WO2005092348A1

WO2005092348A1 - ヘパリン様オリゴ糖含有ｈｇｆ産生促進薬剤

Info

Publication number: WO2005092348A1
Application number: PCT/JP2005/005741
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Nakamura; Kunio Matsumoto; Kazuhiro Fukuta
Original assignee: Kringle Pharma Inc.
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2005-10-06
Also published as: CN1819833A; US20060293275A1; EP1731131A1; CA2534445A1; JPWO2005092348A1

Abstract

　本発明は、ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４－グリコシド結合もしくはβ１，４－グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４－グリコシド結合もしくはβ１，４－グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩を有効成分として含有するＨＧＦ産生促進薬剤を提供することを目的とする。本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、生体の組織、器官等の障害の治癒促進に有用である。

Description

明細書

へパリン様オリゴ糖含有 HGF産生促進薬剤

技術分野

[0001] 本発明は、へノ^ン骨格を有する低分子オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を含有する HGF産生促進薬剤に関する。

背景技術

[0002] 再生因子 ·治療因子として HGF (肝細胞増殖因子）が注目を浴びて!/、る。 HGFは肝実質細胞の増殖を指標として発見された蛋白質であるが、その後の研究により、 H GFは肝実質細胞以外にも多くの上皮系細胞や一部の間葉系細胞にも増殖作用を示すことが明ら力となっている。また、 HGFの示す活性は細胞増殖活性のみならず、細胞遊走促進、形態形成促進、細胞死抑制、血管新生作用等多様な活性を示すことも知られている (非特許文献 1)。 HGFはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃 ·十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等 (特許文献 1〜14参照）としての開発が期待されている。

[0003] HGFは主に間葉系の細胞によって産生される力その産生量は臓器の傷害に応じて上昇する。例えば、肝臓に傷害が起こると、肝臓の血管内皮細胞やクッパー細胞、伊東細胞等の肝非実質細胞で HGFの産生が高まる。一方、この時、無傷の肺、脾臓、腎臓等の他の臓器でも HGFの発現が上昇し、血中の HGFレベルが上昇する。このことは、臓器の傷害に応じて HGFの発現を誘導する因子が血中に存在することを示すが、そのような因子はインジュリンと総称される (非特許文献 2)。

インジユリンは単一の物質ではなぐ例えばインターロイキン 1、 FGF (線維芽細胞増殖因子）、 PDGF (血小板由来増殖因子)等のサイト力インに加え、プロスタグランジン等のォータコイドがインジュリンとして同定されている。これらの因子は、 HGF の mRNAの発現を上昇させることにより、 HGFの産生を高める。一方、インジュリンの探索過程でへパリン及びへパラン硫酸にも HGF産生促進活性があることが見出された (非特許文献 3)。

へパリン及びへパラン硫酸は HGFの mRNAの発現を上昇させずに、翻訳過程以後のステップに作用することが示唆されているが、詳細な機構は不明である。

[0004] へパリン及びへパラン硫酸は、グリコサミノダリカン (GAG)として知られる一群の多糖類のメンバーである。へパリン及びへパラン硫酸は、 D—ダルコサミンとゥロン酸からなる二糖を基本単位とし、該ニ糖の繰り返しによって構成される多糖である（非特許文献 4)。

へパリン及びへパラン硫酸の分子量は不均一で、 5000力ら 30000程度のもの力 S 混在して!/、る。 D -ダルコサミン残基の 6位の炭素は部分的に O―硫酸化を受けており、また、アミノ基は部分的に N—ァセチル化もしくは N—硫酸ィ匕を受けている。ゥロン酸残基としては Lーィズロン酸又は D—グルクロン酸の 2種類をとりうる力へパリンではほとんどが Lーィズロン酸であり、へパラン硫酸ではほとんどが D—グルクロン酸である。ゥロン酸残基の 2位の炭素は部分的に O—硫酸ィ匕を受けている。さらに、その他の部位でも硫酸ィ匕が起こる場合があり、これらの硫酸ィ匕の位置の多様性が分子に多様性を与えている。へノ^ンの方がへパラン硫酸よりも全体的に高度に硫酸ィ匕を受けている。し力しながら、組織から分離されるへパリン又はへパラン硫酸の調製物は不均一であり、両者の明確な区別は困難である。

[0005] へパリンは、従来より主に抗血液凝固剤として臨床の場で用いられている。例えば、へパリンは血液体外循環時の凝固防止や、播種性血管内凝固症候群 (DIC)、心筋梗塞をはじめとする血栓性疾患の治療 ·予防等に用いられている。へパリンはそれ自体に抗血液凝固作用はな、が、アンチトロンビン ΠΙ (ATIII)やへパリンコファクタ — IIと結合し、血液凝固因子である各種のセリンプロテアーゼを不活性ィ匕することで強力な血液凝固阻害作用を示す (非特許文献 5)。

このように既に医薬品として使用されているへパリンの新たな用途として、 HGF産生促進薬としての利用が考えられる (特許文献 15)。

へノリンを HGF産生促進薬として用いることができれば、前述の HGFの薬理作用を介した各種疾患の治療効果を向上させることが期待できる。し力しながら、 HGFの産生を促進する目的でへパリンを用いる上では、従来力ら利用されてきたへパリンの抗血液凝固作用は出血傾向につながり、副作用となることが考えられる。へパリンを人体に投与する際は、投与中の出血を防止するために、抗血液凝固作用をモニターしながら投与量を慎重にコントロールしなければならない。特に、未分画の高分子へノ^ンは抗血液凝固作用が強ぐ使用に当たっては細心の注意が必要である。このように、へノ^ンの抗血液凝固作用は、 HGF産生促進薬として用いる際には欠点となる。

[0006] また、へパリンは血管壁に存在するリポプロテインリパーゼ (LPL)を遊離させることによって血漿中の LPL活性を上昇させる作用も有して、る（非特許文献 6)。

LPL活性の上昇は脂肪の分解によって血液清澄ィ匕を促すが、持続的な LPL活性の上昇は血中の遊離脂肪酸レベルを上昇させ、不整脈を引き起こす恐れがある。そこで、抗血液凝固作用及び LPL放出活性は有しておらず、 HGF産生促進作用のみを有するへパリン又はへパラン硫酸を調製する方法が切望された。

[0007] へノリンの抗血液凝固作用を低下させる方法として、へパリンを低分子化することが知られている（非特許文献 7)。前述のように、未分画の高分子へパリンは抗血液凝固作用が強ぐ使用に当たっては細心の注意が必要である。このような高分子へパリンの欠点を克服するものとして低分子へノ^ンが利用されている。前述のごとぐへパリンの抗血液凝固作用はへパリン— ΑΤΙΠ複合体の形成によるものである。へパリン ΑΤΙΠ複合体はトロンビン（血液凝固因子 Ila)やその他の凝固因子（Xa、 XIIa、 XI a、 IXa等）に結合してそれらを不活性ィ匕する。 Ilaの抑制には 17糖以上のへパリン構造が必要であり、高分子へパリンでは特に Ilaと Xaの不活性ィ匕が主な作用である。一方、へパリンを 16糖以下のサイズに低分子化すると、 17糖以上で見られる Ila阻害活性が抑制されるため、抗血液凝固活性が低下することが知られている（非特許文献 8 、 9)。

また、低分子へノ^ンでは LPL放出活性も低下することが知られている。（非特許文献 10)。

[0008] このように、へノリンを低分子化することで抗血液凝固作用と LPL放出活性を低下させることが可能であるが、ここで、へノ^ンを低分子化させた場合に、 HGF産生促進活性が保持されるかが問題となる。低分子へノリンとして知られるダルテノリンナトリウム (フラグミン静注;キツセィ薬品工業株式会社製）には HGF産生促進活性があることが知られてヽる (非特許文献 11)。

しかし、ダルテパリンナトリウムは平均分子量では 5000であるものの、分子量の分布幅は 2000〜9000と広く、このうちどの分子サイズが HGF産生促進活性を担っているのか不明である。特に、血液凝固因子 Ilaに対する阻害活性が低下する 16糖以下の分子サイズ (分子量 5000以下）に HGF産生促進活性が保持されてヽるのかが重要であるが、この点は全く不明であった。

一方、へノ^ンを低分子化せずに抗血液凝固作用や LPL放出活性を低下させつつ HGF産生促進活性を維持するような方法は全く知られて、な、。

特許文献 1：特開平 4— 18028号公報

特許文献 2 :特開平 4— 49246号公報

特許文献 3 :ヨーロッパ公開第 492614号公報

特許文献 4：特開平 6 - 25010号公報

特許文献 5：国際公開第 3Z8821号パンフレット

特許文献 6：特開平 6 - 172207号公報

特許文献 7：特開平 7— 89869号公報

特許文献 8：特開平 6—40934号公報

特許文献 9 :国際公開第 94Z2165号パンフレット

特許文献 10：特開平 6—40935号公報

特許文献 11：特開平 6— 56692号公報

特許文献 12 :特開平 7— 41429号公報

特許文献 13 :国際公開第 93Z3061号パンフレット

特許文献 14:特開平 5— 213721号公報

特許文献 15 :特開平 6— 312941号公報

非特許文献 1 :マツモト'ケ—（Matsumoto, K)他 1名、キドニ一'インターナショナル (Kidney Int. )、 2001年、第 59卷、 p. 2023— 2038 非特許文献 2：マツモト ·ケー（Matsumoto, K)ら、プロシーディングス ·ォブ 'ザ 'ナショナル ·ァカデミ一.ォブ ·サイエンス ·ォブ ·ザ ·ユナイテッド ·ステート ·ォブ ·アメリカ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ) , 1992年、第 89卷、 p. 3800— 3804 非特許文献 3 :マツモト 'ケー（Matsumoto, K)ら、ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリ一 (J. Biochem. ) , 1993年、第 114卷、 p. 820— 826

非特許文献 4 :スガハラ'ケー（Sugahara K)他 1名、アイ'ュ一'ビ一'ェム 'ビ一'ラィフ（IUBMB Life)、 2002年、第 54卷、 p. 163— 175

非特許文献 5 :ボーリン'ェム 'シー（Bourin, M. C)他 1名、ザ'バイオケミカル'ジャーナル（Biochem J. ) , 1993年、第 289卷（Pt2)、 p. 313— 330

非特許文献 6 :オリべクロナ'ティー（Olivecrona, T. )ら、ハーモスティシス（Haemo stasis) , 1993年、 23卷（Suppl. l)、p. 150— 160

非特許文献 7 :リンハート'アール 'ジエイ（Linhardt, R. J. )他 1名、セミナーズ'イン' トロンボシス'へモスタシス（Semin. Thromb. Hemost. )、 1999年、第 25卷、 Sup pi. 3、 p. 5 - 16

非特許文献 8 :ホルマ^ ~ ·ィー（Holmer, E. )ら、ハーモスティシス（Haemostasis)、 1986年、第 16卷、 suppl. 2、 p. 1—7

非特許文献 9 :レイン'ディ一'エー（Lane D. A. )ら、ザ'バイオケミカル 'ジャーナル（Biochem. ) , 1984年、第 218、卷、 p. 725— 732

非特許文献 10 :ナストロン'ビー（Nasstrom, B. )ら、ザ'ジャーナル'ォブ'ラボラトリ一'アンド 'タリ-カル'メデイシン (J. Lab. Clin. Med. )、 2003年、第 142卷、 p. 90

- 99

非特許文献 11 : (Matsumoto, K. )ら、ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー (J. Bioc hem. ) , 1993年、第 114卷、 p. 820— 826

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

本発明の課題は、へパリン骨格を有し、へパリン又はへパラン硫酸の抗血液凝固作用及び LPL放出活性を有さなヽか抑制されてヽるオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を含む HGF産生促進薬剤を提供することである。課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは上記課題を解決すべくへパリン及びへパラン硫酸の HGF産生促進機能に関する研究 ¾|¾意重ねた。その結果、へパリン又はへパラン硫酸を低分子化したゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1, 4—グリコシド結合又は |8 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 2乃至 16糖のオリゴ糖が、 HG F産生促進作用を有することを見出した。また、前記オリゴ糖は、抗血液凝固作用及びリポプロテイン放出活性が低下していることを見出した。へノ^ン又はへパラン硫酸を 16糖以下に低分子化しても、 HGF産生促進活性が保持されていることは従来全く知られていな力つた。特に、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが α 1, 4—グリコシド結合又は j8 1, 4—グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物であっても HGF産生促進活性を有することは驚くべき発見であった。さらに本発明者らは、へパリン及びへパラン硫酸においてダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基又はダルコサミン残基の 2位のァミノ基が硫酸化されていることが HGF産生促進活性を発揮する効果を高めることを見出し、へパリン又はへパラン硫酸を低分子化せずとも、ダルコサミン残基の 6位のヒド口キシル基のみが硫酸ィ匕されて、る構造、又はダルコサミン残基の 2位のアミノ基のみが硫酸化されている構造に変換すれば HGF産生促進作用を保持したまま、抗血液凝固作用及びリポプロテイン放出活性を低下させられることを見出した。かかる知見に基づき本発明者らはさらに研究をすすめ、本発明の完成に至った。

[0011] すなわち本発明は、

(1) ゥロン酸残基（ゥロン酸は、ィズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ゥロン酸において同じ。）とダルコサミン残基とが a 1, 4—グリコシド結合もしくは |8 1, 4—ダリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とダルコサミン残基とがひ 1, 4ーグリコシド結合もしくは j8 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 3 乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であって、

ゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩を有効成分として含有する HGF産生促進薬剤、 (2) 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Z又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の 3位及び Z又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする上記（1)に記載の HGF産生促進薬剤。

(3) 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Z又は 2 位のアミノ基が硫酸ィ匕されていることを特徴とする上記（1)又は（2)に記載の HGF産生促進薬剤。

(4) 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（1)〜（3)の、ずれかに記載の HGF産生促進薬剤、

(5) オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸のへパリナーゼ又はへパリチナーゼ分解物であることを特徴とする上記（1)〜 (4)の、ずれかに記載の HGF 産生促進薬剤、

(6) オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は β脱離の、ずれかによる分解物であることを特徴とする上記（1)〜（ 4)の、ずれかに記載の HGF産生促進薬剤、

(7) オリゴ糖が、次の（a)〜(h)で表される化合物のいずれかであることを特徴とする上記（1)に記載の HGF産生促進薬剤；

(a) 式 (I)

[化 1]

(式中、 R¹は、水素、硫酸基、アルキル基、ァシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、 R²は、水素、硫酸基、アルキル基又はァシル基を示し、 R³及び R⁴は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、 nは 0〜7を示す。）

(b) 式 (II) [化 2]

(式中、各記号は上記と同じである。 )； (c) 式 (III)

[化 3]

(式中、各記号は上記と同じである。 )； (d) 式 (IV)

[化 4]

(式中、各記号は上記と同じである。 )；

(e) 式 (V)

[化 5]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R及び Rは上記と同じである。 )；

(f) 式 (VI)

[化 6]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R³及び R⁴は上記と同じである。 )；

(g) 式 (VII)

[化 7]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R²、 R³及び R⁴は上記と同じである。 )；又は

(h) 式 ( )

[化 8]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 IT及び R⁴は上記と同じである。 )、

(8) ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1, 4ーグリコシド結合又は 1, 4—ダリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化されて!/、る。 )又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤、 (9) ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4—ダリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤、

( 10) ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが _α 1 , 4—グリコシド結合又は |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2 糖化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤、及び

( 11) 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第 1 〜 10項のいずれかに記載の HGF産生促進薬剤

に関する。

また、本発明は、

( 12) ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4—グリコシド結合もしくは β ΐ , 4— グリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とダルコサミン残基とが ex 1 , 4—グリコシド結合もしくは j8 1 , 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 3乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であって、

ゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法、

( 13) 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Z又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の 3位及び Z又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする上記（12)に記載の HGF産生促進方法、

( 14) 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Z又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されていることを特徴とする上記（12)に記載の HGF産生促進方法、

( 15) 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（12)に記載の HGF 産生促進方法、

( 16) オリゴ糖が、高分子へノリン又は高分子へパラン硫酸のへノリナーゼ又はへノ^チナーゼ分解物であることを特徴とする上記（12)に記載の産生促進方法、

(17) オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は ι8脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする上記（12 )に記載の HGF産生促進方法、

(18) オリゴ糖が、次の（a)〜(h)で表される化合物のいずれかであることを特徴とする上記（12)に記載の HGF産生促進方法；

(a) 上記式 (I) ;

(b) 上記式 (II) ;

(c) 上記式 (III) ;

(d) 上記式 (IV) ;

(e) 上記式 (V) ;

(f) 上記式 (VI) ;

(g) 上記式 (VII) ;又は

(h) 上記式 (VIII)、

(19) ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4—ダリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化されて!/、る。

)又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法

(20) ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4—ダリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法、

(21) ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが _α 1, 4—グリコシド結合又は |8 1, 4—グリコシド結合してなる 2 糖ィ匕合物又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法、及び

(22) 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする上記（12)〜（21 )の、ずれかに記載の HGF産生促進方法、

に関する。

また、本発明は、

(23) HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4—グリコシド結合もしくは |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とダルコサミン残基とが _α 1 , 4—グリコシド結合もしくは |8 1 , 4—グリコシド結合によつて交互に繰返し結合した構造を有する 3乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であってゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩の使用、

(24) 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Ζ又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の 3位及び Ζ又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする上記（23)に記載の使用、

(25) 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Ζ又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されて、ることを特徴とする上記（23)に記載の使用、

(26) 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（23)に記載の使用、

(27) オリゴ糖が、高分子へノリン又は高分子へパラン硫酸のへノリナーゼ又はへノ^チナーゼ分解物であることを特徴とする上記（₂₃₎に記載の使用、

(28) オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は β脱離の、ずれかによる分解物であることを特徴とする上記（23 )に記載の使用、

(29) オリゴ糖が、次の（a)〜 (h)で表される化合物の、ずれかであることを特徴とする上記（23)に記載の使用；

(a) 上記式 (I) ;

(b) 上記式 (II) ; (c) 上記式 (III) ;

(d) 上記式 (IV) ;

(e) 上記式 (V) ;

(f) 上記式 (VI) ;

(g) 上記式 (VII) ;又は

(h) 上記式 (VIII)、

(30) HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが α ΐ, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、る。）又はその塩の使用、

(31) HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが α ΐ, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されて、る。）又はその塩の使用、

(32) HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが a 1, 4—グリコシド結合又は j8 1, 4—グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物又はその塩の使用、及び

(33) 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さな、か、それらの作用が抑制されて、ることを特徴とする上記（23)〜（32 )のいずれかに記載の使用、

に関する。

発明の効果

本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物は、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが _α 1, 4—グリコシド結合又は |8 1, 4—グリコシド結合してなる 2糖の繰り返しのへノ^ン骨格を有するにもかかわらず、出血傾向の副作用を有さないか、抑制しながら HGFの産生を促進することができ、生体の組織、器官等の傷害の治癒を促進することができる等の効果、より具体的には、肝疾患、腎疾患、皮膚疾患、血液疾患、眼疾患、肺疾患、胃十二指腸疾患、癌及びその関連疾患、骨疾患、中枢疾患等の治療に有用である。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]へノリン分解産物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分離を示す図である。

[図 2]へノリン断片の HGF産生促進活性を示す図である。

[図 3]へノリン 10糖断片の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離を示す図である。

[図 4]陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離したへノリン 10糖断片の HG F産生促進活性を示す図である。

[図 5]陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離したへノリン 10糖断片の M ALDI—TOFZMS解析結果を示す図である。

[図 6]硫酸基の位置の異なる 2糖化合物の HGF産生促進活性を示す図である。

[図 7]へパリン断片の抗血液凝固活性を活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間（以下、 A PTTと略記する。 )によって評価した結果を示す図である。

[図 8]へノリン断片の LPL放出活性を示す図である。

[図 9]硫酸基の位置の異なる 2糖ィ匕合物の抗血液凝固活性を APTTによって評価した結果を示す図である。

[図 10]硫酸基の位置の異なる 2糖ィ匕合物のリポプロテインリパーゼ（以下、 LPLと略記する。）放出活性を示す図である。

[図 11]ダルコサミン残基の 2位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾へパリンの HG F産生促進活性を示す図である。

[図 12]ダルコサミン残基の 2位のアミノ基のみが硫酸ィ匕されている修飾へパリンの抗血液凝固活性を APTTによって評価した結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明においてへノリン骨格とは、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4ーグリコシド結合又は j8 1 , 4—グリコシド結合によって交互に繰り返し結合した構造を有する骨格をいう。

本発明においてゥロン酸残基は、 L—ィズロン酸残基 (以下、 IdoAと略記する。）及び D—グルクロン酸残基（以下、 GlcAと略記する。）のいずれであってもよい。また、 I doA又は GlcAのみで存在してもよぐあるいは IdoAと GlcAが混在していてもよぐ I doAと GlcAの存在比は特に制限はな!/、。

[0018] また、本発明においてオリゴ糖というときは、ゥロン酸とダルコサミンの異なる二糖から構成されるへテロオリゴ糖をいい、具体的には、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが oc 1 , 4ーグリコシド結合又は |8 1 , 4 グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物、ゥロン酸残基又はダルコサミン残基と前記 2糖化合物とが oc 1 , 4ーグリコシド結合又は |8 1 , 4 ーグリコシド結合してなる 3糖ィ匕合物、或いはゥロン酸残基とダルコサミン残基とが oc 1 , 4ーグリコシド結合又は |8 1 , 4 グリコシド結合によって交互に繰り返し結合した構造を有する 4〜 16糖の糖鎖化合物をいう。

[0019] また、本発明にお、てアルキル化とは、ゥロン酸残基のヒドロキシル基又は Z及びダルコサミン残基のヒドロキシル基又は Z及びアミノ基の水素がアルキル基、好ましくは低級アルキル基で置換されることを、う。

[0020] 本発明においてァシル化とは、ゥロン酸残基のヒドロキシル基又は Z及びダルコサミン残基のヒドロキシル基又は/及びァミノ基の水素力式—（C = 0)— R⁵、 - (C = O)— OR⁵、一（C = 0)— NR⁵R⁶、一（C = S)— NHR⁵、一 SO— R⁵、一 SO — R⁵又

2 は SO — NHR⁵ (式中、 R⁵及び R⁶は水素原子又は炭化水素基を示す。）で表され

2

るァシル基に置換されることをいう。前記式中、 R⁵及び R⁶で示される炭化水素基としては、例えば、鎖状炭化水素基 (例、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）などが挙げられる。アルキル基としては低級アルキル基が好ましい。ァルケ-ル基としては、例えば C ァルケ-ル基（例、ビュル、ァリル、イソプロべ-ル、 1ーブテュル

2-6

、 2 ブテニル、 3 ブテニル、 2—メチルー 2 プロぺニル、 1ーメチルー 2 プロぺ -ル、 2—メチルー 1—プロべ-ル等）などが好ましい。アルキ-ル基としては、例えば C アルキ-ル基（例、ェチニル、プロパルギル、 1 ブチニル、 2 ブチュル、 3

2-6

ブチュル、 1 へキシュル等）などが好まし、。

[0021] 本発明においてァミノ化とは、ゥロン酸残基のヒドロキシル基又は Z及びダルコサミン残基のヒドロキシル基の水素力ァミノ基に置換されることをいう。該ァミノ基は更に硫酸基、アルキル基、ァシル基で置換されていてもよい。

なお、本発明において低級アルキル基とは、炭素数 1〜6のアルキル基、例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、ペンチル、イソペンチル、 2—メチルブチル、ネオペンチル、へキシル、 4ーメチルペンチル、 3—メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 1ーメチルペンチル、 3, 3— ジメチルブチル、 2, 2—ジメチルブチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2—ジメチルブチル、 1, 3—ジメチルブチル、 2, 3—ジメチルブチル、 1ーェチルブチル、 2—ェチルブチル等をいう。

[0022] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物を構成するゥロン酸残基は、 2位及び 3位のヒドロキシル基のうち少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよいが、硫酸化がより好ましく、とりわけ 2位のヒドロキシル基の硫酸化が好ましい。

[0023] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物を構成するグルコサミン残基は、 2位のアミノ基が硫酸化、アルキルィ匕又はァシルイ匕されていてもよいが、硫酸ィ匕又はァシルイ匕が好ましい。とりわけ硫酸ィ匕が好ましい。ァシル化の場合は、一（C = 0)—R⁵でァシル化されていることがより好ましぐとりわけァセチルでァシル化されて、ることが好まし、。

また、ダルコサミン残基は、 3位及び 6位のヒドロキシル基のうち少なくとも 1つのヒド口キシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよいが、硫酸化が好ましぐとりわけ 6位のヒドロキシル基の硫酸ィ匕が好ましい。

[0024] 本発明にお、てオリゴ糖を構成するゥロン酸残基とダルコサミン残基の 2糖の繰り返し構造は、繰り返し数が多いと HGF産生活性は高くなる。一方、糖の繰り返し数が少ないと、抗血液凝固作用及び LPL放出活性が低下するという特徴を有する。このため、本発明においてオリゴ糖は、 HGF産生促進活性を有しかつ、抗血液凝固作用及び LPL放出活性という副作用が低減されているという点で、 2乃至 16糖が好ましく、 2乃至 10糖がより好ましい。

本発明の HGF産生促進薬剤に使用される 2乃至 16糖のオリゴ糖は、分子全体の硫酸化の程度が高いと、 HGF産生活性が高くなる。好ましい硫酸化の程度は、 2残基当たりに硫酸基が約 1〜3個である。

2乃至 16糖のオリゴ糖において、硫酸基の位置に特に限定はないが、糖鎖化合物の中の少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されていることが好ましぐこのような硫酸ィ匕がなされていれば、糖鎖化合物の他の部位での硫酸ィ匕はなくてもよい。 2糖ィ匕合物の場合においても、少なくともダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基及び 2位のアミノ基の!/、ずれかが硫酸化されて!/、ることが好ましい。

[0025] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用される好ましいオリゴ糖としては、例えば以下で表される化合物及びそれらの塩が例示される。

(a) 式 (I)

[化 9]

[0026] (b) 式（Π)

[化 10]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

[0027] (c) 式（ΠΙ)

[化 11]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(d) 式 (IV)

[化 12]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(e) 式 (V)

[化 13]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R及び Rは上記と同じである。 ) (f) 式 (VI)

[化 14]

mは 0〜6を示し、 R°及び Rは上記と同じである。 ) [0031] (g) 式 (VII)

[化 15]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 R³及び R⁴は上記と同じである。 )

[0032] (h) 式 (VIII)

[化 16]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R"及び R⁴は上記と同じである。 )

[0033] (i) ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基のみが硫酸化されているダルコサミン残基とが α 1, 4 グリコシド結合又は β 1, 4ーグリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物、又は (j) ゥロン酸残基と、 2位のアミノ基のみが硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが α 1, 4ーグリコシド結合又は |8 1, 4 グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物。

[0034] 上記式 (I)〜 (VIII)で示される R¹及び R²で示されるアルキル基としては、炭素数 1 〜6の低級アルキル基が好ましぐ例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert ブチル、ペンチル、イソペンチル、 2—メチルブチル、ネオペンチル、へキシル、 4ーメチルペンチル、 3—メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 1ーメチルペンチル、 3, 3 ジメチルブチル、 2, 2 ジメチルブチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2 ジメチルブチル、 1, 3 ジメチルブチル、 2, 3 ジメチルブチル、 1—ェチルブチル、 2—ェチルブチル等が挙げられる。 R¹及び R²で示されるァシル基としては、式一 (C = 0) 一 R³、一 (C = 0) -OR³, 一 (C = 0) 一 NR³ R⁴、一（C = S)— NHR³、一 SO— R⁵、一 SO— R⁵又は SO— NHR³〔式中、 R³及び R⁴は水素原子、炭化水素基、 R⁴は水素原子、炭素数 1〜6の低級アルキル基、 R⁵ は置換基を有してヽてもよヽ炭化水素基を示す〕で表されるァシル基等が挙げられる。ァシル基の中でも、 - (C = 0)—R³が好ましぐァセチルがとりわけ好ましい。前記式中、 R³及び R⁵で示される炭化水素基としては、例えば、鎖状炭化水素基 (例、アルキル基、アルケニル、アルキ-ル等）などが挙げられる。アルキル基としては炭素数 1 〜6の低級アルキル基（例、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチノレ、ペンチノレ、イソペンチル、 2—メチノレブチノレ、ネォペンチル、へキシル、 4ーメチルペンチル、 3—メチルペンチル、 2—メチルペンチル、 1ーメチルペンチル、 3, 3—ジメチルブチル、 2, 2—ジメチルブチル、 1, 1ージメチルブチル、 1, 2—ジメチルブチル、 1, 3—ジメチルブチル、 2, 3—ジメチルブチル、 1ーェチルブチル、 2—ェチルブチル等）などが好ましい。ァルケ-ルとしては、例えば C ァルケ-ル（例、ビュル、ァリル、イソプロべ-ル、 1—ブテュル、 2—ブテ-

2-6

ル、 3—ブテニル、 2—メチルー 2—プロぺニル、 1ーメチルー 2—プロぺニル、 2—メチル— 1—プロべ-ル等）などが好まし、。アルキ-ルとしては、例えば C アルキ-

2- 6 ル（例、ェチニル、プロパルギル、 1ーブチニル、 2—ブチニル、 3—ブチニル、 1一へキシニル等）などが好まし、。

[0035] 上記式 (I)〜 (VIII)で示される R²で示されるァミノ基に、置換してもよヽ置換基としては、硫酸基、アルキル基、ァシル基が挙げられる力硫酸基又はァシル基が好ましい。特に硫酸基が好ましい。ァシル基は、 - (C = 0)—R⁵がより好ましぐとりわけァセチルが好まし!/、。該アルキル基及びァシル基は上述の R¹及び R²のアルキル基及びァシル基と同義である。

R¹と R²の好ましい組み合わせとしては、 R¹が水素又は硫酸基であり、 R²が水素、硫酸基又はァシル基が好ましい。この場合、ァシル基は—（C = 0)—R³が好ましぐとりわけァセチノレが好ましい。

nは 0〜7、好ましくは 0〜4である。 mは 0〜6、好ましくは 0〜4である。

[0036] 上記オリゴ糖、例えば上記式 (I)〜 (VIII)で示される化合物の塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、例えばカルシウム等のアルカリ土類金属塩、例えば無機酸塩 (例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩 (例えば、酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、シユウ酸塩、メタンスルホン酸塩、 P—トルエンスルホン酸塩等）等の酸付加塩等が挙げられる。

[0037] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、通常へノ^ン又はへパラン硫酸力製造される。へノ^ンは、高分子へパリンでも低分子へパリンでもよぐへパラン硫酸は、高分子へパラン硫酸でも低分子へパラン硫酸でもよい。本発明で使用されるオリゴ糖又はその塩は、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸を断片化して得られる。原料となる高分子へノ^ン又は高分子へパラン硫酸は、生体材料力抽出して得られるものであってもよぐ化学合成によって製造されたへノリン又はへパラン硫酸及びそれらの類似物質であってもよ、。

[0038] 原料となる高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸を生体材料から抽出して得る場合は、ヒト組織を含む種々の哺乳動物組織 (例えば、脾臓、肺臓、筋肉等)から得ることができるが、一般にはブタゃヒッジの腸粘膜又はゥシの肺起源のものが用いられる。好ましいへパリン供給源は、ブタの腸粘膜である。一般にへノリンは、材料となる組織を自己分解させ、該組織をアルカリで抽出し、次いで蛋白を凝固させ、次いで酸ィ匕により上清力もへノリン一蛋白コンプレックスを沈澱させることによって選択した組織供給源力も製造される。該コンプレックスはエタノールやアセトンもしくはその混合物のような極性非水性溶媒を用いて再沈澱させることによって回収され、エタノールのような有機溶媒で抽出して脂肪を除去し、例えばトリプシンのような蛋白分解酵素で処理して蛋白を除去する。へパリンを調製する方法は、例えば第 14改正日本薬局方解説書、 Charles, A. F. らの論文（Biochem. J. 1936年，第 30卷， p. 1927 — 1933)に記載されており、 Chemistry and Biology of Heparin (1981年）（ Lundblad, R. L.ら編、 Elsevier Publishers, North Holland, New York)中に開示されているような基本的方法を改良したものが知られている。一般には、へパリンを抗血液凝固剤として製造するための通常の方法で組織力得ることができる（非特許文献 7)。

[0039] 上記のように、生体材料力抽出して得られる高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸は、ゥロン酸 (IdoA又は GlcA)とダルコサミン力もなる二糖を構成単位として、該二糖の繰り返し力もなる多糖である。 GlcAと IdoAはへパリン及びへパラン硫酸のヽずれにも存在する。へノ《リンでは、ゥロン酸として IdoAが多く含まれ、へパラン硫酸では GlcAが多い。 GlcAと IdoAが混在するのは、一部の GlcA残基の 5炭素がェピマ一化し、 IdoAに変換されるためである。へパラン硫酸がよりへパリン様になるにつれて Ido AZGlcA比は上昇する。

[0040] また、原料となる高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸は化学的に合成されたへノリン又はへパラン硫酸類似物質でもよぐこの場合は上記のような天然の組成ではな、ことがあるが、一般にへノリン又はへパラン硫酸類似物質と称されるものは本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩の原料として用いることができる。

また、本発明では、分子量が 3000— 6000の低分子へパリン又は低分子へパラン硫酸を原料とすることもできる。分子量が 3000— 6000の低分子へパリンは、第 Xa因子抑制作用が強い一方、抗トロンビン作用は弱ぐ出血リスクの少ない低分子へパリンとして臨床に応用されている.分子量が 3000— 6000の低分子へパリンは、血小板凝集作用は弱ぐまた LPL等を血管壁力遊離させる作用も弱ぐ皮下注射での吸収もよい等の点カゝら近年利用が進んでいる。本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、分子量が 3000— 6000の低分子のへパリン又は低分子へパラン硫酸よりもさらに低分子でもよぐ従来一般に低分子へパリン又は低分子へパラン硫酸と呼ばれているものであっても、本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩の原料とすることができる。

[0041] 高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸あるいは分子量が 3000— 6000の低分子へパリンを断片化する方法としては、酵素的にグリコシド結合を分解するか又は化学的に分解する方法が挙げられる。酵素的に分解する場合は、へパリナーゼ又はへノ^チナーゼ等の酵素が用いられ、例えばへパリチナーゼ I、へパリチナーゼ II、及びへパリナーゼ等のへパリン骨格を低分子化するへパリン分解酵素を用いて高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸を分解する方法で調製することができる。通常は、消化前の高分子へノリン又は高分子へパラン硫酸 lOOmgに対して約 0. 02〜2. 0 U、好ましくは約 0. 1〜1. 0Uの酵素を用いて約 20〜45°C、好ましくは約 30〜40°C で 3時間以上、好ましくは 6時間以上、より好ましくは約 8〜 12時間反応させることで調製することができるが、上記条件に限定はされず条件は適宜選択することが可能である。化学的に分解する場合は、例えば亜硝酸分解法、過酸化水素分解法、）8脱離法等の公知の方法が用いられる (非特許文献 7)。

[0042] 断片化された高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の混合物から、本発明で使用されるオリゴ糖又はその塩を取得、精製するためには、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を単独又は組み合わせて行うことができる。例えばゲノレ濾過クロマトグラフィーに、例えばアマシャムバイオサイエンス社製の Superdex 30pgカラム（カラム 1. 6cm X 60cm,流速 0. 4mLZ分）を用いる場合には、 16糖画分は約 135〜138分、 14糖画分は約 140〜144分、 12糖画分は約146〜151分、 10糖画分は約 154〜161分、 8糖画分は約 163〜172分、 6糖画分は約 175〜188 分、 4糖画分は約 190〜209分、 2糖画分は約 216〜249分で溶出されうる。例えば上記の分画によって得られたオリゴ糖をイオン交換クロマトグラフィー等によりさらに分離することで均一構造の物質力なる画分を得ることが可能である。イオン交換ク口マトグラフィーを用いる場合は、溶液中の塩濃度が高くなることが多いため、得られた画分を常法により脱塩することが好まし、。

なお、精製のプロセス中にアンチトロンビン IIIを固定ィ匕したカラム等の工程を組み込むと、該カラムに非吸着の画分を回収することにより、 Xa因子抑制活性を有する画分が除去された画分を得ることができ、抗血液凝固活性が完全に除去されたオリゴ糖を調製することができるのでより好ま U、。アンチトロンビン III非吸着のオリゴ糖であっても HGF産生促進は保持されてヽるため、本発明に適用できる。

また、上記方法により、得られたオリゴ糖を自体公知の方法に従い、硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化することもできる。

[0043] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、化学合成によつて人工的に合成してもよい。例えば、 IdoA又は GlcAあるいはそれらの誘導体と、グルコサミンあるいはその誘導体等力単位 2糖を合成し、これを重合させて合成することができる（Karst, N. A. and Linhardt, R. J. , Curr. Med. Chem. , 2003 年，第 10卷， p. 1993— 2031、 Lee, J. C. , J. Am. Chem. Soc. , 2004年，第 1 26卷， p. 476— 7)。あるいは、酵素反応を組み合わせた chemoenzymaticな合成を行ってもよい（Kuberan, B. et al. , J. Biol. Chem. , 2003年，第 278卷， p. 5 2613— 21)。このような化学合成や chemoenzymaticな合成は、特にダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基又はダルコサミン残基の 2位のアミノ基を選択的に硫酸化する上で有効である。

[0044] また、本発明の HGF産生活性促進薬剤は、上記のようにして得られるオリゴ糖に限られない。ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが α 1, 4—グリコシド結合又は |8 1, 4— グリコシド結合によって交互に結合した構造を有する 17糖以上の糖鎖化合物であつて、該糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化されているか、或いは少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化されており、他のヒドロキシル基ゃァミノ基が硫酸ィ匕されていない糖鎖化合物は、 Η GF産生促進活性を保持してヽる一方で、抗血液凝固作用及び LPL放出活性はへノリンに比べて低下していることから、本発明の HGF産生活性促進薬剤に使用できる。そのような糖鎖化合物は上記のへノ^ン又はへパラン硫酸を例えばィ匕学的に修飾すること〖こよって調製することができる。

17糖以上の糖鎖化合物の糖鎖としては、通常 500糖以下、好ましくは 300糖以下、より好ましくは 200糖以下である。

17糖以上の糖鎖化合物の塩としては、上記オリゴ糖の塩として例示したものが挙げられる。

[0045] 本発明の HGF産生促進薬剤による HGF産生促進活性の測定は、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を HGF産生細胞に添加して培養した場合と、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を加えないで培養した培養液中の HGF濃度を ELIS Α法で測定し、それらの値を比較することで判定できる。 HGF産生細胞としては、ヒト胎児肺線維芽細胞である MRC— 5や MRC— 9等の細胞株を用いることができる。

[0046] 本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩における抗血液凝固作用は、従来の低分子へパリンの抗血液凝固活性を測定するために実施されてヽる方法に従って、活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間 (APTT)あるいは抗 Xa活性を測定することで評価できる。

本発明の HGF産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩における LPL放出活性は上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩をマウス又はラット等に投与して一定時間後に血漿を採取し、該血漿中の LPL量を測定することで評価できる。血漿中の LPL量の測定は、 LPL活性を測定する力、又は ELISAによって L PLタンパク質量として測定することができる。

[0047] 本発明の HGF産生促進薬剤は、 HGFの産生を促進することから、 HGFの薬理作用を介して、各種疾患の予防'治療に有効である。本発明の HGF産生促進薬剤は、例えば、肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、創傷治療剤、皮膚潰瘍治療剤、毛根細胞増殖剤、制ガン剤、肺傷害治療剤、ガン療法用副作用防止剤等の用途を有し、より具体的には、例えば、肝疾患 (例えば、肝炎、肝硬変、肝不全、外科手術後の肝再生等)、腎疾患 (例えば、糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の腎傷害等)、皮膚疾患 (例えば、白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚潰瘍、禿頭症等 )、血液疾患 (例えば、血小板減少症、骨髄移植等)、眼疾患 (例えば、角膜潰瘍等）、肺疾患 (例えば、肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺線維症等）、胃十二指腸疾患 (例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等)、癌疾患及びその関連疾患 (例えば、各種癌、癌療法による副作用、例えば肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛等の予防等)、骨疾患 (例えば、骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎等)、中枢疾患 (例えば、神経分ィ匕異常症等)などの疾患の予防'治療に有用である。

[0048] 本発明の HGF産生促進薬剤は種々の製剤形態 (例えば、注射剤、固形剤、カブセル剤等)をとりうるが、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩又は慣用の担体と共に注射剤とされるのが好ましい。当該注射剤は常法により調製することができ、注射剤中の上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩の濃度は、 0. 0001〜5WZV% 程度の範囲から適宜調整される。注射剤は、例えば、上記のオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。慣用の担体としては、好ましくは安定化剤が挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マン-トール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等が挙げられる。さらに、製剤化に必要な医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン、マン-トール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤 (パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、ノォキシ安息香酸プロピル、パラォキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ-ゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）、 pH調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等)などを適宜添加した溶液に、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（ポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等)などを使用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。

また、本発明の HGF産生促進薬剤は、外用剤、例えば軟膏状、ゲル状、液状等に製剤化される。外用剤は、例えば軟膏基剤（吸水軟膏、浸水軟膏、マクロゴール、精製ラノリン等）にオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を練合して調製される。また、硬ィ匕剤（セタノール、ステアリルアルコール等)や、ゲル状とする場合には、増粘剤 (カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポピドン等）などを使用することができる。外用剤中の有効成分含量は、外用薬の適用疾患、適用部位等に応じて 0. 0001〜5 WZW%程度の範囲力適宜調整することができる。

本発明の HGF産生促進薬剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により哺乳動物（例えば、ヒト、ィヌ、ラット、マウス、ゥサギ等）に投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重等により適宜調整される。その投与量は、患者の症状、年齢、体重等により適宜調整される力通常 0. 001mg〜500mg、好ましくは 0. Olmg 〜100mgであり、これを 1日 1回ないし数回に分けて投与するのが適当である。

[0050] 本発明の HGF産生促進薬剤は、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩と HGF の混合製剤であってもよ、。 HGFをへノリン又はへパラン硫酸との複合体として生体に投与すると、 HGFの血中半減期が延長されることが知られている（Kato, Y. et a 1. , Hepatology, 1994年，第 20卷， p. 417— 424)こと力ら、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩と HGFを混合製剤とすることにより、製剤中に含まれる HGFの血中半減期が延長される。この場合、オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩と HGFの配合比は、 HGF1質量に対し、通常 0. 00002〜50000 (WZW)、好まし <は 0. 01 〜500 (WZW)である。この際、製剤中のオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩は、同時に生体中の内在性 HGFの産生を促進するので、 HGFの作用を介した疾患治療'予防においてより効果的である。同様の理由から、本発明の HGF産生促進薬剤を生体に投与する際、別の製剤として同時に HGFを投与することも可能である。

[0051] 以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。

HGF:肝細胞増殖因子

FCS :牛胎児血清

DMEM培地：ダルベッコ改変イーグル培地

PBS :リン酸緩衝食塩水

ELISA：ェンザィム一リンクド'ィムノソルベント ·アツセィ（enzyme - linked immu nosorbent assay)

MALDI—TOF/M¾ : Matrix— assisted laser desorption ionization— Ti me of flight mass spectrometry

LPL：リポプロテインリパーゼ

APTT：活性ィ匕部分トロンボプラスチン時間 UA:ゥロン酸残基

GlcN :ダルコサミン残基

Ac :ァセチノレ

Arg :ァノレギ-ン

Gly:グリシン

Sac :¾-

2S : 2— o—硫酸

6S : 6— o—硫酸

NS :N—硫酸

実施例 1

[0052] 高分子のへパリン Na (Scientific Protein Laboratories, Inc. ) lOOmgを 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（3mM酢酸カルシウムを含む）（pH7. 0) 2mLに溶解し、へパリナーゼ（生化学工業)を 0. 5unit添加して 37°Cで 10時間反応させた。反応液を 100°Cで 2分間加熱して反応を停止させた。反応液上清の 0. 3mLを Superdex 30pgカラム（ φ 1. 6cm X 60cm) (アマシャムバイオサイエンス）に供してゲル濾過ク口マトグラフィーを行った。移動相に 200mM 重炭酸アンモ-ゥム水溶液を用い、 0 . 4mLZminの流速で通液した。溶出液の 230nmにおける吸光度をモニターし、フラタシヨン (画分)を分画した。溶出されたへノリン断片を分子サイズごとに回収した。へノリン断片は 2糖、 4糖、 6糖、 8糖、 10糖、 12糖、 14糖、 16糖のオリゴ糖分画画分として得られた (図 1)。

実施例 2

[0053] 実施例 1で得られたへノリン断片 (オリゴ糖)を用いて HGF産生促進活性を測定した。活性測定のためには、ヒト胎児肺線維芽細胞である MRC— 9細胞を用い、へパリン断片 (オリゴ糖)添カ卩時の該細胞の HGF産生量を比較した。まず、 MRC— 9細胞を 5 X 10⁴個/ cm²の密度で 48wellプレートに播種し、 10V/V%FCSを含む DME M培地で 1日培養した。次に、該細胞の培地を吸引除去し、 PBSO. 5mLで 2回洗浄した後培地を、 10V/V%CSを含む DMEM培地に交換して培養を継続した。この際、培地中に実施例 1で得られたへノリン断片を 1 gZmlとなるように添加した。 24 時間後に培養上清を回収し、培養上清中に分泌された HGF量を測定した。 HGFの定量は ELISA法にて行った。市販の低分子へノリン (フラグミン、キツセィ薬品工業株式会社製)を添加した場合、 HGF産生量は高分子のへパリン (未分画へパリンと呼ぶ）を添加した場合と同等であり、へノリン無添加の場合の 5倍程度に HGF産生を促進した。実施例 1で調製した 16糖以下のサイズのへノリン断片においても、 6糖以上のサイズのへパリン断片において HGF産生量はへパリン無添加の場合に比べて上昇していた（図 2)。

実施例 3

[0054] 実施例 1で得られたへノリン断片の 10糖画分 (以下、へノリン 10糖断片という。）を凍結乾燥した後、 H Oに溶解した。これを MiniQ4. 5Z50カラム（アマシャムバイオ

2

サイエンス）に供して陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、へパリン 10糖断片をさらに分離した。溶離液には NaCl水溶液 (流速 0. 5mlZmin)を用い、 NaCl濃度を 0Mから 1Mまで直線的に上昇させ、リニアグラジェント溶出法によってへノリン 1 0糖断片を分離した。このとき、溶出液の 230nmにおける吸光度をモニターし、フラクシヨン (画分)を分画した（図 3)。へノ^ン 10糖断片は多数のピークとして分離された力これは硫酸基の数と配置のノリエーシヨンによるものと考えられた。ピークごとに回収し、画分 1から 38とした。それぞれの画分について実施例 2と同様に HGF産生促進活性を測定した（図 4)。その結果、 HGF産生促進活性はほとんどの画分で認められた。このことから、 HGF産生促進活性を発揮する上でへノ^ン 10糖断片中の何らかの特定の構造が必須の機能を果たしているとは考えにくぐゥロン酸とダルコサミンの繰り返し力もなるへパリン 10糖断片の基本構造に硫酸基が適度に配置されていればよいと考えられた。し力しながら、後半の画分 (画分 No. 24〜36)ほど HGF産生促進活性が高い傾向にあることから、硫酸基の数は多い方が、 HGF産生促進活性が高いと考えられた。

[0055] 画分 No. 24、 26、 28、 31、 33に含まれるへパリン 10糖断片について硫酸基の数を求めるため、質量分析装置（UlrtaFlex；ブル力一社）を用、て M ALDI— TOF/ MS分析を行った。各画分は透析膜 (分画分子量 1000)を用いた透析によって脱塩を行った後、凍結乾燥し、 H Oに溶解してサンプルとした。へパリン断片の硫酸基による陰性荷電を中和するため、塩基性ペプチド (Arg— Gly) Arg ( [M (質量） +H]

19

+ =4226. 8 (理論値)）をサンプルに混合し、カフェイン酸をマトリクスに用いて MAL DI—TOFZMS解析を行った（図 5)。この解析法では、へパリン断片は (Arg— Gly ) Argとのコンプレックスとして検出されるので、検出される mZz (質量 Z電荷)値か

19

ら (Arg— Gly) Argの分子量を差し引くことによりへノ^ン断片の分子量が算出され

19

る。いずれの画分においても複数の mZzシグナルが検出され、複数の成分が混在していることが判明した。画分 No.力 24から 33と後になるほど、 m/zシグナルのパターンが高分子側にシフトしており、後のフラクションほど硫酸基の数が多いことが確認された。分子量から推定される画分 No. 24から 33の組成を表 1に示した。

[表 1]

画分コンフ'レククス m/z ヘリ'チト' m/z 才リコ'糖分子量 △ UA-GlcNS AUA-GlcNAc H S0₃H

S0,Hの総数理論分子量

No. (A) 実測値（B) (A-B) 415.3 377.31 1.01 81.07

24 6481.76 4227.60 2254.16 1 4 6 4 5 2254.91

6562.0マ5 2334.45 1 4 5 5 6 2334.97

6641.98 2414.38 1 4 4 6 7 2415.03

6721.87 2494.27 1 4 3 7 8 2495.09

26 6438.53 4226.80 2 3 7 3 6 2212.87

6560.81 2334.01 1 4 5 5 7 2334.97

2414.84 1 4 4 6 8 2415.03

6679.42 2452.62 2 3 4 6 9 2453.05

6721.41 2494.61 1 4 3 7 9 2495.09

6759.56 2532.76 2 3 3 7 10 2533.11

28 6682.56 4227.64 2454.92 2 3 4 6 8 2453.05

6724.38 2496.74 1 4 3 7 8 2495.09

6761.76 2534.12 2 3 3 7 9 2533.11

6804.03 2576.39 1 4 2 8 9 2575.15

6843.51 2615.87 2 3 2 8 10 2613.17

30 6639.35 4226.83 2412.52 3 2 5 5 8 2411.01

6718.81 2491.98 3 2 4 6 9 2491.07

6757.28 2530.45 4 1 4 6 10 2529.09

6799.13 2572.30 3 2 3 7 10

6837.67 2610.84 4 1 3 7 11 2609.15

33 6677.32 4226.85 2450.47 4 1 5 5 9 2449.03

6717.37 2490.52 3 2 4 6 9 2491.07

6756.57 2529.72 4 1 4 6 10 2529.09

6797.29 2570.44 3 2 3 7 10

6836.36 2609.51 4 1 3 7 11 2609.15

実施例 4

[0057] 硫酸基の位置の異なる 2糖ィ匕合物、 2— Sac— 2S (Heparin disaccharide III- H ; Sigma社製）、 2— Sac— 6S (ADiHS— 6S ;生化学工業株式会社製）、 2— Sac NS (ADiHS— NS ;生化学工業株式会社製）（表 2)について、 HGF産生促進活性を測定した（図 6)。実施例 2と同様にして MRC— 9細胞を用いて HGF産生促進活性を測定した。この際、 2糖ィ匕合物の添加濃度を 0〜50 gZmlの間で変化させた。硫酸基の位置によって HGF産生促進効果が異なり、また、 HGF産生促進活性を示すためには、未分画へノリンに比べると高い濃度で添加する必要がある力これらの 2糖ィ匕合物のいずれにおいても HGF産生が促進されることが見出された。 2 -Sac 6Sと 2— Sac— NSの HGF産生促進活性は 2— Sac 2Sよりも高く、ダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基の硫酸化、又はダルコサミン残基の 2位のアミノ基の硫酸化は HGF産生促進活性を発揮する上で重要であることが見出された。

[0058] [表 2]

記号略式構造

R ¹ R ² R ¹ '

2-Sac-2S A UA-2S-G I cN S0₃H H H

2- Sac- 6S A UA-G l cNAc-6S H C0CH₃ S0₃H

2-Sac-NS A UA-G l cNS H S0₃H H 実施例 5

[0059] 実施例 1で得られたへノリン断片 (オリゴ糖）について、分子サイズごとに抗血液凝固活性と LPL放出活性を測定した。抗血液凝固活性は活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT)を比較することで評価した。 APTTの測定には、ウィスターラット (雄）カゝら採取した新鮮血漿を用い、エラジン酸による活性ィ匕を利用したデータフアイ ·ΑΡ ΤΤキット（シスメッタス社)を用いた。ラット血漿にへノリン断片を 9 μ gZmL又は 3 μ g ZmLとなるように添カ卩し、 APTTの値 (秒）を比較した。

APTTの測定結果を図 7に示す。へノリンの代わりに生理食塩水を添加した場合、 APTTは約 20秒であり、血液は急速に凝固した。血液に未消化の高分子へパリン（未分画へパリン）を 9 μ gZmLの濃度でカ卩えると、 APTTが 200秒以上に延長され、血液凝固が阻止された。未分画へパリンを 3 gZmLの濃度で添カ卩しても、 APTT の延長は 160秒以上であり、血液凝固阻害が見られた。市販の低分子へパリン (フラグミン、キツセィ薬品工業株式会社製)では、未分画へパリンよりも APTTの延長は抑制されたが、 APTTの延長は無視できないレベルであった。実施例 1の 16糖へパリン断片を 9 gZmLの濃度でカ卩えた場合では、 APTTは約 46秒であり、へパリン無添カロの場合より APTTが延長されたものの、 APTTの延長の程度はフラグミンよりも短ぐ抗血液凝固活性は大幅に低下した。さらに、分子サイズが低下するほど APTT が短縮され、 4糖以下では 9 gZmL又は 3 gZmLのいずれの添加濃度においても生理食塩水添加の場合の APTTと同等であった。

[0060] LPL放出活性の測定のためには、ウィスターラット（3週齢、雄)の尾静脈からへパリン断片をラットの体重 lgあたり 0. 投与し、 10分後に腋下静脈巣力も採血を行つて得られる血漿中の LPL量を ELISA (第一化学薬品株式会社製）によって測定した。 LPL放出量の測定結果を図 8に示す。未分画へノリンでは 250ngZmL程度の L PLが放出されたが、低分子へノリン (フラグミン、キツセィ薬品工業株式会社製)では LPL放出量が高分子へノリンの場合の 30%程度に低下していた。また実施例 1で調製したへノリン断片でも LPL放出量が低下しており、分子サイズが低下するほど L PL放出量は低下して、た。特に 8糖以下では LPL放出量の低下が顕著であった。実施例 6

[0061] 実施例 1で調製したへノリン断片の 10糖画分について、抗ファクター Xa活性と抗フアクター Ila活性を測定し、抗血液凝固活性をさらに詳細に検討した。

抗ファクター Xa活性測定のためには、サンプル（22. 5 L)に 2. 5 Lのアンチトロンビン III (2. 5U)をカ卩え、 37°Cにて 3分間インキュベートした後、血液凝固因子であるファクター Xa (7. lnkat S— 2222ZmL)を 12. 5 ;z Lカロえた。これにファクター Xa の基質となる S— 2222 (第一化学薬品株式会社製） (0. 75mgZmL)を 2. 5 ;z Lカロえ、 37°Cで 3分間反応させた。その後、 50VZV%酢酸水溶液を 37. 5 /z L添加して反応を停止し、発色量を 405nmの吸光度で測定した。この発色は、ファクター Xaの反応によって S— 2222から遊離した p— -トロア-リンによるものである。サンプル中に抗ファクター Xa活性を有する物質が含まれて、る場合の発色量は、サンプル中にファクター Xa活性を有する物質が含まれて、な、場合の発色量に比べて低下する。すなわち、この発色低下量 ΔΑ405はサンプル中の抗ファクター Xa活性を反映する。低分子へパリン標準品（国立医薬品食品衛生研究所、抗ファクター Xa活性 175U /mg、抗ファクター Ila活性 69/mg)を用いて抗ファクター Xa活性と Δ A405の検量線を作製し、これをもとに非検サンプルの抗ファクター Xa活性を求めた。抗ファクタ一 Ila活性の測定は、 S— 2222、ファクター Xa及び 50VZV%^酸の代わりにそれぞれ S— 2238 (第一化学薬品株式会社製） (0. 625mgZmL)、血液凝固因子であるファクター IIa (0. 4UZmL)及び 0. 01Mクェン酸を用いて同様に行った。

抗ファクター Xa活性と抗ファクター Ila活性の測定結果を表 3に示した。市販の低分子へパリンであるフラグミンの抗ファクター Xa活性とファクター抗 Ila活性は、それぞれ未分画へパリンの 75%、 32%に低下していた。一方、へパリン 10糖断片の抗ファタター Xa活性と抗ファクター Ila活性は、それぞれ未分画へパリンの 12%、 4%と著しく低下していた。

[表 3]

実施例 7

実施例 4に記載の硫酸基の位置の異なる 2糖ィ匕合物、 2— Sac— 2S (Sigma社製）、 2— Sac— 6S (生化学工業株式会社製)、 2— Sac— NS (生化学工業株式会社製) について、実施例 5と同様の方法で抗血液凝固活性と LPL放出活性を測定した（図 9、図 10)。いずれの 2糖ィ匕合物においても、抗血液凝固活性と LPL放出活性は検出されなかった。

実施例 8

ダルコサミンの 2位のアミノ基のみが硫酸ィ匕 (N-硫酸化のみ）されて、る修飾へパリン (CDSNS— Heparin;生化学工業株式会社製）について、実施例 2と同様にして MRC— 9細胞を用いて HGF産生促進活性を測定した（図 11)。この際、ダルコサミンの 2位のアミノ基のみが硫酸ィ匕されて、る修飾へパリンの添加濃度を 0〜50 μ g/ mlの間で変化させた。ダルコサミンの 2位のアミノ基のみが硫酸化されて!/、る修飾へノリンは、通常の未分画へパリンに比べると HGF産生が少し弱いが、最大活性は通常の未分画へノリンと同等であった。また、ダルコサミンの 2位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾へノリンの抗血液凝固活性を調べるため、実施例 5と同様の方法で APTTを測定した（図 12)。ダルコサミンの 2位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾へパリンでは APTTの延長は認められず、抗血液凝固活性は検出されなかった産業上の利用可能性

本発明の HGF産生促進薬剤は、出血傾向の副作用を抑制しながら HGFの産生を促進することができ、生体の組織、器官等の傷害の治癒促進に有用である。

Claims

請求の範囲 [1] ゥロン酸残基（ゥロン酸は、ィズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ゥロン酸において同じ。）とダルコサミン残基とが α 1 , 4—グリコシド結合もしくは |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とダルコサミン残基とが ex 1 , 4ーグリコシド結合もしくは j8 1 , 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 3乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であって、ゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩を有効成分として含有する HGF産生促進薬剤。 [2] 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Z又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の3位及び Z又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の HGF産生促進薬剤。 [3] 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Z又は 2位のァミノ基が硫酸ィ匕されていることを特徴とする請求の範囲第 1又は 2項に記載の HGF 産生促進薬剤。 [4] 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第 1〜3項のいずれ力に記載の HGF産生促進薬剤。 [5] オリゴ糖が、高分子へノリン又は高分子へパラン硫酸のへノリナーゼ又はへノリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第 1〜4項のいずれかに記載の HGF産生促進薬剤。 [6] オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は β脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第1〜4項の、ずれかに記載の HGF産生促進薬剤。 [7] オリゴ糖が、次の（a)〜 (h)で表される化合物の、ずれかであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の HGF産生促進薬剤： (a) 式 (I)

[化 1]

(b) 式 (II)

[化 2]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(c) 式 (III)

[化 3]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(d) 式 (IV)

[化 4]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(e) 式 (V)

[化 5]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R²、 R³及び Rは上記と同じである。 ) (f) 式 (VI)

[化 6]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R³及び Rは上記と同じである。 ) (g) 式 (VII)

[化 7]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 R³及び R⁴は上記と同じである。 )、又は (h) 式 (VIII)

[化 8]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R²、 R及び R⁴は上記と同じである。 )

[8] ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4ーグリコシド結合又は /3 1 , 4ーグリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化されている。 ) 又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤。

[9] ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4ーグリコシド結合又は /3 1 , 4ーグリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤。

[10] ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸化されているダルコサミン残基とが α ΐ , 4—グリコシド結合又は |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする HGF産生促進薬剤。

[11] 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第 1〜10 項の、ずれかに記載の HGF産生促進薬剤。

[12] ゥロン酸残基（ゥロン酸は、ィズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ゥロン酸において同じ。）とダルコサミン残基とが α 1 , 4—グリコシド結合もしくは |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とダルコサミン残基とが ex 1 , 4ーグリコシド結合もしくは j8 1 , 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 3乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であって、

ゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法。

[13] 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Z又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の

3位及び Z又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の HGF産生促進方法。

[14] 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Z又は 2位のァミノ基が硫酸化されていることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の HGF産生促進方法。

[15] 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の H GF産生促進方法。

[16] オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸のへパリナーゼ又はへパリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の産生促進方法。

[17] オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は β脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第

12項に記載の HGF産生促進方法。

[18] オリゴ糖が、次の（a)〜 (h)で表される化合物の、ずれかであることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載の HGF産生促進方法；

(a) 式 (I)

[化 1]

(式中、 R¹は、水素、硫酸基、アルキル基、ァシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、 R²は、水素、硫酸基、アルキル基又はァシル基を示し、 R³及び R⁴は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、 nは 0〜7を示す。）；

(式中、各記号は上記と同じである。 )；

(c) 式 (III)

[化 3]

(式中、各記号は上記と同じである。 )； (d) 式 (IV)

[化 4]

(式中、各記号は上記と同じである。 )； (e) 式 (V)

[化 5]

(式中、 mは O 6を示し、

R及び Rは上記と同じである。 )；

(f) 式 (VI)

[化 6]

(V I )

(式中、 mは (V 6を示し、

IT及び R⁴は上記同じである。 )；

(g) 式 (VII)

[化 7]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 R³及び R⁴は上記と同じである。 )、又は

(h) 式 (VIII)

[化 8]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R³及び R⁴は上記と同じである。；)。

ゥロン酸残基とダルコサミン残基とがひ 1， 4ーグリコシド結合又は 1， 4 ド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸化されている。 ) 又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法。

[20] ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが a 1 , 4ーグリコシド結合又は /3 1 , 4ーグリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物 (但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法。

[21] ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は 2位のアミノ基が硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが α ΐ , 4—グリコシド結合又は |8 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする HGF産生促進方法。

[22] 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第 12〜2 1項の、ずれかに記載の HGF産生促進方法。

[23] HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基 (ゥロン酸は、ィズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ゥロン酸において同じ。）とダルコサミン残基とがひ 1 , 4 ーグリコシド結合もしくは 1 , 4—グリコシド結合してなる 2糖、又はゥロン酸残基とグルコサミン残基とがひ 1 , 4ーグリコシド結合もしくは |8 1 , 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する 3乃至 16糖のオリゴ糖又はその塩であって、ゥロン酸残基及びダルコサミン残基の少なくとも 1つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、ァシルイ匕又はアミノ化されていてもよぐ少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はァシル化されて、てもよ、オリゴ糖又はその塩の使用。

[24] 少なくとも 1つのゥロン酸残基の 2位及び Ζ又は少なくとも 1つのダルコサミン残基の 3位及び Ζ又は 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、てもよ、ことを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用。

[25] 少なくとも 1つのダルコサミン残基において、 6位のヒドロキシル基及び Ζ又は 2位のァミノ基が硫酸化されていることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用。

[26] 2乃至 10糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用。

[27] オリゴ糖が、高分子へノリン又は高分子へパラン硫酸のへノリナーゼ又はへノリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用。

[28] オリゴ糖が、高分子へパリン又は高分子へパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又は β脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用。

[29] オリゴ糖が、次の（a)〜 (h)で表される化合物の、ずれかであることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載の使用；

(a) 式 (I)

[化 1]

(b) 式 (II)

[化 2]

(式中、各記号は上記と同じである。 )；

(c) 式 (III) [化 3]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(d) 式 (IV)

[化 4]

(式中、各記号は上記と同じである。 )

(e) 式 (V)

[化 5]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 R³及び Rは上記と同じである。 )； (f) 式 (VI)

[化 6]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R及び Rは上記と同じである。 )； (g) 式 (VII)

[化 7]

(式中、 mは 0〜6を示し、 R\ R²、 R³及び R⁴は上記と同じである。 )；又は

(h) 式 ( )

[化 8]

(式中、 mは 0〜6を示し、

R、 R及び Rは上記と同じである。 ) ₀

[30] HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが《1, 4 ーグリコシド結合又は 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基が硫酸ィ匕されて、る。）又はその塩の使用。

[31] HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基とダルコサミン残基とが《1, 4 ーグリコシド結合又は 1, 4—グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも 1つのダルコサミン残基の 2位のァミノ基が硫酸ィ匕されている。）又はその塩の使用。

[32] HGF産生促進医薬を製造するための、ゥロン酸残基と、 6位のヒドロキシル基又は

2位のアミノ基が硫酸ィ匕されているダルコサミン残基とが α 1, 4—グリコシド結合又は β 1, 4ーグリコシド結合してなる 2糖ィ匕合物又はその塩の使用。

[33] 糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さな、か、それらの作用が抑制されて、ることを特徴とする請求の範囲第 23〜3 項の、ずれかに記載の使用。