CN108548875B - 一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法。利用9‑芴甲氧羰酰氯(Fmoc‑Cl)与壳二糖和壳三糖中的氨基反应结合，增强糖类的紫外响应。借助高效液相色谱分离衍生化产物，并用紫外检测器于250‑280nm波长下检测，通过外标法计算壳二糖和壳三糖的含量。本方法具有操作简单、检测灵敏的特点，适用于壳寡糖中微量壳二糖和壳三糖含量的检测。

Description

一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法。

背景技术

壳寡糖是以氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖为糖单元，聚合度(DP,degrees ofpolymerization)小于20的壳聚糖。壳寡糖的制备是通过物理降解(超声处理)、化学降解(酸水解)、酶解法，对壳聚糖和甲壳素进行降解从而得到不同分子量的壳寡糖。聚合度越低的壳寡糖生理活性越好，一般聚合度2-12的壳寡糖有良好的生物学活性，如抗菌、抗氧化作用。从壳聚糖和甲壳素制备得到的壳寡糖通常都是不同聚合度的混合物，因此，壳寡糖产品质量的评价指标，包括产品的平均分子量和各聚合度寡糖的含量。通过该指标的检测，控制产品中有生理活性的壳寡糖(比如壳二糖、壳三糖)的含量。目前已有多种分析方法测定壳寡糖的聚合度，比如：电泳、离子交换色谱、薄层色谱法、高效液相色谱-示差折光检测法等，但缺乏直接定量测定壳寡糖样品中壳二糖、壳三糖(氨基葡萄糖构成的聚合度分别为2、3的寡糖)的方法。壳寡糖含量的检测方法一般采用化学试剂法，原理是将高分子聚糖在强酸的条件下分解成单糖(N-乙酰氨基葡萄糖)，然后通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定还原糖的方法测定单糖含量，从而计算出高分子聚糖的含量；该方法检测成本低、易操作，但检测结果无法确定聚合度在2—10个之间的壳寡糖的含量。高效液相色谱法是有效的分离壳寡糖混合样品的方法，壳寡糖中的乙酰基团在210nm下有吸收，但在紫外检测器中低波长检测易受流动相紫外吸收的干扰，不适合分析检测微量样品。除了紫外检测器，通用型的示差折光检测器也被应用于壳寡糖的检测，但灵敏度较低，且不适合应用梯度洗脱分离样品。此外，壳寡糖中的多羟基使其亲水性高，在常用的碳十八键合硅胶柱上保留行为较差，高效液相色谱分析一般采用氨基柱分离，但是氨基柱的使用寿命却不如碳十八键合硅胶柱。这些因素都限制了壳寡糖中壳二糖、壳三糖的检测。

发明内容

为了解决壳寡糖中壳二糖、壳三糖在定量测定时紫外响应不高，灵敏度低的问题，本发明提供了一种简单、快速、灵敏的9-芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)柱前衍生化-高效液相色谱方法，应用于壳寡糖中壳二糖、壳三糖的定量测定。

本发明具体技术方案如下：

一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法，通过9-芴甲氧羰酰氯与壳寡糖结构中的伯氨基发生衍生化反应，在壳寡糖结构中引入9-芴甲氧羰基，再使用高效液相色谱对衍生化后的壳寡糖进行分离，直接经过紫外检测器检测壳寡糖中的壳二糖、壳三糖的含量。

本发明利用9-芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)衍生化试剂与壳寡糖结构中的伯氨基通过酰胺键连接形成单衍生产物(反应式如图1所示)，由于Fmoc基团有较强的紫外吸收，与糖结合后能够增强糖类的紫外吸收。

上述方法，优选Fmoc-Cl与壳寡糖的摩尔比为2-12:1。所述衍生化反应在pH 6-9，0.25M的硼酸缓冲液中进行。优选使用体积比为2-5:1的乙腈和醋酸的混合溶液作为终止液终止衍生化反应。

所述衍生化反应的操作步骤是：将壳寡糖溶液和硼酸缓冲液等体积混匀，加入Fmoc-Cl溶液，混匀，静置反应，优选衍生化时间为3-10分钟，再加终止液终止反应。

本发明一个优选的技术方案，采用碳十八烷基键合硅胶(ODS)柱(4.6×150mm)；以5-20mM的醋酸铵(pH 4-6，含0.1％三乙胺)为流动相A，乙腈为流动相B，利用梯度洗脱程序分离衍生化产物；流速为1.0mL，紫外检测器的检测波长为250-280nm。

本发明经方法验证，对壳二糖和壳三糖的定量限(LOQ，limit of qualification)分别为0.5和1.0μg/mL，相当于壳寡糖中含量0.1％和0.2％；准确度考察中壳二糖和壳三糖的回收率为95.6-107.7％；壳二糖和壳三糖的线性范围分别是0.5-500μg/mL和1.0-500μg/mL。证明该方法准确、可靠，能简单、高效的检测壳寡糖中壳二糖和壳三糖的含量。

附图说明

图1是Fmoc-Cl衍生化反应机理，图中n＝1为氨基葡萄糖，n＝2为壳二糖，n＝3为壳三糖。

图2是本发明方法测定壳寡糖样品和壳二糖、壳三糖的色谱图。

图3是高效液相色谱-示差折光法检测壳寡糖样品的色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

(1)Fmoc-Cl衍生化反应

称取适量的壳二糖、壳三糖，加蒸馏水分别配制成浓度为200μg/mL和300μg/mL的对照溶液。选择三种壳寡糖样品，分别为聚合度为3-7的壳寡糖、分子量为1000-2000Da的壳寡糖、分子量为MW 3000Da的壳寡糖。将壳寡糖样品用蒸馏水配制成浓度为0.5mg/mL的样品溶液。

称取适量的Fmoc-Cl用乙腈溶解，配制成500μg/mL的溶液，-4℃避光保存，24小时内取用。

称取适量的硼酸，加蒸馏水溶液配制成0.25M的溶液，再用氢氧化钠调pH为8.0，得硼酸缓冲液。终止液配制为取适量乙腈和醋酸按4:1的体积比混合而得。

分别取200μL对照溶液和样品溶液，加硼酸缓冲液200μL，涡旋混匀，加入500μg/mL的Fmoc-Cl溶液100μL，涡旋混匀，静置5分钟后，加入终止液200μL并涡旋终止反应。

(2)高效液相色谱测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖的含量

高效液相色谱仪是Agilent 1260系列，配备紫外检测器。色谱柱为岛津C18柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相A是10mM醋酸铵(含0.1％三乙胺，醋酸调节pH 5.0)，流动相B是乙腈，梯度洗脱程序见表1；柱温：25℃；检测波长：262nm；进样量20μL。

表1 HPLC梯度洗脱程序

将衍生化后的对照溶液和样品溶液分别进样20μL，记录色谱图(见图2)，用外标法计算壳寡糖中壳二糖和壳三糖的含量(结果如表2所示)。

表2不同聚合度壳寡糖样品的壳二糖、壳三糖含量测定结果。

图2显示，壳二糖和壳三糖混合样品可在色谱系统中分离度大于1.5，检测时各峰互不干扰。壳二糖和壳三糖由于糖环上氨基存在α、β构型的不同，导致壳二糖、壳三糖经衍生化后在色谱图中分别出现2、3个峰。图2中壳二糖出峰时间为7.5、7.9分钟，壳三糖出峰时间为6.3、6.6、6.9分钟，壳二糖和壳三糖衍生峰满足2：3和0.1：2：3的稳定比例，所以我们分别选取6.9分钟和7.9分钟作为定量计算的峰。

三种分子量的壳寡糖测定结果为：壳寡糖(聚合度3-7)中壳二糖、壳三糖含量为0.72％、14.9％；壳寡糖(分子量1000-2000Da)中壳二糖、壳三糖含量为0.62％、5.30％；壳寡糖(分子量3000Da)中壳二糖、壳三糖含量为1.56％、5.28％。

实施例2

(1)准确度实验

向壳寡糖样品中添加低、中、高浓度(0.4％、20％、100％)的壳二糖、壳三糖，将混合样品经Fmoc-Cl衍生化后，用高效液相色谱测定壳二糖、三糖含量，检测到的浓度除以加入的浓度即为准确度。准确度结果如表3所示，壳二糖的准确度为95.6-107.7％，壳三糖的准确度96.5-96.7％。

表3本发明所述检测方法验证的准确度结果。

(2)线性和定量限实验

分别配制浓度从0.5到500μg/mL的壳二糖、壳三糖溶液，经Fmoc-Cl衍生化后，用高效液相色谱检测壳二糖、三糖的峰面积；以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，绘制曲线。结果如表4所示，壳二糖、壳三糖的线性相关系数分别为0.9998、0.9994；两者的线性范围为0.5-500μg/mL、1.0-500μg/mL。

将500μg/mL壳二糖、壳三糖的溶液稀释，直到其在色谱中响应为：信号/噪声(S/N)>10，该浓度即为定量限。表4显示壳二糖、壳三糖的定量限分别为0.5μg/mL(相当于壳寡糖中含量0.1％)、1.0μg/mL(相当于壳寡糖中含量0.2％)。

表4本发明所述检测方法验证的线性范围和定量限结果。

实施例3

称取聚合度3—7的壳寡糖样品用蒸馏水配制成浓度为0.5mg/mL的样品溶液。

色谱条件为：

色谱柱：Shodex Asahipak NH₂(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(75:25)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样体积25uL；检测器：示差折光检测器

将壳二糖对照溶液、壳三糖对照溶液、壳寡糖样品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行分析，记录色谱图(图3)。

结果表明，采用传统的HPLC方法，使用示差折光检测器进行检测，壳寡糖样品中壳二糖和壳三糖的分离效果不如本发明所述方法，壳二糖与壳三糖的分离度≤1.5，只达到基本分离，当样品浓度变大时，壳二糖、壳三糖的峰会相互干扰，定量不准确。而且该方法的壳二糖、壳三糖定量限为1.5％和2.5％(相当于壳寡糖中的含量)，明显低于本发明中壳二糖(0.1％)、壳三糖(0.2％)定量限。

Claims (4)

1.一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法，其特征在于通过9-芴甲氧羰酰氯与壳寡糖结构中的伯氨基发生衍生化反应，在壳寡糖结构中引入9-芴甲氧羰基，再使用高效液相色谱对衍生化后的壳寡糖进行分离，直接经过紫外检测器检测壳寡糖中的壳二糖、壳三糖的含量；

所述衍生化反应的操作步骤是：将壳寡糖溶液和硼酸缓冲液等体积混匀，加入9-芴甲氧羰酰氯溶液，混匀，静置3-10分钟，再加终止液终止反应，所述9-芴甲氧羰酰氯与壳寡糖的摩尔比为2:1—12:1；

所述高效液相色谱使用碳十八烷基键合硅胶柱进行分离，紫外检测波长为250-280nm，以含 0.1%三乙胺，pH 为4-6的5-20mM 醋酸铵为流动相 A，乙腈为流动相B，利用梯度洗脱程序分离衍生化产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述衍生化反应在pH 6-9，0.25M的硼酸缓冲液中进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用体积比为2-5:1的乙腈和醋酸的混合溶液作为终止液终止衍生化反应。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述梯度洗脱程序为：0-10min，20-50%B；10-11min，50-80%B；11-15min，80%B；15-16min，80-20%B；16-20min，20%B。