JPH10506606A - 消化管損傷の処置のためのバイオポリマーの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トリプシン分解からＦＧＦ及びベータＴＧＦのファミリーの成長因子を特異的に保護し、ＨＢＧＦＰＰと呼ばれる少なくとも１種のポリマーまたはバイオポリマーの、消化管並びに内胚葉及び中胚葉の一次又は二次由来組織の損傷の処置のための医薬の製造における使用が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 消化管損傷の処置のためのバイオポリマーの使用 本発明は、ヒトまたは獣医学において、口腔前庭から肛門先端までの消化管を 襲う全ての起源の障害を処置するための薬物の調製用のポリマー又はバイオポリ マーの使用に関する。 本発明はまた、これらのポリマーを含み、そのような処置を目的とする組成物 に関する。 ＣＭＤＢＳ（カルボキシメチル、ベンジルアミン及びスルホネートで置換され たデキストラン）ポリマーの合成は、フランス特許第2461724号及び米国特許第4 740594号に記載されている。これらのポリマーのいくつかはヘパリンに類似し、 抗血液凝固および抗補体特性のために、血漿のヘパリン代替産物として使用でき る。 これらのＣＭＤＢＳポリマーのいくつかは、ＦＧＦファミリーの成長因子のイ ンビトロでの生物活性の安定化、保護及び相乗作用による作用増強からなるヘパ リンの別の性質に類似する（ターデュー(Tardieu)及び同僚、Journal of Cellul ar Physiology，1992，150，194-203頁）。 フランス特許第2 644.066は、皮膚と角膜を治癒するためにＦＧＦと会合する ある種のＣＭＤＢＳの使用を記載する。実験は、ラットに直径6mmの中空パンチ( hollow punch)で皮膚の創傷を引き起こすことにより行った。この実施例で、Ｆ ＧＦ２に会合するＣＭＤＢＳは、皮膚修復の速度及び質について明確な効果を得 ることができる。 他のバイオポリマーであるデキストラン硫酸は、日本特許第13890号で安定化 剤及び保護剤として、ＦＧＦとの併用投与が提案された。その上、デキストラン 硫酸は、皮膚治療用の軟膏及びクリーム、並びに洗眼剤組成物に広く使用されて いたが、本出願人の知る限りでは、筋肉損傷の治癒及び再生についての効果は報 告されていない。 他の薬剤であるショ糖硫酸エステルおよびそのアルミニウム塩であるスクラル ファートは、それ自身またはＦＧＦと会合して消化管の潰瘍及び障害の治療剤（ 米国特許第3,432,489）及び一連の特許（米国特許第4975281、4885281、5013557 、5164379、5196405、5240710号およびデンマーク特許第102488及び505588号） に記載された各種の医薬配合剤及び組成物として記載及び使用された製品である 。 消化管の組織は、特に成長因子が豊富であり、幾人かの著者は、腸細胞内部／ 表面でのＦＧＦ及びベータＴＧＦの存在及び／又は作用、あるいは消化管組織の 損傷でのこれらの因子の治癒作用、並びにＡＢまたはＢＢ ＰＤＧＦｓまたは肝 細胞成長因子のようなヘパリン又はヘパランに対し親和性を示す成長因子の存在 又は作用を記載する（レモワン エヌアール(Lemoine NR)；レウング エイチワイ (Leung HY)；グリック ダブリュジェイ(Gullick WJ)；Growth Factors in the G astro intestinal tract；Gut 1992，33，1297-1300頁；ディ グリエッタ エイ( Di Gulietta A)、ヘルバダ ティー(Hervada T)；ナルディ アールブイ(Nardy RV )；レシュ シーエイ(LESH CA)：Effect of platelet derived growth factor BB on indomethacin-induced gastric lesions in rats；Scand J．Gastroenterol 1992，27，673-676頁；タジャガスグ エム(Tajagasgu M)および同僚 Hepatocyt e growth factor induces mitogenic reaction to the rabbit gastric epither ial cells in primary culture；Biochem．and Biophys．Res．Comm．1993，191 ；528-534；ムストエ(Mustoe)及び同僚 Differential acceleration of healing of surgical incisions in the rabbit gastrointestinal tra ct by platelet derived growth factor and transforming growth factor beta ；Surgery 1990，108，324-330頁；カタヤマ エム(Katayama M)；カン エム(Kan M）：Heparin-binding（fibroblast）growth factors are potential autocrin e regulators of oesophageal epithelial cell proliferation，In Vitro Cell ．Dev．Biol．1991，27，533-541頁）。 このように、従来技術の状況の分析から、ポリマーは、成長因子と組み合わせ て、非常に特別なタイプの組織、すなわち皮膚組織のある種の損傷について使用 されていることが明らかである。 与えられた分子の治療効果の予測できない性質を考慮すると、これらのポリマ ーが皮膚以外の組織に効果があるかどうかは明らかでなかった。 実際、ヒト及び動物体の異なる組織は、構造的及び機能的に特別の性質を示し 、皮膚組織に関する効果が知られている分子の、消化管組織についての効果を予 測することは不可能であることは周知である。 これは、消化管組織と皮膚組織とは、異なる胚起源を有するという事実から見 ても特に正しい。 同様に、特別な実験モデルに関しインビトロで得られた結果から特別な組織に ついて、ある分子のインビ ボ活性を予測するのは不可能であるのは周知である。 この分野での他の全ての公知の医薬、例えば抗潰瘍薬は、制酸ゲルによる粘膜 の保護、胃酸分泌抑制又は抗Ｈ₂−受容体作用により作用する。 グリコサミノグリカン、メソグリカンの混合物の痔核に関する作用は、サギオ ロ(Saggioro)ら、（1985，Min．Diet．e．Gastr，31，311-315頁）により試験さ れた。この刊行物は、メソグリカンが痔核に対し非常に有効で、内視鏡所見を改 善する一方で、症状を取り除くことを示す。 しかしながら、この刊行物は非常に特別なタイプであり、その上、動物起源の 不十分に定義された変化しやすい組成を示すいくつかのポリマーのみを教示する 。 意外にも、本発明によれば、ある種のポリマーが消化管の損傷の治癒及び再生 の速度、並びにこれらの傷跡の質及び丈夫さについて、非常に顕著な効果を有す ることが見出された。 また、非常に低用量のこれらのポリマーが治療効果を有することを見出した。 本発明は、特にトリプシン分解からＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長 因子を保護し、血液凝固は有意に阻害しない、ＨＢＧＦＰＰと呼ばれる、メソグ リカンを除く少なくとも１種のポリマーまたはバイオポリマーの、消化管および 内胚葉及び中胚葉の一次及び二次由来組織の損傷を処置するための医薬品の製造 における使用に関する。 特に、そのようなポリマーは、メイレット(Maillet)ら、（Mol．Immunol，198 8，25，915-923頁）に従い測定される、ポリマーｍｇ当たり５０国際単位未満の 抗血液凝固活性を示す。有利には、該ポリマーは、インビトロでＦＧＦの薬効を 増強する。 好ましくは、該ポリマーは実質的に補体システムを活性化せず、すなわち、Ｃ Ｈ₅₀が０．５μｇを越える抗補体システムを有する(マウザック(Mauzac)ら、Bio materials，6，61-63，1985による)。 本発明によれば、ポリマーは、上記定義に対応したあらゆる天然物質、化学的 に修飾された天然物質又は全合成物質を意味するものと理解される。 従って、以下のポリマーが関与する： − デキストランから得られるが、他のタイプの基による他のタイプの置換に より修飾されたポリマー、 − デキストランに由来するもの以外であるが、オシディック(osidic)残基を 含む天然ポリマー（セルロース、キチン、フカンなど） − 非オシディックの性質のモノマーの重合により得られる修飾又は非修飾の ポリマー（ポリリンゴ酸、ポリシュウ酸、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリエチレ ングリコール）。 有利には、前記ポリマーまたはバイオポリマーは、主としてグルコース残基か ら構成される多糖である。 それはまた、グルコサミン及び／又はウロン酸残基、特にグルコサミン−ウロ ン酸二量体の形態で含んでいてもよい。 特に好ましい多糖は、置換デキストラン、グリコサミノグリカンであり、脂質 、ペプチド又はタンパク質またはこれらポリマーのサルフェートと会合してもよ い。 そのような多糖は、有利には少なくとも１０ｋＤ、有利には約４０ｋＤの分子 量を示す。 本発明は、これらのポリマーを含む医薬組成物にも関する。 該ポリマー及び／又はバイオポリマーは、天然物質から選択してもよく、該天 然物質は次いで必要に応じて適当な化学基を付加することにより修飾してもよく 、また、再度完全に合成により得てもよい。これらの天然、半合成又は全合成ポ リマーは、次いでいくつかの 成長因子、特にＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子と特異的に相互作 用する能力に基づき選択される。それらはまた、蛋白質分解(proteolytic degra dation)に対し１又は複数の該因子を保護する能力に関しても選択される。これ らのポリマーは、一般的な省略語ＨＢＧＦＰＰ（ヘパリン結合性成長因子保護剤 及び促進剤）と呼ばれるであろう。これらのポリマー又はバイオポリマーのプロ トタイプ(prototype)は、これらのポリマーの選択のプロセス及び基準と共に実 施例として与えられる。 第一のＨＢＧＦＰＰの実施例は、公知の生成物であるＣＭＤＢＳファミリーに 属し、すなわち機能化された生物特異的デキストラン(biospecific dextran)で あり、カルボキシメチル、ベンジルアミドおよびベンジルアミンスルホネートで 置換されている。これらのポリマーは、引き続いて化学的に置換される天然産物 （デキストラン）からのＨＢＧＦＰＰの取得を示す。第二の実施例は、組織抽出 物由来の精製されたプロテオグリコサミノグリカン サルフェートのような全天 然産物の選択を記載する。 これら２つの実施例は、これらＨＢＧＦＰＰのＦＧＦ及びベータＴＧＦファミ リーの成長因子と相互作用 し、安定化し、保護し及び効果を増強する能力、並びに、口腔前庭から肛門先端 までの消化管を襲う全ての起源の損傷を保護、治癒及び／又は再生する医薬組成 物におけるその使用を例示する。 この特許出願において、《処置》により、消化管の損傷の予防及び治癒のため に行われるあらゆる治療的及び予防的操作が意味され、これらの損傷は表在性で あっても深部の潰瘍タイプのものであってもよく、並びに、その起源が何であっ ても、及び／又は穿孔の治癒及び／又は外科的切除及び切開並びに吻合が、消化 管の適当な領域で行われる。 本発明の医薬又は医薬組成物は、有効量のＨＢＧＦＰＰを、例えばＣＭＤＢＳ を１又はそれ以上の併用可能な(compatible)薬学的に許容される賦形剤とともに 含む。それは、例えば胃潰瘍の処置に用いられる抗炎症剤、抗菌剤、抗カビ剤、 ゲル、プラスター(plaster)、制酸保護剤(antacid dressings)、抗Ｈ₂−受容体 剤または抗−プロトンポンプ剤、口腔または歯科保護または痔核の処置に普通に 用いられる薬剤をさらに配合してもよい。 有利には、そのような組成物は、経口経路により直接に吸収されるように設計 され、前記損傷が、特に皮 下、口腔又は直腸の損傷のように直接に接近できる場合には損傷に被覆又は注入 により吸収されるように設計され、あるいは手術中には再縫合、再接続(repatch )又は吻合の実施の前に組織の先端に被覆又は浸漬することにより吸収されるよ うに設計される。 賦形剤は、生理学的な血清又は０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳの様なバッ ファー、又は組織を刺激ないし傷害しないあらゆる他の相溶性の溶液であっても よい。当業者に公知の標準的技術に従いゲル又はエアロゾル中に濃厚溶液を提供 する製剤は、損傷のタイプ及び接近の容易さに依存して提案されてもよい。 従って、口腔アフタ(buccal aphthas)の様な直接に接近できる損傷、舌又は口 蓋円蓋(palatal vault)の損傷、あるいは歯肉又は歯あるいはのどの全ての支持 組織の損傷に関し、該組成物は、液剤、懸濁剤、噴霧剤、粉末剤、ゲル、軟膏剤 、ペースト剤またはゼラチンクリーム、歯磨き剤、歯科定着剤、歯周インプラン ト、チューインガム、飲むための発泡性錠剤又は錠剤に適用されてもよく、小さ いピペット、スパチュラ、またはブラシで適用してもよい。本発明で記載される 組成物は、損傷の治療効果を有し、これらの損傷は微生物、カビまたはウイルス 起源の熱的又は化学的な切 断または火傷の場合に引き起こされるか（但し、損傷の原因は配合する抗菌、抗 カビまたは抗ウイルス剤で処置される。）、あるいは、該損傷は必ずしも同定で きない他の起源によるか、化学療法または放射線療法により引き起こされたもの である。 同様に、直腸肛門の損傷、疾患又は刺激に関し、本発明の組成物は、組織の刺 激、かゆみ、腫脹を軽減し、直腸肛門疾患により引き起こされる苦痛を軽減し、 組織の修復及び再生を助けることによりこれらの損傷の治癒に導く処置を提供す る。直腸肛門疾患は、肛門周囲領域、肛門管(anal canal)及び直腸に関し、便秘 、下痢、妊娠、肛門感染、直腸癌、及び痔瘻および裂肛の様な極めて多様な起源 の痔核を含み、それらは化学療法や放射線治療により時々誘導される各種の原因 を有することもある。消化管の上部の通路の損傷に関し、直腸結腸の損傷は、直 接に接近され、該組成物は、液剤、懸濁剤、噴霧剤、粉末剤、ゲル、軟膏剤、ペ ースト剤またはゼラチンクリームまたは坐剤の形態で、ノズルが肛門管に導入さ れるピペット又はシリンジ、スパチュラ、ブラシまたはあらゆる他の適当な手段 を用いて投与され得る。 該組成物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により１ ９８０年５月２６日に刊行されたモノグラフ第45 35576中に非網羅的(non exhau stively)にリストされた、直腸結腸疾患の処置に通常使用される他の組成物と組 み合わせてもよい。このモノグラフは、局所麻酔剤、血管収縮薬、保護剤(prote ctors)、抗刺激剤(anti-irritants)、収れん剤、治癒剤、防腐剤、角質溶解剤(k eratolytics)及び抗コリン作動薬のようなファミリーに分類される、７５を越え る成分を記載する。 本組成物の適用により得られた結果は、痔核の処置について、１９９３年３月 ２３日に発行された米国特許第５１９６４０５号または米国特許出願第５２４０ ７０１０（ＤＫ１０２４８８及びＤＫ５０５５８８）に記載されたような、スク ラルファートに基づく組成物を含む既存の製品で得られた結果とは全く異なるオ ーダーである。創傷の表面に依存して、ＣＭＤＢＳまたはＨＢＧＦＰ産物の用量 は、１０〜２５００μｇ／ｍｌのフラクションに相当し（普通の傷の局所適用に ついて、数百マイクロリットルを越える溶液の用量は、滅多にないことを意味す る）、この用量は２４時間当たり１回または２回適用される。使用されたスクラ ルファート組成物は、０．０１〜５％（米国特許５１９６４０５による）であり 、換言すれば本発明で記載さ れた用量の少なくとも１０倍であり、前記米国特許５１９６４０５の全ての実施 例に記載された効果は、組成物１ml当たり５０ミリグラムから得られている。 局所経路により容易に接近できない消化管損傷について、該組成物の投与経路 は経口または直腸である。このＨＢＧＦＰに基づく組成物は、咽頭、胃、食道、 十二指腸、小腸、及び結腸の損傷の治療に有効である。本発明に関するＨＢＧＦ Ｐに基づく組成物により有利に治療される損傷の非網羅的な例として、胃酸のよ うな潰瘍を誘発する消化管の部分の粘膜損傷または十二指腸潰瘍、薬物により、 偶然に吸収された化学製品により、または放射線の処置により誘導された損傷、 ストレスまたは食物により誘発され、あるいは外科手術または外傷起源の損傷、 ウイルス損傷または出血性直腸結腸炎またはクローン病のような炎症に関連する 損傷などが言及される。 消化管組織の修復の刺激作用は、例えば肝臓、膵臓、唾液腺、腺性下垂体また は咽頭などの腺関連組織(glandular derivatives)、気管、肺、胸膜のような呼 吸関連組織(respiratory derivatives)などの他の内胚葉及び中胚葉の一次また は二次誘導組織についても見られるかもしれない。 従って、ＨＢＧＰＰｓは、これら他の内胚葉及び中胚葉の一次または二次誘導 組織を襲う全ての起源の損傷（手術又は腫瘍または他の病理により誘発される外 傷性損傷）の修復において推薦されるかもしれない。 本発明は以下の実施例で非制限的に示されるであろう： 図１は、ＣＭＤＢＳの式を示す。 図２は、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドによるＦＧＦ１（２Ａ）及 びＦＧＦ２（２Ｂ）の生物活性の相乗効果を示す。生物活性はＣＣＬ３９細胞に ついてトリチウム化されたチミジンの取り込みの増加を、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２ のみか、またはヘパリン２０μｇ、メソグリカン１０μｇまたはスロデキシド１ ０μｇの存在下に加えて測定することにより測定される。 図３及び図４は、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドの、ＦＧＦ１（３ ）及びＦＧＦ２（４）の熱分解に対する保護効果を示す。ＦＧＦサンプルは、そ れのみで、またはヘパリン２０μｇ、メソグリカン１０μｇまたはスロデキシド １０μｇの存在下に２０℃（ａ）及び３７℃（ｂ）で１、７、１５、３０日間イ ンキュベートする。横軸に示される生物活性の測定は、 ＣＣＬ３９細胞中へのトリチウム化されたチミジンの取り込みの刺激単位値（Ｅ Ｄ₅₀）に相当する。 図５Ａは、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドの¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ１の蛋 白質分解に対する保護効果を示す。蛋白質分解は、３７℃で実施され、サンプル は１８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離された。ゲルは、乾燥され及び オートラジオグラフ処理された。第一のトラックは¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ１のみを含む 。¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ１は、トリプシン（トラック２）、ヘパリン（トラック３）、 メソグリカン（トラック４）またはスロデキシド（トラック５）の存在下でイン キュベートされる。 図５Ｂは、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドの¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ２の蛋 白質分解に対する保護効果を示す。トラックの順序は、図５ａの¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ １で示されたものと同一である。 図６Ａ及び６Ｂは、ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム溶出プロファイルであり 、各々カラムの較正のためのコンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）フラクションの存在 下でのＨＳＭフラクション（図６Ａ）及びＨＳＳフラクション（図６Ｂ）である 。実施例１ ＣＭＤＢＳの調製及び選択 ａ）ＣＭＤＢＳの調製 ＣＭＤＢＳは、カルボキシメチル、ベンジルアミド及びベンジルアミドスルホ ナート基により置換されたデキストランである。ＣＭＤＢＳの合成法は、エム． マウザック(M．Mauzac)及びジェイ．ジョセフォンビクツ(J．Josefonvicz)in Bi omaterials 1984，5，301-304頁により記載された方法でもよい。 この方法によると、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）は、いくつかの グリコシル化ユニットを炭素５位及び６位についてカルボキシル基で置換するこ とによりデキストランから調製される。 次の段階で、ベンジルアミドがカルボキシル基と結合され、カルボキシメチル −ベンジルアミドデキストラン（またはＣＭＢＤ）を形成する。最後に、ベンジ ルアミドのいくつかの芳香族核がスルホン化されてカルボキシメチルデキストラ ン・ベンジルアミド・スルホナートまたはＣＭＤＢＳを得る。これら誘導体のナ トリウム塩は、限外濾過し、凍結乾燥し、そして使用前に適当な緩衝液に溶解さ れる。 ＣＭＤＢＳの一般式は、図１に示される。 ＣＭＤＢＳは、各種置換基の統計的分布を有する。 各ＣＭＤＢＳのタイプの割合は、標準的方法を用いて測定される。 ｂ）ＣＭＤＢＳの選択 ｉ：ＦＧＦの保護及び安定化試験 ＣＭＤＢＳの合成中での各基の置換割合は、置換反応条件を調節することによ り制御できる。温度、反応時間、成分の相対濃度、置換反応の数などのパラメー タを制御すれば、非常に多数の置換ポリマーを得ることができる。５位及び６位 の炭素上のカルボキシメチルによる水酸基の置換は、０〜２００％（５位及び６ 位の炭素各々について１００％）のカルボキシメチル化の割合を与える。カルボ キシメチル基は、次にベンジルアミドを固定するために部分的または全体的に使 用することができる。ベンジルアミド基は、スルホン化のために部分的または全 体的に使用することができる。機能化され、置換された本発明で使用するデキス トランは、特にフランス特許第２．４６１．７２４号に詳細に記載されたものの 中にある。ＦＧＦファミリーの成長因子を安定化及び保護する能力に加えて、タ ーデュー(Tardieu)及び同僚の刊行物、J．Cell．Physio．1992，150，194-203頁 及びフランス特許第2.461.724号中に記載されるように、選択されたＣＭＤＢＳ は、 以下に記載する評価方法に従いベータＴＧＦファミリーに属する成長因子ファミ リーの少なくとも１種と相互作用し、蛋白質分解に対しベータＴＧＦを保護でき なければならない。 ｉｉ．ＣＭＤＢＳとベータＴＧＦファミリー成長因の間の相互作用能力の評価 ある種のＣＭＤＢＳがベータＴＧＦファミリーのメンバーと相互作用し、この 相互作用によりベータＴＧＦを保護する能力を測定するために、等級付け試験を 工夫した。この試験は、選択されたＣＭＤＢＳが、ベータＴＧＦがプロテアーゼ 処理にもかかわらずその生物活性を維持することを可能にする能力を測定するこ とにある。 以下の実施例で、使用されたＣＭＤＢＳは、カルボキシメチル単位１１０％、 ベンジルアミド単位３．６％およびスルホナート単位３６．５％の置換割合で定 義されるバッチ２６．２であり、４IU/mg（国際単位）の抗血液凝固活性を有す る。このバッチの抗−補体活性は、マウザック(Mauzac)ら（既に引用された）に 従い１．１μｇのＣＨ₅₀と測定される。 コントロールとして使用されたヘパリンは、サノフィ カンパニー(Sanofi co mpany)(チョアイ インステ ィテュート(Choay Institute))により供給され、１７５IU/mgの抗血液凝固活性 を示す。 ベータ１ＴＧＦは、多数の刊行物に記載されたプロトコルに従い、ヒト血小板 から調製され（例えば、Growth Factors and their receptors，1992，vol 1，4 19-472頁，エイ．ロバーツ(A．Roberts)及びエム．スポーン(M．Sporn)により記 述され、エイ．ロバーツ(A．Roberts)及びエム．スポーン(M．Sporn)により編集 され、スプリング・フェアラーク・ベルリン(Spring Verlag Berlin)により刊行 される）および当業者により普通に使用される。この実施例で使用されるベータ ＴＧＦ生物活性試験は、ＣＣＬ６４細胞（アメリカン・テッシュー・カルチャー ・コレクション(American Tissue Culture Collection)由来）の阻害試験である 。この阻害は、ファン ゾレン(Van Zolen)、Progress in Growth Factor Resear ch，1990，2，131-152頁により記載されたプロトコルに従い、ＦＧＦまたはウシ 胎児血清により刺激されたＣＣＬ６４細胞への用量依存的なトリチウム化チミジ ンの取り込みをベータＴＧＦが阻害する能力により測定される。ベータＴＧＦの ２つの用量は、一方がトリチウム化チミジンの取り込みの５０％阻害能（活性単 位を阻害するもの として定義される）に相当し、他方は１００％阻害能に相当する。この実施例で は、得られた値は、１ｍｌの培養培地中で培養されたＣＣＬ６４細胞について２ ５０ｐｇのＴＧＦである。 ０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ・カンパニー、セントルイス、米国から 入手）を含むリン酸緩衝生理食塩水中、ベータＴＧＦ５０ｎｇのサンプルを、そ れだけでインキュベートするか、あるいは５０００μｇのＣＭＤＢＳまたは５０ ００μｇのヘパリンとともに、５００μｇのトリプシンの存在下または非存在下 でインキュベートする。インキュベートされた溶液の最終容量は、１ｍｌに調整 され、インキュベーションは３７℃で時間を変えながら（記載された実施例で１ ０分間（表１））行われる。 ２０μｌの容量のサンプルを各インキュベーション反応から取り、イー．ゾレ ン(E．Zohlen)により記載された前記プロトコルに従い各ウエルが１ｍｌの培養 培地を含む２４ウエルプレートで培養されたＣＣＬ６４細胞に加える。これらの 条件で、ウエル当たりのベータＴＧＦの最終濃度は１ng/mlである。表１は、各 種条件で得られた結果を要約し、ＣＭＤＢＳの保護効果を示す。従って、３７℃ で１０分間のインキュベーショ ンの後、ベータＴＧＦの生物活性の７５％がさらに存在し、一方ヘパリンではベ ータＴＧＦに固定できるとの事実にもかかわらず（マク キャフリー(Mac Caffre y)ら、J of Cell．Physiology，1992，vol 52，430-440頁）、ベータＴＧＦをこ の蛋白質分解から保護しない（２０％未満の生物活性が残存する）。ＦＧＦの場 合、ヘパリンはトリプシンにより誘起される蛋白分解に対し保護を提供すること を思い出すべきである（ターデュー(Tardieu)ら、Journal of Cellular Physiol ogy，1992，150，194-203頁）。 ＣＭＤＢＳは、トリプシンの活性について阻害力を有しないことが証明された （表２）。従って、１０μｇのトリプシンは、基質（Ｓ．８７ セルビオ カン パニー(Serbio company)、パリにより供給され、供給者の推薦に従い使用された ）またはこの基質及びソーヤ(soya)（シグマからの大豆トリプシンインヒビター またはＳＴＩなど）に由来するようなトリプシンインヒビターとインキュベート され、これらのインキュベーションは各種量のＣＭＤＢＳ（バッチ ＡＭ２６） の存在下または非存在下で実施された。トリプシンの酵素活性は、インキュベー ション時間に対する分光光度計でのＳ８７のトランスフォーメーション産物の吸 収により測定された。実施例２ 他のＨＢＧＦＰＰの選択 プロテオグリコサミノグリカン及びグリコサミノグリカン、スロデキシド、の 商業的調製物は、ＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子と相互作用する 能力に従い選択された。 メソグリカン及びスロデキシドの分画により得られたヘパラン硫酸の調製物も 試験された。 メソグリカン及びスロデキシドは、シグマ・ケミカル・カンパニー、セントル イス・ミズーリ、米国により供給された。その性質は、表３に要約される。 この実施例で使用された細胞は、アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレ クションからのＣＣＬ３９細胞である。培養及びＦＧＦ生物活性の測定試験に関 する条件は、Journal of Cellular Physiology，1992中タルディウ(Tardieu)及 び同僚による刊行物に記載された条件と同じである。使用されたＦＧＦ成長因子 は、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２組換体である。 ａ）インビトロでのＦＧＦの生物活性についてのスロデキシドの効果 これらの実験では、最大刺激を誘発する用量の５０ ％の生物活性の刺激を誘発するために、ＦＧＦ１または２は、有効量（ＥＤ₅₀と して示される）に相当する量を使用する。生物活性は、既述のタルディウ(Tardi eu)及び同僚による刊行物及びフランス特許第２６４４０６６号のような多数の 文献に詳細に記載されたプロトコルに従い、細胞中のトリチウム化チミジンの取 り込み増加を誘発する能力により測定される。 この実施例では、ＥＤ₅₀は、ＦＧＦ１で５ng/ml、ＦＧＦ２で３ng/mlであり、 これらの値は実験的に測定される（図２Ａ及び２Ｂ）。ＦＧＦ用量の関数である 同一の刺激実験が、１０μｇ／ｍｌのスロデキシド、または２０μｇ／ｍｌのヘ パリンの存在下で行われる。図２はこれらの条件でスロデキシドまたはヘパリン のこれらの用量の存在下で、ＥＤ₅₀がＦＧＦ１及びＦＧＦ２について各々０．４ ng/mlおよび０．２ng/mlになることを示す。ＦＧＦの生物活性を増強するこの能 力に加えて、ＨＢＧＦＰＰは熱分解及びトリプシンの蛋白分解作用により誘発さ れる不活性化に対しＦＧＦを保護する（図４及び図５）。同様に、これらのＨＢ ＧＦＰＰはトリプシンの蛋白分解活性により誘発される不活性化に対しＦＧＦ１ 及び２を保護する（図５Ａおよび５Ｂ）。 ｂ）ベータＴＧＦに関するスロデキシド、デキストラン、デキストラン硫酸及び スクラーゼ(sucrase)の保護効果 いくつかの他の化合物が評価された：デキストラン硫酸（シグマケミカル、分 子量４００００、このデキストランはＣＭＤＢＳ（同様にシグマ由来）の合成に 使用された）、スクラーゼまたはスクロース・オクタサルフェート（ディー．バ ール・シャロム(D．Bar Shalom)、ブク・メディク・カンパニー・デンマーク(Bu kh Medic company，Denmark)。これらの化合物のいくつか、たとえばスクラーゼ （米国特許第５２０２３１１号参照）またはデキストラン硫酸（日本特許１３８ ９０７／８８）は、それらがＦＧＦを保護し安定化するため選択された。デキス トランはＣＭＤＢＳ ＡＭ２６の合成に使用されるものである。 ベータＴＧＦ生物活性の保護実験は、実施例１ ｉｉで記載されたＣＭＤＢＳ についてと同じ方法で行われた。インキュベーション混合物は、５０ｎｇのベー タＴＧＦ（０．１％ウシ血清アルブミン中）及びトリプシン（５００μｇ）を含 んでいた。メソグリカンまたはスロデキシド又はデキストラン硫酸またはデキス トランまたはスクラーゼは、５０００μｇの用量で使 用される。 ベータＴＧＦの生物活性は、５０倍希釈後ＣＣＬ６４細胞を用いることにより 上記のように測定される。 結果を表４に示す。 これらの結果は、ＦＧＦおよびベータＴＧＦに関する２つの選択基準に応答す ることができるある種のＣＭＤＢＳのように、スロデキシドは、ベータＴＧＦに ついて有意な保護活性を示す。 ｃ）スロデキシド及びメソグリカンのヘパリン硫酸フラクションの単離 スロデキシド及びメソグリカンは、実質的に各種のグリコサミノグリカン（Ｇ ＡＧ）からなるいくつかの物質の混合物に相当する。 最初の精製段階により、これら２つの製品の乾燥品１ｇ当たり全ＧＡＧがメソ グリカンでは８７４ｍｇおよびスロデキシドでは７９５ｍｇ、各々含まれている ことが確認された。 この精製は、これらの溶解した製品をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡ Ｅ−トリスアクリル(Trisacryl)にかけ、全ての蛋白性の不純物を除去すること で得られた。全ＧＡＧは、次いでＤＥＡＥゲルを、1.5M NaClを含む酢酸ナトリ ウム溶液、ｐＨ４で溶出して精 製した。 大量の水に対する透析工程の後、各々６０mgのＧＡＧ製品をＡＢＣコンドロイ チナーゼ（ＧＡＧ１mgあたり１単位）により３７℃で終夜消化した。この酵素は 、全てのＧＡＧをヘパラン硫酸（ＨＳ）を除いて分解する。消化産物は、分子ふ るいクロマトグラフィー（Ｇ５０セファデックス、１．８×９５ｃｍカラム）に かけられた。次いで溶出は、１８ml／時間の割合で炭酸水素アンモニウム緩衝液 で行われた。ＨＳ−タイプＧＡＧに相当する非消化物質は、カラムの溶出死容積 中に集められた。 ＧＡＧ濃度が、カルバゾール法（ビター ティー．(Bitter T.)及びムアー エイチ．エム．(Muir H.M.)，1962，Anal．Biochem 4，330-334頁）を用いてウ ロン酸含量から計算された。 これらの測定から、各製品について以下の組成が得られた： これら２つの製品の各ＨＳ分画は、再度ＤＥＡＥ ト リスアクリルゲル上のクロマトグラフにかけた。各ＨＳ分画１mgは、メソグリカ ン（図６Ａ）及びスロデキシド（図６Ｂ）３ml中に精製され、0.05M NaCl、0.05 M Tris-HCl 緩衝液 pH7.5を用いて平衡化したカラムに付着させた。１０倍量の 同じ緩衝液でカラムを洗浄後、１０倍量の0.05M NaCl、0.05M 酢酸ナトリウム緩 衝液ｐＨ４で洗浄し、カラムに固定された物質を同じ酢酸緩衝液中０．０５Ｍか ら１．５Ｍ ＮａＣｌの塩グラジエントにより脱着させた。１ｍｌの各分画を集 め、カルバゾール法で測定した。 もとの各製品のＨＳ成分に相当する物質は、ほぼ同じ溶出プロフィール、従っ てほぼ同一の見かけの負荷(load)を示す。この最大の溶出ピークは、塩濃度が０ ．９４Ｍ ＮａＣｌで得られる。コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）の定義された分 画は、クロマトグラフィーの較正のため同じプロトコルにかけた。このＣＳＡ分 画は、ジサッカライドに１個のみの硫酸基を含み、０．７２Ｍ ＮａＣｌのイオ ン強度で溶出される。 これらの結果は、ＨＳ分画が対照のＣＳＡよりも多くの硫酸基を含むことを示 す。ＨＳ分画は、二糖単位当たり約２個の硫酸基を示す。 これらの分画は、ベータＴＧＦ及びＦＧＦに関する 保護力を各原料で確認された保護力と比較して明らかにするために試験された。各種ポリマーによるＦＧＦの保護効果の半定量的評価 上記のように、一定量の放射性ＦＧＦが種々の条件下でインキュベートされる 。反応生成物のオートラジオグラフィーの後、放射性ＦＧＦの非分解量を濃度計 により定量する。値は、反応の初めに付着した量と比較して見出された放射標識 されたＦＧＦの割合に相当する（表５）。 表４及び５の結果は、ＨＳＭ及びＨＳＳ分画は、メソグリカン及びスロデキシ ドに各々由来し、２つの組成物よりも大きく、１００％に近い保護効果を発現す ることを示す。実施例３ 白血球エラスターゼ及びプラスミンの活性に関するＣＭＤＢＳ及びグリコサミノ グリカンのインビトロ阻害効果 各種ＣＭＤＢＳおよびその合成中間化合物の阻害力が、白血球エラスターゼ及 びプラスミンについて確認された。精製した白血球エラスターゼをエラスチン・ プロダクツ・カンパニー(Elastin Products Co)(オーウェンビル、ミズーリ、米 国(Owenville，MO，USA)か ら入手し、プラスミンをシグマから入手した。 これらの各種化合物による酵素活性の阻害は、３７℃の恒温槽中で行われる。 考慮される酵素は、エラスターゼはｐＨ８の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝 液の溶液中に置かれ、プラスミンは０．０２％アジ化ナトリウム及び０．０１％ トリトン(Triton)Ｘ１００の存在下にｐＨ７．４の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ緩衝液の溶液中に置かれる。基質及び酵素濃度は、８．３ｎＭのエラスターゼ では０．１０ｍＭ MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(パラニトロアニリド)、並びに７７ｎＭ のプラスミンでは０．２０ｍＭ dVal-Leu-dLys-pNAである。ＩＣ₅₀は、各条件で 測定される。 表６は、得られた結果を示し、バッチＡＭ６は４００００ｋＤのＴ４０デキス トランに相当する。バッチＥＭ５は１００００ｋＤのＴ１０デキストランに相当 する。合成の中間体生成物は、各置換反応の数(number)を特定したインデックス 番号で与えられるシンボルにより同定される。 ＩＣ₅₀値は、ＣＭＤＢＳが、この活性の最良の阻害剤の１つである（Ｋｉが１ ｎＭのオーダー）ヘパリンに匹敵する白血球エラスターゼ活性に対する非競合的 双曲線タイプの阻害効果を有することを示す。加えて、 ヘパリンとは異なり、ＣＭＤＢＳはプラスミンについて阻害効果を示す。 表６は、ＨＳＭ及びＨＳＳ分画の阻害効果が、各々メソグリカン及びスロデキ シドの阻害効果より大きいことも示す。実施例４ ＣＭＤＢＳの結腸吻合についての治癒効果 この実施例で用いられたＣＭＤＢＳのバッチは、実施例１に記載されたもので ある。溶液ｍｌ当たり５０μｇのＣＭＤＢＳが生理学的血清中で製造される。雄 ウイスターラット(Wi/Wi，Ico，Iffa Credo France)、体重２５０〜３００ｇを フェノバルビタールナトリウムで麻酔した。臍下正中線開腹術(subumbilical mi dline laparotomy)を１．５ｃｍにわたり行う。直腸結腸接合部(rectocolic jun ction)を区別し、折り込みメスで切断する。吻合術の２つの盛り上がり部(bank) にＣＭＤＢＳまたは生理学的緩衝液を含む溶液を２分間吸収させる。吻合術は直 径６／０のポリグラクチン９１０糸で５針縫うことで、平面中末端−末端様式で 行われる。結び目は、６ループからなる。壁の閉鎖は、２つの平面で行われる。 ラットは７匹の２つの群に分割される。実験は、二重盲検(double blind)で 行われる。サンプルは手術後の２日目、４日目及び７日目に摂取される。治癒の 質は、吻合術の破断圧力を水銀のミリメーターで測定することにより研究する。 結腸は吻合の両側２ｃｍのところを切断し、一方の端部は低いが一定の速度で水 を注入する自己押出シリンジ(self-pushing syringe)に接続し、他方の端部は、 マノメーターに連結する。圧力は連続的に巻紙に記録する。破断圧力を分析し記 録することにより決定する。得られた値は以下の表７に示される。 結果：第２日（手術後４８時間）に、ＣＭＤＢＳ処置とともに及びＣＭＤＢＳ 処置なしに、実現される吻合破断力の間で、約３倍の非常に大きな相違が測定さ れる。この平均(mean)は、統計的に有意（ｐ≦０．０５）である。第４日目にこ の相違はずっと小さく、ＣＭＤＢＳで処置された動物の方が約１０％増大した抵 抗性に相当する。第７日に、処置及び未処置の抵抗性の間に何らの相違もない。 ＣＭＤＢＳ処置の利益は、それが大きく改良された吻合術の固さ(solidity)を非 常に重要な瞬間、すなわち治癒のまさに初期に提供し、吻合破断のリスクは最初 の数日に常に起こることから、明瞭に見られる。実施例５ 酢酸により誘発された結腸炎についてのＣＭＤＢＳの治癒効果 ６匹の体重約２００ｇのSprague Dawley雄ラットの群が試験前２４時間、水は 許される断食(hydric fasting)に置かれる。試験の日に動物を腹腔内経路により ペントバルビタール(30mg/kg)で麻酔する。開腹術の後、盲腸から２cmで、５％ 酢酸２mlの結腸点滴を行う。酢酸は１０秒間接触したままとし、次に結腸は３ｍ ｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７ですすぐ。次いで創傷を閉じる。動 物は頸部の伸張により７２時間後に犠牲にする。結腸の変化は以下のスケールで 表す ０：正常な結腸 １：うっ血 ２：粘膜表面の壊死 ４：浮腫を伴う粘膜の大部分の壊死 ５：穿孔処置 ６匹のラットの第一コントロール群は、処置を受けていない。 第二群は、ＣＭＤＢＳ（バッチＡＭ２６）の水溶液５０μｇを、３日間朝夕経 口投与により受ける。 第三群は、スクラルファート(ウルカーの名称で販 売される(ULCAR)ファーマシューティカル・ラボラトリーズ・ファブレ(Pharmace utical Laboratories Fabre))を受ける。提供者の推薦用量を３日間、１日２回 経口投与して使用する(500mg/kg、すなわち、ラット当たり100mg)。統計的分析 平均及び標準誤差は、各バッチの動物について計算された。統計的な比較は、 コントロールと比較するホワイト非パラメータ試験(White's non parametric te st)を用いて行う。 結果は、以下の表８に示す。 これらの結果が示すように、ＣＭＤＢＳは酢酸により誘発された結腸の損傷の 重傷度を約７５％低減する（有意な効果、ｐ≦０．０５）。一方、スクラルファ ートはこれらの潰瘍の治癒に有意な効果を持たない。実施例７ ＨＢＧＰＰに基づく組成物 実施例５及び６で記載されるように、ＣＭＤＢＳは緩衝生理食塩水溶液（ＰＢ Ｓ緩衝液）または５０μｇ／ｍｌの濃度の生理学的血清である。投与は局所また は経口である。それは静注でもよい。他の組成物は、損傷部位に達するＣＭＤＢ Ｓの用量が１μｇ〜１００ ０μｇになる限り提案できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 37/22

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． トリプシン分解からＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子を特異 的に保護し、血液凝固を有意に阻害しない、メソグリカンを除くＨＢＧＦＰＰと 呼ばれる少なくとも１種のポリマーまたは１種のバイオポリマーの、消化管並び に内胚葉及び中胚葉の一次又は二次由来組織の損傷の処置のための医薬の製造に おける使用。 ２． ポリマーまたはバイオポリマーが、ポリマーｍｇ当たり５０国際単位未満 の抗凝血活性を示すことを特徴とする請求項１記載の使用。 ３． 前記ポリマーが実質的に補体システムを活性化しないことを特徴とする請 求項１及び２のいずれかに記載の使用。 ４． 前記ポリマーがインビトロでＦＧＦの効果を増強することを特徴とする請 求項１〜３のいずれかに記載の使用。 ５． 前記ポリマーがエラスターゼ及び／又はプラスミンのプロテアーゼ活性を 実質的に阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の使用。 ６． 前記ポリマーまたはバイオポリマーが多糖であることを特徴とする請求項 １〜５のいずれかに記載の 使用。 ７． 前記多糖が主としてグルコース残基から構成されることを特徴とする請求 項６記載の使用。 ８． 前記多糖がグルコサミン及び／又はウロン酸残基を含むことを特徴とする 請求項６記載の使用。 ９． 前記多糖がグルコサミン−ウロン酸ダイマーを含むことを特徴とする請求 項８記載の使用。 １０． 前記多糖がグリコサミノグリカン、またはこれら化合物の１つのサルフ ェートであって、脂質、ペプチド又はプロチドと組み合わせてもよいことを特徴 とする請求項８及び９のいずれかに記載の使用。 １１． 前記多糖が置換デキストランであることを特徴とする請求項１〜６のい ずれかに記載の使用。 １２． 前記多糖がＣＭＤＢＳであることを特徴とする請求項１１記載の使用。 １３． 前記ポリマーが非オシディック性(non-osidic nature)であることを特 徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の使用。 １４． 請求項１〜１３に記載されたような少なくとも１種のポリマーを薬理学 的に許容される少なくとも１種の賦形剤と組み合わせて含む消化管並びに内胚葉 及び中胚葉の一次又は二次由来組織の損傷の処置のた めの医薬組成物。 １５． 組成物ｍｌ当たり約１０μｇ〜２５００μｇのポリマーまたはバイオポ リマーを含むことを特徴とする請求項１４記載の組成物。