KR20070007783A

KR20070007783A - 암 및 건선 등의 혈관의존성 질환의 치료를 위한 약제제조시의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 용도

Info

Publication number: KR20070007783A
Application number: KR1020067016184A
Authority: KR
Inventors: 페드로 쿠에바스 산체스; 안토니오 로메로 가리도; 로사 마리아 로잔도 푸에르토; 구일레르모 기메네즈 갈레고; 세라핀 발베르드 로페즈
Original assignee: 액션 메디시네스, 에스.엘.
Priority date: 2004-02-17
Filing date: 2005-02-16
Publication date: 2007-01-16
Also published as: US20130203851A1; IL177238A0; AU2005211956B2; JP2014240445A; CA2555248A1; US20080293816A1; DK1719509T3; JP2012012413A; CA2555248C; ATE444743T1; US8435971B2; EP1719509A1; CN101014330A; JP5639029B2; JP2007522256A; WO2005077352A1; UA86399C2; ES2334447T3; US7968531B2; JP4892360B2

Abstract

본 발명은 혈관의존성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 2,5-디히드록시벤젠 술폰산을 사용하는 것에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 상술한 화합물을 특히 칼슘 및 칼륨염 형태로서, 세포사멸 감소를 나타내는 두가지 혈관의존성 질환 즉, 암과 건선을 치료하는데 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비-휴지기 세포에서 상기 종류의 화합물의 항증식 능력, 항이동 능력, 항혈관신생 능력 및 세포사멸 촉진 능력을 기술한다. 또한, 본 발명은 종양성 및 특히 신경교종의 치료에서 공지의 세포증식 억제제에 대해 상기 화합물의 강화 효과를 상세히 개시한다. 본 발명은 또한 만성 건선 플라크 치료시, 항증식, 할혈관신생 및 세포사멸 촉진의 복합 능력에 근거한 상기 화합물의 치료학적 효능에 관한 것이다.

Description

암 및 건선 등의 혈관의존성 질환의 치료를 위한 약제 제조시의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 용도 {USE OF 2,5-DIHYDROXYBENZENESULFONIC ACID, IN THE PRODUCTION OF MEDICAMENTS FOR THE TREATMENT OF ANGIODEPENDENT DISEASES SUCH AS CANCER AND PSORIASIS}

본 발명은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산을 포함하는 약제 조성물, 또한 급격한 세포증식, 혈관신생화 (혈관의존성 질환), 더 구체적으로는 예컨대 종양이나 건선 등에서와 같이 세포사멸(apoptosis) 기작의 감소를 동반하는 혈관의존성 질환의 치료를 위한 약제 제조시의 이것의 용도에 관한 것이다.

악성 종양은 제어되지 않는 세포 증식 이외에도 종괴 주변의 정상 조직에 침입하는 능력을 특징으로 한다. 종양 침입은 다음과 같은 연속적인 단계에 따라 진행되는 복잡한 과정이다: (a) 세포외 매트릭스의 단백질에 대한 종양 세포의 부착; (b) 종양이 점유하게 될 세포외 공간을 생성하는 것으로서, 프로테아제에 의한 세포외 매트릭스의 단백질의 변성; (c) 세포질막의 신생부 합성 및 세포 골격 인지를 필요로 하는 동적 복합 기작(mechanism)을 통한 이동 (Giese A, Westphal M. Neurosurgery 1996; 235-252). 종양물로부터 나와 종괴 주변의 정상 조직에 침입하는 세포는 세포사를 무력화하는 유전 프로그램을 갖고 있으며, 따라서 상기 무손상 조직으로 이동 침입하는 종양 세포는 세포사멸을 피할 수 있다 (Mariani I et al. Clin Cancer Res 7:2480-2489,2001). 군체화된 종양 세포의 부피가 2 내지 3mm³ 에 이르면 상기 종양 세포는 대량의 혈관신생 인자들을 합성하여 초기 종양의 혈중 산소 감소 현상에 대항하는데(Folkman J. N. Engl J Med 285:1182-1186, 1971; Carmeliet P, Jain RK. Nature 407:249-257, 2000; Yancopoulos GD et al. Nature 407; 242-248, 2000), 이것은 종괴 주변의 혈관을 활성화하여 새로운 혈관을 생성하고 (혈관신생), 이 새로운 혈관들은 종양에 침입하여 혈관에 산소와 영양분을 공급하는 한편 종양 이화작용(catabolism)으로 나온 산물을 제거한다. 종양 침입시 일어나는 것과 유사한 세포적 과정(세포사멸 결핍 및 자력 운동성)은 종양 혈관신생 과정에서 집중적으로 일어난다. 따라서, 종양 세포 및 상피 세포의 침입역량을 억제하면 종양 확대를 억제하고 혈관신생을 감소시키며 또한 세포사멸을 촉진함으로써 종양 성장을 지연하게 된다. 그러므로, 효과적인 암치료는 세포의 이동 및 혈관신생을 억제하고 정상 세포에 대해서는 이러한 영향을 일으킴 없이 세포사멸을 증대시키는 것이다.

종양학적으로 다수의 임상 연구 과정에서 수많은 항암제 및 항혈관신생제가 개발되고 있으며 (Brem S. Cancer Control 6:436-458, 1999), 그 중 상당수는 혈관신생에 관련한 양성 조절인자의 영향에 대항하기 위해 인체가 이용하는 펩티드류에 관한 것이다 (Hagerdorn M, Bikfalvi A. Crit Rev Onc Hemat 34:89-110, 2000). 그러나, 이러한 펩티드류는 분자량이 매우 작은 화합물과 비교시, 분자 구조내에 방향족 고리를 함유하고 성장 인자에서 유발된 미토겐 활성의 억제자 역할을 하는 각종 합성 화합물이 무작용 혹은 비종양 세포에 대해서 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Lozano MR J Mol Biol 281: 899-9115, 1998). 따라서, 정상 세포, 휴지기 세포 혹은 비종양 세포에 대한 독성이 낮으면서도 항암, 항혈관신생 및 세포사멸 촉진(proapoptotic) 활성을 갖는 화합물을 찾아야 할 필요가 있다. 근래에는 옛날부터 이용해온 의약물의 새로운 치료학적 징후에 대한 연구가 큰 관심을 끌고 있다. 이에 관하여 최근에는 다양한 항생제가 항생 작용 이외에도, 예컨대, 라파마이신(Morice MC et al. N Engl J Med 346: 1773-1780, 2002)이나 네오마이신(Cuevas, P. et al. Neurol Res 224:389-391, 2002)의 경우 항증식 효과를 나타내는 것; 또는 노르플록사신(플루오로퀴놀론)(Johnston TB et al. Nat Med 10; 31-32, 2004) 등이 불안 완화제로 유용하다는 사실이 새롭게 밝혀졌다.

건선은 전세계 인구의 2-3% 에게서 발병하는 만성적 혈관의존성 질환으로서, 세포사멸에 의한 세포사의 감소 이외에 상피 과형성, 염증 세포와 T 임파 세포의 피부-상피 감염성, 및 뚜렷한 혈관신생 진행 등을 특징으로 한다 (Kocak M et al. Int J Dermatol 42:789-793, 2003). 현재, 건선을 완치하는 치유법은 없다. 항건선 치료는 국소적 혹은 계통적인 것으로서 질환의 심각성이나 그 범위에 따라 다르다. 가장 널리 이용하는 항건선 국소치료제는 다양한 종류의 코르티코이드류로 구성되나 이 화합물을 광범위하게 사용할 경우 피부 기능약화, 팽창선(stretch mark) 및 모세관 확장 등을 동반한다 (Baker BS, Fry L. Cutis 1999; 64:315-318). 면역억제제를 이용한 계통적 치료법은 심각한 부작용을 수반한다 (Wolina V. et al. Clin Rheumatol 2001:20:406-410). 예를 들면, 건선 치료를 위해 시클로스포린을 사용할 경우 신장독성 (간질성 섬유종 및 세뇨관 위축), 고혈압, 저마그네슘혈증, 고칼슘혈증 및 간기능 장애 등을 일으킬 수 있다 (Travis L, Weinberg JM. Drugs of Today 2002; 38: 847-865). 건선 치료를 위한 또다른 면역억제 약물로서 타크롤리무스(tacrolimus)를 상시 사용하는 경우 고혈압, 신장독성 및 면역억제를 일으킨다 (Jegasothy BV et al. Arch Dermatol 1992; 128:781-785). 최근에는, 마우스의 피부에 타크롤리무스 면역억제제를 국소 도포할 경우 발암 현상이 가속화된다고 기술하고 있다 (Niwa Y, Terashima T, Sumi H. B J Dermatol 2003; 149: 960-967). 따라서, 대부분의 일반적인 항건선 화합물에서 확인된 부작용을 일으킴 없이 효능을 발휘하는 것으로 입증된 새로운 항건선 화합물이 요망된다.

2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 2,5-디히드록시벤조산의 유도체로서, 다양한 염 형태(주로, 칼슘, 칼륨 및 마그네슘)로 약리 처방하여 안정성을 부여한다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 70년대부터 경구용 혈관 약제로 이용되어 왔다.

2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 당뇨성 망막증 환자에 있어서 혈소판 응집, 모세관 투과력 및 혈액 점성의 증대 등을 억제한다 (Bayer J. et al. Dtsch. Mod Wschr 1980; 46: 160-1608; Banarroch I.S. et al. Ophthalmic Res 1985; 17; 131-138; Michal M, Giessinger N. Thromb Res 1988; 51: 593-605). 상기 화합물이 인체에 미치는 대사작용 및 약동학은 1974년부터 공지되어 있다 (Benakis A. et al. Therapie 1974; 29: 211-219). 최근의 연구에서는 래트의 내피 세포에서 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 세포독성 영향을 일으키지 않고 산화질소 합성 효소의 내피 이형체 [내피성 산화질소 신타제(eNOS)]의 활성을 증대시키는 것으로 확인되었다 (Suscheck C. et al. Bt J Pharmacol 1997; 122: 1502-1508). 또한, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 인간의 음경 대동맥의 체외 이완작용을 강화시킨다 (Angulo J et al. Br J Pharmacol 2003; 139: 854-862). 또한, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 (칼슘염 또는 마그네슘염 형태로 제형화된)이 체외 항산화제 활성을 보유한다는 사실이 실험적으로 입증되었다 (Brunet J et al. Fundam Clin Pharmacol 12:205-212, 1998).

본 발명은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 및/또는 그의 염이 비-휴지기 세포에 대해 항증식, 항이동, 항혈관신생 및 세포사멸 촉진 능력에 대한 활성을 갖는다는 점을 발견한 것에 기초하며 이러한 활성을 조합하면, 비종양성 정상 혹은 휴지기 세포에 대하여는 독성을 일으키지 않으면서 세포사멸로 인한 세포사의 결핍 외에, 과증식 현상이 특징인 암, 세포 침입 및 과다한 혈관신생 등과 같은 혈관의존성 질환의 치료에 바람직하게 적용할 수 있는 근거가 된다. 신경교종이 혈관신생력 및 세포사멸 결핍성이 매우 큰 고침입성 종양인 탓에 신경교종 세포를 실험에 이용해왔다 (Merzak A, Pilkington GJ. Cancer Metastasis Rev 16: 155-177, 1997).

본 발명은 또한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 및/또는 그의 염은 조합 형태로 이용시 항증식, 항혈관신생 및 세포사멸 촉진 효과를 갖는다는 입증 사실에 기초하고, 따라서, 만성 건선 플라크에서 상피상의 과다증식, 급성 피부 혈관신생 및 세포사멸 결핍증 등을 특징으로 하는 상기 조합물의 효능을 평가했다 (Karasek MA, Cutis 64: 319-322, 1999).

따라서, 본 발명은 암 및 기타 혈관의존성 질환의 새로운 치료법에 대한 연구 조사에 관한 것으로서, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 및 그의 염이 체외 종양 세포의 성장 및 이동을 억제하고, 세포사멸을 유발하며 또한, 섬유아세포 성장 인자(FGF)에 의해 유발된 체내 혈관신생을 억제하는 능력을 갖는다는 입증 사실에 근거한다. 따라서, 이러한 복합적인 능력에 따라 상술한 화합물은 악성 종양 및 혈액학적 신생물 질환의 치료와 또한 기타의 다른 심각한 혈관신생 관련 질병 (혈관의존성 질환)의 치료에 유용하게 된다.

염 형태로 제형화된 2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 다음의 분자식으로 표현되는 상용의 산물이다 (예를 들면, 칼륨염은 Merck Farma y Quimica SA, Mollet del Valles, Barcelona, 의 제품이다):

(분자식)

여기서, Met 는 금속이며 n 은 염의 금속 원자가의 함수이다. 일반적으로 염의 금속 양이온 형성제가 1가(K) 또는 2가(Ca 또는 Mg) 인 경우 n 은 0, 1 또는 2 이다.

임의의 염으로 제형화한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산은 세포 증식, 이동 및 혈관신생의 억제에 있어서 유사한 효과를 갖기 때문에 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 생물학적 활성은 벤젠 고리에 대한 양이온 결합에 의존하지 않는다. 본 발명은 칼륨염 및 칼슘염 형태로 제형화한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 활성에 대해서만 기술하지만, 본 발명은 이에 국한되지 않으며 상기 화합물의 약제학적 수용가능한 염도 본발명의 사상과 범위에 속한다. 상기의 "약제학적 수용가능한 염" 이란 약제학적 형태에 이용될 수 있는 금속염 또는 부가의 염 형태를 포함하는 것이다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 약제학적 수용가능한 염은 종래의 방법에 따라, 적절한 산 또는 염기를 상기 화합물과 반응시켜 수득할 수 있다.

2,5-디히드록시벤젠 술폰산을 함유하는 약제학적 조성물은 계통적 경로, 경구 또는 비경구, 요도, 직장 혹은 국소 투여식 등의 적절한 투여 형태로 제공할 수 있으며, 필요한 약제학적 수용가능성 부형제를 원하는 투여 형태의 제형에 따라 적절히 포함시킨다.

다음의 실시예는 본 발명을 예시 및 지원하기 위한 것이며 본 발명의 사상 및 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1 은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 (A) 칼슘염 및 (B) 칼륨염을 상이한 농도로서 C6 세포 배양물에 부여하고 48시간 처리한 후의 항증식 효과를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 종좌표: 595nm 에서의 흡수띠. 횡좌표: 농도:μM.

도 2 는 48시간 후 C6 세포의 대조군 배양물의 사진 영상(패널 A), 50μM 의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산(칼슘염)으로 48시간 처리한 C6 세포 배양물의 사진 영상(패널 B), 및 100μM 의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염으로 48시간 처리한 C6 세포 배양물의 사진 영상(패널 C)을 도시한다.

도 3 은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 항증식 효과가 괴사(백색 히스토그램)가 아닌 세포사멸(빗금친 히스토그램) 때문임을 확인할 수 있는 대표적인 히스토그 램을 도시한다. A: 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼슘염. B: 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염. 종좌표: 405nm 에서의 흡수띠. 횡좌표: 시간(시간)

도 4 는 세포사멸 세포의 무작위 검출을 위해 TUNEL 법으로 처리한 신경교종 C6 세포의 사진 영상을 도시한다. 세포사멸 핵은 검게, 사멸되지 않은 세포의 핵 및 세포질은 밝은 색으로 나타난다. 화살표는 세포사멸 핵을 가리킨다. A 및 B 는 대조군 세포이고, C 및 D 는 2,5-디히드록시벤젠 술폰산으로 처리한 세포이다. B 및 D 사진은 각각 A 및 C 사진의 상자부분을 확대한 것이다.

도 5 는 상이한 세포증식 억제 화합물로서, (A) 시스플라틴(5㎍/ml); (B) 빈크리스틴(0.1㎕/ml); (C) 파클리탁셀(5Ug/ml); 및 (D) 5-플루오로우라실(100㎍/ml) 과 함께 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의, 화학요법에 대한 강화효과 (항증식 효과로서 평가함) 를 나타내는 히스토그램을 도시한다. 종좌표: 595nm 에서의 흡수띠; 횡좌표: 백색 히스토그램(대조군); 점 히스토그램(세포증식 억제제; 제1일); 선 히스토그램(2,5-디히드록시벤젠 술폰산 + 세포증식 억제제; 제1일); 사각형 히스토그램(2,5-디히드록시벤젠 술폰산(제0일) + 세포증식 억제제; 제1일).

도 6 은 대조군 실험 및 2,5-디히드록시벤젠 술폰산(B)으로 세포를 처리한 경우의 다른 실험에서 나타낸 세포 이동에 관한 사진 영상을 도시한다. 대조군 세포는 배양중 형성된 하나의 병변을 완전히 재생성하는 반면, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산으로 처리한 세포들의 세포 이동은 배양물의 해당 영역을 완전히 커버할 수 없었다. 수평선은 배양물에 생긴 초기의 종방향 병변을 한정하기 위한 것이다.

도 7 은 대조군 배양물(백색 히스토그램) 및 2,5-디히드록시벤젠 술폰산으로 처리한 배양물(흑색 히스토그램)의 이동력을 표시하는 히스토그램을 도시한다. 이동력은 재생율(배양물에 생긴 종방향 병변에서 커버된 영역의 백분율)로 표시한다 (종좌표).

도 8 은 배양 제17일에 찍은 두개의 닭 태아 사진 영상을 도시한다. 패널(A)는 3 ㎍ 의 bFGF + 0.1% 헤파린으로 처리한 태아에 관한 것이며 패널(B)는 3 ㎍ 의 bFGF + 0.1% 헤파린 + 100μM 의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염으로 처리한 태아를 나타낸다. 물질 방출제로서 사용된 니트로셀룰로오스 종이 원판에 거의 혈관이 없으므로 패널(A)는 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 항혈관신생 효과가 있음을 보여준다.

도 9 는 좌측 엘보의 후부에 위치한 각질 증식형 건선 플라크의 사진 영상을 도시한다. 영상(A)는 처리 개시전 건선 플라크의 모습을 나타낸다. 영상(B)는 활성 성분으로서 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염을 5% 함유하는 크림으로 처리한 뒤 6일후의 동일한 플라크를 나타낸다. 영상(C)는 5% 로 제형화한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염으로 처리한 뒤 2주일 후의 건선 플라크를 나타낸다. 영상에 나타낸 숫자들은 사진을 찍은 날짜이다.

(실시예)

실시예 1: 2,5- 디히드록시벤젠 술폰산의 항증식력에 관한 예시적 분석

3가지의 다른 3회 반복 실험을 래트의 신경교종 세포(C6 세포주)를 이용하여 체외 연구를 실시했다. 세포를 DMEM 둘베코 개질 이글 배지(Gibco, Paisley UK), 7.5% 태혈청(Gibco), 10유닛/ml의 페니실린(Gibco) 및 10㎍/ml의 스트렙토마이 신(Gibco)으로 구성된 배지에서 배양했다. 배양물을 37℃의 습윤 분위기로 유지했다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 세포 증식에 미치는 영향을 평가하기 위하여 각 웰당 2 x 10⁴ 개수의 C6 세포를 24-웰 플레이트 (15mm 직경)에 종균했다. 실험 배양물을 상이한 마이크로 몰수 단위의 농도(μM)의 화합물(2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼슘염 또는 칼륨염)로 48시간 처리했다. 대조군용 배양물은 상기 화합물을 가하지 않고서 48시간 유지했다. 배양물을 48시간 후 도립현미경으로 사진 찍고 결정성 바이올렛(Merck Farma y Quimica SA. Mollet del Valles, Barcelona)으로 착색시킨 후 스펙트럼 광도측정법을 이용하여 각 웰당 세포수를 측정했다. 도 1에서 보는 바와 같이, 상이한 농도의 화합물로 처리하면 세포 증식을 약량의존식으로 억제할 수 있는데 예컨대 100 μM 농도의 2,5-히드록시벤젠 술폰산 칼슘염의 경우 88% 의 억제율을 나타냈다(A). 또한 동일한 농도의 2,5-히드록시벤젠 술폰산 칼륨염을 사용하면 억제율이 74% 였다(B). IC₅₀ 는 칼슘염의 경우 25μM 정도, 또한 칼륨염의 경우 40 내지 50μM 이었다. 도 1A와 1B 를 비교하면, 칼슘염형 화합물로 처리한 후의 세포 증식 억제율과 동일한 값에 도달하기 위해서는 칼륨염형 화합물의 농도가 두배로 되어야 하는 것으로 관찰된다. 이는 칼슘염형 화합물이 수성 용액에서 염으로부터 분리되는 2 활성 단위몰수(2,5-히드록시벤젠 술폰산)를 함유하는 탓이다. 도 2는 처리하지 않은 세포 배양물의 48시간 후의 영상(A), 50μM 농도의 2,5-디히드록시벤젠술폰산의 칼슘염으로 48시간 동안 처리한 C6 세포 배양물에 대한 또다른 영상(B), 그리고 100μM 농도의 2,5-디히드록시벤젠술폰산의 칼륨염으로 48시 간 동안 처리한 C6 세포 배양물에 대한 영상(C)을 나타낸다. 이 연구 결과, 상기 화합물로 처리할 경우 신생물 세포의 증식이 억제되고 미토겐(세포분열) 인자로 체외자극한 정상 혈관 연근육 세포에서 관찰된 상기 화합물의 항증식 효과가 입증되는 것을 확인할 수 있다 (Pares-Herbute N et al. Int J Angiol 8: S5-S10, 1999). 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 항증식 활성이 세포독성에 의해 조정되는지 혹은 세포사멸 촉진 효과에 의해 조정되는지 구분하기 위하여, 여러가지 실험을 다음의 실시예에서 구체적으로 수행했다.

실시예 2: 2,5- 디히드록시벤젠 술폰산의 세포사멸 촉진력에 대한 예시적 분석

이 분석 실험은 실시예 1에서 기술된 절차에 따라 C6 세포에 대해 행했다. 분석 대상 화합물의 세포사멸 촉진 효과를 입증하기 위하여, 두가지 다른 방법으로 DNA의 세포간 분절화 및 세포사멸 핵 그대로의 모습을 검출하였다.

DNA의 세포간 분절화 검출

히스톤에 관련된 DNA 분절편을 정량화하는 효소적 면역분석법이 세포사멸 개시를 측정하는데 적절할 것으로 본다 (Aragane Y et al. J Cell Biol 1998; 140: 171-182). 이 방법은, 괴사시 세포질막이 파괴되어 DNA가 배양 배지에 출현하는 반면 세포사멸시에는 혈장막이 정상 상태를 유지하므로 분절된 DNA 가 세포 속에 그대로 유지되기 때문에, 괴사로 인한 죽음을 세포사멸로 인한 죽음과 구분할 수 있게 해준다 (Aragane Y et al. J Cell Biol 140: 171-182, 1998).

제조업체의 지시에 따라 세포사 검출 ELISA^plus 키트 (Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 C6 (2 x 10³) 세포 배양물에 대해 4, 16, 24 및 48시간에 DNA 분절화를 측정했다. 대조군 배양물은 아무런 처리도 하지 않았으나 실험용 배양물에는 50 내지 200μM 의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염을 가했다 (도 3A). 또한 25 내지 100μM 의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼슘염을 배양물에 가하여 실험했다 (도 3B). 실험은 모두 3가지 다른 실험에서 3회씩 중복 실시했다.

도 3A 및 3B 은: (a) 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 항증식 효과가 주로 세포사멸 촉진 활성에 의해 조정되고; (b) 세포사멸 촉진 효과는 상기 화합물의 칼슘염 또는 칼륨염이 모두 비슷하므로, 분자에 결합된 양이온이 화합물의 활성을 결정하지는 않으며; (c) 48시간 동안 상기 화합물로 처리한 세포에서 최고 세포사멸 촉진 효과를 얻을 수 있고; (d) 또한 칼슘염의 경우 25μM 의 농도와 칼륨염의 경우 50μM 의 농도일 때 최대의 효과를 얻을 수 있으며 상기 효과가 세포 증식 연구시의 IC₅₀ 와 동일하다는 것을 보여준다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 항증식 기작이 세포사멸에 기인한 세포사와 관계있는 것으로 입증되었으므로, 이제 그 효과를 다음의 기술에 따라 신경교종 세포의 현미경 연구를 통해 양적 평가했다.

세포사멸 핵의 직접 검출 (TUNEL 법)

3가지의 독립 실험을 3회씩 반복했다. 대조군 배양물에서 얻은 C6 세포 및 24시간 동안 화합물(각각 50μM 의 칼슘염 및 100μM 의 칼륨염)로 처리하여 얻은 C6 세포를 유리 슬라이드에 부착하여 4% 파라포름알데히드 완충액(pH 7.4) 으로 실 험실 온도에서 1시간 동안 고정시켰다. 그 뒤, 세포를 세척하여 0.1% 트리톤 X-100 용액에 침적시켰다. 이어서 세포를 세척한 후 TUNEL 법을 적용했다 [말단 데옥시누클레오티딜 트랜스페라제(TdT)-조정 dUTP 닉 및 라벨링화 (Gavrieli Y, Sherman Y, Bensasson SA. J Cell Biol 119: 493-501, 1992)]. 세포사멸 핵의 직접 검출용 키트 (In situ Cell Death Detection Kit Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 를 사용했다. 키트 제조업자의 지시에 따라 다단계로 이루어진 상기의 기술을 적용했다. 마지막으로, 세포를 녹색광으로 착색했다 (Fluka, AG, Switzerland). TUNEL 반응은 세포사멸 핵에서만 일어난다.

본 발명의 목적 화합물의 칼슘염 및 칼륨염을 이용하여 매우 유사한 결과를 얻었으므로 칼륨염을 통해 얻은 결과만 도시한다. 6개의 대조군 배양물 및 2,5-디히드록시벤젠 술폰산(100μM)으로 처리하여 얻은 6개의 배양물이 각각 부착된 12개의 슬라이드에서, 6곳의 다른 영역에 있는 세포들의 수를 세었다. 비세포사멸 세포 및 세포사멸 세포의 총수는 다음과 같다.

C6 세포	세포사멸 핵	정상 핵
대조군 세포	138	5954
처리 세포	3846	354

본 발명의 목적 화합물의 항증식 효과 때문에, 처리된 세포의 총수는 대조군 세포의 총수보다 작다.

도 4의 영상은 대조군 배양물(A 및 B)과 화합물 처리된 또다른 배양물(C 및 D)의 실험에서 TUNEL 법이 적용된 영역을 보여준다. 상기 영상에서 보는 바와 같이, 대조군 세포에서는 단 두개의 세포사멸 핵만 관찰되는 반면, 본 발명의 화합물로 처리한 세포에서는 107개의 세포사멸 핵이 발견되었으며 정상 세포(비세포사멸 핵)는 8개에 불과했다.

이들 데이타는 2,5-디히드록실벤젠 술폰산이 종양 세포사멸을 유발하는데 효과적인 중요한 세포사멸 촉진 활성을 가진 화합물임을 보여준다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 정상 인간 세포에서의 세포사멸을 억제하는 것은 이미 입증되었으므로(Braber R, Farine JC, Lora GA. Apoptosis 4: 4111-49, 1998), 상기 화합물은 암 치료에 있어서 강력한 분자후보가 된다.

화학요법 및 방사선 요법의 치료 실패에 관련된 기작 중 하나는, 종양세포내에 항세포사멸 단백질의 과다 발현에 주로 기인하므로 세포사멸에 의해 세포사를 유발하는 이 처리법이 무용하게 되는 것이다 (Sellers WR, Fisher DE.J Clin Invest 104: 1655-1661, 1999; Branch P. et al. Oncogene 19: 3138-3145, 2000). 따라서, 세포사멸 촉진 화합물은 화학 요법 및 방사선 요법 처리시 보조제로서 임상적 용도에 적절히 사용할 수 있다.

이상 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 세포사멸 촉진 효과을 개시하였으며, 상기 화합물이 각종 세포증식 억제 약물의 항증식 효과를 증가시키는 능력도 평가했다. 다음의 실시예는 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 시스플라스틴, 빈크리스틴, 파클리탁셀 및 5-플루오로우라실 같은 종양학 분야에서 이용된 각종 세포증식 억제 화합물의 치료 효능을 증가시키는 방법을 보여준다.

실시예 3: 화학요법의 강화작용에 대한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 능력에 관한 예시적 분석

실시예 1에서 설명한 것과 동일한 조건하에 시험관내 배양된 C6 세포를 이용했다. 1 x 10³ 세포수/웰 의 세포를 24-웰 플레이트에서 배양했다. 3종류의 처리: (a) 종균후 24시간 뒤에 세포를 각각 다음의 약제로 처리했다; 시스플라틴(5㎍/ml),빈크리스틴(0.1㎍/ml), 파클리탁셀(5㎍/ml) 및 5-플루오로우라실(100㎍/ml); (b) 종균후 24시간 뒤에, 2,5-디히드로벤젠 술폰산(칼륨염, 100μM) 및 다음의 약제: 시스플라틴(5㎍/ml), 빈크리스틴(0.1㎍/ml), 파클리탁셀(5㎍/ml) 및 5-플루오로우라실(100㎍/ml) 중 각각을 함께 이용하여 처리했다; (c) 종균시 (제0일), 세포를 2,5-디히드로벤젠 술폰산(칼륨염, 100μM)으로 전처리했다. 다음날, 배양물을 다음의 약제: 시스플라틴(5㎍/ml), 빈크리스틴(0.1㎍/ml), 파클리탁셀(5㎍/ml) 및 5-플루오로우라실(100㎍/ml) 중 각각을 함께 이용하여 또다시 처리했다. 대조군 배양물은 2일간 처리를 하지 않았다. 48시간 후(2일), 실시예 1에서 이용한 것과 동일한 형태의 세포를 모든 배양물에서 평가했다. 이 연구는 3회 반복한 3중 독립 실험에서 행해졌다.

도 5(A, B, C 및 D)는 각종 세포증식 억제 약물의 강화작용에 미치는 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 효과를 평가하가 위해 행한 실험의 히스토그램을 도시한다. 시스플라틴, 빈크리스틴 및 5-플루오르우라실로 처리하면 C6 세포의 증식이 50% 억제되고 파클리탁셀로 처리하면 67% 의 세포증식 억제율을 얻을 수 있다. 2,5-디히 드록시벤젠 술폰산과 세포증식 억제제 (시스플라틴, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실) 복합 처리시 세포증식 억제율은 84% 로 증가하고 2,5-디히드록시벤젠 술폰산과 파클리탁셀을 복합하여 처리하면 세포증식 억제율이 86% 로 증가한다. 세포 배양물을 2,5-디히드록시벤젠 술폰산으로 전처리한 뒤 다시 세포증식 억제제로서 시스플라틴, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실로 처리하면 90% 의 세포증식 억제율을 얻을 수 있고 파클리탁셀을 사용할 경우 세포증식 억제율은 92% 까지 도달한다.

상술한 결과로부터, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산을 화학 치료제와 동시 사용하여 처리해도 치료효능이 더욱 증가하지만, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산으로 전처리한 경우엔 화학적 세포증식 억제 효과가 더욱 높다는 것을 알 수 있다. 이 데이타는 화학요법 및 방사선 요법에 연계한 처리에서 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 보조제로서의 용도를 뒷받침해 준다.

실시예 4: 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 이동방지력에 관한 예시적 분석

3가지 상이한 실험을 3회씩 실행하여 분석했다. 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 세포 이동을 억제하는 능력을 평가하기 위해, 20mm 플레이트에서 체외 배양된 C6 2 x 10⁵ 세포를 사용했다. 대조군 배양물 및 100μM의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염으로 처리한 배양물에 대해 멸균 마이크로피펫으로 종방향 병변을 만들었다(제0일). 발광 현미경에 연결한 사진촬영 장치를 이용하여 디지탈 사진을 찍고 병변 부위에서 컴퓨터 형태분석 프로그램으로 한계범위를 규정했다 (Moticam. Motic. Barcelona). 다시 24시간후 사진을 찍고 병변의 윤곽을 표시하고 처음 두장 의 사진(제0일)과 24시간 후의 사진을 겹쳐서 이동 세포에 의해 점유되는 손상 부위의 면적율을 계산했다. 이 값을 화합물 처리에 의한 재생율로 표시했다. 도 6은 대조군 실험(A), 및 본 발명의 목적 화합물로 24시간 동안 세포 처리한 또다른 실험(B)에 관한 대표적인 실시예를 도시한다. 상기 도면에서 관측된 바와 같이, 무처리 세포의 경우 병변이 완전히 재생성되었으나 (도 6A), 화합물 처리된 세포는 이동 불가했고 따라서 병변 부위 전체를 덮지 못했다 (도 6B). 도 7 은 모든 실험의 백분율 데이타를 나타내며 2,5-디히드록시벤젠 술폰산이 종양 세포 이동을 64% 까지 억제하고 있음을 보여준다.

실시예 5: 2,5- 디히드록시벤젠 술폰산의 항- 혈관신생력에 관한 예시적 분석

이 분석에서는, 항-혈관신생 작용제의 활성을 체내 시험하기 위해 닭 태아의 장뇨막(chorioallantoic membrane)을 사용했다 (Zilberberg L. et al. J Biol Chem 2003; 278: 35564-35573). 혈관신생 촉진 화합물로서 섬유아세포 성장인자 기본형(bFGF)을 사용했다 (Meghna U et al. Blood 2003; 102: 2108-2114).

수정란을 37℃ 및 습도 80% 의 배양기에 유치했다. 4일 후 계란 껍질의 가장 뾰족한 부분에 구멍을 내어 1ml의 알부민을 수득했다. 그 뒤 상기 구멍을 파라핀 필름(Parafilm M Laboratory Film Chicago IL. USA)로 덮었다. 이 방법으로 태아가 껍질 상부에 부착되는 것을 방지하는 에어 챔버를 형성할 수 있다. 배양 제13일째, 에어 챔버 높이에서 껍질을 쪼개어 화합물 처리를 행했다. 12개의 태아를 3㎍ bFGF 와 0.1% 헤파린으로 구성된 5㎕ 용액으로 처리하여 니트로셀룰로오스 종이 원판에 적셨다. 그 뒤 쪼갠 껍질을 다시 파라핀 필름으로 밀봉시켰다. 그 다음날, 태아 중 절반(n=10)은 껍질을 벗기고 100μM 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염을 생리 염수(5㎕)에 녹인 용액과 함께 다시 니트로셀룰로오스 종이 원판에 적셨다. 껍질의 구멍을 다시 파라핀 필름으로 덮었다. 제17일째에 실험을 종료하고 비교 연구를 위해 니트로셀룰로오스편의 사진을 찍었다.

도 8 은 3㎍ bFGF 와 0.1% 헤파린으로 구성된 용액으로 처리한 태아(A) 및 그 다음날 100μM 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염 용액을 첨가한 또다른 태아(B)에 대한 각각의 영상을 나타낸다. 영상(A)는 니트로셀룰로오스 종이 원판이 혈관의 침입을 받는 모습을 나타내는 반면 영상(B)는 거의 혈관 침입이 없는 것을 보여준다. 니트로셀룰로오스 종이 원판의 영상을 컴퓨터 시스템(Moticam Motic. Barcelona)으로 형태분석 정량 측정한 결과, 목적 화합물의 항-혈관신생 효과를 나타낸다 (bFGF + 헤파린으로 처리한 태아의 혈관으로 덮인 원판 면적=35±8.6% 대(vs.) bFGF + 헤파린 + 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염으로 처리한 태아의 혈관으로 덮인 원판 면적=2±1.5%; p < 0.0001; unpaired student's t-test). 50μM 의 상기 화합물의 칼슘염을 이용하여 유사한 효과를 얻었다. 이 실험은 본 발명의 목적 화합물이 bFGF 유발의 혈관신생 영향을 중화시킬 수 있는 항-혈관신생 활성을 갖고 있음을 보여준다.

실시예 6: 건선 병변에 대한 분석

이 연구에서, 피부 질환의 국소 치료를 위한 통상의 방법으로서 크림 형태로 2.5 및 5% 농도로 제형화 한 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염을 사용했다. 상기 2,5-디히드록시벤젠 술폰산염의 선택된 농도는 당뇨성 망막증 치료에 이용된 농 도 범위 내의 값이다: 1개당 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼슘염 500mg의 태블릿을 1일 6개 투여한다(Benakis A et al Therapie 1974; 29:211-219). 수성상 크림 용도로 증류수를 사용했다. 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 또는 바셀린으로 지방상을 구성할 수 있다. 크림 제조에 효과적인 유화제로서 스팬을 사용한다. 두 제형물(2.5 및 5%)이 임상적 효과가 있지만, 치료학적으로 가장 유리한 것은 5% 농도일 때다. 따라서, 5% 크림으로 제형화된 산을 이용하여 얻은 결과를 나타낸다. 다음의 실험은 본 발명을 제한함 없이 예시하기 위한 목적으로서, 건선의 국소 치료용 유효 크림에 관한 것이다.

I. - 활성부 (2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염 5.6%)

II. - 불활성부 (부형제인 세틸 알코올(2.5%), 스테아릴 알코올(2.5%), 액상 바셀린(30%), 백색 소프트 파라핀(20%), 소르비탄 올레이트(5%) 및 증류수(c.s.p. 100g).

본 발명의 목적 화합물을 이용항 처리의 임상적 효능을 박리 징후(D), 홍반(E) 및 침윤(I)을 정량 측정하는 인덱스에 따라 평가했으며 그 평가 결과를 다음과 같이 분류했다: (0) 없음; (1) 약간 있음; (2) 중간 및 (3) 심각함 (Freeman AK et al. J Am. Acad Dermat 2003; 48: 564-568). 도 9 는: 처리 전, 좌측 팔꿈치의 확장부에 위치한 동일한 만성 건선 플라크를 5% 의 2.5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염으로 처리한 후 6일 및 13일의 3가지 경우의 영향을 나타낸다. 관측하는 바와 같이, 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염을 함유하는 크림으로 국소 치료하면 초기(6일)에 플라크를 아주 현저히 "제거" 하여 각질 증식증을 거의 완전히 소거한 다. 크림의 치료 효능은 치료 후 두번째 주가 끝날 때 더욱 뚜렷하다. 치료시 전체 DEI 인덱스값이 크게 감소한다 (전체 DEI 예비치료 = 6±1.57 대 전체 DEI 후치료 = 1±0.58 ; p<0.0001; unpaired student's t-test).

상기와 같이, 본 발명은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산을 포함하는 약제 조성물, 또한 급격한 세포증식, 혈관신생화 같은 혈관의존성 질환, 더 구체적으로는 예컨대 종양이나 건선 등에서와 같이 사멸기작 감소를 동반하는 혈관의존성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 이용할 수 있다.

Claims

혈관의존성 질환의 치료에 적용할 수 있는 약제의 제조에 있어서 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 또는 그의 약제학적 수용가능한 염의 용도.
제 1항에 있어서,

상기 혈관의존성 질환은 세포사멸(아폽토시스: apoptosis)의 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 또는 2항에 있어서,

제조 약제는 암 치료에 응용하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 3항에 있어서,

제조 약제는 암 치료에서 세포증식 억제제의 항증식 효과를 증가시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,

약제 제조에 바람직한 염은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,

약제 제조에 바람직한 염은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼슘염인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,

제조 약제는 또한 적어도 하나의 약제학적 수용가능한 부형제를 적정량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항에 있어서,

제조 약제는 건선 치료에 응용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 8항에 있어서,

약제 제조에 바람직한 염은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼륨염인 것을 특징으로 하는 용도.
제 8항에 있어서,

약제 제조에 바람직한 염은 2,5-디히드록시벤젠 술폰산의 칼슘염인 것을 특징으로 하는 용도.
제 8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,

제조 약제는 적어도 하나의 약제학적 수용가능한 부형제를 적정량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 8항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,

약제는 국소 응용 제형으로 구성되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 12항에 있어서,

약제는 다음으로 구성된 조성을 가진 크림 또는 연고인 것을 특징으로 하는 용도:

- 약제학적 유효량의 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 또는 그의 약제학적 수용가능한 염;

- 약제학적 수용가능한 양의 적어도 하나의 알코올;

- 약제학적 수용가능한 양의 적어도 하나의 유화제;

- 약제학적 수용가능한 양의 적어도 하나의 부형제;

- 지질상, 특히 바셀린을 포함하는 약제학적 수용가능한 양의 적어도 하나의 부형제; 및

- 증류수.
제 13항에 있어서,

약제는 다음으로 구성된 조성을 가진 크림 또는 연고인 것을 특징으로 하는 용도:

- 5% 2,5-디히드록시벤젠 술폰산 칼륨염;

- 2.5% 세틸 알코올;

- 2.5% 스테아릴 알코올;

- 30% 액상 바셀린;

- 30% 백색 소프트 파라핀;

- 5% 스판 (소르비탄 올레이트); 및

- 적정량 100g 의 증류수.