ES2202358T3 - Utilizacion de biopolimeros para el tratamiento de los musculos. - Google Patents
Utilizacion de biopolimeros para el tratamiento de los musculos.Info
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Abstract
UTILIZACION DE AL MENOS UN POLIMEROS O DE UN BIOPOLIMERO LLAMADOS HBGFPP, QUE PROTEGE ESPECIFICAMENTE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO DE LAS FAMILIAS DE FGF Y TGF BETA DE LA DEGRADACION TRIPSICA, PARA LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE LOS TEJIDOS MUSCULARES.
Description
Utilización de biopolímeros para el tratamiento
de los músculos.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de polímeros o biopolímeros para la preparación de un
medicamento para el tratamiento, en medicina o en veterinaria, de
lesiones, de cualquier etiología, que afecten al músculo esquelético
o cardíaco y las composiciones farmacéuticas para este
tratamiento.
La síntesis de los polímeros CMDBS (dextranos
sustituidos por residuos carboximetilo, benzilamina y sulfonato)
ha sido descrita en la patente FR 2 461 724 así como en la patente
US 4.740.594. Algunos de estos polímeros mimetizan a la heparina y
pueden ser utilizados como productos de sustitución de la heparina
plasmática, gracias a sus propiedades anticoagulantes y anti
complemento.
En el conjunto de los polímeros CMDBS, algunos
presentan otra propiedad de la heparina que es la estabilización,
protección y potenciación de la actividad biológica, de los
factores de crecimiento de la familia FGF, in vitro (Tardieu
et cols., Journal of Cellular Physiology, 1992, 150 páginas 194 a
203).
La patente FR 2 644 066 describe la utilización
de ciertos CMDBS asociados a los FGF para la cicatrización de la
piel y de la córnea. Se han realizado experimentos en los que se ha
provocado en la rata una herida cutánea de 6 mm de diámetro con un
sacabocados. En este ejemplo, el CMDBS asociado al FGF 2 permitió
obtener un efecto neto sobre la calidad de la reparación de la
piel.
Otro biopolímero, el dextrano sulfato, ha sido
también propuesto, en asociación con los FGF, como estabilizador y
protector en la patente japonesa nº 13890. El dextrano sulfato es,
por otra parte, ampliamente utilizado en las pomadas y cremas
cicatrizantes de la piel así como en composiciones de colirios,
pero no se ha referido, según el entender del demandante, ningún
efecto sobre la cicatrización o regeneración de las lesiones
musculares.
Otro agente, el éster de sucrosa sulfato y su sal
de aluminio son productos descritos y utilizados, solos o
asociados a los FGF, como agentes para el tratamiento de las
úlceras y lesiones del tubo digestivo (Patente US nº
3.432.489 y patente US nº 5.202.311).
El tejido muscular, esquelético y cardíaco, es
particularmente rico en factores de crecimiento y muchos autores
han descrito la presencia y/o la acción de los FGF y TGF beta en y
sobre las células mioblásticas (por ejemplo: D. Gospodarowicz y
Cheng, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 1987, 23
(7): pp. 507-514; Groux - Muscatelli B., Bassaglia
Y, Barritault D., Caruelle J.P. y Gautron. J. Dev. Biol. 1990, 142:
pp. 380-385; Johnson S. y Allen R Exp. Cell Res.
1990, 187: pp. 250-254; Dayton W. y Hathaway M.
Poult Sci 1991, 70: pp. 1815-1822) así como su
extracción a partir del músculo esquelético o cardíaco (por
ejemplo, Morrow et coll. J. Clin. Invest. 1990, 85: pp.
1816-1820; Padua R y E. Kardami Growth Factor,
1993, 8: pp. 291-306; Parker T y Scheinder M; Annu.
Rev. Physiol. 1991, 53: pp. 179-200; Casscells W
et coll. Ann N.Y. Acad. Sci. 1990, 593: pp.
148-161).
Se ha descrito la acción cicatrizante de los
factores FGF sobre las lesiones del músculo cardíaco inducidas por
la creación de isquemia (Yanagisawa-Miwa et coll.
Science 1992, 257: pp. 1401-1403).
Franco (US nº 4.378.347) ha descrito también la
utilización de un FGF para el tratamiento en particular de la
isquemia cardíaca. En ciertas formulaciones descritas en esta
patente se utilizan gránulos de dextrano como excipiente.
La actividad de la composición es claramente
imputada al FGF.
Del análisis del estado de la técnica se
desprende, por lo tanto, que los polímeros han sido ya utilizados
en asociación con los factores de crecimiento.
No obstante, en ninguno de los documentos citados
presentan estos polímeros ningún efecto por sí mismos, es decir,
sin asociación con los factores de crecimiento.
Además, la actividad de las asociaciones de
polímeros y factores de crecimiento no ha sido bien descrita más
que en ciertas lesiones de un tipo muy concreto de tejido: el
tejido cutáneo.
Debido a lo imprevisible de los efectos
terapéuticos de una molécula dada, no era evidente que estos
polímeros pudieran tener efectos sobre otros tejidos además de la
piel.
De hecho, es bien conocido que los diferentes
tejidos humanos o animales presentan especificidades, tanto
estructurales como funcionales, que hacen imposible ninguna
predicción sobre el efecto de una molécula conocida por su efecto
sobre el tejido cutáneo o sobre el tejido muscular.
Esto es tan cierto como que los tejidos
musculares son muy diferentes, en cuanto a su estructura y su
origen (mesodérmico), de la epidermis y la dermis.
\newpage
Del mismo modo, es bien conocido que es imposible
predecir la actividad in vivo de una molécula sobre un
tejido particular a partir de los resultados obtenidos in
vitro en un modelo experimental específico.
De manera sorprendente, se ha visto, según la
invención, que ciertos polímeros tienen un efecto muy marcado
sobre la velocidad de cicatrización y regeneración de las lesiones
del tejido muscular, esquelético y cardíaco, así como sobre la
calidad de esta cicatrización y regeneración, pudiendo medirse
mediante estudios histológicos y fisiológicos el grado de
maduración de las fibras musculares.
La presente invención tiene como objeto la
utilización de, al menos, un polímero o de un biopolímero de los
denominados HBGFPP, que protegen específicamente a los factores de
crecimiento de las familias de los FGF y TGF beta de la degradación
por la tripsina y no inhiben de forma significativa la
coagulación, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de los tejidos musculares.
Tal polímero presenta particularmente una
actividad anticoagulante inferior a 50 unidades internacionales
por mg de polímero, medido según Maillet et al. (Mol.
Immunol), 1988, 25, 915-923. Un hecho ventajoso es
que potencia a los FGF in vitro.
Preferentemente, no activa de forma sustancial el
sistema del complemento, es decir, posee una actividad anti
complemento superior a 0,5 \mug para la CH50 (según Mauzac et
al., Biomaterials, 6, 61-63, 1985).
Según la presente invención, se entiende por
polímero toda sustancia natural, natural modificada químicamente,
o totalmente sintética, que responde a la definición que se indica
más arriba.
Puede tratarse de:
- -
- polímeros obtenidos a partir de dextranos modificados por otros tipos de sustituciones con otros tipos de radicales.
- -
- polímeros naturales distintos de los derivados de dextranos que contienen residuos osídicos (celulosa, quitina, fucanos etc.)
- -
- polímeros obtenidos por polimerización de monómeros de naturaleza no osídica (poliácido málico, poliácido oxálico, poliácido láctico, polietilenglicol), modificados o no.
Ventajosamente, dicho polímero o biopolímero es
un polisacárido que puede estar compuesto principalmente de
residuos de glucosa.
Tal polisacárido presentará preferentemente un
peso molecular superior a 10 kD y, ventajosamente, próximo a 40
kD.
Puede también comprender residuos glicosamina,
ácido urónico o ambos, especialmente en forma de dímero de
glicosamina - ácido urónico.
Los polisacáridos particularmente preferidos son
dextranos sustituidos, glicosaminoglicanos eventualmente asociados
a un lípido, un péptido o un prótido o sulfatos de estos
polímeros.
La presente invención se refiere además a una
composición farmacéutica que contiene estos polímeros.
Los polímeros o biopolímeros pueden ser
seleccionados a partir de sustancias naturales que pueden, a
continuación, ser modificadas eventualmente por la adición de
grupos químicos apropiados, o incluso ser obtenidos enteramente por
síntesis. Estos polímeros naturales, semisintéticos o enteramente
sintéticos son luego seleccionados sobre la base de sus
capacidades para interactuar específicamente con diversos factores
de crecimiento, principalmente con los de la familia de los FGF y
TGF beta. También son seleccionados por su capacidad para proteger
a estos factores contra la degradación proteolítica. Estos
polímeros son designados bajo la sigla genérica HBGFPP (heparin
binding growth factor protectors and promoters).
Se indican como ejemplos dos prototipos de estos
polímeros o biopolímeros así como los procedimientos y criterios
de selección de los mismos.
El primer ejemplo de HBGFPP pertenece a la
familia de los CMDBS que son productos conocidos, a saber,
dextranos bioespecíficos funcionalizados sustituidos por residuos
carboximetilo, benzilamida y benzilamina sulfonato. Estos polímeros
ilustran la obtención de HBGFPP a partir de productos naturales
(dextranos) químicamente sustituidos posteriormente.
El segundo ejemplo describe la selección de
productos totalmente naturales como los proteoglicosaminoglicanos
sulfatos purificados a partir de extractos tisulares.
\newpage
Estos dos ejemplos ilustran las capacidades de
estos HBGFPP para interactuar, estabilizar, proteger y potenciar
los factores de crecimiento de las familias FGF y TGF beta y su
utilización en una composición farmacéutica que permite la
cicatrización y regeneración de las células musculares
esqueléticas así como la cicatrización de las células musculares
cardíacas.
En la presente demanda se entiende por
tratamiento toda intervención, curativa o preventiva, efectuada
para la profilaxis y cicatrización de las lesiones del tejido
muscular.
Gracias a la acción de los HBGFPP, y
principalmente de los CMDBS, como ilustran los ejemplos descritos
más adelante, se acelera la reorganización muscular, no
modificándose la arquitectura del músculo, es decir, en el caso de
un músculo esquelético no se modifica de forma significativa el
número de fibras por fascículo organizado. En el caso del músculo
cardíaco, el número de miocitos destruidos tras la lesión provocada
por la isquemia es muy inferior al que se puede encontrar tras el
tratamiento con los HBGFPP. (Resultados corroborados por la
disminución del número de fibroblastos y de fibras colágenas en los
corazones tratados con HBGFPP). Estos resultados ilustran el efecto
citoprotector de los HBGFPP.
Un medicamento o una composición farmacéutica
según la invención contiene una cantidad eficaz de HBGFPP, por
ejemplo, de CMDBS, asociado a uno o varios vehículos compatibles y
farmacéuticamente aceptables. Puede igualmente asociarse a agentes
farmacéuticos como los antiinflamatorios o los antibacterianos y,
para el músculo cardíaco, a antiarrítmicos, anticoagulantes o
agentes trombolíticos. El vehículo puede ser suero fisiológico o
tampones como el PBS que contengan NaCl, 0,15 molar o cualquier otro
tipo de solución compatible y no irritante para el tejido muscular
lesionado. Se pueden proponer formulaciones que permitan obtener
soluciones pastosas o en gel según las técnicas habituales del
especialista, dependiendo del tipo y accesibilidad de la
lesión.
Idealmente, un medicamento tal está concebido
para ser inyectado por vía intramuscular, en dosis de 25 a 2.500
\mug/ml de HBGFPP, como el CMDBS en los ejemplos dados o como
los biopolímeros naturales HBGFPP tales como los mesoglicanos pero
también es otra vía de administración la vía intravenosa. Además
de las cualidades protectoras de los factores de crecimiento
"heparin binding", los HBGFPP seleccionados según las pruebas
descritas más adelante, presentan una muy débil actividad
anticoagulante en comparación con la de la heparina, demasiado
débil para perturbar la coagulación en los casos de traumatismos
musculares. En el caso de inyección por vía intravenosa, la dosis
inyectada debe estar relacionada con el volumen sanguíneo del
paciente o del animal, con el fin de que la dosis de HBGFPP en la
sangre esté comprendida entre 25 y 2.500 \mug/ml.
A título de ejemplo de la aplicación de los
medicamentos según la invención, se pueden citar las atrofias y
distrofias musculares, congénitas o adquiridas y en particular:
- -
- las enfermedades genéticas, como las miopatías (Duchennes, Becker), distrofias de cinturas, etc...),
- -
- las enfermedades en las que existe atonía muscular,
- -
- los accidentes medicamentosos yatrogénicos (tratamiento con cloroquina o inyecciones intramusculares de anestésicos locales).
- -
- los accidentes traumáticos, como distensiones, desgarros, tirones, hematomas y otros, y las heridas o los procedimientos quirúrgicos,
- -
- las lesiones producidas por virus o bacterias, por ejemplo, el virus polioma,
- -
- las atrofias musculares inducidas por la inmovilización,
- -
- las isquemias musculares periféricas como las generadas por las arteriopatías obliterantes periféricas de los miembros.
Con respecto al músculo cardíaco, las lesiones
generadas por disminución o ausencia de irrigación sanguínea
pueden ser prevenidas o atenuadas mediante la utilización de la
composición de la invención. Así, en caso de infarto de miocardio,
la inyección en el músculo infartado de la composición, o la
inyección por vía intravenosa, permite el acceso del HBGFPP en el
territorio cardíaco lesionado.
En los casos de trasplante cardíaco, la
supervivencia de las células cardíacas puede favorecerse por la
adición del medicamento, o de la composición de la presente
invención, al igual que en los casos de cardiomioplastia.
En las insuficiencias cardíacas generadas por
enfermedades hereditarias, como ocurre con la enfermedad de
Duchène o de Becker, o incluso en las miocardiopatías relacionadas
con infecciones víricas, parasitarias o bacterianas.
Una ventaja de la invención es que la inyección
de una dosis única de la composición proporciona el resultado
esperado, es decir, la regeneración completa de las fibras
musculares esqueléticas y la preservación de los miocitos
cardíacos.
Otra ventaja con respecto a las lesiones del
tejido muscular es que favorece igualmente la revascularización
del músculo lesionado.
A título de ejemplos descritos en las páginas
siguientes y refiriéndonos al músculo esquelético, una inyección
única de 25 \mul a 2.500 \mug/ml de CMDBS en el lugar de la
lesión, induce una regeneración completa de las fibras musculares al
cabo de 7 días, no observándose tal efecto en el músculo control.
En los cortes histológicos transversales el número de fibras por
unidad de superficie es 10 veces superior en comparación con el
control no tratado con CMDBS.
Hay que señalar que ni la heparina ni el dextrano
sulfato presentan propiedades sobre la regeneración muscular.
Aunque estas moléculas interactúan con los FGF y, al menos la
heparina, con el TGF beta, ni la sucrasa ni la heparina ni el
dextrano sulfato protegen al TGF beta contra la proteolisis
inducida por la acción de la tripsina, como lo demuestran las
pruebas de cribado y selección de los HBGFPP descritas en los
ejemplos siguientes. Así, procediendo a un cribado in vitro
sobre la base de la protección doble de los FGF y TGF beta contra
la proteolisis inducida por la tripsina, es posible seleccionar
HBGFPP y ciertos CMDBS como los de estos ejemplos. Estos mismos
criterios de selección aplicados a los biopolímeros naturales como
el mesoglicano o la sulodexida han permitido mostrar que el
mesoglicano, que presenta una doble actividad de protección y de
estabilización para, ambos, los FGF y los TGF beta, presenta
actividad favorecedora de la reparación y regeneración muscular,
forma parte de la familia de los HBGFPP, en tanto que la
sulodexida, que protege a los FGF de la proteolisis inducida por
la acción de la tripsina, no tiene acción protectora significativa
contra la acción de la tripsina sobre los TGF beta.
La invención se ilustrará a continuación, sin
estar limitada en modo alguno por los ejemplos que siguen, en los
cuales:
La figura 1 representa la fórmula del CMDBS.
La figura 2 ilustra la potenciación de la
actividad biológica de los FGF1 (2A) y FGF2 (2B) de la heparina,
el mesoglicano y la sulodexida. La medida de la actividad biológica
se realiza con células CCL39, midiendo el incremento de la
incorporación de timidina tritiada en función de la dosis de FGF1
y FGF2, solos o en presencia de 20 \mug de heparina, de 10 \mug
de mesoglicano o de 10 \mug de sulodexida.
Las figuras 3 y 4 ilustran el efecto protector de
la heparina, del mesoglicano y de la sulodexida contra la
degradación térmica del FGF1 (3) y FGF2 (4). Las muestras de FGF
son incubadas, solas o en presencia de 20 \mug de heparina, de10
\mug de mesoglicano o de 10 \mug de sulodexida, a 20ºC (A) y a
37ºC (B) durante 1, 7, 15, y 30 días. La medida de la actividad
biológica representada en la abscisa corresponde a los valores de
las unidades de estimulación. (ED_{50}) de la incorporación de
timidina tritiada en las células CCL39.
La figura 5A ilustra el efecto protector de la
heparina, el mesoglicano y la sulodexida contra la degradación
proteolítica del ^{125}I-FGF1. La digestión
proteolítica ha sido realizada a 37ºC y las muestras han sido
separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida al 18%. Los
geles se secan y se realiza autorradiografía. La primera calle
contiene sólo el ^{125}I-FGF1, en la segunda
calle (calle 2) el ^{125}I-FGF1 ha sido incubado
en presencia de tripsina y heparina (calle 3), de mesoglicano
(calle 4) o de sulodexida (calle 5).
La figura 5B ilustra el efecto protector de la
heparina, del mesoglicano y de la sulodexida contra la degradación
proteolítica del ^{125}I-FGF2. La disposición de
las calles es la misma que la que se ha presentado para el
^{125}I-FGF1 en la figura 5A.
Las figuras 6A y 6B son los perfiles de elución
en columna de DEAE - Trisacryl de las fracciones HSM (Fig. 6A) y
HSS (Fig. 6B), respectivamente, en presencia de fracciones
condroitín sulfato (CSA) para la calibración de la columna.
Las figuras 7, 8, 9 y 10 corresponden a montajes
microfotográficos de un hemicorte transversal de músculo tras 8
días de regeneración, tratado (figuras 8 y 10) y no tratado
(figuras 7 y 9) con CMDBS.
Las figuras 10A a 10D representan los
electrocardiogramas de ratas no operadas (10 A y 10 B) y operadas
(11 C y 11 B).
Las figuras 12 A a 12 F son microfotografías de
cortes histológicos de corazones de rata tratados con suero
fisiológico (12 A y 12 D), con CMDBS (12 B y 12 E) y de ratas
control (12 C y 12 F).
Los CMDBS son dextranos sustituidos por grupos
carboximetilo, benzilamida y benzilamina sulfonato. El método de
síntesis de los CMDBS puede ser el descrito por M. MAUZAC y J.
JOSEFONVICZ en Biomaterials, 1984, 5, 301-304. Según
este procedimiento, el carboximetil dextrano (CMD) se prepara a
partir de dextrano por sustitución de algunas unidades
glusosiladas con grupos carboxilo en el carbono en posición 5 ó 6.
En una segunda etapa, la benzilamida es acoplada a los grupos
carboxílicos para formar la carboximetil benzilamida dextrano (o
CMBD). Finalmente, algunos núcleos aromáticos de benzilamida son
sulfonados para dar lugar a carboximetil dextrano benzilamida
sulfonato o CMDBS.
Antes de su utilización, se realiza la
ultrafiltración, liofilización y disolución en el tampón apropiado
de las sales de sodio de estos derivados.
En la figura 1 se ilustra la fórmula general de
los CMDBS.
Los CMDBS poseen una distribución estadística de
los diferentes sustituyentes. Los porcentajes de cada tipo de
CMDBS se determinan con los métodos clásicos.
Durante la síntesis de los CMDBS es posible
controlar la tasa de sustitución de cada uno de los agrupamientos
mediante modificación de las condiciones de la reacción de
sustitución. El control de los parámetros, como la temperatura, el
tiempo de reacción, las concentraciones relativas de los
constituyentes y el número de la reacción de sustitución etc..
permiten obtener un gran número de polímeros sustituidos. La
sustitución de los hidroxilos por el carboximetilo en los carbonos
en posiciones 5 y 6 permite obtener tasas de carboximetilación
entre 0 y 200% (100% para cada uno de los carbonos en posiciones 5
y 6). El grupo carboximetilo puede ser, a su vez, parcial o
totalmente utilizado para la fijación de la benzilamida. Los
grupos benzilamida pueden ser parcial o totalmente utilizados para
la sulfonación. Los dextranos sustituidos funcionalizados
utilizados según la invención están entre los especialmente
descritos en la patente francesa nº 2.461.724. Además de la
capacidad de estabilizar y proteger los factores de crecimiento de
la familia FGF, como ha sido descrito en la publicación de Tardieu
et coll., J. Cell. Physio. 1992, 150, p 194 a 203 y en la patente
francesa nº 2.461.726, el CMDBS seleccionado debe poder interactuar
al menos con un miembro de los factores de crecimiento de la
familia TGF beta, según el método de evaluación descrito más
adelante, y proteger los TGF beta contra la proteolisis.
Con el fin de medir la capacidad de ciertos CMDBS
para interactuar con los miembros de la familia TGF beta y como
consecuencia de dicha interacción proteger los TGF beta, se ha
establecido una prueba de cribado. Esta prueba consiste en medir la
capacidad del CMDBS seleccionado para permitir al TGF beta
conservar su actividad biológica a pesar del tratamiento
proteásico.
En el ejemplo de más adelante, el CMDBS utilizado
es el lote 26.2 definido por una tasa de sustitución del 110% de
motivos carboximetilo, 3,6% de motivos benzilamida y 36,5% de
motivos sulfonato, con una actividad anticoagulante de 4 UI/mg
(Unidades Internacionales). La actividad anticomplemento de este
lote es de 1,1 \mug para la CH50, medida según Mauzac et al
(previamente citados).
La heparina utilizada como control procede de los
establecimientos Sanofi (Institut Choay) y presenta una actividad
anticoagulante de 175 UI/mg.
El TGF beta 1 se prepara a partir de plaquetas
sanguíneas humanas, según el protocolo descrito en numerosas
publicaciones y habitualmente utilizado por el experto en la
materia (por ejemplo, en las publicaciones Growth Factors and their
Receptors 1992, vol 1, páginas 419-472, de A.
Roberts y M. Sporn, editado por A. Roberts y M. Sporn y publicado
por Springer Verlag, Berlín. La prueba de la actividad biológica
del TGF beta utilizado en este ejemplo es la inhibición del
crecimiento de células CCL64 (procedentes de American Tissue
Culture Collection), Esta inhibición se mide por la capacidad del
TGF beta para inhibir la incorporación de timidina tritiada de
forma dependiente de la dosis, en las células CCL64 estimuladas por
el factor de crecimiento FGF o por suero de ternera fetal, según el
protocolo descrito por Van Zolen en Progress in Growth Factor
Research, 1990, 2, pp 131 a 152.
El TGF beta se utiliza en dos dosis, una
correspondiente a la capacidad de inhibición de la incorporación
de timidina tritiada del 50% (definida como la unidad de actividad
inhibidora) y otra correspondiente a la capacidad de inhibición del
100%. En este ejemplo, los valores obtenidos son 250 pg de TGF
beta para lograr la unidad de actividad de inhibición sobre las
células CCL64 cultivadas en 1 ml de medio de cultivo. El 100% de
inhibición se obtiene con 1 ng de TGF beta en 1 ml de medio de
cultivo.
Se incuba una muestra de 50 ng de TGF beta en
tampón fosfato salino que contenga 0,1% de albúmina sérica bovina
(procedente de la Sociedad SIGMA en Saint Louis, USA) sola o tras
la adición de 5.000 \mug de CMDBS o 5.000 \mug de heparina, con
o sin 500 \mug de tripsina. El volumen final de la solución
incubada se ajusta a 1 ml y se realiza la incubación a 37ºC
durante un tiempo variable (10 minutos en el ejemplo descrito (tabla
1).
\newpage
Se extraen muestras de 20 \mul de cada una de
las reacciones de incubación y se añaden a las células CCL64
cultivadas en placas de 24 pocillos, conteniendo cada uno un
mililitro de medio de cultivo, según el protocolo descrito por E.
Zohlen, mencionado previamente. En estas condiciones, la
concentración final de TGF beta por pocillo es 1 ng/ml. La tabla 1
resume los resultados obtenidos en diversas condiciones y muestra
el efecto protector del CMDBS. Así, tras 10 minutos de incubación
a 37ºC, está presente todavía el 75% de la actividad biológica del
TGF beta, en tanto que la heparina que, sin embargo, puede fijarse
al TGF beta (Mac Caffrey et al., J. of Cell. Physiology,
1992, vol. 52, 430-440) no protege al TGF beta
contra esta degradación proteolítica (queda menos del 20% de la
actividad biológica). Hay que recordar que en el caso de los FGF,
la heparina asegura la protección frente a la proteolisis inducida
por la tripsina (Tardieu et al., Journal of Cellular
Physiology, 1992, 150: 194-203).
Se ha comprobado que el CMDBS no tenía poder
inhibidor sobre la actividad de la tripsina (tabla 2). Así, 10
\mug de tripsina incubados con un sustrato (S.87, proporcionado
por la sociedad Serbio, París, y utilizada según las
recomendaciones del proveedor) o con este sustrato y un inhibidor
de la tripsina como el derivado de la soja (por ejemplo, el
Soyabean trypsin inhibitor o STI de Sigma), incubando en
presencia o ausencia de cantidades variables de CMDBS (lote AM26).
La actividad enzimática de la tripsina se ha medido por
espectrofotometría de absorción del producto de transformación del S
87 en función del tiempo de incubación.
Se han seleccionado dos preparaciones comerciales
de proteoglicosaminoglicanos y glicosaminoglicanos, en función de
sus capacidades para interactuar con los factores de crecimiento
de la familia FGF así como con los de la familia del TGF beta.
Por otra parte, se han analizado preparaciones
de heparán sulfato obtenidas por fraccionamiento del mesoglicano y
de la sulodexida.
El mesoglicano y la sulodexida han sido
proporcionados por la Sociedad Sigma Chemical Co, Saint Louis MO
USA, previamente citada.
Las células utilizadas en el ejemplo son las
células CC139, que proceden de American Tissue Culture Collection.
Las condiciones de cultivo y de las pruebas de medida de la
actividad biológica de los FGF son las mismas que las descritas en
la publicación de Tardieu et col., J. Cell. Physiol., 1992.
Sus propiedades se resumen en la tabla 3. Los factores de
crecimiento FGF utilizados son formas recombinantes FGF 1 y FGF
2.
En estos experimentos, se utiliza el FGF 1 ó 2 en
una dosis correspondiente a la dosis eficaz (ED_{50}) para
inducir una estimulación de la actividad biológica del 50% de la
dosis inductora de la estimulación máxima. La actividad biológica
se mide por la capacidad para inducir un aumento de la
incorporación de timidina tritiada en las células, según los
protocolos ampliamente descritos en numerosas publicaciones entre
las cuales está la de Tardieu et col., previamente mencionada, y
también en la patente francesa nº 2.644.066. En este ejemplo la
ED_{50} es 5 ng/ml para el FGF 1 y 3 ng/ml para el FGF 2, valores
medidos experimentalmente (Figs. 2A y 2B). El mismo experimento de
estimulación en función de la dosis de FGF se efectúa en presencia
de 10 \mug/ml de mesoglicano o de sulodexida o de 20 \mug/ml de
Heparina. La figura 2 muestra que en estas condiciones la ED_{50}
es 0,4 ng/ml y 0,2 ng/ml, respectivamente, para los FGF 1 y FGF 2
en presencia de estas dosis de mesoglicano o de heparina. Además
de esta capacidad de potenciar la actividad biológica de los FGF,
los HBGFPP protegen a los FGF contra la degradación térmica así
como contra la inactivación inducida por la acción proteolítica de
la tripsina (Figs. 3 a 5). Del mismo modo, estos HBGFPP protegen
al FGF 1 y 2 contra la inactivación inducida por la actividad
proteolítica de la tripsina (Figs. 5A y 5B).
Se han evaluado otros compuestos: el dextrano
sulfato (Sigma Chemical), con un peso molecular de 40.000,
habiendo servido el dextrano para la síntesis del CMDBS (igualmente
de Sigma) la sucrasa o sucrosa octilsulfato (proporcionado por D.
Bar Shalom, Société Bukh Medic, Danemark). Algunos de estos
compuestos se han elegido porque protegen y estabilizan los FGF.
Por ejemplo, la sucrasa (patente US nº 5.202.311) o el dextrano
sulfato (patente japonesa nº 1 38907/88). El dextrano es el que ha
servido para la síntesis del CMDBS AM26.
El experimento sobre la protección de la
actividad biológica de los TGF beta ha sido realizado de la misma
forma que con los CMDBS, que ha sido descrito en el ejemplo 1 ii:
la mezcla de incubación contiene 50 ng de TGF beta (en albúmina
sérica bovina al 0,1%) y tripsina (500 \mug). El mesoglicano o
la sulodexida o el dextrano sulfato o la sucrasa se utilizan en
dosis de 5.000 \mug.
La actividad biológica del TGF beta se mide como
se ha descrito más arriba, tras diluir 50 veces, utilizando para
ello células CCL64.
Los resultados se presentan en la tabla 4.
Estos resultados ilustran que, a excepción de
ciertos CMDBS capaces de responder sólo a los dos criterios de
selección en relación con los FGF y TGF beta, entre los demás
compuestos analizados, el mesoglicano presenta una actividad
protectora significativa para los TGF beta.
La sulodexida y el mesoglicano corresponden a
mezclas de diversas sustancias de las cuales lo esencial son los
diferentes glicosaminoglicanos (GAG).
En una primera etapa de purificación, se ha
establecido que un gramo de producto seco de cada uno de estos dos
productos contenía 874 mg de mesoglicano y 795 mg de sulodexida
de GAG, respectivamente.
Esta purificación ha sido obtenida sometiendo
estos productos solubilizados a una cromatografía de intercambio
de iones (DEAE - Trisacryl) para eliminar todos los contaminantes
proteicos. A continuación se purifican los GAG totales, eluyendo el
gel de DEAE con una solución de acetato de sodio, pH 4, conteniendo
NaCl 1,5 M.
Tras una fase de diálisis extensiva contra agua,
se digieren 60 mg de cada producto de GAG con condroitinasa ABC
durante una noche, a 37ºC (1 unidad por mg de GAG). Esta enzima
degrada todos los GAG excepto los heparán sulfato (HS). Los
productos de la digestión son sometidos a una cromatografía con
tamiz molecular (Sephadex G50, en columna de 1,8 x 95 cm). A
continuación se eluye en tampón de bicarbonato de amonio, con un
flujo de 18 ml/h. El material no digerido, que corresponde a GAG de
tipo HS, se colecta en el volumen muerto de elución de la
columna.
Las concentraciones de GAG se calculan a partir
de su contenido en ácido urónico, con el método del carbazol
(Bitter T. y Muir H.M., 1962, Anal. Biochem. 4,
330-334).
Estas dosificaciones han permitido precisar la
composición siguiente para cada uno de los productos:
| Sulodexida | Mesoglicano | |
| GAG total | 79% | 87% |
| Fracción heparán sulfato (HS) | 48% | 52% |
| Otros GAG | 31% | 35% |
Las fracciones HS de cada uno de estos dos
productos han sido cromatografiadas de nuevo en gel de DEAE -
Trisacryl. 1 mg de cada fracción HS purificada a partir de
mesoglicano (Fig. 6 A) o de sulodexida (Fig. 6 B), en 3 ml, se
deposita en una columna equilibrada con tampón 0,05 M NaCl, 0,05 M
TMS-Hel, pH 7,5. Tras un lavado de la columna con 10
volúmenes del mismo tampón seguido de un lavado por 10 volúmenes de
un tampón 0,05 M NaCl, 0,05 M de acetato de sodio, pH 4, el
material fijado a la columna es desorbido por un gradiente salino
conteniendo NaCl 0,05 M a 1,5 M hace en el mismo tampón acetato. Se
dosifica con el método del carbazol 1 mg de cada fracción
colectada.
El material correspondiente a los constituyentes
HS de cada uno de los productos de origen presenta aproximadamente
el mismo perfil de elución y, por lo tanto, aproximadamente la
misma carga aparente. Este máximo del pico de elución se obtiene con
una concentración salina de NaCl 0,94 M. Para calibrar la
cromatografía se ha sometido al mismo protocolo una fracción
definida de condroitín sulfato (CSA). Esta fracción de CSA, que no
contiene más que un grupo sulfato por disacárido, es eluida con una
fuerza iónica de NaCl, 0,72 M.
Estos resultados muestran que la fracción HS
contiene más grupos sulfato que los CSA de referencia. La fracción
HS presenta alrededor de dos grupos sulfato por unidad
disacárida.
Estas fracciones han sido probadas para conocer
su poder protector frente al TGF beta y FGF, en comparación con
los poderes establecidos con los productos brutos respectivos.
Como se ha descrito previamente, se ha incubado
una cantidad constante de FGF radiactivo en diferentes
condiciones. Tras la autorradiografía de los productos de la
reacción, se ha cuantificado por densitometría la cantidad de FGF
radiactivo no degradado. Los valores corresponden al porcentaje de
FGF marcado en comparación con la cantidad depositada al comienzo
de la reacción (tabla 5).
Los resultados de las tablas 4 y 5 muestran que
las fracciones HSM y HSS procedentes del mesoglicano y de la
sulodexida, respectivamente, presentan efectos protectores
superiores a estas dos composiciones y próximos al 100%.
El poder de inhibición de diferentes CMDBS y de
los compuestos intermedios de su síntesis ha sido establecido para
la elastasa leucocitaria y la plasmina.
La elastasa leucocitaria purificada ha sido
obtenida de Elastin Products Co (Owenville, MO. USA) y la plasmina
procede de SIGMA.
La inhibición de las actividades enzimáticas por
estos compuestos diferentes se ha realizado a 37ºC, en un baño
provisto de termostato. Las ezimas consideradas se ponen en una
solución con tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8, para la
elastasa y pH 7,4 en el caso de la plasmina, en presencia de azida
sódica al 0,02% y Triton X100 al 0,01% en el caso de la plasmina.
Las concentraciones de los sustratos y de las enzimas son: 0,10 mM
MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA
(paranitroanilida) para la elastasa, 8,3 nM y 0,20 mM
dVal-Leu-dLys-pNA
para la plasmina, 77 nM. Se ha establecido la IC50 en cada una de
las condiciones.
La tabla 6 muestra los resultados obtenidos en
los que el lote AM6 corresponde a un dextrano T40 de 40.000 kD. El
lote EM5 corresponde a un dextrano T10 de 10.000 kD. Los productos
intermedios de la síntesis son catalogados según las siglas
indicadas más arriba e indizados con un número que indica el
número de cada una de las reacciones de sustitución.
Los valores de las IC50 muestran que los CMDBS
tienen efectos inhibidores de tipo hiperbólico no competitivo
sobre la actividad de la elastasa leucocitaria comparables a los de
la heparina, uno de los mejores inhibidores de esta actividad (Ki
del orden de 1 nM). Los CMDBS ejercen, además, y a la inversa de
la heparina, efectos inhibidores sobre la plasmina.
De la tabla 6 se deduce, además, que los efectos
inhibidores de las fracciones HSM y HSS son superiores a los del
mesoglicano y la sulodexida, respectivamente.
La experimentación ha sido realizada en siete
ratas Wistar de dos meses y medio de edad y trescientos gramos de
peso.
Tras anestesia con éter, se separan de la celda
anterior de la pata los músculos EDL (músculos de las patas
traseras de la rata) y se lesionan mecánicamente mediante la
aplicación de una presión constante en toda la longitud el músculo,
usando para ello una pinza de Péan. Se mantiene la presión durante
quince segundos, con la pinza cerrada en la segunda muesca. La
homogeneidad de la lesión en la totalidad del músculo ha sido
controlada siguiendo el infarto durante treinta segundos. A
continuación se repone el músculo en su celda y se sutura la piel
con hilo de lino.
Los músculos EDL han recibido una única inyección
de 200 \mul de CMDBS o de sulfato de dextrano (DS) a 50
\mu/ml, diluidos en PBS sin calcio ni magnesio. Los controles de
regeneración han recibido una inyección de la misma cantidad de PBS.
Según los experimentos, la inyección se realiza antes o después de
la lesión del músculo. Los 200 \mul se inyectan en un minuto y
la difusión del producto de ha asegurado dejando el músculo in
situ durante dos minutos antes de reponerlo a su celda. Se han
tratado cinco músculos EDL con CMDBS y dos con sulfato de
dextrano.
Tras ocho días de regeneración, se extraen los
músculos tratados y los controles y se congelan inmediatamente en
isopentano a -150ºC. Se realizan cortes de congelación
transversales, de 10 \mum de grosor en la región media del
músculo. Se secan los cortes y se tiñen con tricrómico de
Gomori.
El análisis morfométrico del número de fibras y
su diámetro se realiza en montajes micrográficos correspondientes
a un hemicorte transversal del músculo.
Durante la extracción de los músculos tras 8 días
de regeneración, el examen macroscópico muestra un aspecto
diferente entre los músculos tratados con CMDBS y los que
recibieron una inyección de PBS. Los músculos tratados tienen un
color rojo oscuro en tanto que los controles tienen una coloración
mucho más pálida. Esta diferencia sugiere, en el primer caso, una
vascularización mucho más rica y una tasa de mioglobina más
elevada. Por otra parte, el diámetro de los músculos inyectados con
CMDBS es claramente mayor (ver la tabla 7); ocupan toda la celda
anterior de la pata y desplazan hacia fuera al músculo tibial
anterior.
Las figuras 7 a 10 corresponden a montajes
microfotográficos de un hemicorte transversal de músculo EDL tras
8 días de regeneración, tratado o no con CMDBS. El músculo tratado
(figura 8) presenta un número mayor de fibras regeneradas (F), con
un diámetro mayor que el músculo no tratado (figura 7). La
inyección única de CMDBS en el momento de la lesión induce también
una mejor reconstrucción del músculo: los fascículos musculares,
separados por el conjuntivo del perimisio (C) están bien
diferenciados en el día 8º (figura 9, no tratado y figura 10
tratado con CMDBS). En la regeneración normal, este estadio de la
reconstrucción no se alcanza más que al cabo de tres semanas. El
examen histológico de los cortes muestra igualmente una
vascularización más importante y un grado de reinervación más
elevado.
Los resultados son idénticos independientemente
de que la inyección del mismo EDL se realice antes o después de la
lesión.
Los datos de la tabla 7 muestran que el efecto
del CMDBS es muy importante sobre la velocidad de regeneración
(número de fibras regeneradas en 8 días) y sobre el grado de
maduración (diámetro medio de las fibras). Por el contrario, la
arquitectura del músculo (número de fibras por fascículo) no se
modifica de forma significativa.
La inyección de sulfato de dextrano en las mismas
condiciones que la de CMDBS, no induce ninguna modificación
cualitativa ni cuantitativa de la regeneración muscular.
El experimento se ha realizado en 18 ratas Wistar
machos de dos meses y medio de edad y unos 300 gramos de peso.
El protocolo es rigurosamente idéntico al del
ejemplo 4 aunque previamente al aplastamiento del músculo se ha
realizado la sección del nervio motor antes de su entrada en el
mismo.
Las sustancias utilizadas están disueltas en una
solución salina tamponado con fosfato (PBS).
La inyección se realiza tras la desnervación y
aplastamiento, utilizando una microjeringa de 50 \mul provista
de una aguja flexible de 60 mm de longitud y 0,4 mm de diámetro. Se
realizan dos inyecciones a intervalos de 2 minutos. El volumen
inyectado es, por lo tanto, 100 \mul. La sucrasa (glucosa
octilsulfato) ha sido generosamente proporcionada por D. Bar Shalom
Bulk Medic Danemark.
Tras el sacrificio del animal, se pesan los
músculos EDL de la pata tratada y de la pata contralateral. Las
variaciones individuales del peso de los músculos normales de los
animales de la misma edad pueden alcanzar el 20% y los resultados
se han estandarizado calculando la relación entre el músculo
tratado y el control intacto contralateral.
En los músculos tratados sólo con PBS, esta
relación ha sido considerada 100%. El grado de regeneración de los
músculos tratados con los diferentes sustancias ha sido calculada
en % del músculo inyectado con PBS. Los resultados se expresan en la
tabla 8.
Estos resultados muestran el efecto específico de
los HBGFPP sobre la regeneración muscular. De hecho, sólo ciertos
CMDBS y el mesoglicano, que muestran un efecto protector y
promotor a la vez para los FGF y los TGF beta, inducen una
regeneración significativa (190% y 133%, respectivamente).
Los experimentos sobre la cicatrización del
miocardio han sido realizados en la rata.
La rata es un buen modelo experimental en
comparación con otras especies animales porque, como el hombre, no
posee circulación colateral entre las coronarias derecha e
izquierda.
Ratas Wistar (Wi/Wi, Ico, IFFA CREDO, Francia)
macho de 350 g de peso son anestesiadas con pentobarbital sódico
por vía intraperitoneal.
Se rasura el tórax y el cuello de los animales y
se realiza un electrocardiograma (ECG) preoperatorio.
Una traqueotomía permite la ventilación asistida
del animal, combatir el neumotórax peroperatorio y disminuir la
mortalidad postoperatoria.
Tras la instalación de la rata en decúbito
lateral derecho se coloca una pequeña retención bajo el tórax y se
realiza una toracotomía lateral izquierda (un través de dedo por
encima de las costillas flotantes, lo que corresponde al 4º-5º
espacio intercostal izquierdo). Se expone el corazón, se incide el
pericardio, se identifica el ventrículo izquierdo y se liga la
arteria coronaria izquierda en su origen con un hilo de PROLENE
6/0. Un minuto después la zona infartada es visible y el registro
de la actividad eléctrica del corazón permite visualizar las ondas
de Pardie, que indican la ocurrencia del infarto.
Se inyecta, en el centro de la región infartada,
en un solo punto, utilizando para ello una jeringa Hamilton, 10
\mul de una solución de 50 \mug/ml de CMDBS preparado en suero
fisiológico, o 10 \mu de la misma solución sin CMDBS.
A continuación se cierra el tórax, se aspira el
neumotórax y se deja la ventilación asistida hasta que el animal
está totalmente despierto. Se realiza un nuevo ECG.
En la figura 11 se representan los
electrocardiogramas (ECG) de las ratas antes y después del
infarto. Los trazados A y B muestran dos tipos de electrocardiograma
que pueden registrarse en las ratas no operadas. Los trazados C y
D son los ECG postoperatorios de estas mismas ratas. Existe un
desplazamiento muy nítido del segmento ST que señala el
infarto.
Las ratas que se conservan para la
experimentación son las que presentan en el momento del cierre del
tórax los signos eléctricos típicos de infarto de miocardio; los
demás animales son eliminados del estudio.
Tras el examen del ECG se sacrificaron 33 ratas
en los días 7, 15 y 30 del postoperatorio, registrándose un ECG
antes de la eutanasia. Se realizó el estudio histológico de los
corazones infartados.
Los resultados histológicos se presentan en la
Figura 12, que ilustra el estudio histológico correspondiente al
día 15 del postoperatorio de los corazones de rata infartados por
la ligadura de la arteria coronaria izquierda, con tinción con
tricrómico de Masson.
Figuras 12 A y 12 D (inyección de 10 \mul de
suero fisiológico en el centro de la zona infartada). Se constata
la existencia de un infarto subendocárdico que asienta en la pared
del ventrículo izquierdo (12 A). El ventrículo es atrófico y
presenta una importante reacción inflamatoria en la periferia así
como una intensa fibrosis. La figura 12 D (x 25) muestra el centro
del infarto. Se muestra la existencia de una importante atrofia
marcada por la aparición de fibrosis y la total desaparición de
fibras miocárdicas; hay algunas células inflamatorias.
Figuras 12 B y 12 E: Tratamiento del infarto con
CMDBS (inyección en la zona infartada de 10 \mul de una solución
de 50 \mug/ml). El infarto es, igualmente, subendocárdico y
asienta en el ventrículo izquierdo; la zona atrófica es menos
extensa y hay fibras miocárdicas intactas (12 B). La figura 12 E
(x 25) muestra numerosas áreas vasculares y fibras miocárdicas
aparentemente intactas en un ambiente fibroso.
Figuras 12 C y 12 F: Fotografías de un corazón
control.
Resulta evidente que está conservado el tamaño de
la pared del ventrículo izquierdo en los corazones tratados con
CMDBS y que los corazones de la serie de control presentan unas
paredes más delgadas y una zona infartada más extensa. En los
corazones infartados tratados con CMDBS hay zonas de regeneración
miocárdica.
| Mezcla de incubación a 37ºC durante 10 minutos que | % de actividad inhibidora de la incorporación |
| contiene, según la indicación: CMDBS o heparina | de timidina tritiada en células CCL64 (tras la |
| (5.000 \mug); TGF beta (50 \mug); tripsina (500 \mug) | dilución de la mezcla de incubación 50 veces) |
| Tampón de incubación solamente | 0 |
| CMDBS (5.000 \mug) | 0 |
| Heparina (5.000) \mug | 0 |
| Tripsina (1.000 \mug) | 0 |
| beta TGF (50 \mug) | 100 |
| beta TGF + CMDBS (lote AM26) | 100 |
| Mezcla de incubación a 37ºC durante 10 minutos que | % de actividad inhibidora de la incorporación |
| contiene, según la indicación: CMDBS o heparina | de timidina tritiada en células CCL64 (tras la |
| (5.000 \mug); TGF beta (50 \mug); tripsina (500 \mug) | dilución de la mezcla de incubación 50 veces) |
| beta TGF + Heparina | 100 |
| beta TGF + Tripsina | 5 |
| beta TGF + CMDBS + Tripsina | 75 |
| beta TGF + Heparina + Tripsina | 10 |
| Tripsina (10 \mug/ml) + S87 | 100 |
| Tripsina + S87 + 5 \mug/ml de CMDBS | 100 |
| Tripsina + S87 + 50 \mug/ml de CMDBS | 100 |
| Tripsina + S87 + 500 \mug/ml de CMDBS | 100 |
| Tripsina + S87 + STB1 | 0 |
| Sulodexida | Mesoglicano | |
| Origen | duodeno de cerdo | aorta |
| Actividad anticoagulante | 50-70 UI/mg | < 50 UI/mg |
| Composición química | ||
| Dermatán sulfato | 20-35% | 25-60% |
| Condroitín sulfato | 2-7% | 3-15% |
| Heparán sulfato | + | + |
| TGF beta | 100% |
| TGF beta + tripsina | 0% |
| TGF beta + mesoglicano | 100% |
| TGF beta + mesoglicano + tripsina | 50% |
| TGF beta + HSM | 100% |
| TGF beta + HSM + tripsina | 75% |
| TGF beta + sulodexida | 100% |
| TGF beta + sulodexida + tripsina | 20% |
| TGF beta + HSS | 100% |
| TGF beta + HSS + tripsina | 45% |
| TGF beta + dextrano | 100% |
| TGF beta + dextrano + tripsina | 0% |
| TGF beta + dextrano sulfato | 100% |
| TGF beta + dextrano sulfato + tripsina | 0% |
| TGF beta + sucrasa | 100% |
| TGF beta + sucrasa + tripsina | 0% |
| HSM = Heparán sulfatos purificados a partir de mesoglicano |
| HSS = Heparán sulfatos purificados a partir de sulodexida |
| Protección en % | ||
| FGF sólo | 100 | |
| FGF + tripsina | 0 | |
| FGF + tripsina + heparina | 100 | |
| FGF + tripsina + mesoglicano | 75 | |
| FGF + tripsina + sulodexida | 70 | |
| FGF + tripsina + mesoglicano tratado | 0 | |
| Heparinasa | ||
| FGF + tripsina + sulodexida tratado | 0 | |
| Heparinasa | ||
| FGF + tripsina + heparina tratada | 0 | |
| Heparinasa | ||
| FGF + HSM + tripsina | 95 | |
| FGF + HSS + tripsina | 90 |
| Compuesto analizado | Elastasa leucocitaria | Plasmina |
| IC50 en \mug/ml | IC50 en \mug/ml | |
| CMDBS lote AM6 | 2,2 | 1,5 |
| T40 | > 100 | > 100 |
| CMDBS lote EM5 | 10 | 7 |
| T10 CMD 2B | 50 | 53 |
| T10 5CMD 1B | > 100 | > 100 |
| T10 3CMD | > 100 | > 100 |
| T10 | > 100 | > 100 |
| Mesoglicano | 72 | 65 |
| HS mesoglicano | 20 | 22 |
| Compuesto analizado | Elastasa leucocitaria | Plasmina |
| IC50 en \mug/ml | IC50 en \mug/ml | |
| Sulodexida | 79 | 75 |
| HS sulodexida | 25 | 20 |
| Heparina | 1,8 | |
| Lipoheparina | 0,5 | |
| HSM = Heparán sulfatos purificados a partir de mesoglicano | ||
| HSS = Heparán sulfatos purificados a partir de sulodexida |
| EDL contralateral de | EDL tratado con | EDL tratado con | |
| control | CMDBS | D.S. | |
| Diámetro de los músculos, en mm | 4,1 \pm 0,1 | 6,2 \pm 0,4 | 3,9 \pm 0,4 |
| Número de fibras en un hemicorte | 519 | 5523 | 418 |
| Densidad de las fibras regeneradas (nb/mm^{2}) | 67,4 | 639,2 | |
| Diámetro medio de las fibras regeneradas | 30,16 \pm 2,5 | 56,4 \pm 3,62 | 28,2 \pm 4,6 |
| Número de fascículos musculares por corte | 7 | 15 | |
| Número de fibras por fascículo | 67,7 \pm 7 | 75 \pm14 |
| Sustancia: peso inyectado | Relación regeneración degeneración/ | % relación tratado/ |
| contralateral intacto | relación degenerado | |
| PBS | 0,705 | 100 |
| CMDBS (10 \mug) | 1,342 | 190 |
| Sucrasa (10 \mug) | 0,620 | 87 |
| Heparina (10 \mug) | 0,590 | 86 |
| Sulodexida (10 \mug) | 0,638 | 90,7 |
| Mesoglicano (10 \mug) | 0,940 | 133 |
Claims (15)
1. Utilización de por lo menos un polímero o de
un biopolímero, de los denominados HBGFPP, que protegen
específicamente los factores de crecimiento de las familias FGF y
TGF beta de la degradación por la tripsina sin inhibir de forma
significativa la coagulación, para la preparación de un
medicamento para la profilaxis y la cicatrización de las lesiones
del tejido muscular, esquelético o cardíaco.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque el polímero o biopolímero presenta una
actividad anticoagulante inferior a 50 unidades internacionales por
mg de polímero.
3. Utilización según una de las reivindicaciones
1 y 2, caracterizada porque dicho polímero no activa
sustancialmente el sistema complemento.
4. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizada porque dicho polímero potencia in
vitro los FGF.
5. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizada porque dicho polímero inhibe
sustancialmente las actividades proteásicas de la elastasa y/o la
plasmina.
6. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizada porque dicho polímero o biopolímero es
un polisacárido.
7. Utilización según la reivindicación 6,
caracterizada porque dicho polímero está compuesto
principalmente por residuos de glucosa.
8. Utilización según la reivindicación 6,
caracterizada porque el polisacárido comprende residuos
glicosamina y/o ácido urónico.
9. Utilización según la reivindicación 8,
caracterizada porque los polisacáridos comprenden dímeros
de glicosamina - ácido urónico.
10. Utilización según una de las
reivindicaciones 8 y 9, caracterizada porque dicho
polisacárido es un proteoglicosaminoglicano o un glicosaminoglicano
o un sulfato de uno de tales compuestos.
11. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicho
polisacárido es un dextrano sustituido.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho polisacárido es un CMDBS.
13. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicho polímero
es de naturaleza no osídica.
14. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el tejido
muscular es el de los músculos cardíacos o esqueléticos.
15. Composición farmacéutica para el tejido
muscular esquelético o cardíaco que contiene por lo menos un
polímero según las reivindicaciones 1 a 11, asociado con por lo
menos un excipiente farmacológicamente aceptable, con la excepción
de una composición farmacéutica que contenga una asociación de
heparina y sulodexida.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9403803A FR2718026B1 (fr) | 1994-03-30 | 1994-03-30 | Médicament et composition pharmaceutique pour le traitement des muscles. |
| FR9403803 | 1994-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2202358T3 true ES2202358T3 (es) | 2004-04-01 |
Family
ID=9461614
Family Applications (1)
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