CN106841419B - 一种聚肽的快速检测方法 - Google Patents

一种聚肽的快速检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106841419B
CN106841419B CN201611247138.7A CN201611247138A CN106841419B CN 106841419 B CN106841419 B CN 106841419B CN 201611247138 A CN201611247138 A CN 201611247138A CN 106841419 B CN106841419 B CN 106841419B
Authority
CN
China
Prior art keywords
poly
peptide
eluent
detection method
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611247138.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106841419A (zh
Inventor
刘丹
李石平
余继刚
宋瑞
陈雷
汤伟强
王淯
任磊
吴义香
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei Anderson Pharma Co Ltd
Original Assignee
Hefei Anderson Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei Anderson Pharma Co Ltd filed Critical Hefei Anderson Pharma Co Ltd
Priority to CN201611247138.7A priority Critical patent/CN106841419B/zh
Publication of CN106841419A publication Critical patent/CN106841419A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106841419B publication Critical patent/CN106841419B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生化分析领域，具体公开了一种聚肽的快速检测方法，本发明将离子交换柱应用于HPLC仪器平台，取微量样品就能快速检测供试品中的聚肽，包括步骤：取发酵或纯化过程中的样品配制供试品溶液，色谱柱以阴离子交换树脂为填料，以磷酸盐缓冲液或Tris‑HCl缓冲液为洗脱液A，以NaCl溶液或KCl溶液为洗脱液B，梯度洗脱，使聚肽可以和杂蛋白、核酸等杂质很好地分离。本发明的检测方法具有较好的线性范围、重复性和加样回收率，较低的检测限，操作简单，灵敏度高，能快速检测供试样品中的聚肽。

Description

一种聚肽的快速检测方法
技术领域
本发明涉及生化分析检测领域，具体涉及一种聚肽的快速检测方法。
背景技术
聚阴离子聚肽的盐溶液(如钠盐、钾盐等)极性强、水溶性好，用传统的C18色谱填料分离分析保留时间短，很难将其与杂蛋白或核酸等杂质分开。电泳检测只能定性，不能定量。高效快速地检测发酵和纯化过程中聚肽含量不仅能提高筛选聚肽高产菌株和纯化的效率，并且对发酵和纯化条件的优化、工艺控制及质量标准的建立有着非常重要的意义。
目前常用于测定发酵或纯化过程中聚肽含量的方法通常为水解法，将聚肽水解为对应的单个氨基酸，测定水解前后对应氨基酸含量之差，水解前后样品中氨基酸的含量可通过生物传感分析仪如L-谷氨酸氧化酶电极或HPLC等方法测定(施庆珊，等：一株不需谷氨酸的产聚γ-谷氨酸菌株的筛选与鉴定；孟杰，等：酶法快速检测发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度)，也有用凝胶色谱测定γ-PGA含量的(Yao J，et al.Removal of Cr(III)，Ni(II)andCu(II)by poly(γ-glutamic acid)from Bacillus subtilis NX-2[J].)。张庆庆等在《发酵液中γ-聚谷氨酸含量快速测定方法研究》中用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与γ-PGA反应产生浑浊的特性，通过反应体系的吸光度来反映其浊度，进而通过浊度与γ-PGA浓度的线性关系，测定发酵液中γ-PGA。
现有技术中的水解法过程繁琐、水解程度对结果准确性影响较大；凝胶色谱法是根据分子量大小不同保留时间不同来检测的，由于大分子相近分子量的物质较多，凝胶色谱本身的分辨率有限，所以也存在较大的误差；而CTAB法中的CTAB很容易与杂蛋白反应产生浑浊，进而影响检测的准确性。因此，很有必要建立一种聚肽快速、准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术上的不足，提供了一种聚肽的快速检测方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种聚肽的快速检测方法，包括如下步骤：
(1)样品溶液的配制：取发酵液或发酵菌体破碎液或纯化中间过程溶液适量，过0.22μm滤膜；
(2)样品的测定：采用高效液相离子交换色谱法，以10-30mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液作为洗脱液A，调pH至7.5-8.5，以洗脱液A为溶剂配制1-3M的NaCl溶液或KCl盐溶液为洗脱液B；
所述离子交换色谱条件为：填料Q SepharoseTM FF装填于空管柱或使用预装柱；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.1-2mL/min；洗脱方式：0-10min，100％A等度洗脱；10-25min，洗脱液A:洗脱液B为(85-95):(15-5)；25-45min，洗脱液A:洗脱液B为(75-85):(25-15)；45-60min，洗脱液A:洗脱液B为(60-75):(25-40)；60-80min，100％B等度洗脱，之后通过双波长紫外检测器检测；
(3)含量分析。
本发明聚肽的快速检测方法中含量分析为根据标准曲线法进行聚肽的含量计算；所述标准曲线为称取聚肽标准品，溶于洗脱液A中，配制成一定浓度的标准溶液，分别稀释成一定浓度梯度的稀释液，过0.22μm滤膜，分别进行检测，以标准溶液的质量浓度(x/mg·mL-1)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
本发明所述的离子交换空管柱或预装柱内径为2-20mm，长度为20-100mm，总体积为1-25mL。
本发明所述的双波长检测，其中一个检测通道波长设置为205-230nm，用于检测不含苯环的蛋白类物质(包括聚肽)，另一个检测通道波长设置为250-280nm，用于检测核酸类和含苯环的蛋白类物质。
本发明所述的聚肽可为盐型阴离子聚肽；所述盐型阴离子聚肽包括α-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸以及由谷氨酸和天冬氨酸所形成的聚肽的盐。进一步地，本发明所述聚肽为α-聚谷氨酸。
本发明采用离子交换色谱检测聚肽类物质，并将其应用于HPLC检测平台，不但使聚肽能与其他杂蛋白和大部分核酸等杂质很好地分离，而且采用双波长可以同时检测聚肽和核酸，将核酸的影响去除，样品用量少，只需5-20μL，具有较好的线性范围、重复性和加样回收率，较低的检测限。本发明操作简单，灵敏度高，能快速检测样品中的聚肽。
附图说明
图1是峰面积-质量浓度曲线；
图2是α-聚谷氨酸标准图谱；
图3是α-聚谷氨酸发酵菌体破碎液离子交换检测色谱图；
图4是α-聚谷氨酸的MALDI-TOF-MS图谱；
图5是α-聚谷氨酸初步纯化离子交换检测色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。
实施例1:标准曲线的绘制
1.1色谱检测条件
仪器：岛津高效液相色谱仪
色谱柱：4.6*50mm，Q SepharoseTM FF阴离子交换填料
检测波长：210nm，260nm
洗脱液A：20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，调节pH为8.0
洗脱液B：2M NaCl溶液(用20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为溶剂配制)
流速：0.3mL/min
进样量：10μL
柱温：25℃
洗脱程序如表1所示：
表1 洗脱程序
1.2线性范围
精密称取α-聚谷氨酸标准品10mg于50mL容量瓶中，加水溶解并定容配制成储备液，精密量取不同体积的标准品储备液，配制成浓度梯度为0.0243mg/mL，0.0729mg/mL，0.2187mg/mL，0.6561mg/mL，1.3122mg/mL，1.9683mg/mL的标准品溶液，精密量取标准品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以标准溶液的质量浓度(x/mg·mL-1)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得α-聚谷氨酸回归方程为y＝(4E+07)x+21643，R＝0.9998，说明α-聚谷氨酸在0.0243-1.9683mg·mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系，如图1所示。
1.3重复性试验
精密吸取同一供试溶液如线性关系考察中浓度为0.6561mg/mL的溶液10μL，重复进样6次，记录色谱图，峰面积相对标准偏差(RSD)为0.7％，表明重复性良好，具体数值如表2所示。
表2 重复性试验
序号 峰面积
1 25091631
2 24958976
3 24781012
4 24764583
5 24897895
6 25198588
RSD(％) 0.7
1.4加样回收率试验
取已知α-聚谷氨酸含量的发酵菌体破碎液样品6份，分别精密加入标准品储备液0.50mL，摇匀，精密量取10μL，注入高效液相色谱仪，在1.1所述的色谱条件下进行分析，记录色谱图。计算α-聚谷氨酸的回收率，回收率如表3所示。
表3 α-聚谷氨酸的回收率
1.5检出限考察
精密量取1.1542mg/mL的α-聚谷氨酸标准品溶液，加水稀释成0.11542mg/mL，0.011542mg/mL，0.005771mg/mL的样品溶液，各精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，其进样量和信噪比如表4所示。
表4 进样量和信噪比
进样量(μg) 信噪比(S/N)
1.1542 75.3
0.011542 11.8
0.05771 2.7
结果表明：当进样量为0.05771μg时，信噪比为2.7，故检测限为0.05771.
实施例2：发酵菌体破碎液中α-聚谷氨酸的含量测定
取发酵菌体破碎液适量，0.22μm滤膜过滤，精密量取10μL，按实施例1中1.1所述的色谱条件进样分析，重复进样3次，用峰面积按外标法计算α-聚谷氨酸的含量，并在检测过程收集α-聚谷氨酸所对应的峰，富集的样品做MALDI-TOF-MS测试，如图4，显示分子均一性好，纯度高，其含量具体值如表5所示。
表5 发酵菌体破碎液中α-聚谷氨酸的含量测定
实施例3：初步纯化样品中α-聚谷氨酸的含量测定
取初步纯化样品适量0.22μm滤膜过滤，精密量取10μL，按实施例1中的色谱条件进样分析，重复进样3次，用峰面积按外标法计算α-聚谷氨酸的含量，如图5所示，其含量具体值如表6所示。
表6 初步纯化样品中α-聚谷氨酸的含量测定
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些修饰和改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种聚肽的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品溶液的配制：取发酵液或发酵菌体破碎液或纯化中间过程溶液适量，过0.22μm滤膜；
(2)样品的测定：采用高效液相离子交换色谱法，以10-30mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液作为洗脱液A，调pH至7.5-8.5，以洗脱液A为溶剂配制1-3M的NaCl溶液或KCl盐溶液为洗脱液B；
所述离子交换色谱条件为：填料Q SepharoseTM FF装填于空管柱或使用预装柱；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.1-2mL/min；洗脱方式：0-10min，100％A等度洗脱；10-25min，洗脱液A:洗脱液B为90:10；25-45min，洗脱液A:洗脱液B为80:20；45-60min，洗脱液A:洗脱液B为70:30；60-80min，100％B等度洗脱，之后通过双波长紫外检测器检测；
(3)含量分析；
其中，所述聚肽为盐型阴离子聚肽，所述盐型阴离子聚肽包括α-聚谷氨酸、γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸以及由谷氨酸和天冬氨酸所形成的聚肽的盐。
2.根据权利要求1所述的聚肽的快速检测方法，其特征在于，所述含量分析为根据标准曲线法进行聚肽的含量计算。
3.根据权利要求2所述的聚肽的快速检测方法，其特征在于，所述标准曲线法为：称取聚肽标准品，溶于洗脱液A中，配制成一定浓度的标准溶液，分别稀释成一定浓度梯度的稀释液，过0.22μm滤膜，分别进行检测，以标准溶液的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
4.根据权利要求1所述的聚肽的快速检测方法，其特征在于，所述的离子交换空管柱或预装柱内径为2-20mm，长度为20-100mm，总体积为1-25mL。
5.根据权利要求1所述的聚肽的快速检测方法，其特征在于，所述的双波长检测，其中一个检测通道波长设置为205-230nm，用于检测不含苯环的蛋白类物质，另一个检测通道波长设置为250-280nm，用于检测核酸类和含苯环的蛋白类物质。
6.根据权利要求5所述的聚肽的快速检测方法，其特征在于，所述不含苯环的蛋白类物质包括聚肽。
CN201611247138.7A 2016-12-29 2016-12-29 一种聚肽的快速检测方法 Active CN106841419B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611247138.7A CN106841419B (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种聚肽的快速检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611247138.7A CN106841419B (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种聚肽的快速检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106841419A CN106841419A (zh) 2017-06-13
CN106841419B true CN106841419B (zh) 2019-08-13

Family

ID=59113519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611247138.7A Active CN106841419B (zh) 2016-12-29 2016-12-29 一种聚肽的快速检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106841419B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110346471B (zh) * 2019-07-04 2022-02-18 浙江海洋大学 一种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009208A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-25 Cangene Corporation Poly(ethylene glocol) modified human gm-csf with increased biological activity
CN101215588A (zh) * 2008-01-04 2008-07-09 南京工业大学 酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法
CN101448931A (zh) * 2006-05-23 2009-06-03 东洋纺织株式会社 γ-L-PGA生产微生物、使用该微生物的γ-L-PGA制造方法、交联体及皮肤外用剂
CN103288953A (zh) * 2013-05-31 2013-09-11 大连理工大学 一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法
CN106053669A (zh) * 2016-07-15 2016-10-26 福建省产品质量检验研究院 饮品中ε‑聚赖氨酸含量和分子量的检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009208A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-25 Cangene Corporation Poly(ethylene glocol) modified human gm-csf with increased biological activity
CN101448931A (zh) * 2006-05-23 2009-06-03 东洋纺织株式会社 γ-L-PGA生产微生物、使用该微生物的γ-L-PGA制造方法、交联体及皮肤外用剂
CN101215588A (zh) * 2008-01-04 2008-07-09 南京工业大学 酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法
CN103288953A (zh) * 2013-05-31 2013-09-11 大连理工大学 一种血浆中功能性蛋白质的分离纯化方法
CN106053669A (zh) * 2016-07-15 2016-10-26 福建省产品质量检验研究院 饮品中ε‑聚赖氨酸含量和分子量的检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of Polycationic Amino Acids Fusion Systems for Ion‐Exchange Purification of Cyclodextrin Glycosyltransferase from Recombinant Escherichia coli;Dae-Hyuk Kweon 等;《Biotechnol.Prog.》;20020131;第18卷(第2期);303-308
γ-聚谷氨酸提取的发酵液预处理及分离纯化工艺;梁金丰 等;《食品与发酵工业》;20090331;第35卷(第3期);6-11
阴离子交换层析法分离纯化γ-PGA;王浩 等;《食品工业科技》;20120601;第33卷(第11期);253-255,263

Also Published As

Publication number Publication date
CN106841419A (zh) 2017-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108120792B (zh) 一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法
CN103616454B (zh) 一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒
CN106950290B (zh) 克林霉素磷酸酯凝胶中有关物质的检测方法
CN109030658B (zh) 一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法
CN111323527B (zh) 一种用复合二维液相色谱同时测定多种精神药物的方法
CN102323233A (zh) 一种检测同型半胱氨酸的试剂和方法
CN106841419B (zh) 一种聚肽的快速检测方法
CN113588837B (zh) 一种盐酸莫西沙星有关物质的检测方法
CN105301157B (zh) 一种甲磺酸苦柯胺b有关物质检测方法
CN110118836A (zh) 高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法
CN103645151B (zh) 一种快速测定大观霉素发酵液或成品中大观霉素含量的方法
CN106338561A (zh) 一种丙谷二肽中间体的定量检测方法
CN110687223B (zh) 一种丙戊酸钠原料乙酰乙酸甲酯的含量测定方法
CN112485344A (zh) 一种蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱检测方法
CN105866270B (zh) 一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法
CN110954629A (zh) 一种呋塞米中糠胺含量测定的控制方法
CN106290683B (zh) 一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法
CN103323541B (zh) 肝素钠封管注射液的质量检测方法
CN113484450B (zh) 药物对映异构体检测用衍生化处理方法及测定方法、应用
CN106290680A (zh) 头孢美唑酸的中间体s-氰甲基异硫脲的分析方法
CN108548875B (zh) 一种测定壳寡糖中壳二糖、壳三糖含量的方法
CN111521693B (zh) 一种单硝酸异山梨酯的检测方法
CN104198418A (zh) 金霉素效价的高通量测定方法
CN111323492A (zh) 一种复合色谱柱以及一种二维液相色谱系统
CN113433249B (zh) 一种高效液相色谱法检测米诺环素中间体有关物质的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant