JP2002003384A - 成長因子誘導剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 成長因子を人為的に外部から併用投与した
り、又は予め配合もしくは結合させて投与しなくても、
単独に投与された場合に内因性の成長因子の濃度を増加
させ、また抗血液凝固活性が低いため安全で有用な医薬
として投与することができる成長因子誘導剤を提供す
る。 【解決手段】 グリコサミノグリカン又はその薬理学的
に許容される塩を有効成分として含有する、成長因子誘
導剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、内因性の成長因子
を誘導しうるグリコサミノグリカン又はその薬理学的に
許容される塩を有効成分として含有する成長因子誘導剤
に関する。

【従来の技術】

【０００２】従来、各種疾病の治療を目的として、ＤＮ
Ａ組み換え技術により得られた成長因子自体を投与する
試みがなされている。しかし、成長因子自体の投与に
は、成長因子がタンパク質であって一般的に不安定であ
り、またその製造コストが高いなどの欠点がある。ま
た、成長因子の多くがガン細胞を活性化しうることか
ら、成長因子自体を直接投与することには懸念がある。

【０００３】一方、ヘパリンは、グリコサミノグリカン
の一種であり、体内に存在する種々の成長因子に結合性
を示し、成長因子の血中半減期を延長し、生物学的利用
能を増大させることが既に知られており、更に近年、ヘ
パリン及びヘパリンを含む各種グリコサミノグリカンに
ついて、種々の成長因子に対する作用が研究されてい
る。

【０００４】特開平５−１４８３０５には、線維芽細胞
増殖因子結合担体に結合性を有するヘパラン硫酸をヘパ
リチナーゼＩ処理することによって得られ、線維芽細胞
増殖因子（ＦＧＦ）に結合性を有するオリゴ糖とＦＧＦ
を含有する組成物を投与することにより、ＦＧＦのタン
パク分解酵素に対する抵抗性が増大し、更に、細胞外マ
トリックス中においてＦＧＦが高拡散性を示すようにな
るので、このような組成物が医薬として高い有用性を有
し得ることが記載されている。また、特開平５−３０１
８２４には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、ヘパリン、
デキストラン硫酸などの多糖類とからなる組成物を投与
することにより、ＨＧＦの活性が増強され、ＨＧＦの分
解が抑制されることが報告されている。更に、ＵＳＰ
５,８４９,６８９には、肝細胞増殖因子とヘパリンなど
の併用投与によりＨＧＦの血漿内半減期が延長されるな
ど、ＨＧＦの作用を増強する効果が報告されている。ま
た、ＨＧＦに関しては、ＨＧＦを併用せずに、ヘパリ
ン、ヘパラン硫酸などを単独で投与しても、ＨＧＦ産生
細胞におけるＨＧＦ産生が促進されるとの報告がされて
いる（特開平６−３１２９４１）。

【０００５】また、多糖に限らず、ヘパリン型又は硫酸
ヘパラン型の少糖類も、成長因子に対し顕著な親和性を
示し、成長因子と併用しなくても単独で投与することに
より、細胞の分割及び分化に対する活性が示されること
（特開昭６３−６６１９２）や、多糖だけではなく硫酸
化された特定の構造を有する８糖以上の硫酸化多糖が、
ＨＧＦに親和性を有し、ＨＧＦを安定化し、その増殖活
性を向上させること（特開平８−３４８０１）も報告さ
れている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、各種グ
リコサミノグリカンと共に、成長因子を外的に投与する
ことにより、当該成長因子の寿命が延長されたり、薬理
作用が増強されることは従来知られていたが、成長因子
をなんら人為的に外部から併用投与しなくても、グリコ
サミノグリカンを単独で投与することにより、体内に存
在する内因性の各成長因子の濃度を上昇させうること
は、ヘパリン及び硫酸ヘパラン型の少糖類以外について
は、現在に至るまで知られていなかった。また、成長因
子は、ガン細胞から発見されたものであり、ガン細胞を
活性化すると認識されているため、成長因子を外的に投
与することには懸念があり、更にヘパリンについては出
血活性も知られている。そのため、外部から成長因子を
併用投与しなくても、単独で投与することにより、体内
に存在する内因性の成長因子の濃度を増加及び／又は活
性を増強し、かつ出血傾向などの副作用が少なく、成長
因子誘導剤として有用な医薬の開発が求められていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、各種グリコサ
ミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩が、外部
から成長因子を併用投与したり、又は予め成長因子を配
合又は結合して投与しなくても、単独に投与された場合
に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の濃度を増
加させる作用を有することを見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００８】即ち本発明は、グリコサミノグリカン（以
下、ＧＡＧという）又はその薬理学的に許容される塩を
有効成分として含有する成長因子誘導剤に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に本発明をさらに詳細に説明
する。本発明における「グリコサミノグリカン」（ＧＡ
Ｇ）とは、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクトースとヘ
キソサミン残基が、ヘキスロン酸残基又はＤ−ガラクト
ースの１位とヘキソサミン残基の３位又は４位とでグリ
コシド結合した二糖単位の繰り返し構造で形成された基
本骨格を有する、ヘパリン以外の多糖又はオリゴ糖を指
し、直鎖状のものであっても、分枝状のものであっても
良い。

【００１０】本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であ
るヘキスロン酸残基としては、イズロン酸残基、ガラク
ツロン酸残基、グルクロン酸残基、グルロン酸残基、マ
ンヌロン酸残基などを挙げることができ、好ましくは、
イズロン酸残基、ガラクツロン酸残基及びグルクロン酸
残基、より好ましくは、イズロン酸残基及びグルクロン
酸残基、特に好ましくは、Ｌ−イズロン酸及びＤ−グル
クロン酸を挙げることができる。

【００１１】本発明に使用されるＧＡＧの構成成分であ
るヘキソサミン残基としては、グルコサミン残基、ガラ
クトサミン残基、マンノサミン残基、及びこれらのＮ−
アセチル化物を挙げることができ、好ましくはグルコサ
ミン残基及びそのＮ−アセチル化物、並びにガラクトサ
ミン残基及びそのＮ−アセチル化物、より好ましくは、
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、特に好ましくは、Ｎ
−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を挙げることがで
きる。

【００１２】本発明に使用されるＧＡＧを構成する糖残
基は、前述の各残基よりそれぞれ選択することができ、
イズロン酸残基又はグルクロン酸残基とＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミン残基を構成糖とするヘパラン硫酸及び
ヒアルロン酸、Ｄ−ガラクトースとＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンから成るケラタン硫酸などに加えて、特に
好ましくは、Ｌ−イズロン酸残基又はＤ−グルクロン酸
残基のいずれかとＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残
基の組み合わせからなるデルマタン硫酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸などをＧＡＧとして用いること
ができる。

【００１３】本発明の好ましい態様においては、なかで
もヘパラン硫酸や、デルマタン硫酸及びコンドロイチン
硫酸のようなガラクトサミノグリカンを用いることがで
き、特にデルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸のよう
なガラクトサミノグリカンをＧＡＧとして好ましく用い
ることができる。

【００１４】本発明に使用されるＧＡＧは、その起源、
由来によっては特に限定されるものではなく、天然から
得られるグリコサミノグリカン（本明細書中では単に天
然グリコサミノグリカンという）、天然グリコサミノグ
リカンを化学的又は硫酸基転移酵素などにより酵素的に
改変したグリコサミノグリカン、人工的に化学合成した
グリコサミノグリカン、遺伝子工学的に動物細胞、植物
細胞、微生物などにより合成させたグリコサミノグリカ
ンなどいずれのグリコサミノグリカンも用いることがで
きる。

【００１５】本発明に使用されるＧＡＧとして用いるこ
とが可能な天然グリコサミノグリカンは、グリコサミノ
グリカンを含む生物体（例えば動物組織）から通常用い
られている方法（物理的抽出法、酵素抽出法、有機溶媒
分画法、イオン交換樹脂などを用いるクロマトグラフィ
ー分画法などの単独又は組合わせ）により抽出・精製し
て得ることができる。天然グリコサミノグリカンの供給
源は、当該グリコサミノグリカンを得ることが可能であ
れば、特に限定はされないが、例えば、鶏冠、ブタ皮、
ヒト臍帯、サメ軟骨又はクジラ軟骨、ウシ腎臓、ウシ腸
などから得られるグリコサミノグリカンを用いることが
できる。このような生物の組織、器官から抽出、精製さ
れたグリコサミノグリカンは市販されており、本発明に
使用されるＧＡＧとして、このような市販のグリコサミ
ノグリカンを用いることも可能である。

【００１６】また、本発明に使用されるＧＡＧにおける
ヘキソサミン残基及びヘキスロン酸残基は、好ましくは
硫酸化されており、その硫酸化の位置や割合は特に限定
されない。硫酸化とは、ヘキソサミン残基又はヘキスロ
ン酸残基を構成している炭素原子上に、オキソ基（−Ｏ
−）又はイミノ基（−ＮＨ−）を介して硫酸基（−ＳＯ
₃Ｈ）及び／又はヒドロキシスルフィニル基（−ＳＯ・
ＯＨ）が結合していることを意味する。

【００１７】本発明に使用されるＧＡＧの分子量は、特
に限定されないが、平均分子量５千〜２００万のＧＡＧ
が好ましく、より好ましくは平均分子量５,０００〜２
００,０００、更に好ましくは平均分子量５,０００〜５
０,０００のＧＡＧを用いることができる。なお、多糖
類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的で
あるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試
料でも測定方法や測定条件などによって多少異なること
は当業者にとって常識であり、本発明に使用されるＧＡ
Ｇにおいても、上記の平均分子量の範囲のものに厳密に
限定されるべきものではない。

【００１８】本発明の成長因子誘導剤は、上述のＧＡＧ
又はその薬理学的に許容しうる塩を含有するが、その薬
理学的に許容しうる塩としては、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニ
ウム塩などの無機塩基との間で形成された塩、又はジエ
タノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸
塩などの有機塩基との塩のうち、薬理学的に許容しうる
塩を選択し用いることができる。

【００１９】ヘパリンは、本発明の成長因子誘導剤に含
まれるＧＡＧではないが、グリコサミノグリカンの１種
類であり、抗血液凝固活性（出血活性）を有することが
知られている。一方、本発明の成長因子誘導剤に含まれ
るＧＡＧは、ヘパリンと比較して抗血液凝固活性が極め
て低いため、本発明の成長因子誘導剤を生体に投与して
も、出血傾向などの副作用を惹起する可能性が少ない。
またヘパリンは、副作用として血小板減少症を惹起しや
すいが、本発明の成長因子誘導剤に含まれるＧＡＧであ
るデルマタン硫酸ではこのような副作用は起こりにく
い。

【００２０】一般に、物質の抗血液凝固活性を表す指標
としては、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴ
Ｔ）及びトロンビン時間（ＴＴ）がある。出血活性を有
することが知られているヘパリンと比較するため、後述
する試験例１に記載する方法により、ヘパリン及び本発
明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ及びＴＴ値を測定し、
また、何も添加しない状態におけるＡＰＴＴ及びＴＴ値
（以下、正常値）の２倍の凝固時間を示すヘパリン及び
本発明に使用されるＧＡＧの濃度を求め、下記式によっ
て百分率で表した数値（％）を、それぞれＡＰＴＴ活
性、ＴＴ活性として比較に用いた。両活性とも数値
（％）が大きいほど、出血活性が高いことを示してい
る。 （ヘパリンの濃度／各ＧＡＧの濃度）×１００

【００２１】

【表１】

【００２２】本発明に使用されるＧＡＧのＡＰＴＴ活性
は、１０％以下であり、特に５％以下である。なかで
も、本発明に使用されるＧＡＧの一例として挙げられる
デルマタン硫酸のＡＰＴＴ活性は、１.５％以下である
と、より好ましい。また、本発明に使用されるＧＡＧの
ＴＴ活性は、１５％以下であり、特に１０％以下であ
る。

【００２３】このように、本発明に使用されるＧＡＧ
は、極めて低いＡＰＴＴ活性、ＴＴ活性を示し、その抗
血液凝固活性が極めて低いため、本発明の成長因子誘導
剤を医薬品として投与した際に、出血を惹起する危険性
が低く、本発明の成長因子誘導剤の安全性は高い。

【００２４】上述したように、コンドロイチン硫酸、デ
ルマタン硫酸、ヘパラン硫酸などの本発明の成長因子誘
導剤に含有されるＧＡＧは、外因性の成長因子を併用投
与しなくても、単独に投与された場合に内因性の成長因
子濃度を増加させる作用を有する。なお、ＰＤＧＦ-Ａ
Ｂ（血小板由来増殖因子）については、本発明に使用さ
れるＧＡＧを単独投与した後の培養細胞中濃度は、ほぼ
０であり、本発明に使用されるＧＡＧは、ＰＤＧＦ-Ａ
Ｂの体内における調節機能にも影響を及ぼすことが判明
しているので、ＰＤＧＦ−ＡＢの生体内での産生を抑制
するために利用できる可能性がある。

【００２５】本発明に使用されるＧＡＧの投与により誘
導することができる体内に存在する成長因子は、塩基性
線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈ
ＧＦ）などである。

【００２６】本発明の成長因子誘導剤は、本発明に使用
されるＧＡＧの投与により誘導しうる各種成長因子の欠
乏あるいは減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防
止）、軽減（症状の改善）及び治療などを目的として投
与することができる。本発明の成長因子誘導剤を適応し
うる疾患としては、具体的には肝疾患（肝炎、肝硬変、
肝不全など）、外科手術後の肝再生、腎疾患（糸球体腎
炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の
腎障害など）、皮膚疾患（白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚
潰瘍、禿頭症など）、血液疾患（血小板減少症、血流障
害など）、骨髄移植手術時、眼疾患（角膜潰瘍など）、
肺疾患（肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵
肺、肺繊維症など）、胃十二指腸疾患（胃炎、胃潰瘍、
十二指腸潰瘍など）、癌疾患、各種癌又は癌療法による
肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛など副
作用の予防、骨疾患（骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関
節炎など）、中枢疾患（神経分化異常症など）などを挙
げることができる。

【００２７】本発明の成長因子誘導剤は、注射（筋肉
内、皮下、皮内、静脈内、関節腔内、眼内、腹腔内な
ど）、点眼、点入、経皮、経口、経直腸、吸入などの投
与方法によって経口又は非経口的に投与することができ
る。本発明の成長因子誘導剤は、これらの投与方法に応
じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤型も、
本発明の成長因子誘導剤の有効性が保持され、重篤な副
作用が惹起されない範囲において、特に限定はされず、
例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形
剤など）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リ
ポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入
散剤、点眼剤、眼軟膏剤、坐剤などの剤型とすることが
できる。

【００２８】また、本発明の成長因子誘導剤の上記製剤
の調製にあたり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、保存
剤、着色剤、崩壊剤、溶媒、可溶化剤、乳化剤、界面活
性剤、浸透圧調節剤など、通常医薬品の製剤に用いられ
る成分を必要に応じて適宜配合することができる。さら
に、本発明の成長因子誘導剤には、その有効成分である
ＧＡＧのほか、成長因子誘導作用を有する他の物質や、
有効成分であるＧＡＧの作用を損うことのない薬理学上
許容されうる他の物質を、組成成分として配合し、ある
いは結合体として、又は併用薬剤として、投与すること
もできる。

【００２９】上記の「成長因子誘導作用を有する他の物
質」とは、本発明に使用されるＧＡＧとの組合せ配合あ
るいは結合させて、又は併用投与により、重篤な副作用
を惹起したり、一方の物質が他方の物質の本来有する成
長因子誘導作用を阻害する物質ではない限りにおいて特
に限定されない。

【００３０】本発明の成長因子誘導剤中の有効成分であ
るＧＡＧの配合量、及びその投与量は、その製剤の投与
方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、疾患の
重症度、患者の年齢、体重などに応じて個別に決定する
ことができ、特に限定はされないが、ＧＡＧの臨床投与
量としては、例えば成人に対しては、１日当り約０．１
mg/kg〜３００mg/kg・体重を例示することができる。ま
た、投与回数は１日１回程度でも可能であり、また１日
２〜４回、又はそれ以上の回数に分けて投与することも
できる。また、例えば点滴などにより連続的に投与する
ことも可能である。

【００３１】

【実施例】以下に、本発明を以下の製造例、試験例、及
び製剤例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以
下の例に限定されるものではない。 製造例１ 〔鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）の製造〕鶏冠由
来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）は「新規ガラクトサミノ
グリカン」（特開２０００−４０６０１号公報）に開示
の方法で製造した。 ＡＣＤＳの調製 ＜１＞鶏冠１，５００kgに水４０００Ｌを加えてミンチ
した後、煮沸し、冷却後、プロテアーゼ（商品名：プロ
ナーゼ 科研製薬（株）製）を添加して一晩放置し、加
水分解した。加水分解液に、塩化ベンザルコニウム溶液
３２Ｌを添加後、珪藻土でろ過し、ろ過上清を捨て、珪
藻土１８０kgを得た。この珪藻土に水３５０Ｌと塩化ナ
トリウム４２kgを加えた後、ろ過し、ろ液にエタノール
２５０Ｌを加え、得られた沈殿物を乾燥させて、粉体
１．３kgを得た。 ＜２＞上記粉体を水１．３Ｌに溶解して１０％溶液とな
るように調製し、ShivelyとConrad法により亜硝酸処理
を行って、ヘパリン／ヘパラン硫酸を除去した。すなわ
ち、上記粉体を溶解した溶液を、０．１％亜硝酸水溶液
に混和し、室温で１０分間放置した後、沈殿をろ過して
除いた。ろ過液のｐＨを１０．５に調整し、塩化ナトリ
ウムを終濃度１％になるように加え、さらにエタノール
を終濃度４８％になるように３０〜４０分かけて攪拌し
ながら加えた。得られた沈殿物に活性炭を加えて、吸引
ろ過し、ろ過液をイオン交換樹脂Diaion SA-12A（三菱
化学（株））に通して脱塩し、通過液にエタノールを加
え、鶏冠由来デルマタン硫酸の調製品（ＡＣＤＳ）１０
５ｇを得た。

【００３２】製造例２ 〔ウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）の製造〕ウシ
腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）は「抗血栓剤」（Ｗ
Ｏ９５/０９１８８）に開示の方法で製造した。 ＢＩＤＳの調製 ＜１＞ウシ小腸１０kgを切断し、糞及び脂肪を除去後、
粘膜を回収した。これに水酸化ナトリウムを加え、２.
５Ｎ、３Ｌに調整して、３７℃で２時間抽出した。この
抽出液を中和後、珪藻土で濾過し、濾液を水で透析し、
生じた不溶物を遠心分離して除去した。上清に等量のエ
タノール及び５ｇの酢酸ナトリウムを加えて、沈澱物を
得た。この沈澱物を０.６５Ｍ食塩溶液に溶かし、０．
５Ｍ食塩溶液で平衡化した Diaion HPA-10（三菱化学
（株）製）アニオン交換樹脂に負荷し、０.６５Ｍ及び
１.１Ｍ食塩溶液で順次洗浄後、１.５Ｍ食塩溶液で溶出
した。溶出画分を蒸留水を用いて透析し、透析内液に酢
酸カルシウム及び酢酸を加え、それぞれ終濃度５％及び
０.５Ｍに調整した。この液にエタノールを加え、１５
〜３０％(V/V)で沈澱する画分を集めた。沈澱物を水に
溶解して、イオン交換樹脂に通液して脱塩後、通過液を
酢酸又は水酸化ナトリウム水溶液にて中和した。中和液
に２倍量のエタノールを加え、生じた沈殿を７０％エタ
ノール、純エタノール及びエーテルの順で洗浄後、五酸
化リン存在下で減圧乾燥し、ＢＩＤＳ中間品を得た。 ＜２＞＜１＞で得られたＢＩＤＳ中間品について、Shiv
elとConrad法（Biochemistry 15, 3932-3942, 1976）の
方法に準拠して亜硝酸分解を行い、ヘパリン・ヘパラン
硫酸を除去し、ウシ腸由来デルマタン硫酸の調製品（Ｂ
ＩＤＳ）を得た。

【００３３】以上のデルマタン硫酸２種（ＡＣＤＳ、Ｂ
ＩＤＳ）に加え、サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Ｃナ
トリウム塩（以下、ＣＳＣという。生化学工業（株）
製）、ウシ腎臓由来ヘパラン硫酸ナトリウム塩（以下Ｈ
Ｓという。生化学工業（株）製）を後述する試験例の被
検物質として用いた。

【００３４】試験例１ 〔活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及び
トロンビン時間（ＴＴ）の測定法〕 ＡＰＴＴ活性の測定方法 ラットの下大静脈より３．２％クエン酸１／１０容量で
採血し、血液を３０００r.p.mで１０分間遠心分離して
血漿を得た。血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得
た鶏冠由来デルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得
たウシ腸由来デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリ
ン（Syntex社製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．
Ｗ．１０，０００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップ
に入れ、３７℃で１分間保温した。その後、あらかじめ
３７℃に保温しておいたアクチン１００μlを添加し、
さらに２分間保温した。ついで３７℃に保温しておいた
０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μlを添加し、こ
の時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装
置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。

【００３５】ＴＴ活性の測定方法 血漿１００μlと既知濃度の製造例１で得た鶏冠由来デ
ルマタン硫酸（ＡＣＤＳ）、製造例２で得たウシ腸由来
デルマタン硫酸（ＢＩＤＳ）、又はヘパリン（Syntex社
製ウシ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．１０，０
００Ｄａ）溶液１００μlを測定用カップに入れ、３７
℃で２分間保温した。その後、５分前より３７℃に保温
しておいたトロンビン（１０U/ml)１００μlを添加し、
この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定
装置（KC-10A、アメルング社製）により測定した。

【００３６】上記試験法によって測定したＡＰＴＴ及び
ＴＴ値を示すグラフを、図１及び図２に示す。この結果
から、試験したＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ及びヘパリンのいず
れも、濃度依存性に血液凝固開始までの時間の延長傾向
を示したものの、ＡＣＤＳ及びＢＩＤＳは、ヘパリンに
比して抗血液凝固作用が極めて弱いことが示された。し
たがって、本発明の成長因子誘導剤の出血傾向は、ヘパ
リンより非常に弱く、本発明の成長因子誘導剤は、ヘパ
リンより安全性が高い医薬であることが示された。

【００３７】試験例２ 〔正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）に対する各種
グリコサミノグリカンの成長因子誘導作用〕正常ヒト皮
膚線維芽細胞（ＨＳＦ−１）を２６才の成人女性肘内側
皮膚より分離し、真皮を分離後トリプシン処理し、１０
％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco's m
odified Eagle's medium）培地にて８世代継代維持した
後、通常の方法により凍結保存した。試験時には、凍結
保存したＨＳＦ−１をHuMedia-EG2培地（クラボウ
（株）製）を用いて２４wellマイクロプレートでコンフ
ルエントになるまで培養した。

【００３８】培地を HuMedia-EG培地（クラボウ（株）
製）に置換したのち、最終濃度０.１mg/mlになるように
ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、又はヘパリン（ＳＰＬ社
製ブタ腸由来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，００
０）を添加した。４８時間培養後、培養上清を別の容器
に移し、遠心分離して、細胞成分を除去した後、各種成
長因子の濃度を測定した。

【００３９】培養上清中に含まれるｂＦＧＦおよびＨＧ
Ｆの濃度は、それぞれQuantikine HUMAN FGF-basic ELI
SA kitおよび Quantikine HUMAN HGF ELISA kit（いず
れもR&D systems製）を用いて測定した。対象として何
も添加せず同様にして得られた培養上清中の各種成長因
子の濃度も測定した。この測定結果を図３及び図４に示
す。

【００４０】この結果から、ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、ＣＳ
Ｃ、又はヘパリンのいずれを添加した場合においても、
無添加対照群に比して、培養終了後における培養上清中
のｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度が高いことが示された。ま
た、本試験例では、各種ＧＡＧ又はヘパリンの添加後４
８時間しか経過しておらず、細胞分裂は起こっていない
と推測され、更に、本試験例における添加濃度０.１mg/
mlにおいては各種ＧＡＧ自身に細胞毒性がないことも確
認済みである。したがって、本試験に用いたＡＣＤＳ、
ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンが、培養線維芽細胞自
体が有する内因性成長因子の濃度に関する制御機構に働
きかけ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦの濃度を増加させたものと
考えられる。

【００４１】試験例３ 〔初代ヒト真皮線維芽細胞に対する各種グリコサミノグ
リカンの成長因子誘導作用〕初代ヒト真皮線維芽細胞
（日水製薬（株）製）を、type-1コラーゲン(Cell Matr
ix Type-1A、新田ゼラチン製）をコートしたディッシュ
上で、５％のＦＢＳを含有する線維芽細胞用培地（日水
製薬（株）製）にて培養した。適度に増殖させた後、細
胞をトリプシン/０．０２％エチレンジアミン４酢酸水
溶液を用いて、回収した。回収した細胞を５％ＦＢＳを
含有する線維芽細胞用培地で５×１０⁴個/wellになるよ
うに４８−wellプレートに播種した。常法で２４時間培
養した後、培地を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換
し、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリン（ＳＰＬ社製ブタ腸由
来ヘパリンナトリウム塩、Ｍ．Ｗ．９，０００）を、種
々の濃度（１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml、１０
００μg/ml、ただしＡＣＤＳのみ１０μg/ml、１００μ
g/ml、１０００μg/ml、２５００μg/ml）で添加した。
さらに２４時間培養後、培養上清を別の容器に移し遠心
分離して細胞成分を除去した後、成長因子の濃度を測定
した。

【００４２】培養上清中に含まれるＨＧＦの濃度は、Qu
antikine HUMAN HGF ELISA kit（ R&D systems製）を用
いて測定した。対照として何も添加せず同様にして得ら
れた培養上清中の成長因子の濃度も測定した。その結果
を図５に示す。

【００４３】この結果から、ＡＣＤＳ、ＨＳ又はヘパリ
ンのいずれを添加した場合でも、培養上清中のＨＧＦ濃
度が増加したことが示された。試験例２においては各種
ＧＡＧ又はヘパリンの添加濃度は０.１mg/mlであった
が、０.１mg/mlの１０分の１あるいは１００分の１の低
濃度においても各種ＧＡＧ及びヘパリンが、培養線維芽
細胞自体が有する内因性のＨＧＦ濃度を増加させること
が示された。

【００４４】製剤例 製剤例１：眼用溶液 製造例１で得たＡＣＤＳ １mg 塩化ナトリウム ９００mg チオメルサール １mg 上記に精製水を加えて全１００mlとし、pH５．５〜７．
５に調整したのち、無菌濾過し、無菌容器に充填した。

【００４５】製剤例２：軟膏１ 製造例２で得たＢＩＤＳ ２ｇ 鉱油 ４ｇ 石油ゼリー ８ｇ 混合メチル／プロピルパラバン ０．０６ｇ 非イオン性界面活性剤 １ｇ 精製水 ３０ｇ 上記を常法により混合し、容器に充填した。

【００４６】製剤例３：軟膏２ 製造例１で得たＡＣＤＳ ０．１ｇ 白色ワセリン １８ｇ 精製水 ２ｇ 上記を常法により混合し、容器に充填した。

【００４７】製剤例４：注射用製剤 製造例１で得たＡＣＤＳ ０．５ｇ 上記に注射用食塩水２０mlを加え、無菌濾過した後アン
プルに分注し、密封した。

【００４８】

【発明の効果】グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を有効
成分として含有する本発明の成長因子誘導剤は、成長因
子を人為的に外部から併用投与したり、又は予め成長因
子を配合又は結合させて投与しなくても、単独に投与さ
れた場合に細胞や生体内に存在する内因性の成長因子の
濃度調節機構に働きかけ、内因性の成長因子の濃度を増
加させる。また、本発明の成長因子誘導剤では、ヘパリ
ン系医薬において問題となる抗血液凝固活性が低く、出
血の危険性が極めて低いため、成長因子の欠乏あるいは
減少を原因とする疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減
（症状の改善）及び治療のために、安全で有用な医薬と
して投与することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＡＰＴＴ
測定値を示す。

【図２】ＡＣＤＳ、ＢＩＤＳ、及びヘパリンのＴＴ測定
値を示す。

【図３】培養上清中のｂＦＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、
ＢＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。

【図４】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、Ｂ
ＩＤＳ、ＣＳＣ、及びヘパリンの効果を示す。

【図５】培養上清中のＨＧＦ濃度に対するＡＣＤＳ、Ｈ
Ｓ、及びヘパリンの効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA22 EA26 MA01 MA04 NA06 NA14 ZC02 4C090 BA64 BA66 DA23

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グリコサミノグリカン又はその薬理学的
   に許容される塩を有効成分として含有する、成長因子誘
   導剤。
2. 【請求項２】 上記グリコサミノグリカンが、ヘパラン
   硫酸である、請求項１記載の成長因子誘導剤。
3. 【請求項３】 上記グリコサミノグリカンが、ガラクト
   サミノグリカンである、請求項１記載の成長因子誘導
   剤。
4. 【請求項４】 上記ガラクトサミノグリカンが、デルマ
   タン硫酸又はコンドロイチン硫酸のいずれかである、請
   求項３記載の成長因子誘導剤。