加え、脱イオン
水を流して混合物を透析し、その後、凍結乾燥した。

得られた粉末１ｇを１０１１の水中に溶解させ、溶液を
５０℃に加熱した。次に４ｗ１の０．５Ｍ　ＮａＢＨ４
溶液を加え、混合物を５０℃で２時間インキュベートし
た。

次に２Ｎ酢酸により溶液のｐＨを３．４に調整した。５
分後に溶液をＩＮ　Ｎａ０１１でｐＨ７，１に中和した
。脱イオン水を流して混合物を透析し、凍結乾燥した。

分子量６４２０　（ヘパリン標準に基づ＜＋！ＰＬＣ）
。

ウロン酸含有量９０．４％（ヘパリンに基づく）。

ｐＨ５，８で０．０２５Ｍの酢酸カルシウムを含有する
０、２５Ｈ酢酸アンモニウム中にヘパリン（２％ｌ１ｌ
ｔ／ｖ）を溶解し、ヘパリン化学（５１Ｕ／ｇヘパリン
）と共に３０℃でインキュベートした。０Ｄ２３４−６
１で強塩基性アニオン交換体を混合物に加え（５ｙｌＷ
　ＭＰ５００Ａ／ｇヘパリン）、２時間吸収後にイオン
交換体を５床容Ｊｉ（ｂｅｄｖｏｌｕｍｅｓ）の５％塩
化ナトリウム溶液で溶離した。

次に５床容量の１５％塩化ナトリウム溶液で溶離し、４
倍容量の１００％メタノールで沈降させることにより主
フラクションを得た。沈降物を後処理し、真空下に乾燥
した。

分子量２５００　（ヘパリン標準に基づ＜ＩＩＰＬＣ）
。

ウロン酸含有ｉ９８．６％（ヘパリンに基づく）。

ヘパリン（０，０５ｕ＋ｔ／ｖ）をｐＨ３，０の０．１
Ｍクエン酸緩衝液中に溶解した。次に１Ｍ亜硝酸ナトリ
ウム溶液を加えた（１ｊＮ／１０肩ｇヘパリン）。

１５分後に混合物を１２．５％（ｗｔ／ｖ）のスルファ
ミン酸アンモニウム（２ｚ１／１０ｚｌ？ヘパリン）で
注意深く中和した。混合物を更に３０分間撹拌した後、
１時間放置した。溶液を濃縮し、アルカリでｐＨ７，０
±０．２に中和し、塩基性アニオン交換体＜５ｘＩＬＫ
Ｂ　ＤＥＡＥＺｅｔａｐｒｅｐ／ＩＯＢヘパリン＞−ｂ
に導入した。水で予備溶Ｍ後、３Ｍ塩化ナトリウム溶液
で溶離することにより主フラクションを得た。フラクシ
ョンを集め、３倍容量の１００％メタノールを加えるこ
とにより沈降させた。沈降物を後処理し、真空下に乾燥
した。

分子ｊｉ　４８００．４４００．３９００．３５００　
（ヘパリン標準に基づ＜ＩＩＰＬｃでの４つのピーク）
。

ウロン酸含有量９６．４％（ヘパリンに基づく）。

実施例３で得られた低分子量（ＬＭ）ヘパリンフラクシ
ョンを４℃で＾Ｔ−ｍアフィニティーカラム（１０ｘｇ
　ＬＭ−ヘパリン／１３０ｚ１＾Ｔ−Ｉ［［−Ｍ＾＾ト
シリカ）に導入した。ｐ１１７．５の０．０５Ｍ酢酸ア
ンモニウム中の、１５床容量の０．４Ｍ塩化ナトリウム
溶液で溶離することにより低親和性フラクションを得た
。

低親和性ＬＭ−ヘパリンを室温で集め、塩基性イオン交
換体上に導入した。水洗後、イオン交換体を３Ｍ塩化ナ
トリウム溶液で溶離した。集めたフラクションを３倍容
量の１００％メタノールで沈澱させた。沈降物を後処理
し、真空下に乾燥した。

分子量４４００．３９００　（ヘパリン標準に基づ＜Ｉ
ＩＰＬＣでの２つのピーク）。

ウロン酸含有量１１０．６％（ヘパリンに基づく）。

ラットの毛細血管性出血試験 麻酔したラットの陰茎背静脈経由でブラシーボ又は被験
生成物を投与した。１分後に、毛を剃った腹部から予め
形成した２本の切開部に沿って皮膚を浮かせ、皮膚弁を
形成した。傷をガーゼ包帯で覆い、皮膚弁をガーゼの上
に再び置いた。１０分後にガーゼを除去し、ガーゼに染
み混んだ血液を２０１１の水で抽出した。水中のヘモグ
ロビン濃度を分光分析により測定し、血液損失のパラメ
ーターとして使用した（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　ｌｌａｅ
ｍｏｓｔａｓ、　４２．４６６゜１９７９参照）。

例えばＰａｕｗｅ　Ｉ他（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、　２０．　（１９８８）３０９−３２１）により
記載の３’−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル
）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド（ＮＴ
Ｔ）法を用いてウィルス−誘導細胞病原性の阻害を測定
することにより、ＨＩＶ複製に対する物質の抗ウィルス
活性を決定した。この方法では、ＭＴ−４細胞を１００
０　ＣＣＩＤ、、／ｚｌのＨＩＶで感染させた。

ウィルス吸着後、感染細胞を洗って培地に懸濁させた。

ＭＴ−４細胞の数を３Ｘ１０Ｓ個／ｘｌにした。次に、
種々の濃度の被験物質を含むプラスチック微量滴定プレ
ート上にこれらの細胞を導入した。３７℃で５日間イン
キュベート後、生存細胞の数をＮＴＴ法で測定した。Ｂ
ａｂａ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　５ｃｉ
ＵＳ＾、肱、　（１９８８）、　６１３２）により記載
されているような間接免疫蛍光法及びレーザー流動細胞
フルオログラフィー（ｌａｓｅｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏ
ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、感染から１２
日０に）Ｉ［ＩＴ−７８細胞中におけるウィルス抗原発
現をモニターすることにより、化合物の抗ＨＴＶ−１活
性も測定した。

＋１１Ｖ−１及びＨＩＶ−２に対する５０％抗ウィルス
有効量（ＥＤ、、）、５０％細胞傷害！ｔ　（ｃｙｔｏ
Ｌｏｘｉｃ　ｄｏｓａｇｅ）（ＣＤ９．）並びに抗トロ
ンビン活性を下表に示す。

Ｎ、Ｔ、試験せず。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の複製を阻害又
   は予防する医薬の製造における、５０Ｕ／ｍｇ未満の抗
   トロンビン活性を有するヘパリンフラクション及びヘパ
   リンフラグメントの使用。
2. （２）ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２の複製を阻害又
   は予防する医薬の製造における、請求項１に記載のヘパ
   リンフラクション及びヘパリンフラグメントの使用。
3. （３）抗トロンビン活性が２０Ｕ／ｍｇ未満であること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のヘパリンフラクシ
   ョン及びヘパリンフラグメントの使用。
4. （４）抗トロンビン活性が１Ｕ／ｍｇ未満であることを
   特徴とする請求項１又は２に記載のヘパリンフラクショ
   ン及びヘパリンフラグメントの使用。
5. （５）分解し、さらに必要に応じて固体キャリヤーに結
   合された抗トロンビンIII（ＡＴIII）を用いて分離する
   ことにより低親和性ヘパリンフラグメントを得ることを
   特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のヘパ
   リンフラグメントの使用。
6. （６）過ヨウ素酸塩で分解することにより得る請求項５
   に記載のヘパリンフラグメントの使用。
7. （７）亜硝酸塩で分解することにより得る請求項５に記
   載のヘパリンフラグメントの使用。