JP2005290383A

JP2005290383A - ６−ｏ−硫酸化ｎ−アセチルヘパロサン及び造血幹細胞増殖助剤

Info

Publication number: JP2005290383A
Application number: JP2005107760A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Kariya; 豊苅谷; Mamoru Kiyougashima; 守京ヶ島; Kiyoshi Suzuki; 喜義鈴木; Yosuke Yasuda; 洋祐安田
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-04-04
Publication date: 2005-10-20
Also published as: US20050233453A1

Abstract

【課題】優れた造血幹細胞増殖促進能を有し、かつ、病原性ウィルスやプリオンタンパク質の汚染の心配のないヘパラン硫酸類似物質であって、このような活性を有することが知られているＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンに代わり得る物質を提供すること。
【解決手段】Ｎ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化された６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
【選択図】なし

Description

本発明者は、Ｎ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化された６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンに関する。また、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを有効成分とする造血幹細胞増殖助剤およびそれを用いる造血幹細胞の培養方法に関する。

現在、ヒト由来の幹細胞などを移植することにより疾患を治療しようとする再生医療の必要性が声高に叫ばれているが、小児白血病など血液関連疾患の新規治療法の一つとして、臍帯血由来の造血幹細胞を白血病患者に投与するという再生医療の一分野が確立されつつある。この場合、投与される造血幹細胞の数は多ければ多いほど白血病の治癒効果が高くなり、例えば拒絶反応低減化のためＨＬＡ抗原５座のうち３座以上の一致が達成されている造血幹細胞を選択した後、その造血幹細胞の幼若化レベルを保ったまま増殖させる（イクスパンジョン）ことの意義は大きい。

ヘパリンにＮ−脱硫酸化及びＮ−再アセチル化を順次施して得られるＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンは、脊髄中のニッチェの中でストローマ細胞表面に局在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの構成成分であるヘパラン硫酸鎖の構造と非常によく似ており、そのヘパラン硫酸鎖は脊髄ニッチェに於いて、造血幹細胞の非常によいリザーバーとして造血幹細胞の安定化に寄与していることが知られている（非特許文献１）。

また、造血幹細胞をｅｘｖｉｖｏにて培養する際、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンを添加した培地で培養することが提案されている（非特許文献２）。更に、最近の研究からは、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンと類似の構造を有するヘパラン硫酸の増殖促進能が、サイトカインの一種であるＭＩＰ−１αとの親和性に基づいていることも分かっている（非特許文献３）。

しかしながら、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンは、一般的にウシやブタなど動物臓器を原料として単離・精製されたヘパリンを用いて製造されるため、病原性ウィルスやプリオンタンパク質などからの汚染の危険性が避けがたいという難点がある。

動物臓器に頼らないヘパリンあるいはヘパリン類似物質は、上記の通り有用性が高く、その工業的な製造について鋭意研究がなされている。
例えば、ヘパリン前駆物質であるとされているＮ−アセチルヘパロサンなどが挙げられる。Ｎ−アセチルヘパロサンは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの二糖単位の繰り返し構造を特徴とするグリコサミノグリカンであり、大腸菌のある種の菌株によって産生される夾膜多糖であり、Ｋ５抗原と呼ばれている（非特許文献４）。

また、Ｎ−アセチルヘパロサンの誘導体としては、化学的に硫酸化を施すことにより得られるＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン（特許文献１）、Ｋ５多糖を直接硫酸化することにより得られるＯ−硫酸化Ｋ５多糖（特許文献２）、脱アセチル化、硫酸化することにより得られるスルファミノヘパロサンスルフェート（特許文献３）等がある。

しかしながら、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン自体およびそれが、造血幹細胞の増殖促進活性を有することについては知られていなかった。
特開平５−２７１３０５特表２００１−５１０５０２特表２０００−５１７３２８Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９２，４６４１−４６５１Ｂｌｏｏｄ（２０００）９５，１４７−１５５Ｂｌｏｏｄ（２００３）１０１，２２４３−２２４５Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）１１６，３５９−３６４

従って、本発明の目的は、優れた造血幹細胞増殖促進能を有し、かつ、病原性ウィルスやプリオンタンパク質の汚染の心配のないヘパラン硫酸類似物質であって、このような活性を有することが知られているＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンに代わり得る物質を提供することにある。

本発明者らは、上記実情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、Ｎ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化された６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを合成することに成功し、さらに該物質が優れた造血幹細胞増殖促進効果を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化された６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
（２）グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖組成において、ΔＤｉＨＳ−６Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが３０−７０モル％である（１）記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
（３）グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖組成において、ΔＤｉＨＳ−０Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースが７０−３０モル％である（１）または（２）に記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
（４）造血幹細胞の増殖を促進する作用を有し、（１）〜（３）のいずれかに記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを有効成分とする造血幹細胞増殖助剤。
（５）造血幹細胞が、ヒト由来造血幹細胞である（４）記載の造血幹細胞増殖助剤。
（６）造血幹細胞が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の造血幹細胞である（４）または（５）に記載の造血幹細胞増殖助剤。
（７）インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）での細胞培養に用いられる（４）〜（６）のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤。
（８）生体への移植用造血幹細胞の増殖を促進するための、（４）〜（７）のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤。
（９）（４）〜（８）のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤と造血幹細胞の培養に必要な他の培地成分とを含む造血幹細胞用培地。
（１０）他の培地成分が、インターロイキン３、マクロファージ炎症性蛋白、幹細胞因子および血小板因子４からなる群から選択された１以上のサイトカインである（９）に記載の造血幹細胞用培地。
（１１）（４）〜（８）のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤の存在下、または（９）もしくは（１０）記載の造血幹細胞用培地中において、造血幹細胞を培養することからなる造血幹細胞の培養方法。
（１２）（１１）に記載の方法で培養された造血幹細胞を、哺乳動物の骨髄に移植することからなる血液疾患の治療方法。

本発明の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンは造血幹細胞増殖促進活性を有し、病原性ウィルスやプリオンタンパク質などの汚染の心配がなく、また、抗凝固活性の低い、安全、かつ、継続的供給可能な造血幹細胞増殖促進剤を供給することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンは、Ｎ−アセチルヘパロサンのＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化されたものである。

本発明の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの製造法としては、Ｎ−アセチルヘパロサン酸の第１級水酸基を特異的に硫酸化する方法であれば特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はピリジン等の非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とトリメチルアミン、トリエチルアミン、またはピリジンのような有機塩基との複合体を用いて行う方法、グリコサミノグリカンのグリコサミンの第１級水酸基に硫酸基を転移する活性を有するグリコサミノグリカン−６−Ｏ−硫酸基転移酵素を用いる方法等が挙げられる。

出発物質として用いるＮ−アセチルヘパロサンは、例えば、Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を培養し、培養物から精製する方法により得られたものを使用することができる。

Ｎ−アセチルヘパロサン生産能を有する大腸菌は特に限定されないが、例えば、Ｋ５菌株もしくは該菌株と実質的に同一の性質を有する菌株などが挙げられ、Ｋ５菌株としては、当業者が容易に入手可能な標準菌株を使用することができる。

このようにして製造される６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを、ヘパリン消化酵素（ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ）等のグリコサミノグリカン分解酵素で消化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で生成した不飽和二糖組成を分析すると、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース（以下、「ΔＤｉＨＳ−６Ｓ」という）が３０−７０モル％であり、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース（以下、「ΔＤｉＨＳ−０Ｓ」という）が７０−３０モル％である。

また、重量平均分子量は、後述するＨＰＬＣを用いたゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて測定を行った場合、通常、３５，０００〜４５０，０００の範囲であり、好ましくは、４０，０００〜８０，０００である。
以下、本明細書において、重量平均分子量（Ｍｗ）とは、特に、ＨＰＬＣによるゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて測定を行った場合の分子量（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１１７，６０−７０（１９９２））を表す。

本発明の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの造血幹細胞増殖促進活性はＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンよりも高いと考えられ、また、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）はＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンよりも短いと考えられるので抗凝固活性も低いと考えられる。

本発明の造血幹細胞増殖助剤は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）での造血幹細胞の培養において、細胞増殖促進作用を有する増殖助剤として好適に用いられる。
なお、該増殖助剤には６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの他に、水、緩衝液等を含んでいてもよい。

本発明の造血幹細胞の培養方法において用いられる造血幹細胞は、脊椎動物由来であれば特に限定されないが、哺乳動物、特にヒトの骨髄、末梢血または臍帯血由来の幹細胞であることが好ましく、血液疾患等の治療に用いる場合には、他人の造血幹細胞である同種造血幹細胞および自分自身の造血幹細胞である自家造血幹細胞がより好ましい。
また、本発明の造血幹細胞増殖剤を含む造血幹細胞培養培地中で培養され増殖した造血幹細胞は、血液疾患などの治療を目的として生体への移植用として用いることができる。

本発明の培養方法において適用される造血幹細胞培養培地は、前記造血幹細胞増殖助剤と該細胞の培養に必要な他の培地成分を含む。このような培地成分としては、基本増殖培地が挙げられる。具体的には、細胞の培養に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ−１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）に、本発明の造血幹細胞増殖助剤を添加した培地である。また、前記培地に、更に、インターロイキン３、マクロファージ炎症性蛋白、幹細胞因子および血小板因子４などのサイトカイン類を含有させてもよい。

本発明の造血幹細胞増殖助剤は、上記培地に、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの培地中における終濃度として、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、５〜２０μｇ／ｍｌで添加される。

次に、以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
＜６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの合成＞
大腸菌Ｋ５株培養物から得られた２１８．７ｍｇのＮ−アセチルヘパロサンを１０ｍｌの蒸留水に溶解した後、蒸留水で平衡化したアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（オルガノ社製）カラム（φ２ｘ１５ｃｍ）に通塔し、溶出液を３ｍｌごとに分画した。最終的に得られた３０本の画分のｐＨを測定した後、酸性画分を集めＮ−アセチルヘパロサンの総カルボキシル基の３．０当量に相当する０．４２ｍｌのｎ−トリブチルアミン（ＴＢＡ）を添加した。この溶液を凍結乾燥することによりＮ−アセチルヘパロサンＴＢＡ塩を得た。特異的に６−Ｏ−硫酸化反応を行うために、下記２種類の反応に応じてＸｍｇのＮ−アセチルヘパロサンＴＢＡ塩に対し２５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加し、５０℃の温度条件下で４時間撹拌した。さらに、Ｙｍｇのピリジン−サルフォトリオキサイド複合体（Ｐｙ−ＳＯ₃）を添加した後、５０℃にて撹拌条件下２時間の反応を進行させた。なお、Ｘ，Ｙの組み合わせに基づき次に示すＡ、Ｂの２種類の反応を実施した。
反応Ａ：Ｘ＝５０．４ｍｇ，Ｙ＝８３．９ｍｇ（二糖単位あたり３．１当量）
反応Ｂ：Ｘ＝４６．５ｍｇ，Ｙ＝８６．０ｍｇ（二糖単位あたり３．８当量）

尚、ここでは、用いたＮ−アセチルヘパロサンＴＢＡ塩のカルボキシル基が定量的にｎ−トリブチルアミン塩に変換されていること、１０％の水分を含んだ凍結乾燥粉末であると仮定した場合の当量を示している。
反応を終結させるために、反応液を氷冷し２５ｍｌの蒸留水を添加した後、流水透析した。透析内液を濃縮し、アンバーライトＩＲ−１２０Ｂカラム（φ２ｘ１５ｃｍ）に通塔した。最終的に得られた３０本の画分のｐＨを測定した後、酸性画分を集め１ＮＮａＯＨを適量加えてｐＨ７．０に調整した。これを０．２ＭＮａＣｌで平衡化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＧＣＬ−９０（生化学工業（株）販売）カラム（φ３ｘ１２０ｃｍ）、次いで蒸留水で平衡化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＧＣＬ−２５（生化学工業（株）販売）カラム（φ３．３ｘ３６ｃｍ）にて順次精製した。その後、凍結乾燥処理に付すことにより反応Ａ及びＢ由来の凍結乾燥粉末を、それぞれ４２．７ｍｇ及び５２．２ｍｇ得た。

次いで、反応Ａの反応産物のうち４１．８ｍｇを３０ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に溶解し、同溶媒にて平衡化したＷｈａｔｍａｎＤＥ５２カラム（φ２．３ｘ１８ｃｍ）にアプライした。１００ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）での洗浄後、２００ｍｌの同溶媒と２００ｍｌの１．２ＭＮａＣｌを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を用いたＮａＣｌの直線的濃度勾配により溶出を行った。図１にはカルバゾール法によるウロン酸の検出値（ＯＤ５３０）をプロットした溶出パターンを示した。図示したように溶出順に画分Ｉ及び画分ＩＩを分取し、それぞれ脱塩・凍結乾燥した。得られた画分Ｉ及び画分ＩＩの重量は、それぞれ１５．２ｍｇ、及び１５．４ｍｇであった。

（実施例２）
＜６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンのゲル濾過ＨＰＬＣと分子量測定＞
各５０μｇ／５μｌのＮ−アセチルヘパロサンおよび６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを、０．２ＭＮａＣｌで平衡化した４，０００、３，０００および２，５００ＧタイプのＴＳＫｇｅｌ−ＰＷ_XLカラムを上流から順に各一本ずつ連結したＣＣＰＭ型ＨＰＬＣ（東ソー社製）に付し、ゲル濾過（ＧＰＣ）−ＨＰＬＣ分析を行った。なお、分析はカラムオーヴンＣＯ−８０２０（東ソー社製）４０℃、０．６ｍｌ／分の定流速下で、示差屈折計ＲＩ−８０２０（東ソー社製）を用い、示差屈折（ＲＩ）を指標として行った。その結果、図２に示すように、反応Ａ由来画分Ｉ（図２ａ）、反応Ａ由来画分ＩＩ（図２ｂ）及び反応Ｂ産物（図２ｃ）は、それぞれ溶出時間（以下、同様）２９．１分、２９．０分、及び２８．９分に溶出された。分子量標品を用いた検量線との比較の結果、反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ、及び反応Ｂ産物の分子量は、それぞれ６．１ｘ１０⁴Ｄａ、６．２ｘ１０⁴Ｄａおよび６．３ｘ１０⁴Ｄａと算出された。なお、図２ｄ，ｅ，ｆには、反応Ａ由来画分Ｉ，ＩＩ及び反応Ｂ産物の酵素消化後のパターンを示した。

（実施例３）
＜６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの不飽和二糖組成分析＞
不飽和二糖組成分析は、Ｋａｒｉｙａｅｔａｌ．の方法（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９２）１０３Ｂ，４７３−４７９）に従って実施した。なお、酵素消化は、各４０ｍＵのｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅＩ，ＩＩ及びｈｅｐａｒｉｎａｓｅ（いずれも生化学工業株式会社製）の混合物を用い、各基質２００μｇにつき３７℃にて２時間の条件で行った。酵素消化物を強イオン交換（ＳＡＸ）−ＨＰＬＣ（ＣａｒｂｏＰａｋＰＡ−１ｃｏｌｕｍｎ，Ｄｉｏｎｅｘ社製）で分析した結果、図３に示すように、反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ、及び反応Ｂ産物のＳＡＸ− ＨＰＬＣパターンが得られた。図３ａは、コントロールのＮ−アセチルヘパロサンの酵素消化物のＳＡＸ−ＨＰＬＣパターンである。図３ｂ，３ｃ，及び３ｄのパターンは、それぞれ反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ、及び反応Ｂ産物のＳＡＸ−ＨＰＬＣパターンを示す。図３ａのＮ−アセチルヘパロサンのパターンでは、２．５分の溶出時間にΔＤｉＨＳ−０Ｓの単一ピークのみが観察される。

一方、図３ｂの反応Ａ由来画分Ｉのパターンでは、２．５分のΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークに加え、１２分の溶出時間にΔＤｉＨＳ−６Ｓのピークが新たに検出された。また両ピークの面積比は、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＤｉＨＳ−６Ｓ＝２：１であった。図３ｃの反応Ａ由来画分ＩＩのパターンでは、２．５分のΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークと１２分のΔＤｉＨＳ−６Ｓのピークがやはり検出された。また両ピークの面積比は、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＤｉＨＳ−６Ｓ＝１：１であった。これらの結果より、反応ＡではＮ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基の約１／３〜１／２に於いて特異的硫酸化反応が進行していたことが示された。図３ｄの反応Ｂ産物のパターンでは、主要ピークとして２．５分のΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークと１２分のΔＤｉＨＳ−６Ｓのピークが観察される一方１７．５分に切れ残りオリゴ糖と目されるブロードなマイナーピークが検出された。また両主要ピークの面積比は、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＤｉＨＳ−６Ｓ＝１：２であった。この結果より、反応ＢではＮ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基の約２／３に於いて特異的硫酸化反応が進行していたことが示された。すなわち、実施例１の反応Ｂの方が、反応Ａよりも４／３〜２倍効率的に、第１級水酸基特異的に硫酸化反応が進行することが判明した。以上より、Ｎ−アセチルヘパロサンを出発材料として、あらかじめ設計した化学修飾形態に起因する構造を有する６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンが段階的硫酸化度を有する一連の誘導体として合成された。

（実施例４）
＜造血幹細胞増殖活性の測定＞
Ｂｌｏｏｄ（２０００）９５，１４７−１５５の方法に従って、ｅｘｖｉｖｏでの反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ、及び反応Ｂ産物の造血幹細胞増殖促進活性を測定する。すなわち、造血幹細胞増殖培地には、１２．５％ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ、１２．５％ｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ、２ｍＭＬ−グルタミン、１０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０^-6ｍｏｌ／Ｌハイドロコルチゾンを含むＩＳＣＯＶＥ改変ダルベッコ培地（ＬＴＢＭＣ培地）を基本培地とし、前記ＬＴＢＭＣ培地にＩＬ−３及びＭＩＰ−１α添加後、各６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン（反応Ａ由来画分I、反応Ａ由来画分II及び反応Ｂ産物）を加え、造血幹細胞増殖培地として用
いる。ＣＤ３４⁺／ＨＬＡ−ＤＲ^-細胞（造血幹細胞）を６又は２４ウェルのマイクロタイタープレートに１０〜１４×１０³個／ウェルとなるよう各ウェルに加え、更に、前記造血幹細胞増殖培地を３ｍｌ（６ウェル）又は０．８ｍｌ（２４ウェル）ずつ添加する。培養は、５％ＣＯ₂中、３７℃で行う。２〜５週間後、コロニーを形成したＣＤ３４⁺／ＨＬＡ−ＤＲ^-細胞を各ウェルから取り出し、メチルセルロース培地に移す。前記コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の細胞数を限定希釈分析法を用いて計測する。

実施例３で示したように、反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ及び反応Ｂ産物は、それぞれ約３０％、５０％及び７０％の二糖単位に於いてＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化されているので、それらの構造はいずれもＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンに類似の構造をとることになり、造血幹細胞増殖促進活性を示すとともに、造血幹細胞増殖促進活性は硫酸含量依存的に高くなる（反応Ａ由来画分Ｉ＜反応Ａ由来画分ＩＩ＜反応Ｂ産物）と考えられる。

（実施例５）
＜活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定＞
ラットの下大動脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採取した血液を１０００ｘｇ、１０分間遠心分離して得た血漿１００μｌと様々な濃度のＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンあるいは各６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン（反応Ａ由来画分Ｉ、反応Ａ由来画分ＩＩ及び反応Ｂ産物）各１００μｌを測定用カップに入れ、３７℃で１分間保温する。その後、予め３７℃に保温しておいたアクチン（商品名：三菱ウェルファーマ（株））１００μｌを添加し、さらに２分間保温する。次いで、３７℃に保温しておいた０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μｌを添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自動測定装置（ＫＣ−１０Ａ；アメルング社製）で測定する。

その結果、被検物質の濃度１００μｇ／ｍｌの時のＡＰＴＴは、Ｎ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンでは８０秒以上であるのに対し、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンではいずれも７０秒以下であると考えられる。すなわち、６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンの抗凝固活性はＮ−脱硫酸化Ｎ−再アセチル化ヘパリンの同活性よりも弱いと推定される。

反応Ａ産物の陰イオン交換クロマトグラフィーパターンを示す。反応Ａ画分Ｉ，ＩＩ及び反応Ｂ産物のゲル濾過ＨＰＬＣパターンを示す。反応Ａ画分Ｉ，ＩＩ及び反応Ｂ産物の強イオン交換ＨＰＬＣパターンを示す。

Claims

Ｎ−アセチルヘパロサンを構成するＮ−アセチルグルコサミンの第１級水酸基が硫酸化された６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖組成において、ΔＤｉＨＳ−６Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが３０−７０モル％である請求項１記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖組成において、ΔＤｉＨＳ−０Ｓで示される２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコースが７０−３０モル％である請求項１または２に記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサン。
造血幹細胞の増殖を促進する作用を有し、請求項１〜３のいずれかに記載の６−Ｏ−硫酸化Ｎ−アセチルヘパロサンを有効成分とする造血幹細胞増殖助剤。
造血幹細胞が、ヒト由来造血幹細胞である請求項４記載の造血幹細胞増殖助剤。
造血幹細胞が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の造血幹細胞である請求項４または５に記載の造血幹細胞増殖助剤。
インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）またはエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）での細胞培養に用いられる請求項４〜６のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤。
生体への移植用造血幹細胞の増殖を促進するための、請求項４〜７のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤。
請求項４〜８のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤と造血幹細胞の培養に必要な他の培地成分とを含む造血幹細胞用培地。
他の培地成分が、インターロイキン３、マクロファージ炎症性蛋白、幹細胞因子および血小板因子４からなる群から選択された１以上のサイトカインである請求項９に記載の造血幹細胞用培地。
請求項４〜８のいずれかに記載の造血幹細胞増殖助剤の存在下、または請求項９もしくは１０に記載の造血幹細胞用培地中において、造血幹細胞を培養することからなる造血幹細胞の培養方法。
請求項１１に記載の方法で培養された造血幹細胞を、哺乳動物の骨髄に移植することからなる血液疾患の治療方法。