JPH10503472A - 筋肉処置のためのバイオポリマーの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 筋肉組織の処置用薬剤の製造のための、特に、トリプシン分解からＦＧＦ及びベータＴＧＦのファミリーの成長因子を保護することができる、ＨＢＧＦＰＰとして知られる少なくとも１種のポリマー又はバイオポリマーの使用が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 筋肉処置のためのバイオポリマーの使用 本発明は、ヒトもしくは獣医学における、骨格筋又は心筋を襲うあらゆる起源 の損傷を処置する薬物の調製のためのポリマー又はバイオポリマーの使用、及び この処置のための医薬組成物に関する。 ＣＭＤＢＳポリマー（カルボキシメチル、ベンジルアミン及びスルホネートに より置換されたデキストラン）の合成は、フランス国特許第２４６１７２４号及 び米国特許第４ ７４０ ５９４号に記載されている。これらポリマーのあるも のはヘパリンに良く似ており、その抗凝血性及び抗補体性ゆえに、血漿ヘパリン 置換産物として用いられるかもしれない。 これらＣＭＤＢＳポリマーのあるものは、ＦＧＦファミリーの成長因子のイン ビトロ生物学的活性の安定化、保護及び相乗作用からなるヘパリンのもう一つの 性質と良く似ている〔タルデュー(Tardieu)及び共同研究者、ジャーナル・オブ ・セルラー・フィジオロジー(Journal of Cellular Physiology)、1992、150、 第194〜203頁〕。 フランス国特許第２ ６４４．０６６号には、皮膚及び角膜の治癒のためにＦ ＧＦと会合してある種のＣＭＤ ＢＳを使用することが記載されている。実験は、ラットに直径６ｍｍの陥凹パン チ(hollow punch)の助けを借りて、皮膚の創傷を引き起こすことにより行われて いる。この例で、ＦＧＦ２と会合したＣＭＤＢＳは、皮膚回復の早さと質に関し て確かな効果の獲得を可能とする。 もう一つのバイオポリマーであるデキストラン硫酸は、日本特許第１３８９０ 号において、ＦＧＦと会合して安定化剤及び保護剤として提唱されている。さら に、デキストラン硫酸は、洗眼薬組成物においてばかりでなく、皮膚治癒の軟膏 剤およびクリーム剤において広く使用されているが、出願人の知る限りでは、筋 肉損傷の治癒及び再生に関する効果については報告されていない。 もう一つ別の作用薬である蔗糖硫酸エステル及びそのアルミニウム塩であるス クラルファート(sucralfate)は、それ自体もしくはＦＧＦと会合して、消化管の 潰瘍及び損傷を処置する際の薬剤として記載され、かつ使用されている産物であ る（米国特許第３．４３２．４８９号、及び米国特許第５．２０２．３１１号） 。 骨格及び／又は心臓の筋肉組織は成長因子が特に豊富であり、多くの著者が、 骨格又は心臓の筋肉からのそれらの抽出〔例えば、モロー(Morrow)及びその共同 研究者、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーショ ン(J．Clin．Invest.)、1990、85、第1816-1820頁；パドゥア・アール.(Padua R .)及びイー.カルダミ(E．Kardami)、グロース・ファクター(Growth Factor)、19 93、8、第291-306頁；パーカー・ティ.(Parker T.)及びシェインダー・エム.(Sc heinder M.)、アニュアル・レビュー・オブ・フィジオロジー(Annu．Rev．Physi ol.)、1991、53、第179-200頁；キャッセルズ・ダブリュ(Casscells W)及び共同 研究者、アナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシー ズ(Ann．N.Y．Acad．Sci.)、1990、593、第148-161頁〕に加えて、筋原細胞中及 びその表面にＦＧＦ及びベータＴＧＦが存在すること及び／又はその作用につい て記載している〔例えば、デー.ゴスポダロヴィッチ(D．Gospodarowicz)及びチ ェング(Cheng)、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオ ロジー(In Vitro Cellular and Developmental Biology)、1987 23 (7)、第507 −514頁；グロークス−ムシャテリー・ビー.(Groux-Muscatelli B.)、バッサグ リア・ワイ(Bassaglia Y)、バリタウルト・デー．(Barritault D.)、カルエレ・ ジェイ．ピー．（Caruelle J.P.）及びゴウトロン・ジェイ.(Gautron J.)、デベ ロップメンタル・バイオロジー(Dev．Biol.)、1990、142、第380-385頁；ジョン ソン・エス.(Johnson S.)及びアレ ン・アール.(Allen R.)、イクスペリメンタル・セル・リサーチ(Exp．Cell Res. )、1990、187、第250-254頁；デイトン・ダブリュ.(Dayton W.)及びハザウェイ ・エム．(Hathaway M.)、ポルト・サイエンス(Poult Sci)、1991、70、第1815-1 822頁〕。 虚血発生によってもたらされた心筋損傷におけるＦＧＦの治癒作用が記載され ている（ヤナギサワ−ミワ(Yanagisawa-Miwa)及び共同研究者、サイエンス 199 2、257、第1401-1403頁）。 フランコ(Franco)(米国特許第４．３７８．３４７号)はまた、特に心臓虚血の 治療におけるＦＧＦの使用について記述している。この特許に記載のある製剤の 賦形剤として、デキストランビーズが使用されている。 その組成物の活性は、非常に明らかにＦＧＦに起因している。 そのため、先行技術の分析から、既にポリマーが成長因子と組み合わせて使用 されることが明らかである。 しかしながら、上に引用した文献のポリマーはいずれも、それ自身で、つまり 成長因子と組み合わせることなしに効果を示してはいない。 さらに、ポリマー−因子会合物の活性は、特定の組織タイプ、即ち皮膚組織の 特定の損傷に関してのみ記載さ れている。 与えられた分子の治療効果の非予測性ゆえに、これらのポリマーが皮膚組織以 外の組織に効果があるかどうかは明らかでない。 事実、ヒトもしくは動物体の異なる組織は、構造的及び機能的に特有の性質を 示し、それが、皮膚組織に対して効果があると知られている分子の筋肉組織の場 合における効果の予測を不可能にしていることが良く知られている。 これは、構造及び起源（中胚葉の）の両面からみて、筋肉組織が表皮及び角膜 組織とは非常に異なっているという事実から、特に真実である。 同様に、特殊な実験モデル上においてインビトロで得られた結果から特定組織 上の分子のインビトロ活性を予測することは不可能であることが良く知られてい る。 驚くべきことに、本発明によると、あるポリマーが、骨格筋及び／又は心筋組 織の損傷の治癒及び再生の速さ、及びこの治癒及び／又は再生の質に対して、非 常に著しい効果を持っていることが分かったので、この速さは、組織学的及び生 理学的な方法を用いて筋繊維の成熟の度合いを研究することにより測定されるか もしれない。 本発明は、筋肉組織の処置のための医薬の製造におい て、特にＦＧＦ及びベータＴＧＦのファミリーである成長因子をトリプシン分解 から保護し且つ凝血を有意には阻害しない、ＨＢＧＦＰＰと呼ばれる少なくとも 一つのポリマーもしくはバイオポリマーの使用に関する。 特に、マイレット(Maillet)ら〔モレキュラー・イムノロジー(Mol．Immunol) 、1988、25、第915-923頁〕によると、そのようなポリマーは、測定されたポリ マーｍｇ当たり５０国際単位よりも小さい抗凝血活性を示す。有利には、該ポリ マーはインビトロでＦＧＦの活性を増強する。 好ましくは、それは補体システムを実質上活性化しない。すなわち、それはＣ Ｈ₅₀に対して０．５μｇ以上の抗補体システムを有している〔マウザック(Mauza c)ら、バイオマテリアルズ(Biomaterials)、6、第61-63頁、1985による〕。 本発明によると、ポリマーは、上記の定義に対応し、天然物質、化学的に修飾 された天然物質または完全に合成の物質のいずれをも意味するものと理解される 。 従って、以下のポリマーに関する： −デキストランから得られるが、他のタイプの基による他のタイプの置換で修飾 されたポリマー、 −デキストランから誘導されるもの以外であるが、オシ ディック(osidic)残基を含む天然ポリマー（セルロース、キチン、フカンス(fuc ans)等） −修飾の有無に関わらず、非オシディック(non-osidic)な性質を有するモノマー の重合によって得られるポリマー〔ポリリンゴ酸(malic polyacid)、ポリシュウ 酸(oxalic polyacid)、ポリ乳酸(lactic polyacid)、ポリスチレン、ポリエチレ ングリコール〕、 有利には、該ポリマー又はバイオポリマーは主としてグルコース残基から構成 されてもよい多糖である。 そのような多糖は、好ましくは分子量約１０ｋＤ、有利には４０ｋＤを示すで あろう。 それはまた、グルコサミン及び／又はウロン酸残基を、特にグルコサミン−ウ ロン酸二量体の形で包含しているかもしれない。 特に、好ましい多糖は置換されたデキストラン、およらくは脂質、ペプチド又 はプロタイド(protide)と会合したグリコサミノグリカン、またはこれらのポリ マーの硫酸塩である。 本発明は、またこれらのポリマーを含有する医薬組成物に関する。 ポリマー及び／又はバイオポリマーは、所望ならば、次いで適当な化学基を付 加することにより修飾されても よい天然の基質から選択されてもよく、あるいは再び完全に合成により得られる ものでもよい。これらの天然、半−もしくは全合成ポリマーは、次いで数個の成 長因子、特にＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーと本質的に相互作用する能力を 基礎として選択される。それらは、またこの（又はこれらの）因子を蛋白質分解 から保護する能力に基づいて選択される。これらのポリマーは、総称的な略語Ｈ ＢＧＦＰＰ〔ヘパリン結合性成長因子保護剤及び促進剤(heparin binding growt h factor protectors and promoters)〕のもとに呼ばれるであろう。 これらのポリマー又はバイオポリマーの二つの原型が、これらポリマーの製法 及び選択基準とともに例として与えられる。 第一のＨＢＧＦＰＰの例は、既知の産物であるＣＭＤＢＳファミリー、即ち、 カルボキシメチル，ベンジルアミド及びベンジルアミンスルホネートにより置換 された、機能的にされた生物特異的デキストランに属する。これらのポリマーは 、次に化学的に置換される天然産物（デキストラン）からのＨＢＧＦＰＰの産生 の例証となる。 第二の例は、組織抽出物から精製された硫酸プロテオグリコサミノグリカンの ような完全な天然産物の選択について記載する。 これらの二つの例は、ＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子と相互作 用し、安定化し、保護しかつ効果を増強するこれらＨＢＧＦＰＰの能力、並びに 骨格筋細胞の治癒及び再生、及び心筋細胞の保護及び治癒を可能とする医薬組成 物におけるその使用を説明するものである。 この特許出願において、「処置」によるとは、筋肉組織の損傷を予防しかつ治 癒するために行われるいかなる治療又は予防的な操作をも意味するものと理解さ れる。 ＨＢＧＦＰＰ及び特にＣＭＤＢＳの作用のため、以下に記載する実施例により 説明されるように、筋肉の構築、すなわち骨格筋の場合、構成束(organized bun dle)あたりの繊維の数は有意に修飾されないのに対して、筋肉の再構成は促進さ れる。心筋が関係するところでは、虚血によってもたらされた損傷後に破壊され た筋細胞の数は、ＨＢＧＦＰＰで処理された後にカウントされた数よりもかなり 少ない（これらの結果は、ＨＢＧＦＰＰで処理された心臓の繊維芽細胞及び膠原 繊維の数の減少によって確認される。）。それらはＨＢＧＦＰＰの細胞保護効果 の例証となる。 本発明の医薬または医薬組成物は、有効量のＨＢＧＦＰＰ、例えば、ＣＭＤＢ Ｓを一またはそれ以上の配合可 能な薬学的に許容された賦形剤(vehicles)と組み合わせて含んでいる。 それはまた、抗炎症剤もしくは抗菌剤、心筋用の抗不整脈剤、抗凝血剤又は血 栓溶解剤といった薬学的な作用薬と組み合わせてもよい。該賦形剤は、生理学的 血清もしくは０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ又は損傷をうけた筋肉組織に対 して適合性でかつ非刺激性の他の溶液といった緩衝液であってもよい。心臓に関 しての当業者に知られている標準技術によれば、濃厚なもしくはゲル状の溶液を 与える処方が、損傷のタイプと及び接近のし易さ(accessibility)に依存して提 案されるかもしれない。 有利には、そのような薬剤は、実施例においてＣＭＤＢＳ、またはメソグリカ ンのようなＨＢＧＦＰＰ天然ポリマーにより説明されるように、筋肉内経路でＨ ＢＧＦＰＰを２５〜２５００μｇ／ｍｌの投与量で、直接注射されるように設計 されるが、該薬剤はまた静脈内に投与されてもよい。ヘパリン結合性成長因子保 護特性に加えて、下に記載する試験に従って選択されたＨＢＧＦＰＰは、ヘパリ ンと比較して非常に弱い抗凝血活性を示し、このため筋肉外傷の場合の凝血を攪 乱させることができない。静脈内経路による注射の場合、血液中のＨＢＧＦＰＰ の投与量はまた２５〜２５００μｇ／ｍｌの範囲に あるように、注射量は処置を受けるヒト又は動物の血液量に調整されなくてはな らない。 本発明の薬剤の適用例として、記載は、筋肉、先天性もしくは後天性の萎縮症 及び／又はジストロフィーからなり、より詳細には： −遺伝病：例えば、筋病（ジュシエンヌ氏病、ベッケル氏病）、帯ジストロフィ ー等、 −筋肉の弛緩を伴う疾病、 −医原性の薬物事故（クロロキニン治療又は筋肉内局所麻酔注射） −スポーツマン及びウーマンが被るような外傷性の事故： 引っ張られ、裂け及び違えた筋肉、血腫等、傷害又は外科的な行為により引き起 こされた損傷、 −ウイルス又は細菌の攻撃、例えばポリオーマウイルス、 −運動不足から生じる筋肉萎縮症 −肢の末梢閉塞性動脈疾患によって生じるような末梢筋肉虚血症。 心筋に関しては、血液濯流の減少及び消失(elimination)によって生じる損傷 は、本発明の組成物を使用することにより予防もしくは減らせるかもしれない。 このように、心筋梗塞の場合、該組成物の梗塞筋肉内への注射もしくは静脈経路 による注射は、損傷した心臓領域へのＨ ＢＧＦＰＰの接近を許容する。 心臓移植の場合、心筋形成の場合と同様に、心臓細胞の生存は、本発明の薬剤 又は組成物の添加により助長されるかもしれない。 心不全の場合、ジュシエンヌ氏病，ベッケル氏病のような遺伝病、またはウイ ルス，寄生虫又は細菌の感染と関連する心筋障害にて生じる。 本発明の有利な点は、該組成物の単一投与量の使用によって所望の結果、換言 すれば骨格筋繊維の完全な再生及び心臓の筋細胞の保護が得られることである。 もう一つの有利な点は、筋肉組織の損傷に関して、損傷した筋肉の脈管再生が また助長されることである。 骨格筋に関連して引き続く頁に示す例においては、ＣＭＤＢＳの２５μｇ／ｍ ｌの損傷部位への単回注入が、７日後筋肉繊維の完全な再生を誘導するのに対し て、対照筋肉においてはその種のことは全く観察されない。組織学的断面におけ る表面単位当たりの繊維の数は、ＣＭＤＢＳ非処置対照より１０倍多い。 ヘパリンもデキストラン硫酸も筋肉再生の性質は有していないことに注目すべ きである。之等の分子は、ＦＧＦと相互作用するけれども、いずれにしてもヘパ リンに関する限りベータＴＧＦと相互作用するが、シュークラ ーゼもヘパリンもデキストラン硫酸も、トリプシンの作用により誘導される蛋白 質分解からベータＴＧＦを保護しない。これは下記例に記載のＨＢＧＦＰＰのス クリーニング及び選択試験への適用によって示される通りである。かくして、ト リプシンによって誘導される蛋白質分解に対するＦＧＦ及びベータＴＧＦの両者 の保護を基礎とするインビトロ（in vitro）でのスクリーニングを行なうことに よって、之等の例に示されたものを含むある種のＣＭＤＢＳと同様に、ＨＢＧＦ ＰＰを選択することが可能である。メソグリカンやスロデキシド（sulodexide） 等の天然のバイオポリマーに適用された之等と同様の選択の判定基準より、ＦＧ Ｆ及びベータＴＧＦの両者に対して保護及び安定化の両方の活性を有するメソグ リカンは、筋肉修復及び再生に好ましい活性を有しており、ＨＢＧＦＰＰファミ リーに属する一方、トリプシンの作用により誘導される蛋白質分解に対してＦＧ Ｆを保護するスロデキシドは、ベータＴＧＦへのトリプシンの作用に対しては、 有意な保護作用を有さないことが示された。 以下、本発明を、何等限定するものではないが、実施例により示す。ここで 図１は、ＣＭＤＢＳの構造式を示し、 図２は、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドに よる、ＦＧＦ１（２Ａ）及びＦＧＦ２（２Ｂ）の生物活性の増強を示す。生物活 性は、ＣＣＬ３９細胞について、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２の単独添加での、又はヘ パリン２０μｇ、メソグリカン１０μｇもしくはスロデキシド１０μｇの存在下 での、投薬量の関数としてトリチウム化されたチミジンの増加された取り込み量 の測定により、測定される。 図３及び４は、ＦＧＦ１（３）及びＦＧＦ２（４）の熱分解に対するヘパリン 、メソグリカン及びスロデキシドの保護効果を示す。ＦＧＦサンプルをそれ自体 で又はヘパリン２０μｇ、メソグリカン１０μｇもしくはスロデキシド１０μｇ の存在下に、２０℃（ａ）及び３７℃（ｂ）で、１、７、１５、３０日培養した 。横座標にて示される生物活性の測定は、ＣＣＬ３９細胞に取り込まれたトリチ ウム化されたチミジンの刺激単位値（ＥＤ₅₀）に相当する。 図５Ａは、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドの、¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ１の 蛋白質分解に対する保護効果を示す。蛋白質分解消化は、３７℃で行ない、サン プルは、１８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ゲルを乾燥し オートラジオグラフ化した。最初のトラックは、¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ１のみを含む。^{1 25} Ｉ−ＦＧＦ１を トリプシン（トラック２）、ヘパリン（トラック３）、メソグリカン（トラック ４）又はスロデキシド（トラック５）の存在下に培養する。 図５Ｂは、ヘパリン、メソグリカン及びスロデキシドの、¹²⁵Ｉ−ＦＧＦ２の 蛋白質分解に対する保護効果を示す。トラックの配列は図５Ａにおける¹²⁵Ｉ− ＦＧＦ１で示されたものと同じである。 図６Ａ及び６Ｂは、ＨＳＭ画分（図６Ａ）及びＨＳＳ画分（図６Ｂ）のそれぞ れの、カラムの較正のためのコンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）画分の存在下におけ る、ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム溶出プロフィールである。 図７、８、９及び１０は、ＣＭＤＢＳにより処置した（図８及び１０）又は処 置しない（図７及び９）、再生８日後の筋肉交差半切片(muscle cross semi-sec tion)の顕微鏡モンタージュ写真に相当する。 図１１Ａから１１Ｄは、非手術ラット（図１１Ａ及び１１Ｂ）及び手術ラット （図１１Ｃ及び１１Ｄ）の心電図を示す。 図１２Ａから１２Ｆは、生理食塩水（図１２Ａ及び１２Ｄ）又はＣＭＤＢＳ（ 図１２Ｂ及び１２Ｅ）で処置したラット及び対照ラット（図１２Ｃ及び１２Ｆ） のそれ ぞれの心臓の組織切片写真を示す。実施例１ ＣＭＤＢＳの製造及び選択 ａ）ＣＭＤＢＳの製造 ＣＭＤＢＳは、カルボキシメチル、ベンジルアミド及びベンジルアミドスルホ ネート基によって置換されたデキストランである。該ＣＭＤＢＳの合成方法は、 エム．マウザック及びジェイ．ジョセフォンビッチ（M．Mauzac and J．Josefon vicz，Biomaterials，1984，5，301-304頁）により記載されている方法であって もよい。この方法によれば、いくつかのグリコシル化単位を、その５位及び６位 炭素原子上にてカルボキシル基で置換することにより、デキストランからカルボ キシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を製造できる。次の段階においては、ベンジ ルアミドを上記カルボキシル基と結合させて、カルボキシメチル−ベンジルアミ ドデキストラン（即ちＣＭＢＤ）を得る。最後に、カルボキシメチルデキストラ ンベンジルアミドスルホネート即ちＣＭＤＢＳを得るために、ベンジルアミドの いくつかの芳香族核をスルホン化する。 之等誘導体のナトリウム塩は、限外濾過され、凍結乾燥され、その使用に先立 って適当な緩衝剤に溶解される。 ＣＭＤＢＳの一般式は図１に示される。 ＣＭＤＢＳは、異なる置換基の統計上の分布を有している。各ＣＭＢＤＳ型の 割合は、標準的方法により測定される。ｂ）ＣＭＤＢＳの選択 ｉ：ＦＧＦの保護及び安定化試験 ＣＭＤＢＳの合成の過程で、各基の置換割合は、置換反応条件を調節すること により制御できる。温度、反応時間、成分の相対濃度、置換反応数等のようなパ ラメーターの制御によって、非常に多数の置換ポリマーを得ることができる。５ 位及び６位の炭素上のヒドロキシル基のカルボキシメチル基による置換は、０〜 ２００％（５位及び６位のそれぞれの炭素につき１００％）の範囲のカルボキシ メチル化の割合を与える。カルボキシメチル基は、次に、部分的に又は全部ベン ジルアミドの固定に用いられる。ベンジルアミド基は、部分的に又は全部スルホ ン化に用いられる。本発明に用いられる機能化された置換デキストランは、特に フランス国特許第２．４６１．７２４号に記載のものの中にある。そのＦＧＦフ ァミリー成長因子の安定化及び保護の能力に加えて、タルデュー(Tardieu)及び 共同研究者の刊行物〔Tardieu et coll.，J.Cell.Physio.，1992，150，194-203 頁〕及びフ ランス国特許第２．４６１．７２４号に記載されているように、選択されたＣＭ ＤＢＳは、以下の評価方法に従って、ベータＴＧＦファミリーに属する成長因子 ファミリーの少なくとも１種のメンバーと相互作用し、ベータＴＧＦを蛋白質分 解から保護できる必要がある。 ｉｉ：ＣＭＤＢＳ及びベータＴＧＦファミリー成長因間の相互作用能力の評価 ある種のＣＭＤＢＳのベータＴＧＦファミリーのメンバーと相互作用し、該相 互作用によってベータＴＧＦを保護する能力を測定するために、等級付け試験を 工夫した。この試験は、選択されたＣＭＤＢＳが、プロテアーゼ処理にもかかわ らずベータＴＧＦの生物学的活性を維持することを許す能力を測定することから なる。 以下の例において、用いたＣＭＤＢＳは、カルボキシメチル単位１１０％、ベ ンジルアミド単位３．６％及びスルホネート単位３６．５％の置換割合によって 定義されるバッチ２６．２であり、抗凝固活性４IU/mg（国際単位）を有してい る。このバッチの抗補体活性は、マウザックら（Mauzac et al.前出）に従って 測定されたＣＨ₅₀が１．１μｇである。 対照として用いたヘパリンは、サノフィ社（Sanoficompany(Choay Institute) ）から供給され、抗凝固活性 １７５IU/mgを示す。 ベータ１ＴＦＧは、多数の刊行物（例えば、成長因子及びその受容体、１９９ ２、１巻、４１９−４７２頁、A.Roberts and M.Sporn，A.Roberts and M.Sporn により記載及び編集され，Springer Verlag Berlinにより刊行された）に記載の プロトコルに従ってヒト血小板から製造され、当業者に慣用されている。この例 に用いたベータＴＧＦ生物活性試験は、ＣＣＬ６４細胞（アメリカン・ティシュ ー・カルチャー・コレクションより入手）の抑制活性である。この抑制は、ヴア ン ゾーレン（Van Zolen）に記載のプロトコル〔Progress in Growth Factor R esearch，1990，2，131-152頁〕に従って、ＦＧＦもしくは牛胎児血清により刺 激された之等ＣＣＬ６４細胞への用量依存性の様式で、ベータＴＧＦがトリチウ ム化チミジンの取り込みを抑制する能力によって測定される。 ベータＴＧＦの２つの投薬量を用いた。一方はトリチウム化したチミジンの取 り込みを５０％抑制する能力に相当し（抑制活性単位として定義される）、他方 は１００％抑制能に相当する。この実施例では、培養培地１ｍｌ中で培養された ＣＣＬ６４細胞に対して得られたＴＧＦの値は、２５０ｐｇである。 ０．１％牛血清アルブミン（シグマ社(SIGMA company, Saint Louis，USA)）を含むリン酸塩緩衝液中ベータＴＧＦサンプル５０ｎｇ を、それのみで、又はＣＭＤＢＳ５０００μｇもしくはヘパリン５０００μｇと 共に、トリプシン５００μｇを用いるか又は用いることなく、培養した。培養液 の最終容量を１ｍｌに調節し、培養は３７℃下に時間を変えて（本例では１０分 間（表１））行なった。 各培養反応からサンプル２０μｌをとり、２４−ウエルプレートに培養したＣ ＣＬ６４細胞に加えた。各ウエルは、前述したE.Zohlenのプロトコルに従い各々 培地１ｍｌを含んでいる。このような条件において、ウエル当りのベータＴＧＦ の最終濃度は、１ｎｇ／ｍｌである。表１に各種条件下に得られた結果を要約し 、ＣＭＤＢＳの保護効果を示す。かくして、３７℃１０分培養後、ベータＴＧＦ の生物活性の７５％がなお存在し、一方、ヘパリンは、これがベータＴＧＦに固 定できる〔Mac Caffrey et al.，J of Cell．Physiology，1992，vol 52，430-4 40頁〕という事実にもかかわらず、この蛋白質分解に対してベータＴＧＦを保護 しない（残存生物活性は２０％未満）。ＦＧＦの場合、ヘパリンは、トリプシン により誘導される蛋白質分解に対する保護を与える〔Tardieu et al.，Journal of Cellular Physiology，1992， 150: 194-203頁〕ことを思い出すべきである。 ＣＭＤＢＳは、トリプシンの活性に対して全く抑制力のないことが証明された （表２）。かくして、トリプシン１０μｇを、基質（セルビオ社（Serbio compa ny in Paris）から供給され、供給者の勧めに従い用いられたＳ．８７）と共に 、又はこの基質及びトリプシンインヒビター、例えば大豆起源のインヒビター（ 大豆トリプシンインヒビター又はシグマ社製のＳＴＩ）と共に培養した。この培 養は、ＣＭＤＢＳ（バッチＡＭ２６）の各種量の存在下もしくは非存在下に行な われた。トリプシンの酵素活性を、培養時間に対するＳ８７のトランスフォーメ ーション産物の分光光学的吸収により測定した。実施例２ 他のＨＢＧＦＰＰの選択 プロテオグリコサミノグリカン及びグリコサミノグリカンの２つの市販の調製 物を、それらのＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子との相互作用能力 に従い選択した。 メソグリカン及びスロデキシドの分画により得られたヘパラン硫酸の調製物も また、試験した。 メソグリカン及びスロデキシドは、前記のようにシグマ社（SIGMA Chemical c ompany，Saint Louis，MO，USA） より提供された。 この実施例で用いた細胞は、アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクシ ョン由来のＣＣＬ３９細胞である。培養及びＦＧＦ生物活性測定試験の条件は、 タルデュー(Tardieu)及び共同研究者による刊行物〔the Journal of Cellular P hysiology，1992〕記載の条件と同じである。それらの特徴を表３に要約する。 用いたＦＧＦ成長因子は、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２組換体である。 ａ）ＦＧＦのインビトロ生物活性に及ぼすメソグリカン及びスロデキシドの効果 之等実験においては、ＦＧＦ１又は２を、最大刺激を誘起する投薬量の５０％ の生物活性の刺激を誘起するための有効量（ＥＤ₅₀という）に相当する量で用い る。生物活性は、多数の刊行物例えば前述したタルデュー及び共同研究者の刊行 物及びフランス国特許第２６４４０６６号に詳細に記載されているプロトコルに 従って、細胞へのトリチウム化されたチミジンの取り込み増加を誘導する能力に よって測定する。この例ではＥＤ₅₀は、ＦＧＦ１について５ｎｇ／ｍｌであり、 ＦＧＦ２については３ｎｇ／ｍｌであり、之等の値は、実験的に測定される（図 ２Ａ及び２Ｂ）。ＦＧＦ投薬に依存する、同一刺激試験を、メソグリカンもしく はスロデキシド１０μｇ／ ｍｌ又はヘパリン２０μｇ／ｍｌの存在下に実施する。図２は、之等の条件下に おいて、メソグリカン又はヘパリンのこれらの投薬量の存在下に、ＥＤ₅₀は、Ｆ ＧＦ１及びＦＧＦ２につきそれぞれ０．４ｎｇ／ｍｌ及び０．２ｎｇ／ｍｌとな ることを示す。ＦＧＦの生物活性を増強するこの能力に加えて、ＨＢＧＦＰＰは 、ＦＧＦを熱分解及びトリプシンの蛋白質分解作用により誘導される不活性化か ら保護する（図３乃至５）。同様に、之等のＨＢＧＦＰＰは、トリプシンの蛋白 質分解活性によって誘導される不活性化に対して、ＦＧＦ１及び２を保護する（ 図５Ａ及び５Ｂ）。 ｂ）ベータＴＧＦに関するメソグリカン、スロデキシド、デキストラン、デキス トラン硫酸及びスクラーゼの保護効果 いくつかの他の化合物を評価した：デキストラン硫酸（シグマケミカル(Sigma Chemical)、分子量40.000）、デキストランはＣＭＤＢＳ（同様にシグマから入 手）の合成のために使用された、スクラーゼ又はスクロースオクタサルフェート （ディー．バー シャロム(D.Bar Shalom)、ブク メディク カンパニー、デン マーク(Bukh Medic Company，Denmark)のにより提供された）。これらの化合物 のいくつかは、例えばスクラーゼ（米国特許第 ５２０２３１１号参照）又はデキストラン硫酸（日本特許１３８９０７／８８参 照）のようなＦＧＦを保護し、安定化させるために選ばれた。デキストランはＣ ＭＤＢＳ ＡＭ ２６の合成に用いられたものである。 ベータＴＧＦ生物活性の保護試験は、実施例１ ｉｉに記載されたようにＣＭ ＤＢＳを用いて同様に実施された。培養混合物には、ベータＴＧＦ５０ｎｇ（０ ．１％ウシ血清アルブミン中）及びトリプシン（５００μｇ）が含まれていた。 メソグリカン又はスロデキシド又はデキストラン硫酸又はデキストラン又はスク ラーゼは、５０００μｇの用量で使用された。 ベータＴＧＦ生物活性は、５０倍に希釈した後に、ＣＣＬ６４細胞を用いて前 記と同様にして測定した。 その結果を表４に示す。 これらの結果は、ＦＧＦ及びＴＧＦに関する２つの選択基準に応答することが できる、ある種のＣＭＤＢＳを除き、試験された他の化合物のうちメソグリカン だけがベータＴＧＦに対する有意な保護活性を示すことを示す。 ｃ）スロデキシド及びメソグリカンのヘパラン硫酸分画の単離 スロデキシド及びメソグリカンは、実質的に異なるグルコサミノグリカン（Ｇ ＡＧ）から構成されているいく つかの物質の混合物に相当する。 最初の精製段階によって、これら２つの製品の各乾燥産物１ｇあたり全ＧＡＧ がメソグリカンについて８７４ｍｇ、スロデキシドについて７９５ｍｇそれぞれ 含まれることが確認された。この精製は、すべての蛋白性不純物を取り除くため に、これらの溶解生成物をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−トリスア クリル）にかけることにより得られた。全ＧＡＧは、次いで１．５ＭのＮａＣｌ を含む酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４を用いてＤＥＡＥゲルを溶出することにより 精製された。 大量の水に対する透析工程の後に、３７℃で終夜ＡＢＣコンドロイチナーゼに より（ＧＡＧ １ｍｇ当たり１単位）ＧＡＧの生成物の各６０ｍｇを消化した。 この酵素は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）を除いて、すべてのＧＡＧを分解する。消化 生成物は、分子ふるいクロマトグラフィー（Ｇ５０ セファデックス、１．８× ９５ｃｍカラム）にかけた。次いで溶出は、炭酸水素アンモニウム緩衝液上１８ ｍｌ／時の割合で実施した。ＨＳタイプＧＡＧに相当する消化されない物質は、 カラムの溶出死容積中に集められた。 ＧＡＧの濃度は、カルバゾール法(ビター ティー．(Bitter T.)及びムアー エイチ．エム．(Muir H.M.)、 1962、Anal.Biochem 4、330-334頁)を用いて、それらのウロン酸含有量から算出 した。 これらの測定から、それぞれの生成物について次の組成を得た： これら２つの生成物における各ＨＳ分画は、再度ＤＥＡＥトリスアクリルゲル 上でクロマトグラフ処理された。３ｍｌ中メソグリカン（図６Ａ）又はスロデキ シド（図６Ｂ）で精製されたＨＳ分画の各１ｍｇは、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０ ．０５Ｍ ＴＭＳ−Ｈｅｌ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて平衡化したカラム上に付 着させた。１０倍量の上記緩衝液を用いてカラムを洗浄し、次いで１０倍量の０ ．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４で洗浄した。その 後、カラムに固定された物質を、同じ酢酸緩衝液中０．０５Ｍ ＮａＣｌから１ ．５ＭのＮａＣｌの範囲の塩グラジエントで脱着させる。回収された分画各１ｍ ｌは、カルバゾール法で測定 された。 もとの各生成物のＨＳ成分に相当する該物質は、ほぼ同じ溶出プロフィールを 示し、概ね同じ見掛けの負荷を示す。０．９４ＭのＮａＣｌとなる生理食塩水濃 度で溶出ピークの最大値が得られる。コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ）の定義され た分画は、クロマトグラフィーの較正のために、同じプロトコルにかけた。この ＣＳＡ分画は、ジサッカリドにより一つのみの硫酸基を含み、０．７２ＭのＮａ Ｃｌのイオン強度で溶出される。 これらの結果より、ＨＳ分画は、対照ＣＳＡよりも多くの硫酸基を含むことが わかる。ＨＳ分画には、ジサッカライド単位当たり約２の硫酸基が存在する。 それぞれの原料において確認された能力と比較してベータＴＧＦ及びＦＧＦに 関する保護能力を明らかにするために、これらの分画について試験を行った。異なるポリマーによるＦＧＦ保護効果の半定量的評価 上記のように、一定量の放射性ＦＧＦを種々の条件下で培養する。反応生成物 のオートラジオグラフィーの後、放射性ＦＧＦの非分解量を濃度計で定量する。 その値は、反応初めにおいて付着した量と比較して見出された放射標識されたＦ ＧＦの割合に相当する（表５）。 表４及び５の結果より、メソグリカン及びスロオキシ ドからそれぞれ由来するＨＳＭ及びＨＳＳ分画は、これら２つの組成物よりも大 きく、１００％に近い保護効果を有することがわかる。実施例３ 白血球エラスターゼ及びプラスミンの活性におけるＣＭＤＢＳ及びグリコサミノ グリカンのインビトロ抑制効果 異なるＣＭＤＢＳ及びその合成中間体化合物の抑制能力は、白血球エラスター ゼ及びプラスミンについて確認された。 精製された白血球エラスターゼは、エラスチンプロダクツ社（Elastin Produc ts Co） （Owenville、MO、USA）から入手し、プラスミンはシグマから入手した。 これらの異なる化合物による酵素活性の抑制は、恒温槽中３７℃で実施された 。考慮下における酵素は、エラスターゼではｐＨ８の１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ緩衝液の溶液中に置かれ、プラスミンは０．０２％のアジ化ナトリウム及び ０．０１％トリトンＸ１００の存在下にｐＨ７．４の１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ緩衝液の溶液中に置かれる。基質及び酵素濃度は：８．３ｎＭのエラスター ゼに対して０．１０ｍＭのＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− ｐＮＡ（パラニトロアニリド）、及び７７ｎＭでプラスミンに対して０．２ ０ｍＭのｄＶａｌ−Ｌｅｕ−ｄＬｙｓ−ｐＮＡである。ＩＣ₅₀は、各条件により 測定される。 表６は得られた結果を示し、バッチＡＭ６は４０，０００ｋＤのＴ４０デキス トランに対応し、バッチＥＭ５は１０，０００ｋＤのＴ１０デキストランに対応 する。合成における中間体生成物は、それぞれの置換反応の数(number)を特定す るインデックス番号で与えられた上記記号によって特定される。 ＩＣ₅₀値は、ＣＭＤＢＳが、最も優れた抑制剤の一つである（１ｎＭオーダー のＫｉ）ヘパリンに匹敵する白血球エラスターゼ活性に対する非競合的双曲線タ イプの抑制効果を有することを示す。加えて、ＣＭＤＢＳは、ヘパリンとは異な り、プラスミンについて抑制効果を示す。 表６の結果より、ＨＳＭ及びＨＳＳ分画の抑制効果はメソグリカン及びスロオ キサイドのそれぞれよりも大きいことがわかる。実施例４ 単純圧挫傷後の骨格筋の再生 実験プロトコル 実験は、月齢２ヶ月半で体重３００ｇのウィスターラット７匹について行った 。 エーテルで麻酔した後、ＥＤＬ筋（後方のラットの足の筋肉）が前足から取り 出され、ペアン鉗子を用いて、筋肉の全長にわたって一定の圧力を加えることに より機械的に損傷を与えた。加圧は１５秒間維持され、鉗子は第二ノッチで閉じ られた。筋肉全体にわたる損傷の均一性は、３０秒間梗塞を続けることにより制 御した。その後、筋肉をもとの位置に戻し、皮膚をリネン糸で縫合した。 カルシウム又はマグネシウムを用いずにＰＢＳ中で希釈した５０μ／ｍｌのＣ ＭＤＢＳ又はデキストラン硫酸（ＤＳ）の２００ｍｌの単回注射をＥＤＬ筋に行 った。再生のコントロールには、同じ量のＰＢＳを単独で注入した。実験によっ ては、筋肉の損傷が起こる前又は後に注入を実施した。１分間で２００μｌが注 入され、前足に戻す前に２分間筋肉を放置することにより生成物の拡散を確保し た。５つのＥＤＬ筋がＣＭＤＢＳにより処理され、２つがデキストラン硫酸によ り処理された。 処理された筋肉とコントロールは、再生８日後に回収した後、直ちにイソペン タン中−１５０℃で冷凍した。厚さ１０μｍの冷凍された横断面には、筋肉の中 間領域に形成されていた。乾燥部分は、ゴモリのトリクローム（Ｇｏｍｏｒｉ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）によって着色し た。 繊維数及び繊維径の形態測定分析(morphometric analysis)は、筋肉の半横断 面の相当するマイクログラフィックモンタージュにより行った。結果 再生８日後に筋肉を回収する間において、肉眼的試験により、ＣＭＤＢＳで処 理された筋肉とＰＢＳのみが注入された筋肉ではその外観が異なっていることが 判明した。上記処理された筋肉は暗赤色を呈しているのに対し、コントロールは 非常に明るい色を呈している。この違いは、前者において、血管新生がより豊富 であり、かつミオグロビン含量がより高いことを示唆している。さらに、ＣＭＤ ＢＳにより処理された筋肉の繊維径において顕著な増加がある（表７参照）；こ れらの筋肉は、すべての前足を占めており、前頸骨筋を外側へ押す。 図７及び１０は、ＣＭＤＢＳで処理された又は処理されていないものについて 、再生８日後におけるのＥＤＬ筋の半横断面(transverse half-section)のマイ クログラフィックモンタージュに相当する。処理された筋肉（図８）は、より多 くの再生繊維（Ｆ）が認められ、未処理の筋肉（図７）に比べてより大きな繊維 径を有する。損傷時におけるＣＭＤＢＳの単回注入により、改善された 筋肉の再構成が誘発される：筋周膜結膜（Ｃ）により分離されている筋束は、８ 日目と同じ早さで明確に判別できる（未処理である図９及びＣＭＤＢＳで処理さ れた筋肉を示す図１０参照）。通常の再生において、３週間後まではこの再構成 の段階には到達しない。断面における組織試験においても、血管新生がより大き く、かつ神経再支配の度合が高いことを示している。 損傷の前又は後に注入されたＥＤＬ筋であったどうかにかかわらず、上記結果 は同じである。 表７のデータより、ＣＭＤＢＳが再生速度（８日間中において再生した繊維数 ）及び成熟の度合（繊維の平均径）に非常に大きな影響を与えることがわかる。 筋肉の再器質化の明確な促進も認められる（器質化された繊維束の数）。一方、 筋肉の構造（単位束当たりの繊維数）には、明瞭な改質は認められない。 ＣＭＤＢＳにおける条件と同様にしてデキストラン硫酸を注入した結果、筋肉 の再生において質的にも量的にも改質が認められない。実施例５ 脱神経支配及びそれに続く挫傷後の骨格筋の再生 各種ＨＢＧＦＰＰ及び他のＨＢＧＦＰＰグリコサミノグリカンの比較研究 実験は、月齢２ヶ月半で体重３００ｇの雄ウィスターラット１８匹を用いて行 った。 筋肉の挫傷の前に、筋肉の入り口にある運動神経を切断するほかは、実施例４ と全く同じプロトコルである。 物質は、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中に存在する。 長さ６０ｍｍ、直径０．４ｍｍのフレキシブルニードルを備えた５０μｌマイ クロシリンジを用い、脱神経支配及び挫傷後に注入を実施する。２回の注入は、 ２分間隔で実施する。従って、注入した容積は１００μｌである。スクラーゼ（ グルコースオクチルサルフェート）は、デンマーク ディー．バー シャロム ブルク メディック(D.Bar Shalom Bukh Medic)により無償で提供された。 該動物を犠牲にした後、処理された足及び反対側の足のＥＤＬ筋の重量を測定 した。同じ年齢の動物における正常な筋肉の重量中の個体差は２０％に達するの で、その測定結果は、処理された筋肉の、その反対側の無傷のコントロールに対 する比率を計算することにより標準化した。 この比率は、ＰＢＳ単独で処理された筋肉を１００％として考慮した。異なる 物質により処理された筋肉の再生の度合は、ＰＢＳにより注入された筋肉の％で 計算し た。その結果を表８に示す。 これらの結果より、筋肉の再生におけるＨＢＧＦＰＰの特有の効果がわかる。 事実、ＦＧＦ及びベータＴＧＦのいずれにも保護効果及び促進効果を示す特定の ＣＭＤＢＳ及びメソグリカンだけが、有意な再生を誘発することがわかる（それ ぞれ１９０％及び１３３％）。実施例６ 心筋の治癒 心筋梗塞の治癒の間に行われる実験を、ラットで行った。 ラットは、他の動物種に比べ優れた実験モデルである、なぜなら、ヒトの場合 のように、右と左の冠動脈間での側副循環が無いからである。実験プロトコル 性別が雄で体重が３５０ｇのウィスター系(Wistar)ラット（Ｗｉ／Ｗｉ Ｉｃ ｏ、イファ クレド(IFFA CREDO)、フランス）を、腹腔内経路によってペントバ ルビタールナトリウムを用いて麻酔をかける。 ラットの胸及び首を剃り、術前の心電図（ＥＣＧ）を録る。 気管切開術でラットを補助換気下に置くことで、術前の気胸と戦い、及び手術 前後の死亡を減少させることが 可能となる。 ラットを右横向きの臥床姿勢に置き、胸部下に小さなブロックを取り付けた後 、左横の開胸術（４番目と５番目の助間の空間に対応する浮動助骨上指幅で）を 行う。心臓を露出させ、心膜を切開し、左心室を確認後、左冠動脈をその起点位 置でプロレーン（PROLENE）６／０糸を用いて結紮する。１分後、梗塞領域が観 察され、心臓の電気活性の記録から梗塞を示すものとしてパーディ波（Pardee w ave）が観察できる。 生理食塩水中調製された５０μｇ／ｍｌのＣＭＤＢＳ溶液１０μｌ又はＣＭＤ ＢＳを含まない同溶液１０μｌを、ハミルトンシリンジ（Hamilton syringe）を 用いて、梗塞領域のちょうど中央に一点で注射する。 その後胸部を閉じ、気胸を吸引し、補助換気を動物が完全に起きるまで同じ場 所で継続する。最後のＥＣＧを録る。 誘導(derivation)での梗塞前後のラットの心電図（ＥＣＧ）を、図１１に示す 。トレースＡ及びＢは手術を受けていないラットで見られる２つのタイプの心電 図を示す。トレースＣ及びＤは手術後のこれら同じラットを示す。梗塞を示すＳ −Ｔセグメントの非常に明瞭な過剰間隔がある。 この実験に使用するラットは、胸部を閉じるときに心筋梗塞の典型的な電気徴 候を示すものであり、他の動物は本研究から排除されるであろう。 ＥＣＧの測定後、３３匹のラットを手術後７、１５及び３０日目に犠牲にし、 安楽死術の前にＥＣＧを録る。梗塞した心臓における組織学的研究を行う。 組織学的な結果を図１２に述べるが、該図１２は、左の冠動脈の結紮による梗 塞し、マッソントリクロム（Masson trichrome）で染色したラット心臓の手術後 １５日の、組織学的研究を示すものである。 図１２Ａ及び１２Ｄ：梗塞領域の中央に生理食塩水１０μｌ注射。左心室の壁 に位置する心内膜下に梗塞の存在が確認される。これは、萎縮しており、周辺に 相当な炎症反応及び強度の線維形成が存在する。図１２Ｄ（×２５）は、梗塞の 中央部を視覚化したものである。線維形成の出現によって表された実質的な萎縮 及び心筋の線維の完全な消失がある。いくらかの炎症細胞が存在する。 図１２Ｂ及び１２Ｅ：ＣＭＤＢＳでの梗塞の処置（梗塞領域に５０μｌ／ｍｌ 溶液１０μｌを注射する）。再度ここで、左心室の壁に位置する心内膜下の梗塞 が存在する；萎縮した領域は広がらなくなり、心筋の線維は無傷である（１２Ｂ ＝）。図１２Ｅ（×２５）は、線維環 境において多数の血管領域及び心筋線維が外見的に無傷であることを示している 。 図１２Ｃ及び１２Ｆ：対照の心臓の写真。 左心室の大きさが、ＣＭＤＢＳで処置した心臓の壁で保存されることは明らか である：対照群での心臓は、より薄い壁及びより広い梗塞領域を示す。ＣＭＤＢ Ｓで処置した梗塞した心臓において、心筋の再生領域が存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デグランジュ パスカル フランス国 エフ−75011 パリ ブルヴ ァール ヴォルテール 273 (72)発明者 ゴートロン ジャン フランス国 エフ−94400 ヴィトリー− シェル−セーヌ リュ アトワーヌ−ブー ルデル 12 (72)発明者 メダイ アンヌ フランス国 エフ−94000 クレテイユ スクワー エディソン 23

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨格筋又は心筋組織の処置用薬剤の製造における、特に、トリプシン分解か らＦＧＦ及びベータＴＧＦファミリーの成長因子を保護し、有意に血液凝固を阻 害しない、ＨＢＧＦＰＰと呼ばれる少なくとも１種のポリマー又は１種のバイオ ポリマーの使用。 ２．該ポリマー又はバイオポリマーが、ポリマーｍｇあたり、５０国際単位より 小さい抗血液凝固活性を示すことを特徴とする請求項１に記載の使用。 ３．該ポリマーが、実質的に補体系を活性化しないことを特徴とする請求項１又 は２に記載の使用。 ４．該ポリマーが、インビトロにおいてＦＧＦの作用を増強することを特徴とす る請求項１〜３のいずれかに記載の使用。 ５．該ポリマーが、実質的にエラスターゼ及び／又はプラスミンのプロテアーゼ 活性を阻害することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の使用。 ６．該ポリマー又はバイオポリマーが、ポリサッカライドであることを特徴とす る請求項１〜５のいずれかに記載の使用。 ７．該ポリサッカライドが、主としてグルコース残基から構成されることを特徴 とする請求項６に記載の使用。 ８．該ポリサッカライドが、グルコサミン及び／又はウロン酸残基を含有するこ とを特徴とする請求項６に記載の使用。 ９．該ポリサッカライドが、グルコサミン−ウロン酸二量体を含有することを特 徴とする請求項８に記載の使用。 10．該ポリサッカライドが、プロテオグリコサミノグリカン又はグリコサミノグ リカン又はこれら化合物の一つのサルフェートであることを特徴とする請求項８ 又は９に記載の使用。 11．該ポリサッカライドが、置換されたデキストランであることを特徴とする請 求項１〜６のいずれかに記載の使用。 12．該ポリサッカライドが、ＣＭＤＢＳであることを特徴とする請求項１１に記 載の使用。 13．該ポリマーが非−オシディック（non-osidic）の性質を有することを特徴と する請求項１〜５のいずれかに記載の使用。 14．筋肉組織が心筋又は骨格筋の組織であることを特徴とする請求項１〜１３の いずれかに記載の使用。 15．薬理学的に許容される賦形剤と共に、請求項１〜１１に記載のような少なく とも１種のポリマーを含む骨 格筋又は心筋組織の治癒用医薬組成物。