JPH0421636A - 肝機能改善剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １（７）　ＪＪｌｆｌ’損」 本発明は、肝疾患や肝手術のために低下した肝機能を改
善する肝臓用薬剤に関する。

良來立改４ 今日、出血性ショック、肝ガン治療のための肝手術等に
おいて、肝機能を保持しあるいは改善する薬剤はない。

一方出血あるいはエンドトキシン汚染時あるいは外科的
肝治療において、肝臓はしばしば障害を受け、ＧＯＴ、
ＧＰＴの値の上昇で示されるような肝機能の低下、ＡＴ
Ｐ産生能の低下がおこり、時には肝細胞の壊死を引き起
こす。

さらに肝ガン、肝硬変を有する患者においてはこれらの
治療に伴う侵襲の影響は深刻であり、例えば肝ガン患者
の肝部分切除手術における死亡率は高く、有効な肝機能
の維持、改善剤の出現が望まれている。

が　゛　しよ゛とする課 本発明は、ショックあるいは外科手術における肝機能の
低下を防止し、患者の治癒を促進する肝機能維持改善能
を有する薬剤を創出することを課題とする。

を　′　るための 本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、
スーパーオキサイドジスムターゼ（ＩｓＯＤＪと略記す
る）をポリオキシアルキレン類で修飾したものをショッ
ク治療あるいは肝手術時に投与することにより、治療後
の肝機能及び生存率に著しい改善効果を認めたので、こ
の発見に基づき本発明を完成するに到った。即ち、本発
明はポ本発明で使用するポリオキシアルキレン類で修飾
された５ＯＤ（ｒ修飾５ＯＤＪ　と略記する）は、ポリ
オキシアルキレン類の末端とＳＯＤとの結合部分が下記
に示す構造式を有することが望ましい。

−０−（ＣＨ２）　ｌｌ−Ｃｏ−ＮＨ−５ＯＤ（ｎは０
〜１２の整数をあられす） 修飾ＳＯＤについては既に公知の方法（特開昭６１−２
４９３８８号公報参照）を利用して調製することができ
る。例えば、ポリオキシアルキレン類としてポリオキシ
エチレンを使用し、ポリオキシエチレンの両末端にＳＯ
Ｄが結合した骨格を有するものを５〜５０％含み、ＳＯ
Ｄ分子１分子当たりのポリオキシエチレンの結合数が０
．５〜１０個のものが調製される。修飾ＳＯＤの平均分
子量は３５，０００〜５００，０００程度である。

ＳＯＤとポリオキシアルキレン類を反応させる際は、反
応時のＳＯＤ濃度、緩衝液のｐＨ，添加するポリオキシ
アルキレン類の量あるいは種類によって、または反応時
にグリシンやリジンなどのアミノ酸等を共存させること
により、得られる修飾ＳＯＤの血中半減期を最も好まし
い範囲に調整することが可能である。

原料であるＳＯＤとしては、ヒト由来、牛、ウマ等の哺
乳動物由来、微生物由来のもの、遺伝子工学的手法によ
って得られた微生物、酵母等から産出されたもの等、そ
の由来に制限はない。

さらに本発明の有効成分として使用する修飾ＳＯＤは、
医療的に許容し得る範囲であれば塩の形態であってもよ
い。

本発明の前記修飾ＳＯＤはかかる治療を必要とする患者
（動物およびヒト）に対して患者光たり０．０２〜１０
００ｍｇ／ｋ　ｇの用量範囲で投与することができる。

用量は病気の重さ、患者の体重及び当業者が認める他の
因子によって変化させる。

前記修飾ＳＯＤは肝機能の維持ないしは改善を目的とし
て使用されるものであり、例えば非経口投与として無菌
溶剤液で処方し利用することができる。

注射のための無菌組成物は、例えば注射用蒸留水に緩衝
剤、酸化防止剤などを必要に応じて混合させたものによ
って調製される。

また、ＳＯＤを他の化学修飾により血中寿命を延長させ
たものでもよく、また投与法の工夫により未修飾ＳＯＤ
の血中における活性を長時間維持してもよい。

夾に乳 以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

なお本発明はこれらの実施例に限られるものではない。

実施例１ （１）ＳＯＤ−ＰＯＥの調製 大腸菌を用いる遺伝子組み替え法により得られたヒト型
Ｃｕ　、Ｚｎ−５ＯＤ　（４１７０単位／　ｍ　ｇ　）
３　ｇ　（０，０９４ｍＭ）　を０．１Ｍのリン酸カワ
ウム緩衝液（−ｐ　Ｈ７、２）　３００　ｍ　ｌに溶解
させ、これにポリオキシエチレンをＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドによって活性エステル化した活性化α−カル
ボキシメチル、ω−カルボキシメトキシポリオキシエチ
レン（以下「活性化ＰＯＥＪ　と略す。

平均分子量約３０００ダルトン、日本油脂（株）製）を
３．５６　ｇ　（１，１９ｍＭ）添加し、素早く一様に
攪拌し室温にて１時間放置したのちグリシン０．３４　
ｇ　（４，５ｍＭ）を添加することにより反応を終了さ
せた。その後、この溶液を分子量阻止３万ダルトンの限
外濾過膜ＹＭ３０　（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐ、、Ｄａｎ
ｖｅｒｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いて脱塩、濃縮ノ し２００ｍ１のＰＯＥ修飾ＳＯＤ　（ＳＯＤ−ＰＯＥと
略す）の水溶液を得た。

溶液中ＳＯＤ濃度は１０．２ｍｇ／ｍｌ、比活性は４０
２０単位／ｍｌであり、従って蛋白収率６８％、酵素活
性保持率９６．４％であった。また５ＯＤＩ分子当たり
の平均ポリオキシエチレン結合数は４．３個であった。

尚ＳＯＤ活性値はマツコードらの方法（Ｊ、Ｍ、ＭｃＣ
ｏｒｄ、、１．Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｈ　。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４４．６０４９〜６０５
５　（１９６９））により測定し、ＳＯＤ蛋白濃度は２
８０　ｎｍの吸光度より求めた。また活性保持率は、反
応前のＳＯＤ活性値に対する保持率で求めた。５ＯＤ１
分子当たりの平均ＰＯＥ結合数は、元素分析を行ないＣ
／Ｎ比をもとめることにより算出した。

（２）ショック肝モデルにおける効果 上記（１）の方法で得られた５ＯＤ−ＰＯＥを用いて以
下に示すショック肝モデル実験を行なった。

、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（２５０〜３００ｇ））４
８匹を用い、ベンドパルビタール４０ｍｇ／ｋｇの腹腔
的投与による麻酔後開胸した。外側左葉および中間葉へ
の流人血行を血管クリップを用いて全て遮断する７０％
部分肝虚血モデルを作製し、３０．６０，１２０分後の
アデノシントリフオスフェート　（ＡＴＰ）量、総アデ
ニンヌクレオチド（ＴＡＮ）量を測定した。その後血流
を再開し１８０分後同様にＡＴＰ、ＴＡＮの測定と、肝
機能の指標である血漿中グルタミックオキザロアセチッ
クトランスアミラーゼ（ＳＧＯＴ）およびグルタミック
ビルビックトランスアミラーゼ（Ｓ　Ｇ　ＰＴ）活性を
測定し、肝機能の回復に対する薬物の効果を測定した。

。 各測定方法を以下に示す。

ＡＴＰ及びＴＡＮ量；スギノらの方法（Ｓｕｇｉｎ。

Ｋ、、Ｙａｍａｄａ　Ｋ、、Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｔ、、
　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。

凰４２７〜３１　（１９８６））に従って測定した。

５ＧＯＴ及び５ＧＰＴ活性；カルメンの方法（Ｋａｒｍ
ｅｎ　Ａ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　３４．
１３１〜５　（１９５５））に従って測定した。

統計処理；測定値は平均値と標準偏差を求め、ダネット
の検定を行なうことにより有意差検定を行なった。

なお対象群（Ｃｏｎｔｒｏ１）には乳酸リンゲル液を、
薬物投与群には５ＯＤ−ＰＯＥ６０００Ｕｎ　ｉ　ｔ／
ｋｇを血行遮断１０分前に静脈内投与した。

結果を第１表および第１，２図に示す。いずれも対象群
に比べ５ＯＤ−ＰＯＥ投与群で血液再開後の肝機能の回
復に優れた改善効果がみられた。

第」ｊ！。

（にａｒｍｅｎ　Ｌｌｎｉｔ） ＊：　　　Ｐ＜０．００１　　ＶＳ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ
実施例２ （１）ＣＨ３０ＰＯＥ−３ＯＤの調製 ！市販のポリエチレングリコールメチルエーテル分子量
５０００ダルトン（Ａｌｄｒ　ｉｃｈ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ
、Ｉｎｃ、、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）　５
０　ｇとモノクロル酢酸１．８ｇを無溶媒、水酸化カリ
ウムの存在下、１２０℃１０時間反応させた。生成物は
トルエンで抽出し陰イオン交換樹脂を用いて精製し、α
−カルボキシメチル、ω−メトキシポリオキシエチレン
３０ｇ即ち、ＣＨ３０（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、、ＣＨ２Ｃ
○○Ｈ（以下ＣＨ３０ＰＯＥと略す）を得た。

このＣＨ３０ＰＯＥ　　５ｇをジメチルホルムアルデヒ
ドを溶媒としＮ−ヒドロキシコハク酸イミドとジシクロ
へキシルカルボジイミドの存在下縮合させ、ＣＨ３０Ｐ
ＯＥのＮ−ニトロキシコハク酸イミドエステル（いわゆ
る活性エステル）　４．５ｇを調製した。

牛赤血球由来ＳＯＤ　（ｂ−３ＯＤ、比活性３８００Ｕ
ｎ　ｉ　ｔ／ｍｇ）　１．５ｇ　（０，０４７ｍＭ）を
３００ｍ１の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，２）に溶
解させた。ＣＨ３０ＰＯＥの活性エステル４゜０　ｇ　
（０，８４ｍＭ）をｂ−３ＯＤの水溶液に添加し、０．
４規定水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８，２に調整しなが
ら１時間反応を行なった。

反応生成物（ＣＨ３０ＰＯＥ−５ＯＤ）は、ＨＰＬＣに
て分子量が一定になったところで中止、分子量阻止限界
３０００ダルトンの限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ、
、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）で塩類および低分子
物を除去、精製した。なお操作は４℃のクリーンブース
内で行なった。このＣＨ３０ＰＯＥ−５ＯＤの結合ＣＨ
３０ＰＯＥ数を元素分析により測定すると５ＯＤ１分子
当たり６．１個、活性収率７０％、ＳＯＤ比活性３５０
０Ｕｎ　ｉ　ｔ／ｍｇであった。

（２）肝部分切除後の肝機能及び生存率における改善効
果 上記（１）にて得られたＣＨ３０ＰＯＥ−５゜Ｄを用い
て、以下に示す実験系にて、病変を起こした肝の部分切
除後の肝機能及び生存率の改善効果について比較検討を
行なった。

・実験方法 ７２匹の雄うッ）（２００±１０ｇ）を以下に示す３つ
の群に分けた。

１、コントロール群 ２、病変肝（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅｄ　１ｉｖｅｒ）
群３、修飾Ｓ　ＯＤ（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅｄ　１ｉ
ｖｅｒ＋５ＯＤ）群コントロール群には１ｍｌの生理食
塩水を３回／週、１０週間腹腔内投与した。病変肝群（
以下ＤＬ群と略す）はカサハラの方法（Ｋａｓａｈａｒ
ａ　Ｙ、。

Ａｒｃｈ、Ｊｐｎ、Ｃｈｉｒ、　４６．３３５〜６０　
（１９７７））に従い４％のチオアセトアミド（カタヤ
マ化学（株）製）２００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇを３回／
週、１０週間腹腔内投与することにより病変肝を作成し
た。修飾ＳＯＤ群（以下Ｄ　Ｌ＋Ｓ　ＯＤ群と略す）は
ＤＬ群と同様にして病変肝を作成し、さらに修飾ＳＯＤ
を投与した。

１０週間の後、ヒギンスとアンダーソンの方法（Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ　Ｇ、Ｍ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｒ，Ｍ、、Ａ
ｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ。

１２、１８６〜２０２　（１９３１））に従い、肝の７
０％切除を行なった。修飾ＳＯＤは手術３０分前１手術
後２回／日それぞれ５０００単位／ｋｇずつを腹腔内投
与した。

）手術前および手術後１日目、３日目、５日目にそれぞ
れの群から各６匹ずつのラットを断頭することにより層
殺し肝臓を取り出し、ＡＴＰ量、ＴＡＮ量を測定した。

また同時に血液を採取し、５ＧＯＴ及び５ＧＰＴを測定
した。

さらに別のラット６０匹を用いて、５日後まで！主人 ！１表 これらの結果から、修飾ＳＯＤの投与によって病変肝に
おける切除手術後の生存率が有意に上昇したことがわか
った。さらにＡＴＰ量及びＴＡＮ量と５ＧＯＴ、５ＧＰ
Ｔ活性の手術後の低下に対する回復力も有意に上昇して
いた。

病変肝では手術後キサンチンの組織濃度が著名に上昇し
ており、従ってこれより生成されるＯ′２（スーパーオ
キサイドラジカル）が再生過程において細胞障害を引き
起こす原因となっていることが明らかとされた。

発貝ｊづ娼」 以上から明らかなように、本発明の肝臓用薬剤はショッ
ク時あるいは外科手術時における肝機能を著しく改善し
ており、故に本発明は医薬産業上きわめて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１，２図はそれぞれ実施例１におけるＡＴＰ及びＴＡ
Ｎ量の経時的変化を表す。 第３図は実施例２において各群における手術経過日数ご
との生存率を示す。 なお、略号および記号は以下の意味を表す。 Ｐｒｅ　：手術前 ＰＯＤ；手術後経過日数 ＊　；　ｐ　＜０．０５対コントロ一ル群＋　；　ｐ　
＜０．０５対ＤＬ群

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ポリオキシアルキレン類で修飾されたスーパーオキ
   サイドジスムターゼを有効成分として含有する肝機能改
   善剤 ２）ポリオキシアルキレン類で修飾されたスーパーオキ
   サイドジスムターゼが、ポリオキシアルキレン類分子の
   両末端にスーパーオキサイドジスムターゼが結合した骨
   格を有するものを含むものである請求項１記載の肝機能
   改善剤 ３）ポリオキシアルキレン類がポリオキシエチレンであ
   る請求項１記載の肝機能改善剤 ４）ポリオキシアルキレン類がアルコキシポリエチレン
   グリコールである請求項１記載の肝機能改善剤