ES2334447T3 - Uso del acido 2,5-hidroxibencenosulfonico, en la fabricacion de medicamentos de aplicacion en el tratamiento de enfermedades angiodependientes tales como cancer y psoriasis. - Google Patents
Uso del acido 2,5-hidroxibencenosulfonico, en la fabricacion de medicamentos de aplicacion en el tratamiento de enfermedades angiodependientes tales como cancer y psoriasis. Download PDFInfo
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Abstract
Uso del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico, en la fabricación de medicamentos de aplicación en el tratamiento de enfermedades angiodependientes. La invención cubre la aplicación de este compuesto y, particularmente de sus sales cálcica y potásica, en el tratamiento de dos enfermedades angiodependientes y que presentan disminución de la apoptosis, como son el cáncer y la psoriasis. La invención pone de manifiesto la capacidad antiproliferativa, antimigratoria, antiangiogénica y proapoptótica de esta familia de compuestos en células no quiescentes. Asimismo refleja el efecto potenciador de estos compuestos sobre conocidos fármacos citostáticos en el tratamiento de tumores, en concreto sobre gliomas. Por último se pone de manifiesto la eficacia terapéutica de estos compuestos, basada en la combinación de sus capacidades antiproliferativa, antiangiogénica y proaptótica, en el tratamiento de placas psoriásicas crónicas.
Description
Uso del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico, en la fabricación de
medicamentos de aplicación en el tratamiento de enfermedades
angiodependientes tales como cáncer y psoriasis.
Esta invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico, y su empleo en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
caracterizadas por una intensa proliferación celular, gran
vascularización (enfermedades angiodependientes) y más
particularmente enfermedades angiodependientes que presenten además
disminución de la apoptosis, como ocurre por ejemplo en el cáncer o
la psoriasis.
Los tumores malignos se caracterizan, aparte de
por su incontrolada proliferación celular, por su capacidad para
invadir los tejidos peritumorales normales. La invasión tumoral es
un proceso complejo que se desarrolla según las siguientes etapas
consecutivas: a) adhesión de las células tumorales a proteínas de la
matriz extracelular; b) degradación de las proteínas de la matriz
extracelular por proteasas que crean espacios extracelulares que
las células tumorales utilizan para, c) migrar mediante un
mecanismo dinámico y complejo que requiere la síntesis de nuevas
porciones de la membrana citoplásmica y reorganización del
citoesqueleto (Giese A., Westphal M. Neurosurgery 1996; 39:
235-252).
Las células que desde la masa tumoral invaden el
tejido peritumoral normal tienen inactivado su programa genético de
muerte celular programada y por ello, las células tumorales que
migran para invadir los tejidos sanos peritumorales, eluden la
apoptosis (Mariani I. et al. Clin. Cancer Res. 7:
2480-2489, 2001). Cuando las células tumorales
agrupadas alcanzan una masa de 2 a 3 mm^{3}, para contrarrestar la
situación de hipoxia de este tumor primario, las propias células
tumorales sintetizan grandes cantidades de factores angiogénicos
(Folkman J. N. Engl. J. Med. 285: 1182-1186, 1971;
Carmeliet P., Jain R.K. Nature 407: 249-257, 2000;
Yancopoulos G.D. et al. Nature 407: 242-248,
2000) que activan a los vasos sanguíneos peritumorales para que
éstos formen nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) que invaden el
tumor para aportar el oxígeno y los nutrientes y eliminar productos
del catabolismo tumoral. Los mismos procesos celulares que acontecen
durante la invasión tumoral (motilidad y ausencia de apoptosis)
suceden en sentido centrípeto durante la angiogénesis tumoral. Por
lo tanto, la inhibición de la capacidad invasiva de las células
tumorales y de las células endoteliales debería producir un retraso
en el crecimiento tumoral al inhibir la expansión del tumor,
disminuir la angiogénesis y promover la apoptosis. Por ello, un
tratamiento eficaz contra el cáncer debería inhibir la migración,
la angiogénesis y aumentar la apoptosis sin producir estos efectos
en células normales.
Existen numerosos agentes antitumorales y
antiangiogénicos en diferentes estados de desarrollo clínico en
oncología (Brem S. Cancer Control 6: 436-458, 1999),
de los que un considerable número son polipéptidos que el organismo
utiliza para contrarrestar el efecto de los reguladores positivos
de la angiogénesis (Hagedorn M., Bikfalvi A. Crit. Rev. Onc. Hemat.
34: 89-110, 2000). Sin embargo, cuando dichos
polipéptidos se comparan con compuestos de peso molecular
considerablemente inferior, se ponen de manifiesto sus
inconvenientes farmacológicos. Por otra parte, se ha comprobado que
diferentes compuestos sintéticos que contienen anillos aromáticos en
su molécula y actúan como inhibidores de la actividad mitogénica
inducida por factores de crecimiento, son citotóxicos frente a
células quiescentes o no tumorales (Lozano R.M. J. Mol. Biol. 281:
899-9115, 1998). Sigue existiendo, por tanto, la
necesidad de encontrar compuestos con actividad antitumoral,
antiangiogénica y proapotótica de baja toxicidad para las células
sanas, quiescentes, no tumorales. Actualmente existe un gran interés
en la búsqueda de nuevas indicaciones terapéuticas para
medicamentos antiguos. En este sentido se ha comprobado
recientemente que diferentes antibióticos, aparte de su actividad
antimicrobiana, poseen efectos antiproliferativos, como es el caso
de la rapamicina (Morice M.C. et al. N. Engl. J. Med. 346:
1773-1780, 2002), o de la neomicina (Cuevas P.
et al. Neurol. Res. 224: 389-391, 2002); o
son útiles como ansiolíticos como la norfloxacina (fluroquinolona)
(Johnstone T.B. et al. Nat. Medicine 10;
31-32, 2004).
La psoriasis es una enfermedad crónica
angiodependiente que afecta al 2-3% de la población
mundial y se caracteriza por hiperplasia epidérmica, infiltración
dermo-epidérmica de células inflamatorias y
linfocitos T, y un desarrollo muy evidente de la vascularización,
junto con una disminución de muerte celular por apoptosis (Kocak M.
et al. Int. J. Dermatol. 42: 789-793, 2003).
Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para la
psoriasis. La terapia antipsoriásica puede ser tópica o sistémica,
dependiendo de la extensión y de la gravedad de la enfermedad. La
terapia tópica más utilizada consiste en diferentes tipos de
corticoides, pero el uso prolongado de estos compuestos se asocia
con atrofias cutáneas, estrías y telangectasias (Baker B.S., Fry L.
Cutis 1999; 64: 315-318). La terapia sistémica con
fármacos inmunosupresores se asocia a efectos secundarios muy
importantes (Wolina V. et al. Clin. Rheumatol. 2001: 20:
406-410). Por ejemplo, el empleo de ciclosporina
para el tratamiento de la psoriasis puede producir nefrotoxicidad
(fibrosis intersticial y atrofia tubular), hipertensión,
hipomagnesemia, hipercalcemia y disfunción hepática (Travis L,
Weinberg J.M. Drugs of Today 2002; 38: 847-865).
También el uso prolongado de otro medicamento inmunosupresor para
el tratamiento de la psoriasis, el tacrolimus, puede producir
hipertensión, nefrotoxicidad e inmunosupresión (Jegasothy B.V. et
al. Arch. Dermatol. 1992; 128: 781-785).
Recientemente se ha descrito que la aplicación tópica del
inmunosupresor tacrolimus acelera la carcinogénesis en la piel del
ratón (Niwa Y., Terashima T., Sumi H.B. J. Dermatol. 2003; 149:
960-967). Por ello, son necesarios nuevos
compuestos antipsoriásicos que demuestren ser eficaces sin producir
efectos secundarios evidentes como los que se asocian con los
tratamientos antipsoriásicos más comunes.
El ácido 2,5 dihidroxibencenosulfónico es un
derivado del ácido 2,5-dihidroxibenzoico que se
formula farmacológicamente en forma de diferentes sales
(fundamentalmente cálcica, potásica y magnésica) que le confieren
estabilidad. El ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico
se viene utilizando desde los años 70 como medicamento
vasculotrópico oral.
El ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico inhibe la agregación
plaquetaria, el aumento de la permeabilidad capilar y la viscosidad
sanguínea en pacientes con retinopatía diabética (Bayer J. et
al. Dtsch. Mod. Wschr. 1980; 46: 160-1608;
Banarroch I.S. et al. Ophtalmic Res 1985; 17;
131-138; Michal M., Giessinger N. Thromb. Res. 1988;
51: 593-605). El metabolismo y la farmacocinética
de este compuesto en el ser humano son conocidos desde el año 1974
(Benakis A. et al. Thérapie 1974; 29:
211-219). Recientemente se ha comprobado
experimentalmente que el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico aumenta la actividad
de la isoforma endotelial de la enzima sintasa del óxido nítrico
[endothelial nitric oxyde synthase (eNOS)] en células endoteliales
de rata sin producir efectos citotóxicos (Suscheck C. et al.
Bt. J. Pharmacol. 1997; 122: 1502-1508). Además, el
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico es capaz de
potenciar la relajación in vitro de arterias peneanas
humanas (Angulo J. et al. Br. J. Pharmacol. 2003; 139:
854-862). Existe evidencia experimental de que el
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (formulado como
sal cálcica o magnésica) posee actividades antioxidantes in
vitro (Brunet J. et al. Fundam Clin. Pharmacol. 12:
205-212, 1998).
También se ha descrito que el dobesilato cálcico
(sal cálcica del ácido 2,5-dihidroxibenzesulfónico)
fortalece los vasos capilares en el tratamiento de enfermedad
fibroquística de la mama (Nour A.F. et al., Invasive
Treatment, vol. 12, no. 3, 1986, páginas 233-242) y
que es utilizada como agente angioprotector para la prevención de
disfunciones vasculares (Ruiz E. et al., Pharmacological
Research, vol. 38, no. 5, 1998, páginas
361-366).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de nuevas actividades del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico y/o sus sales,
referidas a su capacidad antiproliferativa, antimigratoria,
antiangiogénica y proapoptótica en células no quiescentes,
actividades que, combinadas, justifican su empleo como compuesto
útil para el tratamiento de enfermedades angiodependientes como es
el caso del cáncer, caracterizado por una hiperproliferación,
invasión celular y angiogénesis excesivas, junto con un déficit de
muerte celular por apoptosis, sin presentar toxicidad para células
sanas o quiescentes, no tumorales. En los experimentos se han
utilizado células tumorales gliómicas, pues los gliomas son tumores
muy invasivos con gran capacidad angiogénica y con un déficit
apoptótico importante (Merzak A., Pilkington G.J. Cancer Metastasis
Rev. 16: 155-177, 1997).
La presente invención se basa también en el
hecho comprobado de que el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico y/o sus sales poseen,
de forma combinada, efectos antiproliferativos, antiangiogénicos y
proapoptóticos, por lo que se ha procedido a valorar la eficacia
terapéutica del mismo en placas psoriásicas crónicas caracterizadas
por una hiperproliferación epidérmica, una intensa angiogénesis
dérmica y un déficit apoptótico (Karasek M.A., Cutis 64:
319-322, 1999).
La presente invención está relacionada pues con
la búsqueda de nuevos tratamientos contra el cáncer y otras
enfermedades angiodependientes y se basa en el hecho de que el
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico y/o sus sales,
han mostrado la capacidad de inhibir el crecimiento, la migración e
inducir la apoptosis en células tumorales in vitro así como
capacidad para inhibir in vivo la angiogénesis inducida por
el factor de crecimiento para fibroblastos (FGF). Por tanto, debido
a la combinación de dichas capacidades, dichos compuestos resultan
útiles en el tratamiento de los tumores malignos y enfermedades
neoplásicas hematológicas así como en el tratamiento de otras
patologías asociadas a una gran vascularización (enfermedades
angiodependientes).
El ácido
2,5-dehidroxibencenosulfónico formulado en forma de
sales es un producto comercial (por ejemplo, la sal potásica puede
adquirirse en Merck Fama y Química SA, Mollet del Vallés,
Barcelona) con la siguiente fórmula molecular:
en la que Met = Metal y n es
función de la valencia del metal empleado en la sal. Generalmente n
0 1 ó 2 al ser el catión metálico formador de la sal, monovalente
(K) o divalente (Ca ó
Mg).
Las nuevas actividades biológicas del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico no dependen del
catión unido al anillo bencénico pues el ácido
2,5-dihidroxi-bencenosulfónico
formulado con cualquier sal tiene efectos similares en la inhibición
de la proliferación celular, la migración y la angiogénesis. En la
presente invención se describen únicamente las actividades del
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico formulado como
sal potásica y cálcica sin olvidar que dentro del alcance de esta
invención se encuentra cualquier sal farmacéuticamente aceptable
del compuesto. El término "sales farmacéuticamente aceptables"
incluye las sales metálicas o las sales de adición susceptibles de
ser utilizadas en formas farmacéuticas. Las sales farmacéuticamente
aceptables del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico
pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o
inorgánicos, por métodos convencionales haciendo reaccionar el
ácido o la base apropiadas con el compuesto.
Las composiciones farmacéuticas que contengan el
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico pueden
presentarse en cualquier forma de administración que se considere
adecuada; por ejemplo, por vía sistémica, oral, parenteral, uretral,
rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes
farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la
forma de administración deseada.
Los siguientes ejemplos ilustran y apoyan la
invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la
misma.
Para este estudio, realizado in vitro, en
tres experimentos diferentes triplicados se han empleado células
gliómicas de rata (línea C6). Las células se cultivaron en un medio
compuesto por DMEM [Dulbecco's modified Eagle's Medium (Gibco.
Paisley UK)], 7,5% de suero fetal (Gibco), 10 unidades/ml de
penicilina (Gibco) y 10 \mug/ml de estreptomicina (Gibco). Los
cultivos fueron mantenidos en una atmósfera humidificada a 37ºC.
Para valorar el efecto del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico sobre la
proliferación celular se sembraron 2 x 10^{4} células C6 por
pocillo (15 mm de diámetro) en placas de 24 pocillos. Los cultivos
experimentales fueron tratados durante 48 horas con diferentes
concentraciones micromolares (\muM) del compuesto (sal cálcica o
potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico).
Los cultivos controles vivieron 48 horas sin
añadirles el compuesto. Después de 48 horas los cultivos fueron
fotografiados utilizando un microscopio invertido y posteriormente
los cultivos fueron coloreados con violeta cristal (Merck Farma y
Química SA. Mollet del Vallés, Barcelona) y procesados para
determinar el número de células por pocillo utilizando un método
espectrofotométrico. Como muestra la Figura 1 el tratamiento con
diferentes concentraciones del compuesto produce una inhibición de
la proliferación celular dosis dependiente, obteniéndose una
inhibición del 88% con una concentración de 100 \muM de la sal
cálcica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (A).
Con la misma concentración de la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico se obtuvo una
inhibición del 74% (B). La IC_{50} se encuentra en un rango
próximo a 25 \muM para la sal cálcica y entre 40 y 50 \muM para
la sal potásica. Comparando la Figura 1A con la Figura 1B se observa
que para conseguir el mismo porcentaje de inhibición en la
proliferación celular tras el tratamiento con la sal cálcica del
compuesto se necesita una concentración doble de sal potásica para
obtener el mismo efecto. Esto es debido a que la sal cálcica del
compuesto contiene dos moles de principio activo (ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico) que en solución
acuosa se separan de la sal. La Figura 2 muestra una imagen de un
cultivo de células C6 después de 48 horas sin tratamiento (A), otra
correspondiente a un cultivo de células C6 tratadas durante 48 horas
con una concentración de 50 \muM de la sal cálcica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico (B) y una tercera
perteneciente a un cultivo de células C6 tratadas con 100 \muM de
la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico durante 48 horas (C).
Este estudio demuestra que el tratamiento con el compuesto inhibe
la proliferación en células neoplásicas y corrobora el efecto
antiproliferativo del compuesto observado en células musculares
lisas vasculares normales estimuladas in vitro con factores
mitogénicos (Parés-Herbute N. et al. Int. J.
Angiol. 8: S5-S10, 1999). Para discernir si la
actividad antiproliferativa del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico está mediada por un
efecto citotóxico o proapoptótico realizamos diferentes
experimentos que se detallan en el ejemplo siguiente.
Este ensayo se realizó en células C6 cultivadas
in vitro según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Para la demostración del efecto proapoptótico de los compuestos
analizados, hemos empleado dos métodos diferentes que detectan la
fragmentación intracelular del ADN y los núcleos apoptóticos in
situ.
Los métodos de inmunoensayo enzimático que
cuantifican los fragmentos del ADN asociado a histonas pueden
considerarse idóneos para determinar el inicio de la apoptosis
(Aragane Y. et al. J. Cell. Biol. 1998; 140:
171-182). Este método permite diferenciar la muerte
por necrosis de la muerte por apoptosis ya que en la necrosis se
rompe la membrana citoplásmica y el ADN aparece en el medio de
cultivo, mientras que en la apoptosis el ADN fragmentado permanece
en el interior de la célula pues la membrana plásmica se conserva
intacta (Aragane Y. et al. J. Cell. Biol. 140:
171-182, 1998).
Utilizando el kit Cell Death Detection ELISAplus
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, hemos determinado la fragmentación
del ADN en cultivos de células C16 (2 x 10^{3}) a las 4, 16, 24 y
48 horas. Los cultivos controles no recibieron tratamiento mientras
que a los cultivos experimentales se les añadió de 50 a 200 \muM
(Fig. 3A) de la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico. También se realizaron
experimentos añadiendo 25 a 100 \muM de la sal cálcica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico (Fig. 3B). Todos los
experimentos fueron realizados por triplicado en tres experimentos
diferentes.
Las Figuras 3A y 3B demuestran lo siguiente: a)
el efecto antiproliferativo del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico está mediado
fundamentalmente por una actividad propapotótica; b) el catión
unido a la molécula no condiciona la actividad del compuesto pues
el efecto proapoptótico es similar utilizando la sal cálcica o
potásica del mismo; c) el mayor efecto proapoptótico se consigue en
células tratadas durante 48 horas con el compuesto; d) el máximo
efecto se consigue con una concentración de 25 \muM para la sal
cálcica y 50 \muM para la sal potásica, idénticas a la IC_{50}
en estudios de proliferación celular. Una vez comprobado que en el
mecanismo antiproliferativo del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico participa en la muerte
celular por apoptosis, valoramos cuantitativamente dicho efecto
estudiando microscópicamente las células gliómicas utilizando la
siguiente técnica.
Se realizaron tres experimentos independientes
repetidos tres veces. Las células C6 procedentes de los cultivos
controles y los procedentes de los cultivos tratados durante 24
horas con el compuesto (50 \muM y 100 \muM de la sal cálcica y
potásica respectivamente) fueron adheridas a portaobjetos de vidrio
donde se fijaron con una solución tamponada (pH 7,4) de
paraformaldehido al 4% durante una hora a la temperatura del
laboratorio. Posteriormente las células fueron lavadas y
permeabilizadas con una solución al 0.1% de Triton
X-100. Seguidamente las células fueron lavadas
antes de aplicar la técnica TUNEL [(terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT)-mediated dUTP nick and labelling
(Gavrieli Y., Sherman Y., Bensasson S.A. J. Cell. Biol. 119:
493-501, 1992)]. Utilizando un kit para detectar
in situ núcleos apoptóticos (in situ Cell. Death.
Detection Kit Boehringer Mannheim, Mannheim. Alemania). Las
diferentes etapas de la técnica se realizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante del kit. Finalmente las células fueron
coloreadas con verde luz (Fluka, AG, Suiza). La reacción TUNEL sólo
aparece en los núcleos apoptóticos.
Aunque se obtuvieron resultados muy similares
con la sal cálcica y potásica del compuesto objeto de la invención,
en la memoria se presentan únicamente los resultados obtenidos con
la sal potásica del compuesto. Se contaron las células en 6 campos
diferentes en 12 portaobjetos donde se habían adherido las células
de 6 cultivos controles y de 6 cultivos tratados con el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico (100 \muM). El
número total de células no apoptóticas y apoptóticas fue el
siguiente:
El número total de células tratadas es menor que
el número total de células controles debido al efecto
antiproliferativo del compuesto.
En las imágenes de la Figura 4 se representa un
área de un experimento de un cultivo control (A y B) y de otro
cultivo tratado con el compuesto (C y D) en los que se empleó la
técnica TUNEL. Como se muestra en las imágenes, sólo se observan 2
núcleos apoptóticos en las células controles, mientras que en las
células tratadas con el compuesto objeto de la invención aparecen
107 núcleos apoptóticos y sólo 8 núcleos normales (no
apoptóticos).
Estos datos demuestran que el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico es un compuesto con
gran actividad proapoptótica útil para inducir la apoptosis tumoral.
Como se ha demostrado que el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico inhibe la apoptosis en
células humanas normales (Braber R., Farine J.C., Lora G.A.
Apoptosis 4: 4111-49, 1998) este compuesto es una
molécula firme candidata para el tratamiento del cáncer.
Uno de los mecanismos implicados en el fracaso
terapéutico de la quimio y la radioterapia es la ineficacia de
estos tratamientos en inducir la muerte celular por apoptosis,
debido fundamentalmente a la hiperexpresión de proteínas
antiapoptóticas en las células tumorales (Sellers W.R., Fisher D.E.
J. Clin. Invest. 104: 1655-1661, 1999; Branch P.
et al. Oncogene 19: 3138-3145, 2000). Por
ello, los compuestos proapoptóticos pueden ser de gran utilidad
clínica como coadyuvantes en el tratamiento quimio y
radioterapéutico.
Una vez comprobado el efecto proapoptótico del
ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico hemos valorado
la capacidad de este compuesto en aumentar el efecto
antiproliferativo de diferentes medicamentos citostáticos. En el
siguiente ejemplo se demuestra como el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico es capaz de aumentar
la eficacia terapéutica de diferentes compuestos citostáticos
empleados en oncología, como el cis-platino, la
vincristina, el paclitaxel y el 5- fluorouracilo.
Para este estudio, hemos empleado células C6
cultivadas in vitro en las mismas condiciones que las
descritas en el ejemplo 1. Se sembraron 1 x 10^{3} células por
pocillo en placas de 24 pocillos. Se realizaron tres tipos de
tratamiento: a) a las 24 horas después de la siembra, las células
fueron tratadas independientemente con cada uno de los siguientes
fármacos; cis-platino (5 \mug/ml), vincristina
(0,1 11 g/ml), paclitaxel (5 \mug/ml) y
5-fluorouracilo (100 \mug/ml); b) a las 24 horas
después de la siembra, las células fueron tratadas conjuntamente
con el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (sal
potásica, 100 \muM) y con cada uno de los siguientes fármacos;
cis-platino (5 \mug/ml) vincristina (0,1
\mug/ml), paclitaxel (5 \mug/ml) y
5-fluorouracilo (100 \mug/ml); c) en el momento
de realizarse la siembra (Día 0), las células fueron pretratadas con
el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (sal
potásica, 100 \muM). Al día siguiente, los cultivos fueron
tratados además con cada uno de los siguientes fármacos:
cis-platino (5 \mug/ml) vincristina (0,1
\mug/ml), paclitaxel (5 \mug/ml) y
5-fluorouracilo (100 \mug/ml). Los cultivos
controles no recibieron tratamiento durante 2 días. A las 48 horas
(día 2) se valoró en todos los cultivos el número de células de
idéntica forma a la usada en el ejemplo 1. Este estudio se efectuó
en experimentos independientes triplicados repetidos tres veces.
En la figura 5 (A, B, C y D) se representan los
histogramas de los experimentos realizados para valorar el efecto
del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico en la
potenciación de diferentes fármacos citostáticos. El tratamiento con
cisplatino, vincristina y 5-fluorouracilo produce
una inhibición del 50% en la proliferación de células C6, mientras
que el tratamiento con paclitaxel consigue un 67% de inhibición de
la proliferación celular. El tratamiento conjunto del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico + los fármacos
citostáticos (cis-platino, vincristina y
5-fluorouracilo) produce una inhibición del 84% en
la proliferación celular. El tratamiento conjunto con
2,5-dihidroxibencenosuflóncio + paclitaxel produce
un 86% en la inhibición de la proliferación celular. Cuando los
cultivos celulares son pretratados con el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico y posteriormente con
los siguientes citostáticos: cis-platino,
vincristina y 5-fluorouracilo se consigue una
inhibición del 90% en la proliferación celular. Cuando se emplea el
paclitaxel, la inhibición en la proliferación celular alcanza hasta
el 92%.
Los resultados anteriormente expuestos
demuestran que el tratamiento simultáneo del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico y de agentes
quimioterapéuticos aumenta la eficacia terapéutica de los mismos y
además, este efecto quimiopotenciador es mayor cuando las células
han sido pretratadas con el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico. Estos datos apoyan
el empleo del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico
como tratamiento coadyuvante asociado a la quimio y
radioterapia.
Este ensayo se efectuó en tres experimentos
diferentes triplicados. Para valorar la capacidad del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico en la inhibición de la
migración celular se utilizaron 2 x 10^{5} células C6 cultivadas
in vitro en placas de 20 mm. Con ayuda de una micropipeta
estéril se practicó una lesión longitudinal (día 0) en cultivos
controles y en cultivos tratados con 100 \muM de la sal potásica
del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico. Se
realizaron fotos digitalizadas utilizando un sistema fotográfico
conectado a un microscopio luminoso y con un programa de morfometría
computarizada (Moticam. Motic. Barcelona) se delimitó el área de
lesión. A las 24 horas se volvieron a obtener fotografías y se
marcaron los bordes de la lesión superponiendo las primeras fotos
(día 0) con las obtenidas a las 24 horas para calcular el
porcentaje del área lesionada cubierta por las células migratorias.
Estos valores se representaron como porcentaje de regeneración
obtenida con el tratamiento. En la Figura 6 se representa un
ejemplo típico de un experimento control (A) y de otro experimento
en el que las células fueron tratadas durante 24 horas con el
compuesto objeto de la invención (B). Como se observa en esta
Figura las células no tratadas regeneran completamente la lesión
(Fig. 6A), mientras que las células tratadas con el compuesto no son
capaces de migrar y recubrir toda el área de la lesión (Fig. 6B). En
la Figura 7 que representa los datos porcentuales de todos los
experimentos se observa que el ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico inhibe hasta un 64% la
migración de células tumorales.
Para este ensayo hemos utilizado la membrana
corioalantoídea del embrión de pollo que permite testar in
vivo la actividad de substancias antiangiogénicas (Zilberberg L.
et al. J. Biol. Chem. 2003; 278:
35564-35573). Como compuesto proangiogénico, hemos
utilizado la forma básica del factor de crecimiento para
fibroblastos (bFGF) (Meghna U. et al. Blood 2003; 102:
2108-2114).
Huevos fecundados se incuban en una estufa a
37ºC y una humedad del 80%. Después de 4 días se practica una
apertura de la cáscara del huevo en el polo más agudo del mismo
para aspirar 1 ml de albúmina. Posteriormente se cierra la apertura
con una lámina de parafina (Parafilm M. Laboratory Film Chicago IL.
USA). Este procedimiento permite crear una cámara de aire que impide
que el embrión se adhiera a la parte superior de la cáscara. El día
13 de incubación se rompe la cáscara a nivel de la cámara de aire
para poder efectuar el tratamiento. Veinte embriones son tratados
con 5 \mul de una solución de 3 \mug de bFGF + 0.1% de
heparina, embebida en un disco de papel de nitrocelulosa.
Seguidamente se sella la cáscara con lámina de parafina. Al día
siguiente, en la mitad de los embriones (n = 10) se produce la
apertura de la cáscara para empapar de nuevo el disco de papel de
nitrocelulosa con 100 \muM de sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico disuelta en suero
fisiológico (5 \mul). De nuevo se vuelve a cerrar la apertura de
la cáscara con lámina de parafina. El día 17 termina el experimento
fotografiándose los discos de nitrocelulosa para su estudio
comparativo.
En la Figura 8 se presentan dos imágenes
correspondientes a un embrión tratado con 3 \mug de bFGF + 0,1%
de heparina (A) y a otro al que se añadió al siguiente día además
100 de una solución de sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico (B). En la imagen A
se observa como el disco de nitrocelulosa aparece invadido por vasos
sanguíneos, mientras que en la imagen B se aprecia una escasísima
invasión vascular en el disco. La cuantificación morfométrica de
las imágenes de los discos de nitrocelulosa utilizando un sistema
computarizado (Moticam Motic. Barcelona) muestra el efecto
antiangiogénico del compuesto (área del disco cubierta por vasos
sanguíneos en embriones tratados con bFGF + heparina = 35 \pm
8.6% vs área del disco cubierta por vasos sanguíneos en embriones
tratados con bFGF + heparina + sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico = 2 \pm 1,5%;
p<0,0001; test de student no pareado). Efectos similares se
obtuvieron utilizando 50 \muM de la sal cálcica del compuesto.
Este experimento demuestra que el compuesto, objeto de la presente
invención, posee actividad antiangiogénica al ser capaz de
neutralizar el efecto angiogénico inducido por el bFGF.
Para este estudio hemos empleado la sal potásica
del ácido 2,5-dihidroxi bencenosulfónico formulada
al 2,5 y 5% en forma de crema, por ser este tipo de formulación un
procedimiento habitual para el tratamiento tópico de enfermedades
cutáneas. Las concentraciones elegidas de las sales del ácido
2,5-dihidroxi bencenosulfónico se encuentran dentro
del rango de las concentraciones utilizadas para el tratamiento de
la retinopatía diabética: 6 comprimidos diarios de 500 mg de la sal
cálcica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico
(Benakis A. et al Thérapie 1974; 29:
211-219).
Como fase acuosa de la crema hemos utilizado
agua destilada. La fase grasa de la misma puede estar constituida
por alcohol cetílico, alcohol esteárico o vaselina. El span es un
emulgente eficaz en la elaboración de la crema. Aunque ambas
formulaciones (2,5 y 5%) del producto muestran ser eficaces
clínicamente, el mayor beneficio terapéutico se obtiene con la
concentración al 5%. Por ello, presentamos los resultados obtenidos
con el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico formulado
en forma de crema al 5%. El siguiente ejemplo ilustra la
formulación de una crema eficaz en el tratamiento tópico de la
psoriasis y no debe ser considerado limitativo del alcance de la
invención:
I.- Parte activa (sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico al 5,6%)
II.- Parte inactiva. Como excipientes se pueden
utilizar alcohol cetílico (2,5%), alcohol estearílico (2,5%),
vaselina líquida (30%), vaselina filante (20%), oleato de sorbitano
(5%) y agua destilada (c.s.p. 100 g).
La eficacia clínica del tratamiento fue evaluada
de acuerdo con el índice que cuantifica los signos de descamación
(D), eritema (E) e infiltración (I) a los que se asignó la
siguiente valoración: (0) ausente; (1) leve; (2) moderada y (3)
severa (Freeman A.K. et al. J. Am. Acad. Dermat. 2003; 48:
564-568). En la Figura 9 aparecen tres imágenes:
antes del tratamiento, a los seis y a los trece días de tratamiento
de una misma placa psoriásica crónica localizada en la zona de
extensión del codo izquierdo tratada con la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico al 5%. Como puede
observarse, el tratamiento tópico dos veces al día con una crema
conteniendo la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico produce precozmente (6
días) un "aclaramiento" muy notable de la placa con
desaparición casi total de la hiperqueratosis. La eficacia
terapéutica de la crema es más evidente al final de la segunda
semana de tratamiento. El tratamiento produce una reducción
importante de los valores globales del índice DEI (DEI global
pretratamiento = 6 \pm 1,57 vs DEI global postratamiento = 1 \pm
0,58; p<0,0001; test de student no pareado).
- 1.
- Histograma que representa el efecto antiproliferativo del tratamiento con diferentes concentraciones de las sales (A) cálcica y (B) potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico en cultivos de células C6 después de 48 horas de tratamiento. Ordenadas: Absorbancia a 595 nm; Abcisas: concentración \muM.
- 2.
- El panel A representa el aspecto a las 48 horas de un cultivo control de células C6. El panel B muestra una imagen de un cultivo de células C6 tratadas durante 48 horas con 50 \muM del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (sal cálcica). El panel C es un aspecto de un cultivo de células C6 tratadas durante 48 horas con 100 \muM de la sal potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico.
- 3.
- Histogramas representativos en donde se observa que el efecto antiproliferativo del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico no es debido a necrosis (histograma blanco) sino a apoptosis (histograma rayado). A: Tratamiento con la sal cálcica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico. B: Tratamiento con la sal potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico. Ordenadas: Absorbancia a 405 nm; Abcisas: tiempo en horas.
- 4.
- Imágenes de células C6 gliómicas procesadas con la técnica TUNEL para detectar in situ células apoptóticas. Los núcleos apoptóticos aparecen oscuros y los núcleos y citoplasma de las células no apoptóticas aparecen de color claro. Las flechas indican núcleos apoptóticos. A y B: células controles. C y D: células tratadas con el ácido 2,5- dihidroxi-bencenosulfónico. Las fotografías B y D corresponden a una amplificación de los recuadros de las fotografías A y C, respectivamente.
- 5.
- Histogramas demostrando el efecto quimiopotenciador (valorado como efecto antiproliferativo) del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico, con diferentes compuestos citostáticos. A) Cis-platino (5 \mug/ml); B) Vincristina (0.1 \mul/ml); C) Paclitaxel (5 \mug/ml) y D) 5-fluorouracilo (100 \mug/ml). Ordenadas: Absorbancia a 595 nm; Abcisas: histograma blanco (control); punteado (citostático; día 1); histograma rayado (ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico + citostático; día 1); histograma a cuadros (ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (día 0) + citostático; día 1).
- 6.
- Imágenes fotográficas de la migración celular en un experimento control (A) y en otro experimento en donde las células fueron tratadas con el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (B). Las células controles regeneran totalmente una lesión practicada en el cultivo, mientras que la migración celular de las células tratadas con el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico es incapaz de cubrir totalmente el área lesionada del cultivo. Las líneas horizontales delimitan la lesión longitudinal inicial practicada en los cultivos.
- 7.
- Histograma representando la capacidad migratoria de las células C6 en cultivos controles (histograma blanco) y en cultivos tratados con el ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico (histograma negro). La capacidad migratoria se expresa (ordenadas) como el porcentaje de regeneración (porcentaje de área cubierta de una lesión longitudinal practicada en los cultivos).
- 8.
- Muestra imágenes de dos embriones de pollo de 17 días de incubación. El panel A corresponde a un embrión tratado con 3 \mug de bFGF + 0,1% de heparina. El panel B muestra el aspecto de un embrión tratado con 3 \mug de bFGF + 0.1% de heparina + 100 \muM de la sal potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico. En el panel A se puede observar el efecto antiangiogénico del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico, pues el disco de nitrocelulosa utilizado como vehículo liberador de substancia aparece desprovisto de vasos casi en su totalidad.
- 9.
- Imágenes de una placa psoriásica hiperqueratósica localizada en la región posterior del codo izquierdo. La imagen A representa el aspecto de la placa psoriásica antes de iniciarse el tratamiento. La imagen B es un aspecto de la misma placa tras seis días de tratamiento con una crema al 5% conteniendo como componente activo la sal potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico. La imagen C muestra el aspecto de la placa psoriásica tras dos semanas de tratamiento con la sal potásica del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico formulada al 5%. Los números que aparecen en las imágenes corresponden a la fecha en que se realizaron las fotografías.
Claims (14)
1. Uso del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico o de cualquiera de sus
sales farmacéuticamente aceptables en la fabricación de
medicamentos de aplicación en el tratamiento de enfermedades
angiodependientes.
2. Uso según la reivindicación 1 en que la
enfermedad angiodependiente presenta además una disminución de la
apoptosis.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 ó 2 en el que el medicamento fabricado es de aplicación en el
tratamiento del cáncer.
4. Uso según la reivindicación 3
caracterizado porque el medicamento fabricado se utiliza
para aumentar el efecto antiproliferativo de los fármacos
citostáticos en el tratamiento del cáncer.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizado porque la sal preferida para la
fabricación del medicamento es la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizado porque la sal preferida para la
fabricación del medicamento es la sal cálcica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 1 a 6 en que el medicamento fabricado incluye también
una cantidad adecuada de al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
8. Uso según la reivindicación 1 en el que el
medicamento fabricado es de aplicación en el tratamiento de la
psoriasis.
9. Uso según la reivindicación 8
caracterizado porque la sal preferida para la fabricación
del medicamento es la sal potásica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico.
10. Uso según la reivindicación 8
caracterizado porque la sal preferida para la fabricación
del medicamento es la sal cálcica del ácido
2,5-dihidroxibencenosulfónico.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 8 a 10 en que el medicamento fabricado incluye también
una cantidad adecuada de al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
8 a 11, caracterizado porque el medicamento consiste en una
formulación de aplicación tópica.
13. Uso según la reivindicación 12,
caracterizado porque el medicamento se trata de una crema o
pomada cuya composición incluye:
- \bullet
- Una cantidad farmacéuticamente eficaz del ácido 2,5-dihidroxibencenosulfónico o de cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables.
- \bullet
- Una cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos un alcohol.
- \bullet
- Una cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos un emulgente.
- \bullet
- Una cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos un excipiente.
- \bullet
- Una cantidad farmacéuticamente aceptable de al menos un excipiente que comprende una fase lipídica, particularmente vaselina.
- \bullet
- Agua destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque el medicamento es una crema o pomada
que presenta una composición que incluye:
- \bullet
- 5% de la sal potásica del ácido 2,5-dihidrobencenosulfónico
- \bullet
- 2,5% alcohol cetílico
- \bullet
- 2,5% alcohol esteárico
- \bullet
- 30% vaselina líquida
- \bullet
- 20% vaselina filante
- \bullet
- 5% span (oleato de sorbitano)
- \bullet
- c.s.p. 100 g de agua destilada.
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