CN108318602A - 一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法，包括：S1)将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；S2)将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图；所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐。与现有技术相比，本发明通过肝素酶将肝素和/或低分子肝素完全降解得到主要的肝素二糖组成和/或小片段如三糖、四糖单元，通过反相离子对试剂结合反相色谱能被快速分离并定量分析，且该方法具有很好的耐久性和重复性。
Description
技术领域
本发明属药物检测技术领域，尤其涉及一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法。
背景技术
依诺肝素钠属于低分子肝素，随着仿制药厂家的增多，低分子肝素产品多样性层出不穷，FDA加强了对低分子肝素仿制药进入美国市场的监控。
2010年7月23日，FDA制定了一种基于五项标准的系统的、严谨的方法即所谓的仿制药一致性指导原则，包括以下5点：1、理化性质；2、肝素来源与降解方式；3、二糖、寡糖片段序列一致性；4、生物生化等效性；5、体内药效学等效性。除此之外，FDA还使用了体内、体外和模型动物数据，以确保相对于原研药的仿制药的免疫原性风险没有增加。
对于仿制药来说，建立一致性是相当必要的。然而，对仿制药一致性有两个关键挑战：1、不同供应商提供的产品必须具有相同的活性，因为依诺肝素钠不像传统小分子一样有一个相对简单的化学结构，其是一种复杂的寡糖混合物；2、确保仿制药纯度与质量与原研药的可比性，这样仿制药依诺肝素钠就不会比原研药有更安全(如免疫原性)的风险。
依诺肝素钠是粗品肝素经提纯后进行成盐、酯化、降解、精制而得。依诺肝素钠在降解过程中产生了新的修饰末端，但仍保留了天然的粗品肝素结构。因此，鉴定依诺肝素钠结构中的天然肝素结构是必须的。
公开号为CN104792896A的中国专利公开了一种可才彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物及其应用，其提供的肝素酶组合物为肝素酶II与肝素酶III的混合物，可彻底特异性酶解肝素钠，但该专利中采用此肝素酶组合物酶解之后对还原产物进行HPLC检测需要使用保护柱，且流动相需要调节酸碱度同时检测时间也较长。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法。
本发明提供了一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法，包括：
S1)将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物或肝素酶II；
S2)将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图；
所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐。
优选的，所述反相离子对为四丁基硫酸氢铵和/或四丁基溴化铵。
优选的，所述流动相A与流动相B中反相离子对的浓度各自独立地为1～10mmol/L。
优选的，所述流动相A与流动相B中的有机溶剂各自独立地选自乙腈和/或甲醇。
优选的，所述流动相A与流动相B中有机溶剂的体积浓度为5％～10％。
优选的，所述反相离子对色谱的固定相选自多孔硅胶；所述多孔硅胶的孔径为1.5～5μm。
优选的，所述反相离子对色谱的固定相选自BDS HYPERSIL C18、BDS HYPERSILC8、TSKgel Super-Octyl C8或TSKgel Super-Octyl C18。
优选的，所述反相离子对色谱采用梯度洗脱；以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序为：0～3min，90％～99％A；3～3.5min，40％～90％A；3.5～8.5min，20％～60％A；8.5～11.5min，5％～40％A；11.5～21.5min，5％～99％A；21.5min，90％～99％A。
优选的，以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序为：
优选的，所述碱金属氯盐选自氯化钠和/或氯化铯；所述流动相B中碱金属氯盐的浓度为200～500mmol/L。
本发明提供了一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法，包括：S1)将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物或肝素酶II；S2)将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图；所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐。与现有技术相比，本发明通过肝素酶将肝素和/或低分子肝素完全降解得到主要的肝素二糖组成和/或小片段如三糖、四糖单元，这些单独的组分通过反相离子对试剂结合反相色谱能被快速分离并定量分析，在很短的时间即可检测出肝素和/或低分子肝素中的二糖含量，并且该方法具有很好的耐久性和重复性，这些天然二糖组成的定性定量检测确定了仿制药与原研药肝素来源一致性，在低分子肝素一致性评价具有重要意义。
实验表明，本发明提供的检测方法不必使用保护柱，流动相无需调节酸碱度，使用反相离子对多孔硅胶色谱柱柱子使用寿命长，检测时间由74min缩短至15min，能够快速解析肝素二糖含量。
附图说明
图1为供试品为肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图；
图2为供试品依诺肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图；
图3为采用不同色谱柱的肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图；
图4为HPLC系统为沃特世Waters时肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图；
图5为HPLC系统为安捷伦Agilent时肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图；
图6为连续注射6次酶解产物的RPIP-HPLC谱图；
图7为肝素8个二糖标准品混合液6针叠加的RPIP-HPLC谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法，包括：S1)将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物或肝素酶II；S2)将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图；所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐。
本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
所述肝素和/或低分子肝素溶液为本领域技术人员熟知的肝素和/或低分子肝素溶液即可，并无特殊的限制，本发明中其浓度优选为10～50mg/ml，更优选为10～40mg/ml，再优选为20～30mg/ml。
所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物或肝素酶II；当所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物时，所述肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的质量比优选为1：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，更优选为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，再优选为1：1：1；所述肝素和/或低分子肝素与肝素酶的比例优选为1mg：(0.02～0.08)IU，更优选为1mg：(0.03～0.06)IU，再优选为1mg：(0.04～0.06)IU。
所述肝素酶优选以肝素酶溶液的形式添加，所述肝素酶溶液中肝素酶的浓度优选为0.2～0.6IU/ml，更优选为0.3～0.5IU/ml，再优选为0.4IU/ml；所述肝素酶溶液优选以磷酸二氢钾缓冲液溶解肝素酶得到；所述磷酸二氢钾缓冲液为本领域技术人员熟知的磷酸二氢钾缓冲液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为pH值为7的磷酸二氢钾缓冲液；所述磷酸二氢钾缓冲液优选按照以下步骤制备：将磷酸二氢钾、牛血清蛋白、水混合后加入氢氧化钾调节pH值至7，过滤后得到磷酸二氢钾缓冲液；所述磷酸二氢钾缓冲液中磷酸二氢钾的浓度优选为1～2mg/ml，更优选为1～1.8mg/ml，再优选为1.2～1.6mg/ml，最优选为1.36～1.4mg/ml；所述磷酸二氢钾缓冲液中牛血清蛋白的浓度优选为0.1～0.5mg/ml，更优选为0.15～0.3mg/ml，再优选为0.15～0.25mg/ml，最优选为0.2mg/ml；所述过滤优选采用0.1～0.65μm的滤膜，更优选采用0.22～0.45μm的滤膜，再优选采用0.22μm的滤膜。
将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；所述混合反应优选在醋酸钙缓冲液和/或醋酸钠缓冲液中进行；所述醋酸钙氢氧化钠缓冲液的pH值优选为7；在本发明中，所述醋酸钙缓冲液和/或醋酸钠缓冲液优选按照以下步骤制备：将醋酸钙和/或醋酸钠、牛血清蛋白、冰醋酸与水混合，然后加入氢氧化钠调节混合液的pH值为7，过滤后得到缓冲液；所述醋酸钙缓冲液中醋酸钙的浓度优选为0.2～0.5mg/ml，更优选为0.3～0.4mg/ml，再优选为0.32mg/ml；所述醋酸钠缓冲液中醋酸钠的浓度优选为0.2～0.5mg/ml，更优选为0.3～0.4mg/ml，再优选为0.32mg/ml；所述醋酸钙缓冲液和/或醋酸钠缓冲液中冰醋酸的添加量优选为每100ml中添加0.4～0.7ml，更优选为0.5～0.6ml，再优选为0.58ml；所述醋酸钙缓冲液和/或醋酸钠缓冲液中牛血清蛋白的浓度优选为0.05～0.2mg/ml，更优选为0.1～0.15mg/ml；所述过滤优选采用0.1～0.65μm的滤膜，更优选采用0.22～0.45μm的滤膜，再优选采用0.22μm的滤膜；所述混合反应的温度优选为20℃～30℃，更优选为25℃；所述混合反应的时间优选至少为48h。
将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图。
所述酶解产物进行反相离子对色谱检测时的进样体积优选为5～20μL，更优选为5～15μL，再优选为10μL。
在本发明中，所述反相离子色谱固定相优选为多孔硅胶，更优选为C18多孔硅胶或C8多孔硅胶；所述多孔硅胶的孔径优选为1.5～5μm，更优选为1.5～4μm，再优选为1.5～3μm；在本发明中，所述反相离子色谱的固定相最优选为BDS HYPERSIL C18、BDS HYPERSILC8、TSKgel Super-Octyl C8或TSKgel Super-Octyl C18；所述BDS HYPERSIL C18或BDSHYPERSIL C8的规格优选为4.6×100mm，内径3～5μm；所述TSKgel Super-Octyl C8或TSKgel Super-Octyl C18的规格优选为4.6×100mm，内径2μm。
所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐，优选为四丁基硫酸氢铵和/或四丁基溴化铵；所述流动相A中反相离子对的浓度优选为1～10mmol/L，更优选为3～8mmol/L，再优选为4～6mmol/L，最优选为5mmol/L；所述流动相A的有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙腈；所述流动相A中有机溶剂的体积浓度优选为5％～10％，更优选为7％～9％，再优选为8％～9％，最优选为8.5％；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B中的反相离子对为季铵盐，优选为四丁基硫酸氢铵和/或四丁基溴化铵；所述流动相B中反相离子对的浓度优选为1～10mmol/L，更优选为3～8mmol/L，再优选为4～6mmol/L，最优选为5mmol/L；所述流动相B的有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙腈；所述流动相B中有机溶剂的体积浓度优选为5％～10％，更优选为7％～9％，再优选为8％～9％，最优选为8.5％；所述碱金属氯盐为本领域技术人员熟知的碱金属氯盐即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氯化钠和/或氯化铯；所述流动相B中碱金属氯盐的浓度优选为200～500mmol/L，更优选为200～400mmol/L，再优选为250～350mmol/L，最优选为300mmol/L。
按照本发明，所述流动相的流速优选为0.8～1.2ml/min，更优选为0.9～1.1ml/min，再优选为1.0ml/min；固定相的温度优选为30℃～50℃，更优选为35℃～45℃，再优选为40℃。
按照本发明，所述反相离子对色谱采用梯度洗脱，以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序优选为：0～3min，90％～99％A；3～3.5min，40％～90％A；3.5～8.5min，20％～60％A；8.5～11.5min，5％～40％A；11.5～21.5min，5％～99％A；21.5min，90％～99％A；更优选为：0～3min，95％～99％A；3～3.5min，45％～85％A；3.5～8.5min，25％～55％A；8.5～11.5min，10％～35％A；11.5～21.5min，8％～99％A；21.5min，95％～99％A；再优选为：0～3min，97％～99％A；3～3.5min，80％～85％A；3.5～8.5min，45％～52％A；8.5～11.5min，20％～30％A；11.5～21.5min，10％～99％A；21.5min，97％～99％A；最优选为：
梯度洗脱后，记录HPLC谱图，优选在检测波长231～234nm记录HPLC谱图，最优选在检测波长232nm记录HPLC谱图。
更具体地，本发明可按照以下方法实现：
浓度为20mg/ml肝素和低分子肝素溶液中加入乙酸钙缓冲液和混合肝素酶I/II/III溶液，在25℃反应至少48小时，制得酶解产物。
酶解产物通过3μm BDS HYPERSIL C18多孔硅胶色谱法柱进行检测，从而达到二糖组分的分离。
本发明的检测方法其色谱特征如下：
HPLC系统：waters e2695-2489或安捷伦Agilent 1260
柱子：BDS HYPERSIL C18(4.6×100mm，内径3μm)
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 99％ | 1％ |
| 3 | 85％ | 15％ |
| 3.5 | 50％ | 50％ |
| 8.5 | 25％ | 75％ |
| 11.5 | 10％ | 90％ |
| 21.5 | 99％ | 1％ |
流速：1.0ml/min
进样体积：10μl
UV检测器：232nm
柱温：40℃。
本发明通过肝素酶将肝素和/或低分子肝素完全降解得到主要的肝素二糖组成和/或小片段如三糖、四糖单元，这些单独的组分通过反相离子对试剂结合反相色谱能被快速分离并定量分析，在很短的时间即可检测出肝素和/或低分子肝素中的二糖含量，并且该方法具有很好的耐久性和重复性，这些天然二糖组成的定性定量检测确定了仿制药与原研药肝素来源一致性，在低分子肝素一致性评价具有重要意义。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
仪器：
高效液相色谱仪(Waters e2695-2489),BSA224S电子天平(梅特勒)，低温循环水槽，FE20pH计(梅特勒)。
试剂：
肝素钠(东营天东制药有限公司)，依诺肝素钠(东营天东制药有限公司)，肝素酶I/II/III(Iduron)，乙酸钙，氢氧化钾，氢氧化钠，磷酸二氢钾，牛血清蛋白，纯化水，四丁基硫酸氢铵，乙腈，氯化钠。
试剂的配制：
流动相A：配制含3.3954g四丁基硫酸氢铵、170ml的乙腈的水溶液2L即5mmol/L四丁基硫酸氢铵、8.5％的乙腈水溶液。
流动相B：配制含3.3954g四丁基硫酸氢铵、170ml的乙腈、35.10g NaCl的水溶液2L即5mmol/L四丁基硫酸氢铵、8.5％的乙腈、300mmol/L NaCl的水溶液。
醋酸钙pH7.0的溶液：称取醋酸钙32mg和牛血清蛋白10mg于纯化水60mL中，加冰乙酸580μL，用2mol/L氢氧化钠调pH7.0，转移至100mL容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，用0.22μm滤膜过滤。
磷酸二氢钾pH7.0缓冲液：称取磷酸二氢钾68mg和牛血清蛋白10mg于纯化水30mL中，完全溶解后转移至50mL容量瓶中，用2mol/L氢氧化钾调pH7.0，用纯化水稀释至刻度，用0.22μm滤膜过滤。
肝素酶I溶液：使用磷酸二氢钾7.0缓冲液溶解肝素酶I，浓度0.4IU/mL，漩涡混合器混合，使用前储存在-20℃。
肝素酶II溶液：使用磷酸二氢钾7.0缓冲液溶解肝素酶II，浓度0.4IU/mL，漩涡混合器混合，使用前储存在-20℃。
肝素酶III溶液：使用磷酸二氢钾7.0缓冲液溶解肝素酶III，浓度0.4IU/mL，漩涡混合器混合，使用前储存在-20℃。
肝素酶I、II、III混合溶液：将肝素酶溶液I、II、III按1：1：1混合，漩涡混合器混匀。
供试品溶液：称取依诺肝素钠20mg，溶于纯化水1mL中，配制20mg/ml依诺肝素钠水溶液，漩涡混合器混合。
供试品降解溶液：取供试品溶液20μL，加入醋酸钙pH7.0的溶液70μL，再加入肝素酶I、II、III混合溶液100μL，漩涡混合器混合，在25℃水浴中放置至少48个小时。
色谱条件：
| 色谱柱 | BDS HYPERSIL C18(4.6x100mm，内径3μm) |
| 仪器 | Waters e2695 |
| 检测器 | 紫外检测器2489 |
| 柱温 | 40℃ |
| 流速 | 1ml/min |
| 进样体积 | 10μl |
| 波长 | 232nm |
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 99％ | 1％ |
| 3 | 85％ | 15％ |
| 3.5 | 50％ | 50％ |
| 8.5 | 25％ | 75％ |
| 11.5 | 10％ | 90％ |
| 21.5 | 99％ | 1％ |
图1为供试品肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图。
图2为供试品依诺肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图。
图3为采用同一型号不同批号的BDS HYPERSIL C18色谱柱的肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图，其中上面的色谱柱批号为10544056；下面的色谱柱批号为10540926。
图4为HPLC系统为沃特世Waters时肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图。
图5为HPLC系统为安捷伦Agilent时肝素钠酶解后的RPIP-HPLC谱图。
将肝素8个二糖标准品混合液采用实施例1中的色谱条件进行检测，得到肝素8个二糖标准品混合液6针叠加RPIP-HPLC谱图如图6和图7所示。
由图6和图7可知本发明提供的检测方法具有很好的重复性。
Claims (10)
1.一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法，其特征在于，包括：
S1)将肝素和/或低分子肝素溶液与肝素酶混合反应，得到酶解产物；所述肝素酶为肝素酶I、肝素酶II与肝素酶III的混合物或肝素酶II；
S2)将所述酶解产物利用反相离子对色谱进行检测，记录HPLC谱图；
所述反相离子对色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为包含反相离子对的有机溶剂与水的混合溶液；所述流动相B为包含反相离子对、碱金属氯盐的有机溶剂与水的混合溶液；所述反相离子对为季铵盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相离子对为四丁基硫酸氢铵和/或四丁基溴化铵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B中反相离子对的浓度各自独立地为1～10mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B中的有机溶剂各自独立地选自乙腈和/或甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B中有机溶剂的体积浓度为5％～10％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相离子对色谱的固定相选自多孔硅胶；所述多孔硅胶的孔径为1.5～5μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相离子对色谱的固定相选自BDSHYPERSIL C18、BDS HYPERSIL C8、TSKgel Super-Octyl C8或、TSKgel Super-Octyl C18。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相离子对色谱采用梯度洗脱；以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序为：0～3min，90％～99％A；3～3.5min，40％～90％A；3.5～8.5min，20％～60％A；8.5～11.5min，5％～40％A；11.5～21.5min，5％～99％A；21.5min，90％～99％A。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序为：
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱金属氯盐选自氯化钠和/或氯化铯；所述流动相B中碱金属氯盐的浓度为200～500mmol/L。
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|---|---|---|---|
| CN201810413400.3A Pending CN108318602A (zh) | 2018-05-03 | 2018-05-03 | 一种快速检测肝素和/或低分子肝素中肝素二糖含量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108318602A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050233453A1 (en) * | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Seikagaku Corporation | 6-O-sulfated N-acetylheparosan and hematopoietic stem cell growth auxiliary agent |
| CN102759596A (zh) * | 2012-07-09 | 2012-10-31 | 山东大学 | 一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN103454372A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 山东大学 | 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN104198635A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-10 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种应用快速分离蛋白纯化仪检测肝素钠中多硫酸软骨素的方法 |
-
2018
- 2018-05-03 CN CN201810413400.3A patent/CN108318602A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050233453A1 (en) * | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Seikagaku Corporation | 6-O-sulfated N-acetylheparosan and hematopoietic stem cell growth auxiliary agent |
| CN102759596A (zh) * | 2012-07-09 | 2012-10-31 | 山东大学 | 一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN103454372A (zh) * | 2013-09-10 | 2013-12-18 | 山东大学 | 一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法 |
| CN104198635A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-10 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种应用快速分离蛋白纯化仪检测肝素钠中多硫酸软骨素的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GALEOTTI, F 等: "Novel reverse-phase ion pair-high performance liquid chromatography separation of heparin, heparan sulfate and low molecular weight-heparins disaccharides and oligosaccharides", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| JONES, CJ 等: "Understanding the Effect of the Counterion on the Reverse-Phase Ion-Pair High-Performance Liquid Chromatography (RPIP-HPLC) Resolution of Heparin-Related Saccharide Anomers", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| KARAMANOS, NK 等: "Ion-pair high-performance liquid chromatography for determining disaccharide composition in heparin and heparan sulphate", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
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