KR101552591B1 - 당 사슬 조성 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당 사슬(sugar chain)의 조성을 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 당 사슬을 포함하는 시료를 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)를 이용하여 이동상이 칼럼을 통과하는 중에 이동상 저장소에 불활성 기체 주입하면서 단당류 및 시알산을 분리하고, 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR)을 첨가하여 검출 간섭 피크를 억제하여 분리된 시료를 펄스식 전기화학 검출기(pulsed amperometric detector: PAD)로 검출하여 분석한 결과, 본 발명의 사슬 조성의 분석하기 위한 HPAEC 분석을 위한 장치는 높은 선택성, 높은 감도 및 우수한 분석 재현성으로 단당류 및 시알산의 동시 분석이 가능할 뿐 아니라, 시간을 절약하고 간편하도록 하므로, 상기 분석 장치는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당 사슬 조성 분석 방법{Method for Analysis of Suger chain composition}
본 발명은 당 사슬 조성의 분석 방법에 관한 것으로, 구체적으로 당 사슬의 특성 분석의 핵심인 조성 분포 확인을 위하여, 단당류와 시알산을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 당단백질의약품 또는 단백체학의 당단백물질과 같이 분자생물학적 활성의 열쇠라 불리는 당사슬의 특성을 분석하기 위해 시료에 함유된 당 사슬의 성분당을 선택성, 효율성 및 우수한 재현성으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
당 사슬(sugar chain)은 분자생물학에 있어서 3번째의 사슬로 불리며, 단백질 등의 생체 내 고분자가 나타내는 생리 활성의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 이래, 다양한 당 사슬에 비밀로 숨긴 암호를 해독한다면 생물학에 새로운 전망이 열릴 것으로 기대되고 있다. 당 사슬이 생체 내 고분자의 생리 활성에 미치는 대표적인 예로 동일 단백질의 표면의 당 사슬 발현에 따라 암의 예후에 직접적인 영향을 미치는 것이 알려져 있으며, 이에 따라 최근 들어 ‘생물-유사(biosimilar)’의약품에 대한 관심이 높아짐과 동시에 당 사슬의 특성 분석에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재 당단백질 의약품(glycoprotein drug)은 의약품 시장의 약 70% 이상을 차지하며, 빠른 속도로 시장의 규모가 확대되는 추세를 나타낸다. 대표적인 당단백질 의약품으로는 40%가 당으로 구성된 당단백호르몬인 에리스로포이에틴(Erythropoietin)이 있으며, 이 밖에도 단클론항체 의약품(monoclonal antibody drug) 및 효소 치료제 등이 개발되고 있다. 상기 당단백질 의약품의 생산 내 체내 활성의 핵심이 되는 것이 바로 당 사슬이라 할 수 있다.
당 사슬 수식은 단백질에서만 일어나는 현상으로 제한되지 않으며, 세포막을 구성하는 당지질(glycolipid), 세포막 매질을 구성하는 프로테로글리칸(proteoglycan) 및, 올리고당(oligosaccharide) 또는 다당(polysaccharide)의 유리당류(free sugars) 등 다양한 존재 형태를 가지고 있으며, 이에 따라 기능의 형태 또한 다양하게 나타낸다. 현재까지 알려진 모든 생물은 세포에 다양한 당 사슬을 발현하고 있으며, 종 특이적으로 나타나기도 한다. 이러한 당 사슬 수식의 예를 도 1에 나타내었다(도 1).
단당류(monosaccharide)는 탄수화물의 기본 단위로, 일반적으로 Cn(H2O)n의 분자식을 가지는 일종의 폴리하이드록시 알데하이드(polyhydroxy aldehyde) 또는 폴리하이드록시 케톤(polyhydroxy ketone)의 입체이성질체(Stereoisomer)를 지칭한다. 단당류는 기본 골격을 중심으로 수많은 이성체(isomer)가 존재하며, 이를 에피머(epimer)라 한다. 도 2는 가장 일반적인 단당류인 D-포도당(D-glucose)를 기준으로 하는 다양한 종류의 천연 유래 주요 알도오스(aldose) 단당류 에피머를 나타낸다. 상기 에피머는 생체 내에서 각각의 역할이 다르므로, 시료 내 존재하는 단당류 에피머에 대한 분리 및 규명이 요구된다.
시알산(sialic acid)은 D-뉴라민산(D-neuraminic acid)으로도 불리우며, 글루코사민(glucosamine) 및 갈락토사민(galactosamine)과 같은 아미노당(aminosugar) 또는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine) 및 N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)과 같은 단당류와 함께 대표적인 다당체의 구성당으로 알려져 있다. 시알산은 당단백질의 생체 내 효능 및 제조상의 프로토콜에 의해 나타나는 미세한 변화에 대한 변수로 작용할 수 있으며, 이에 따라 당 사슬의 품질 평가에 중요한 역할을 한다. 대표적인 시알산인 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, NANA) 및 N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, NGNA)의 구조를 도 3에 나타내었다(도 3).
이와 같이, 다당체를 구성하는 다양한 단당류 및 시알산의 구성에 따라 당 사슬 수식의 적합성뿐만 아니라 재조합 당단백질의 안정성 및 안전성이 달라지므로, 상기 재조합 당단백질의 제조 및 평가 기준을 마련하기 위한 당 사슬 조성의 분석법에 대한 정량법이 요구되었다.
그러나, 단당류는 단순한 구조와 함께 적은 발색단을 나타내며, 에피머 형태의 다양한 이성질체를 가지므로 일반적인 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC) 분석을 통한 분리 및 정량에 한계를 나타내는 단점을 가진다. 이러한 단점을 극복하기 위한 방법으로는 1) 유도체화(derivatization)하지 않고 굴절률(Refractive Detector) 또는 광산란 검출기(Light Scattering Detector)를 통한 분석; 및 2) 형광유도체화(fluorogenic derivatization)하여 흡광도 검출기(Absorbance Detector, 자외가시부 또는 형광)를 통한 분석이 대표적이다.
상기 분석 방법은 직접 정량이 가능하다는 장점이 있으나, 에피머 분리가 어렵고, 감도가 낮으며, 유도체화 과정의 수율 확인이 어렵고 복잡하다는 등의 단점을 가지고 있어 새로운 정량법에 대한 개발이 요구되고 있다.
펄스식 전기화학 검출기(pulsed amperometric detector: PAD)는 전기화학적 검출기의 일종으로서 일정 전위를 가해 주었을 때, 금 전극에서 당과 같은 분석 물질의 산화에 의한 전류의 변화를 신호(signal)로 나타내는 검출기로, 종래에 고성능 음이온교환 크로마토그래피법(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)과 결합되어 주로 식품이나 생체 시료에 함유된 당 및 아미노산을 검출하는 용도로 사용되어 왔다. 단당류는 일반적으로 11 내지 13 이상의 pKa 값을 나타내어 높은 pH 조건 하에서 음이온으로 해리하는 성질을 가지므로, 이를 이용하여 음이온교환 칼럼 내에서 에피머의 분리와 같은 매우 미세한 분리까지 가능하며, 이를 PAD 검출기로 검출하였을 때, 당 및 아미노산을 피코몰 수준의 낮은 감도까지 검출할 수 있다.
현재까지 단당류 또는 시알산의 분석을 위한 HPAEC-PAD 조건이 다양하게 알려져 있으며(Tommaso R. I. et al ., Fresenius J Anal Chem 368 (2000) 739-758; David W. Templeton et al ., Journal of Chromatography A 1270 (2012) 225-234), 이를 실제 당 사슬의 정량에 이용하고 있다. 그러나 단순당류에 비해 약산성인 시알산은 음이온교환 칼럼 내에서 머무름 시간(retention time)의 차이를 나타내므로, 단순당류 및 시알산의 분석을 위하여 다른 조건 하에서 구별 분석(divided analysis)이 일반적으로 수행되었다. 따라서, 단당류 및 시알산의 분석에 시간 및 노력이 소비되므로, 분석 시간 및 노력의 감소는 물론, 시료 처리 조건에 따른 각 성분의 변화 추적 및 전 성분의 조성비를 용이하게 구할 수 있도록 하는 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 조건에 대한 개발이 요구되고 있으나, 매우 다른 머무름을 가지는 두 조건을 동시에 정량하기 위해서는 칼럼의 선택, 이동상 조성비의 변화 및 PAD 상에서의 검출 간섭 피크의 효과적인 제어 등의 기술적 난제를 가진다.
본 발명의 목적은 당단백질 또는 그의 가공물에 함유된 당 사슬의 성분당에 대한 높은 선택성, 고감도 및 우수한 재현성으로 상기 성분당을 분리 및 분석하는 방법을 제공하는 것이다. 이를 위하여 본 발명자들은 효과적인 당류의 분석방법을 개발하기 위해 연구 검토한 결과, 단당, 이당 및 아미노당 등의 극성물질의 분석에 특이적으로 개발된 시판 음이온교환 칼럼 중 가장 효과적인 두 종류의 칼럼을 선정하여 목적하는 성분들의 최적의 분리효율을 확보할 수 있는 기울기용리 조건을 선정함으로써, 선택적이면서도 고감도의 분석을 확인하였으며, 특히 이때 발생하는 시스템 간섭 피크의 효과적 억제가 가능한 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR) 주입을 적용하여 재현성 있는 분석법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
i) 당 사슬을 포함하는 시료를 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)를 이용하여 단당류 및 시알산을 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 분리 과정 중 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR)을 첨가하여 검출 간섭 피크를 억제하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 분리된 시료를 펄스식 전기화학 검출기(pulsed amperometric detector: PAD)로 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 당 사슬(sugar chain)의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
i) 당 사슬을 포함하는 시료를 시료 주입구에 주입하는 단계;
ii) 이동상이 칼럼을 통과하는 중에 이동상 저장소에 불활성 기체를 공급하는 단계;
iii) 칼럼을 통과한 이동상을 T자형 혼합기에서 칼럼후 시액을 공급자에 혼합시키는 단계; 및
iv) 분리된 시료를 PAD를 통해 검출 신호를 기록하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 시료 내 당 사슬(sugar chain)의 단당류 및 시알산을 동시에 분석하기 위한 고성능 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC) 분석 방법은 높은 선택성, 높은 감도 및 우수한 분석 재현성으로 단당류 및 시알산의 동시 분석이 가능할 뿐 아니라, 시간을 절약하고 간편하므로, 상기 분석 방법은 1) 당사슬의 성분당 조성 분석을 위한 가수분해 당단백시료의 단당류 및 시알산의 정량, 및 조성비 분석을 통한 재조합 당단백질 제조품의 품질 파악; 2) 재조합 단백질 의약품 내 단당류 및 시알산의 조성을 동시 확인하는 생체 내 흡수 및 활성 등의 모니터링; 3) 식품 및 건강보조식품 내의 다당체 및 당지질 등의 당사슬 성분의 품질 확인 및 성분 정량; 및 4) 종 특이적 당류의 확인을 통한 가공품의 원료에 대한 종별 파악에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 종에 따른 대표적인 당 사슬의 수식을 나타낸다.
도 2는 D-포도당(glucose)의 에피머(epimer)를 나타낸다.
도 3은 대표적인 시알산(sialic acid)인 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, NANA) 및 N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, NGNA)의 구조를 나타낸다.
도 4는 단당류(monosaccharide) 및 시알산의 분리 분석을 위한 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC) 분석을 나타낸다;
도 4a는 HPAEC 분석을 통한 단당류의 분석을 나타내며; 및
도 4b는 HPAEC 분석을 통한 시알산의 분석을 나타낸다.
도 5는 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 HPAEC 분석을 나타낸다.
도 6은 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR)의 도입을 통한 단당류 분석의 기저선 안정화 효과 확인을 위한 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 7은 칼럼후 시액의 도입을 통한 단당류 분석의 기저선(base line) 안정 효과 확인을 나타낸다.
도 8은 칼럼후 시액의 도입을 통한 단당류 및 시알산의 동시 분석의 기저선 안정 효과 확인을 나타낸다.
도 9는 단당류 및 시알산의 동시 분석의 재현성 확인을 위한 반복 HPAEC 분석을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
i) 당 사슬을 포함하는 시료를 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)를 이용하여 단당류 및 시알산을 분리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 분리 과정 중 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR)을 첨가하여 검출 간섭 피크를 억제하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 분리된 시료를 펄스식 전기화학 검출기(pulsed amperometric detector: PAD)로 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 당 사슬(sugar chain)의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법을 제공한다.
상기 시료는 당 표준품 또는 유리된 당을 포함하는 당 표준품 또는 유리된 당을 포함하는 식품, 또는 의약품 등의 가공물일 수 있으며, 상기 가공물은 당사슬을 당업계에 공지된 방법으로 가공하여 글리코시드 결합(glycoside bond)를 제거한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 시료는 단당류(monosacchraide) 또는 시알산(sialic acid) 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 단당류는 포도당(glucose), 리보오스(ribose), 푸코오스(fucose, Fuc), 갈락토사민(Galactosamin, GalN), 글루코사민(Glucosamin, GlcN), 갈락토오스(Galatose, Gal), 만노오스(Mannose, Man), 자일로오스(xylose) 및 프럭토오스(Fructose, Fruc) 등 당업계에 단당류로서 알려진 모든 당을 사용할 수 있으며, 구체적으로 푸코오스(fucose, Fuc), 갈락토사민(Galactosamin, GalN), 글루코사민(Glucosamin, GlcN), 갈락토오스(Galatose, Gal), 만노오스(Mannose, Man) 및 프럭토오스(Fructose, Fruc)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 시알산은 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, NANA) 또는 N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, NGNA) 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 i)의 HPAEC는 칼럼은 음이온교환 칼럼을 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수크레비드II(SUCREBEAD II, shiseido 사, 일본), 카르보팩 PA1 칼럼(Carbopac PA1 column) 및 카르보팩 PA10 칼럼(Carbopac PA10 column)과 같이 당업계에서 통상적으로 당을 분석하기 위하여 사용되는 것으로 공지된 모든 음이온교환 칼럼인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 카르보팩 PA1 칼럼(Carbopac PA1 column) 및 카르보팩 PA10 칼럼(Carbopac PA10 column)이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 음이온교환 칼럼의 선택에 있어서, 카르보팩 PA1 칼럼과 유사한 용량(capacity)를 나타내는 모든 음이온교환 칼럼을 사용할 수 있다. 본 발명의 음이온교환 칼럼은 높은 물질 이동 효율(mass transfer rate)을 나타내므로, 칼럼 내 머무름(retention) 정도가 적은 푸코오스 및 칼럼 내 머무름 정도가 큰 약산성의 N-아세틸뉴라민산과 같은 유사한 당 선택성을 나타내는 물질을 동시에 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 기울기 용리 후 재평형 시간을 단축할 수 있어 분석 시간 감소 효과를 나타내므로 기존의 단당류 및 시알산 구별 분석 방법에 비하여 더욱 효과적이다.
상기 단계 i)의 HPAEC는 분석 이동상으로 수산화나트륨(NaOH), 초산나트륨(NaOAc) 및 탈이온수를 이용하는 것이 바람직하고, 상기 분석 이동상의 용매 조건으로 100 mM 수산화나트륨용액(용매 A), 100 mM 초산나트륨용액(용매 B) 및 탈이온수(용매 C)의 세 가지 용매를 0 내지 9 분간 A:B:C (20:0:80)으로 등용매성 용리; 9 내지 10 분간 A:B:C (20:40:40)으로 기울기 용리; 10 내지 20 분간 A:B:C (20:80:0)으로 기울기 용리; 20 내지 25 분간 A:B:C (20:80:0)으로 등용매성 용리; 25 내지 30 분간 A:B:C (0:0:100)으로 분석 후 칼럼세척; 및 30 내지 45분간 A:B:C (20:0:80)로 용리하면서 칼럼을 초기 용매 조건으로 평형화하는 기울기 용리 조건을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 이동상은 HPAEC 분석을 수행하기 직전에 신선하게 조제하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 이동상의 제조에서 흡습성이 강한 이동상의 성질을 제어하기 위해, 혼합 및 탈기 과정 중에 강한 교반이나 가온을 삼가하는 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 탈이온수를 멤브레인 필터(membrane filter)를 이용해 감압여과하여 필요량을 이동상 용기에 옮겨 담은 후, 최종 목적 농도가 되도록 수산화나트륨 및 초산나트륨 원액을 첨가하여, 교반하지 않은 상태에서 초음파처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 i)의 HPAEC는 이동상 저장소에 지속적으로 불활성 기체를 공급하는 것이 바람직하다. 상기 불활성 기체는 헬륨(He), 네온(Ne), 아르곤(Ar), 크립톤(Kr), 제논(Xe) 및 라돈(Rn)과 같이 당업계에 불활성 기체로 알려진 모든 기체를 사용할 수 있으며, 구체적으로 헬륨, 네온 및 아르곤이 바람직하고, 더욱 구체적으로 헬륨인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 헬륨은 이동상 저장소 내에 30 내지 100 kPa의 압력으로 주입되는 것이 바람직하며, 구체적으로 35 내지 60 kPa의 압력으로 주입되는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 40 kPa의 압력으로 주입되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 30 kPa 미만의 압력에서는 공기 중의 이산화탄소가 이동상에 용해되어 상기 이동상의 이온 농도가 변화하게 되므로 재현성이 감소하여 분석의 신뢰성을 잃게 되므로 효과적이지 않다.
상기 단계 ii)에서 단계 i)의 HPAEC를 통과한 이동상을 칼럼후 시액으로서의 염기성 용액과 혼합하는 것이 바람직하며, 구체적으로 상기 염기성 용액은 수산화나트륨 수용액인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 단당류 및 시알산의 동시 분석을 수행하기 위한 효과적인 칼럼 및 용매 조건을 확인하기 위해서, 6 종류의 단순 단당류 및 2 종류의 시알산을 혼합하여 단당류 및 시알산의 구별 분석 및 동시 분석을 각각 수행한 결과(표 1 내지 표 4 참조), 단당류 및 시알산의 구별 분석 방법에 비하여 본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법에서 안정적인 기저선(base line)을 유지하면서 기저선 수준에서 단당류 및 시알산의 분리가 동시에 가능함과 함께, 용매 조제 및 칼럼 안정화 시간을 절약할 수 있으므로 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법이 효과적인 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 HPAEC 분석에서 분석의 효율성을 유지하면서 기저선을 보다 안정화하기 위해서, 분석된 시료가 검출기의 전극에 다다르기 전 산소의 영향을 최소화할 수 있는 칼럼후 시액(post-coulmmn reagent, PCR)으로 200 mM 수산화나트륨(NaOH)을 주입하여 HPAEC를 수행한 결과, 안정화된 기저선 및 이에 따른 향상된 감도 효과로 단당류 및 시알산이 동시에 분석하는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 대한 분석 재현성을 확보하기 위해, 이동상인 NaOH의 흡습성으로 인해 용액 내로 CO2가 용해되는 것을 억제하기 위한 불활성 기체인 헬륨(He)을 이동상 저장소에 공급하여 HPAEC 분석을 약 68 시간 동안 50 회 반복하여 수행한 결과, 최적 용매 조건의 HPAEC 분석에서 세척 및 재평형에 소요되는 시간이 감소됨과 동시에 분석 재현성이 유의적으로 유지되는 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 대한 검출 한계를 확인하기 위해, 단당류 및 시알산을 다양한 농도 범위에서 HPLC 분석하여 직선성 및 검출 감도를 확인한 결과, r2 값을 0.9999 이상 나타내어 유의적인 직선성 및 분석 감도를 나타내는 범위를 확인하였으며, 단당류의 경우 1 내지 3 nmol/g의 범위에서 검출 한계를 나타내었고, 시알산의 경우 30 nmol/g의 범위에서 검출 한계를 나타내는 것을 확인하였다(표 5 참조).
따라서, 본 발명의 당 사슬 조성의 분석하기 위한 HPAEC 분석 방법은 높은 선택성, 높은 감도 및 우수한 분석 재현성으로 단당류 및 시알산의 동시 분석이 가능할 뿐 아니라, 시간을 절약하고 간편하므로, 상기 분석 방법은 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 HPAEC-PAD에 있어서,
i) 시료 주입구;
ii) 고정상으로 카르보팩 PA1 칼럼;
iii) 이동상으로 수산화나트륨 수용액, 초산나트륨 수용액 및 탈 이온수;
iv) 불활성 기체를 공급할 수 있는 이동상 저장소;
v) 염기성 용액을 공급할 수 있는 T자형 혼합기(T-mixer); 및
vi) 펄스식 전기화학 검출기(PAD)를 포함하는, 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 장치를 제공한다.
본 발명의 당 사슬 조성의 분석하기 위한 HPAEC 분석을 위한 장치는 높은 선택성, 높은 감도 및 우수한 분석 재현성으로 단당류 및 시알산의 동시 분석이 가능할 뿐 아니라, 시간을 절약하고 간편하도록 하므로, 상기 분석 장치는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은
i) 당 사슬을 포함하는 시료를 시료 주입구에 주입하는 단계;
ii) 이동상이 칼럼을 통과하는 중에 이동상 저장소에 불활성 기체를 공급하는 단계;
iii) 칼럼을 통과한 이동상을 T자형 혼합기에서 칼럼후 시액을 공급자에 혼합시키는 단계; 및
iv) 분리된 시료를 PAD를 통해 검출 신호를 기록하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 당 사슬 조성의 분석하기 위한 HPAEC 분석 방법은 높은 선택성, 높은 감도 및 우수한 분석 재현성으로 단당류 및 시알산의 동시 분석이 가능할 뿐 아니라, 시간을 절약하고 간편하므로, 상기 분석 방법은 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 단당류( monosaccharide ) 및 시알산( sialic acid )의 동시 분석을 위한 칼럼 및 용매 조건의 확인
<1-1> 단당류 및 시알산의 분리 분석
단당류 및 시알산의 효과적인 분석 조건을 확인하기 위해서, 6 종류의 단순 단당류 및 2 종류의 시알산을 혼합하여 일반적으로 당 사슬 성분당 조성의 분석을 위해 사용되는 조건 하에서 고성능 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)를 통한 분리 분석을 수행하였다.
구체적으로, 하기 [표 1]의 단당류 및 시알산 표준품 분말(시그마 알드리치 사, 미국) 각각 20 ㎎을 탈이온수 10 ㎖에 첨가하고, 볼텍스 혼합법(vortex mixing)으로 교반하여 단당류 분말을 탈이온수에 완전히 용해하여 표준품 원액을 제조한 후, 이를 탈이온수에 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 및 40 μ㏖/㎏의 농도로 희석하여 표준 시료를 제조하였다. 그런 다음, 단당류 및 시알산의 농도가 동일한 상기 표준 시료를 혼합하여 하나의 시료를 제조하고, 4차 기울기용리 펌프(quaternary gradient pump), 펄스식 전기화학검출기(pulsed amperometry detector, PAD), 오븐(oven)으로 이루어지며 유로 전체가 폴리에테르 에테르 케톤(polyether ether ketone; PEEK)로 구성되어 BioLC로 불리는 ICS-5000 시리즈(ICS-5000 series; 다이오넥스 사, 미국)에 상기 시료 2 ㎕를 주입하여 HPAEC 분석을 수행하였다. 분석 수행을 위한 칼럼으로 460 ㎚ 마이크로비드 이작용성 사차 암모늄이온(MicroBead difunctional quaternary ammonium ion)이 5% 공유결합(crosslinked)으로 포함된 55% 디비닐벤젠(divinylbenzene) 공유결합 에틸비닐벤젠(ethylvinylbenzene) 충진된 이온교환 칼럼인 카르보팩 PA10 칼럼(Carbopac PA10 column; 다이오넥스 사, 미국)을 사용하였고, 칼럼의 온도를 30℃로 유지하여, 하기 [표 2]의 용매 조건에서 유속 0.5 ㎖/분으로 분리하여 HPAEC 분석하였다. 분석 후, 상기 분리한 시료를 하기 [표 3]의 전위 파장을 나타내는 펄스식 전기화학 검출기로 검출하여, 크로멜레온7 프로그램(Chromeleon7 program; 다이오넥스 사, 미국)을 통해 자료를 수집하여 분석하였다.
본 발명의 분석에 사용된 단당류 및 시알산
종류 명칭


단당류
 푸코오스 fucose, Fuc
글루코사민 glucosamine, GlcN
갈락토사민 galactosamine. GalN
갈락토오스 galactose, Gal
만노오스 mannose, Man
프럭토오스 fructose, Fruc
시알산
 N-아세틸뉴라민산 N-acetylneuraminic acid, NANA
N-글리코릴뉴라민산 N-glycolylneuraminic acid, NGNA
단당류 및 시알산의 분리 분석을 위한 용매 조건
목적
물질		 용매 조건 용리 시간
이동상 용매* 용리 조건

단당류
 18 mM 수산화나트륨용액(NaOH) 등용매 용리(isocratic elution) 18 분
48 분
200 mM NaOH 칼럼 세정(column cleaning) 15 분
18 mM NaOH 재-평형(Re-equilibration) 15 분


시알산

 100 mM NaOH으로부터
100 mM NaOH 및 80 mM NaOAca까지		 기울기 용리(Gradient elution) 28 분

43 분
100 mM NaOH 및 80 mM NaOAc으로부터
100 mM NaOH까지		 구배 용리 5 분
100 mM NaOH 재-평형 10 분
a NaOAc: 초산 나트륨 용액(sodium acetate)
* 이동상 용매는 분석 수행 전에 매일 진공 여과기(Vacuum Filter)로 탈기하여 사용하는 것을 원칙으로 하였다.
단당류 및 시알산을 분리하기 위한 HPAEC 분석에 대한 검출기의 전위 파장
명칭 전위 파장 시간
E1 -0.20 V 0.00 내지 0.04 초
E2 -0.05 V 0.05 내지 0.21 초
E3 +0.22 V 0.22 내지 0.46 초
E4 -0.05 V 0.47 내지 0.56 초
E5 -0.05 V 0.57 내지 0.58 초
E6 +0.60 V 0.59 초
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 단당류 및 시알산을 각각 분석하였으며, 총 분석 시간으로 48 분이 소요되는 것을 확인하였다(도 4a 및 도 4b).
<1-2> 단당류 및 시알산의 동시 분석
단당류 및 시알산을 동시에 분석하기 위한 조건을 확인하기 위해서, 6 종류의 단순 단당류 및 2 종류의 시알산을 혼합하여 동시 분석을 위한 HPAEC 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 시료를 제조하고, 동일한 ICS-5000 시리즈 장치에 시료 2 ㎕를 주입하여 HPAEC 분석을 수행하였다. 분석 수행을 위한 칼럼으로 500 ㎚ 마이크로비드 사차 암모늄 기능성 라텍스(MicroBead quaternary ammonium fuctionalized latex)가 5% 공유결합으로 포함된 2% 디비닐벤젠 공유결합 폴리스티렌(polystyrene) 충진된 이온교환 칼럼인 카르보팩 PA1 칼럼(Carbopac PA1 column, 250 ㎜×2.0 ㎜, 10 ㎛; 다이오넥스 사, 미국) 및 카르보팩 PA1 가드 칼럼(Carbopac PA1 guard column; 다이오넥스 사, 미국)을 사용하였고, 칼럼의 온도를 30℃로 유지하여, 하기 [표 4]의 용매 조건에서 유속 0.5 ㎖/분으로 분리하여 HPAEC 분석하였다. 분석 후, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 수행하여 시료를 검출 및 분석하였다.
단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 용매 조건
용매 비율*(%, v/v/v) 용리 조건
 용리 시간
용매 Aa 용매 Bb 용매 Cc
20 0 80 등용매성 용리 0 내지 9 분


45 분
20 40 40 기울기 용리 9 내지 10 분
20 80 0 기울기 용리 10 내지 20 분
20 80 0 등용매성 용리 20 내지 25 분
0 0 100 칼럼 세척 25 내지 30 분
20 0 80 재-평형 30 내지 45 분
a 100 mM 수산화나트륨 용액(NaOH)
b 100 mM 초산나트륨 용액(NaOAc)
c 탈이온수
* 이동상 용매는 분석 수행 전에 매일 진공 여과기(Vacuum Filter)로 탈기하여 사용하는 것을 원칙으로 하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 6 종류의 단순 단당류 및 2 종류의 시알산을 30 분 이내에 동시 분석하였고, 총 분석 시간으로 칼럼 세정 및 재평형 시간을 포함하여 45 분이 소요되는 것을 확인하였다(도 5). 이는 안정적인 기저선(base line)을 유지하면서 기저선 수준에서 단당류 및 시알산의 분리가 가능함과 동시에, 용매 조제 및 칼럼 안정화 시간 등을 고려하였을 때, 단당류 및 시알산의 분리 분석에 비하여 현저한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
< 실시예 2> 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 기저선 안정화 조건 확인
<2-1> 칼럼후 시액( post - column reagent , PCR )의 도입을 통한 단당류 분석의 기저선 안정화 효과 확인
단당류의 분석을 위한 HPAEC 분석에서 분석의 효율성을 유지하면서 기저선을 보다 안정화하기 위해서, 분석된 시료가 검출기의 전극에 다다르기 전 산소의 영향을 최소화할 수 있는 칼럼후 시액으로 고농도의 염기성 시액을 주입하여, 도 6에서 나타난 바와 같이 HPAEC를 수행하였다(도 6).
구체적으로, 상기 [표 1]의 단당류 분말 각각 20 ㎎을 탈이온수 10 ㎖에 첨가하고, 볼텍스 혼합법으로 교반하여 단당류 분말을 탈이온수에 완전히 용해하여 표준품 원액을 제조한 후, 이를 탈이온수에 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 및 40 μ㏖/㎏의 농도로 희석하여 표준 시료를 제조하였다. 그런 다음, 단당류 및 시알산의 농도가 동일한 상기 표준 시료를 혼합하여 하나의 시료를 제조하고, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 HPAEC 분석을 수행하였다. 분석 후, 200 mM 수산화나트륨용액(NaOH)을 0.5 ㎖/분의 유속으로 T자형 혼합기(T-mixer)에 공급하고, 상기 분리한 시료를 상기 [표 3]의 전위 파장을 나타내는 펄스식 전기화학 검출기로 검출하여, 크로멜레온7 프로그램을 통해 자료를 수집하여 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 칼럼후 시액의 도입을 통해 분리도의 손실은 최소화되면서 효과적으로 산소 피크의 간섭이 사라져 기저선이 안정화되었고, 이에 따라 산소 피크의 신호크기만큼 분석 대상 물질들의 피크 신호가 향상되어 분석의 감도가 향상되는 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 7).
<2-2> 칼럼후 시액( post - column reagent , PCR )의 도입을 통한 단당류 및 시알산의 동시 분석의 기저선 안정 효과 확인
본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석을 위한 HPAEC 분석에서 분석의 효율성을 유지하면서 기저선을 보다 안정화하기 위해서, 칼럼후 시액으로 고농도의 염기성 시액을 주입하여 HPAEC를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 시료를 제조하여 동일한 조건에서 HPAEC 분석을 수행한 다음, 상기 실시예 <2-1>와 동일한 방법을 수행하여 시료를 검출 및 분석하였다.
그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 단당류 및 시알산의 동시 분석의 최적화된 조건에서 안정화된 기저선 및 이에 따른 향상된 감도 효과를 확인하였다(도 8).
< 실시예 3> 단당류 및 시알산의 동시 분석의 재현성 확인
본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 대한 분석 재현성을 확보하기 위해, 이동상인 NaOH의 흡습성으로 인해 용액 내로 CO2가 용해되는 것을 억제하기 위한 불활성 기체를 이동상 저장소에 공급하여 HPAEC 분석을 반복 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 시료를 제조하고, 동일한 ICS-5000 시리즈 장치의 이동상 저장소에 40 kPa의 헬륨(He) 가스를 공급하여 상기 실시예 <1-2>와 동일한 조건에서 HPAEC 분석을 약 68 시간 동안 50 회 반복하여 반복 분석하였다. 분석 후, 상기 실시예 <2-1>와 동일한 방법을 수행하여 시료를 검출 및 분석하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 최적 용매 조건의 HPAEC 분석에서 세척 및 재평형에 소요되는 시간이 감소됨과 동시에 분석 재현성이 유의적으로 유지되는 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 9).
< 실시예 4> 단당류 및 시알산의 동시 분석의 검출 한계 확인
본 발명의 단당류 및 시알산의 동시 분석에 대한 검출 한계를 확인하기 위해, 단당류 및 시알산을 다양한 농도 범위에서 HPAEC 분석하여 직선성 및 검출 감도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 [표 1]의 단당류 및 시알산 표준품 분말 각각 20 ㎎을 탈이온수 10 ㎖에 첨가하고, 볼텍스 혼합법으로 교반하여 단당류 분말을 탈이온수에 완전히 용해하여 표준품 원액을 제조한 후, 이를 탈이온수에 0.1 내지 100 μ㏖/㎏의 농도로 단계별 희석하여 표준 시료를 제조하여 상기 <실시예 3>의 조건에서 HPAEC 분석을 수행하고, 상기 실시예 <2-1>와 동일한 방법을 수행하여 시료를 검출 및 분석한 다음, 단당류 및 시알산의 농도에 따른 HPAEC 분석의 검출 신호(signal)의 직선성을 분석하였다. 또한, 상기 신호의 크기를 비교하여, 신호 대 잡음(signal to noise ratio, SNR)을 계산하여 3이 되는 농도를 검출 한계로 정하고, 10이 되는 농도를 정량 한계로 설정하였다.
그 결과 하기 [표 5]에서 나타난 바와 같이 r2 값을 0.9999 이상 나타내어 유의적인 직선성 및 분석 감도를 나타내는 범위를 확인하였으며, 단당류의 경우 1 내지 3 nmol/g의 범위에서 검출 한계를 나타내었고, 시알산의 경우 30 nmol/g의 범위에서 검출 한계를 나타내는 것을 확인하였다(표 5).
단당류 및 시알산의 동시 분석의 검출 한계 설정을 위한 직선성 및 분석 감도의 확인
물질명 농도 범위
(μmol/㎏)		 기울기
(slope)		 절편a r2 검출 한계b
(nmol/㎏)
Fuc 0.01 내지 100 0.4213 -0.0004 1.0000 1
GalN 0.01 내지 101 1.0421 -0.0020 1.0000 1
GlcN 0.01 내지 102 0.9070 0.0085 0.9999 1
Gal 0.01 내지 103 0.6430 -0.0165 1.0000 1
Man 0.03 내지 100 0.5428 0.0079 0.9999 3
NANA 0.5 내지 100 1.8849 0.1077 0.9997 30
a HPAEC 분석 후 직선성 분석에 대한 y 절편값을 나타낸다.
b 검출 한계(Limit of detection, LOD)

Claims (13)

  1. i) 당 사슬을 포함하는 시료를 음이온교환 크로마토그래피(high-performance anion-exchange chromatography: HPAEC)에서 분석 이동상의 용매 조건으로 100 mM 수산화나트륨용액 (용매 A), 100 mM 초산나트륨용액 (용매 B) 및 탈이온수(용매 C)의 세 가지 용매를 0 내지 9 분간 A:B:C (20:0:80)으로 등용매성 용리; 9 내지 10 분간 A:B:C (20:40:40)으로 기울기 용리; 10 내지 20 분간 A:B:C (20:80:0)으로 기울기 용리; 20 내지 25 분간 A:B:C (20:80:0)으로 등용매성 용리; 25 내지 30 분간 A:B:C (0:0:100)으로 분석 후 칼럼세척; 및 30 내지 45분간 A:B:C (20:0:80)로 용리하면서 칼럼을 초기 용매 조건으로 평형화하는 기울기 용리 조건을 이용하여 단당류 및 시알산을 분리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 분리 과정 중 칼럼후 시액(post-column reagent, PCR)을 첨가하여 검출 간섭 피크를 억제하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 분리된 시료를 펄스식 전기화학 검출기(pulsed amperometric detector: PAD)로 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 당 사슬(sugar chain)의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 당 사슬을 포함하는 시료는 당 표준품 또는 유리된 당을 포함하는 식품, 또는 의약품인 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 단당류는 푸코오스(fucose, Fuc), 갈락토사민(Galactosamin, GalN), 글루코사민(Glucosamin, GlcN), 갈락토오스(Galatose, Gal), 만노오스(Mannose, Man) 및 프럭토오스(Fructose, Fruc)로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 시알산은 N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, NANA) 또는 N-글리코릴뉴라민산(N-glycolylneuraminic acid, NGNA) 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 HPACE는 카르보팩 PA1 칼럼(Carbopac PA1 column)을 이용하는 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 HPAEC는 이동상 저장소에 지속적으로 불활성 기체를 공급하는 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 불활성 기체는 헬륨(He)인 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 단계 i)의 HPAEC를 통과한 이동상을 칼럼후 시액으로서의 염기성 용액과 혼합하는 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨 수용액인 것을 특징으로 하는 시료 내 당 사슬의 단당류 및 시알산의 동시 분석 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
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