CN101448931A - γ-L-PGA生产微生物、使用该微生物的γ-L-PGA制造方法、交联体及皮肤外用剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微生物，其特征在于，在液体培养条件下生产分子量为130万以上的光学纯度均一的聚－γ－L－谷氨酸，还提供该微生物的筛选方法、使用该微生物生产高分子量的聚－γ－L－谷氨酸的方法及平均分子量为130万以上的聚－γ－L－谷氨酸。另外，还提供它们的利用法。

Description

γ—L—PGA生产微生物、使用该微生物的γ—L—PGA制造方法、交联体及皮肤外用剂

技术领域

本发明涉及一种聚—γ—L—谷氨酸高生产微生物及其变异株、使用该微生物或变异株的聚—γ—L—谷氨酸的制造方法以及高分子量聚—γ—L—谷氨酸。

另外，本发明还涉及一种聚—γ—L—谷氨酸交联体、其制造方法以及内含该交联体而成的水凝胶。更具体而言，涉及一种吸水性及生物降解能力出色而且可以稳定地供给需要的质量的聚—γ—L—谷氨酸交联体、其制造方法以及含有该交联体而成的水凝胶。

进而，本发明还涉及一种皮肤外用剂。更具体而言，涉及一种内含具有高保湿效果的聚—γ—L—谷氨酸及聚—γ—L—谷氨酸交联体中的至少一种，优选作为保湿剂、化妆品而使用的皮肤外用剂。

背景技术

近年来，地球环境的劣恶化被视为问题，急于开发环境修复·保护技术。作为环境污染的原因，例如广泛认为是工厂废水等人类生产活动的扩大引起的。不过，还已知深入渗透到我们的生活的、成为现代的“生活必需品”的塑料制品给环境带来与生产活动的扩大同等程度或比其更厉害的环境负荷。多数常用塑料或合成聚合物是通过石油化学制造的。这些化成品极为稳定，轻型、强韧且廉价及其便利性是惊人的。另一方面，反复轻率利用和废弃也是事实。如今，这些废弃物大多在自然环境中不能被分解，所以被指责导致了生态系统的破坏。由于利用废弃处理法而成为二噁英(dioxin)等环境激素(内分泌扰乱化学物质)的发生源，其威胁不可估量。

对环境问题重视的提高成为了重新认识生物降解之类的功能性的契机。产生了被称为生物降解性塑料的概念，需要尽快地将其实用化。微生物生产的生物聚合物被认为有希望成为作为提供生物降解性塑料或水凝胶的材料。尤其在氨基酸以特殊的结合方式连接而成的被称为聚氨基酸的一组生物高聚物中发现的潜在能力备受瞩目。已被同定的有聚—γ—谷氨酸(以下有时也记载为PGA)、聚—ε—赖氨酸及藻青素这3种聚氨基酸。

最近，已知聚氨基酸的结构特征(构成氨基酸的旋光性或种类、分子尺寸、结合方式等)强有力地反映其功能性。PGA是谷氨酸的α—氨基与γ—羧基以酰胺键结合的聚氨基酸。PGA已知为纳豆产丝的主体物质，而这极大地来自于其具有魅力的功能性。为人所熟知的点可以举出兼具生物降解性和高吸水性。期待利用这些功能，在食品、化妆品、医疗品等众多领域中有各种用途。但是，目前被制品化的PGA是从纳豆菌或其亲缘菌生产而来的，谷氨酸的两个旋光异构体被生产为随机地结合的化学杂聚合物。因此，考虑PGA作为塑料的代替材料，其实用化具有很大的障碍。

还有生产均聚—γ—谷氨酸的菌的报道。例如报道了炭疽杆菌Bacillusanthracis生产只由D—谷氨酸构成的聚—γ—D—谷氨酸(以下有时也记载为D—PGA)(非专利文献1)。但是，由于本菌为具有强病原性的细菌，所以不适合作为工业上的PGA生产菌，生产的D—PGA的分子量也小。另外，还报道了嗜碱性细菌嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)生产仅由L—谷氨酸构成的聚—γ—L—谷氨酸(以下有时也记载为L—PGA)(非专利文献2)。但是，本菌生产的L—PGA的分子量也极小。

另一方面，作为较高分子量的均聚—γ—谷氨酸的生产菌，报道了嗜碱性古细菌Natrialba aegyptiaca仅生产分子量为10万～100万左右的聚—γ—L—谷氨酸。但是，本菌在液体培养条件下生产分子量为10万左右的较小的谷氨酸，而且几乎不生产聚—γ—L—谷氨酸，所以作为工业上的生产菌存在问题(非专利文献3、专利文献1)。

除了上述以外，作为生产聚—γ—L—谷氨酸的生物，可以举出水螅等，但水螅的情况也同样存在分子量极小的问题(非专利文献4)。

作为PGA的利用领域，包括化妆品领域。在化妆品领域中应用PGA时，如PGA之类的水溶性高分子化合物所需要的性质为光学纯度均一，而且具有高的保湿性能和增粘性。但是，为了同时满足这两个要件，需要光学纯度均一的高分子量PGA。

另外，吸水性树脂在众多领域中被用作纸尿片或生理用品、医疗、建设、土木工学、建筑领域、触感改善剂、用于食品的鲜度保持剂、进而用于园艺等农学领域中的绿化工学的重要的基材等。

在吸水性树脂中，丙烯酸系的吸水性树脂具有出色的吸水性，而且廉价，所以被使用在广泛的领域。但是，丙烯酸系的吸水性树脂几乎不具有生物降解性。所以，难以利用微生物等的分解来处理丙烯酸系的吸水性树脂。例如，不适于混合肥料处理之类的生物处理，另外，即使在填埋处理场等也不能被分解而残存。

作为解决该问题的吸水性树脂，例如在专利文献1中公开了由聚—γ—谷氨酸交联体构成的生物降解性吸水树脂。PGA是由各种生物合成的高分子化合物，生物降解性出色。所以，在专利文献1中的生物降解性吸水性树脂可以安全且简单地进行废气处理。

此外，对过去已知的PGA进行归纳，如在专利文献2中使用的PGA，通常为由L—谷氨酸及D—谷氨酸这两旋光异构体不规则地结合而成的PGA，还有仅由D—谷氨酸结合而成的PGA(非专利文献1)或仅由L—谷氨酸结合而成的PGA(专利文献1、非专利文献2～4)的报道。

此外，在本说明书中，为了便于说明，将D—谷氨酸及L—谷氨酸结合而成的PGA记载为“DL—PGA”。另外，将仅由D—谷氨酸构成的PGA记载为“D—PGA”，将仅由L—谷氨酸构成的PGA记载为“聚—γ—L—谷氨酸”或“L—PGA”。

但是，以专利文献2中的生物降解性吸水性树脂难以稳定地制造具有需要质量的生物降解性吸水性树脂，或者，起始制造构成该生物降解性吸水性树脂的DL—PGA的交联体本身是困难的。

具体而言，在专利文献2中公开的作为DL—PGA交联体的原料的DL—PGA利用Bacillus Subtillus等纳豆菌或其亲缘菌来合成。但是，在从纳豆菌或其亲缘菌获得的DL—PGA中，D—谷氨酸及L—谷氨酸不规则地结合，D—谷氨酸及L—谷氨酸的含有比率或序列在每次培养生产菌时都发生改变。因此，DL—PGA交联体的每一分子结构不同，其每一分子性质也不同。这样一来，在制作交联体时，使用的DL—PGA的批次间容易产生质量差，难以稳定地制造具有需要质量的PGA交联体。

进而，如果如上所述，成为原料的DL—PGA的质量不一定，则难以稳定地获得交联体。在本发明人等的探讨中也不能得到DL—PGA的交联体。认为这是因为，如上所述，DL—PGA的每一分子结构不同。就是说，制作PGA的交联体时的交联效率依赖于分子的结构，在每一分子结构不规则地不同时，交联效率显著地降低。因而，难以使每一分子结构不同的DL—PGA交联，交联体的效率也极低。

而且目前没有获得L—PGA的交联体的报道。认为这是由于以下的原因。即，过去在液体培养时，不能获得平均分子量大的L—PGA。另一方面，极难获得低分子量的有机化合物的交联体是技术常识。这样的话，从业者甚至很难想象获得低分子量的L—PGA的交联体。因此，甚至没有尝试获得L—PGA的交联体的报道。此外，工业用途的PGA要求可以利用液体培养来制造。这是因为，如果用平板培养，则一时难以培养大量的微生物，另外，从平板培养基上收集L—PGA的效率也差。

例如，作为合成L—PGA的生物，在非专利文献1中，公开有嗜碱性细菌嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，以及在非专利文献2中，公开有水螅。但是，利用这些生物合成的L—PGA的分子量为10万左右，极小。

另外，在专利文献2及非专利文献3中，报道了如果用平板培养基培养作为嗜碱性古细菌的Natrialba aegyptiaca，则生产分子量10万～100万左右的L—PGA。但是，该Natrialba aegyptiaca在液体培养条件下合成的L—PGA的分子量为10万左右，而且其合成效率极低。

即使能够获得D—PGA的交联体，也不适合用于产业上。

这是因为，在非专利文献4中公开的合成D—PGA的菌为具有强病原性的炭疽杆菌Bacillus anthracis。极不适合使用炭疽杆菌制造产业上利用的PGA。

粗糙皮肤存在由于角质细胞的剥离而引起和由于干燥使皮肤的健康状况变差直至表皮的硬化或损伤的情况。其中，角质细胞的剥离引起的粗糙皮肤的发生是由胆固醇、神经酰胺、脂肪酸等从角质细胞间脂质洗脱、紫外线、洗涤剂等引起的角质细胞的变性、表皮细胞的增值平衡及/或角化平衡的崩溃引起的角质层透过屏障的形成障碍等引起的。

过去，为了预防或治疗粗糙皮肤，进行了合成角质细胞间脂质成分或与其类似的角质细胞间脂质并向皮肤供给等的探讨。角质细胞间脂质是指棘层及颗粒层的细胞生物合成的层板颗粒在紧邻角质层的下方释放到细胞间，并伸展，形成层板(lamellar)结构，由此向细胞间扩展的物质。

层板颗粒由葡糖苷酰鞘氨醇、胆固醇、神经酰胺、磷脂质等构成，而在角质细胞间脂质中几乎不含有葡糖苷酰鞘氨醇。即，认为层板颗粒中的葡糖苷酰鞘氨醇在β—葡糖脑苷酯酶的作用下发生水解，转换成神经酰胺。认为神经酰胺通过形成层板结构，作为角质细胞间脂质，发挥改善角质层透过屏障的形成、防止粗糙皮肤的屏障的功能。尤其报道了可以有效地向洗涤剂等引起的粗糙皮肤中补充神经酰胺，在改善皮肤粗糙方面显示出较高的效果(非专利文献5)。

另一方面，为了防止表皮硬化或损伤引起的粗糙皮肤，过去使用具有保湿效果的化妆品等皮肤外用剂。通过使用具有保湿效果的皮肤外用剂，可以防止从皮肤挥发水分，在表皮及角质层中保持水分。这样，可以维持皮肤的正常性，可以保持保湿性、柔软性，可以保持娇嫩的皮肤。

作为过去报道的对皮肤具有保湿效果的亲油性物质，可以举出橄榄油等植物油、羊毛脂等动物来源的脂质等。另外，作为对皮肤具有保湿效果的亲水性物质，可以举出甘油、1，3—丁二醇、丙二醇、山梨糖醇等水溶性多元醇，透明质酸及苍耳烷橡胶(xanthane gum)等多糖类，聚乙二醇等水溶性高分子，吡咯烷酮羧酸盐、氨基酸为代表的低分子量的天然保湿因子，植物萃取物等。

作为这样具有对皮肤的保湿效果的物质，存在各种物质，但近年来，由于重视安全性等，存在避免动物来源的物质或化学合成品的趋势。那么，优选天然物质来源的物质或利用微生物的发酵生产物。进而，期待并备受瞩目的是不仅对生物体而且对环境的负荷均小的生物降解性原材料。

在生物降解性原材料中，期望的是微生物生产的生物聚合物。在生物聚合物中，氨基酸缩聚构成的被称为聚氨基酸的一组生物聚合物可见各种功能，其潜在能力备受瞩目。尤其瞩目的是所述的作为聚氨基酸的PGA。

如上所述，PGA是谷氨酸的α—氨基与γ—羧基进行酰胺键合而成的聚氨基酸。PGA已知为从古代开始为日本人所熟悉的纳豆产丝的主体物质，是吸水性的聚氨基酸，而作为这样熟悉的背景，极大地利用的是其具有魅力的功能性。作为PGA的具有魅力的功能，已知同时具备生物降解性及高吸水性。期待利用这些功能，以所述的化妆品为首，用于医疗品、食品等各种领域、用途中。

但是，在含有所述过去的PGA的皮肤外用剂中，具有难以稳定地制造具有需要质量的皮肤外用剂的问题，或者保湿性不充分的问题。

如上所述，目前，被制品化的DL—PGA在化学上为杂聚合物。具体而言，PGA由纳豆菌或其亲缘菌生产得到，而D—谷氨酸及L—谷氨酸不规则地结合，其含有比率或序列在每次培养生产菌时会发生改变。通常聚氨基酸的结构特征(构成的氨基酸的旋光性或种类、分子尺寸、结合样式等)很大程度地影响其功能。所述DL—PGA的每一分子结构不同，其每一分子性质也不同。这样一来，难以稳定地制造具有需要质量的DL—PGA。

另外，由于DL—PGA的保湿性不充分，所以作为化妆品的皮肤外用剂的实用化成为较大的课题。

过去，还没有制造内含L—PGA的皮肤外用剂的报道。这是因为以下原因。

通常在使用PGA制造皮肤外用剂的情况下，要求保湿性，所以高分子量的PGA是不可缺少的。另一方面，过去，在液体培养中，不能得到平均分子量较大的L—PGA。这样一来，甚至难以设想制造内含L—PGA的保湿剂。

另外，如上所述，工业上用途的PGA要求可以利用液体培养来制造，而如果用平板培养，则一时难以培养大量的微生物，从平板培养基上收集L—PGA的效率也差。另外，如上所述，D—PGA不适合用于产业上。

在专利文献2中，DL—PGA的交联体被用作吸水性树脂，但难以将DL—PGA的交联体用作皮肤外用剂。

在专利文献2中公开的作为DL—PGA的原料的DL—PGA利用Bacillus Subtillus等纳豆菌或其亲缘菌合成。这样一来，成为原料的DL—PGA的质量不一定，所以难以稳定地获得交联体。即使在本发明人等的探讨中，也不能得到DL—PGA的交联体。认为这是因为，如上所述，DL—PGA的每一分子结构不同。就是说，制作PGA的交联体时的交联效率依赖于分支结构，在每一分子结构不规则地不同的情况下，交联效率显著降低。因而，难以使每一分子结构不同的DL—PGA交联，交联体的收率也极低。

因而，即使使用DL—PGA的交联体，也难以稳定地制造需要质量的皮肤外用剂。

另一方面，过去还没有获得L—PGA的交联体的报道。

这是因为，如上所述，在液体培养中，不能得到平均分子量较大的L—PGA。极难获得低分子量的有机化合物的交联体是技术常识。从业者甚至很难想象获得低分子量的L—PGA的交联体。因此，甚至没有尝试获得L—PGA的交联体的报道。

另外，即使可以获得D—PGA的交联体，如上所述，D—PGA的生产菌目前只是炭疽杆菌，所以不适合用于产业上。

专利文献1：特表2002—517204号公报(2002年6月18日公表)

专利文献2：特开平10—251402号公报(1998年9月22日)

非专利文献1：Makino，S.，I.Uchida，N.Terakado，C.Sasakawa，and M.Yoshikawa，Molecular characterization and protein analysis of the cap region，which is essential for encapsulation in B acillus anthracis，Journal ofBacteriology，1989，171，722-730.

非专利文献2：Aono，R.，M.Ito，and T.Machida，Contribution of theCell Wall Component Teichuronopeptide to pH Homeostasis and Alkaliphilyin the Alkaliphile Bacillus lentus C-125，Journal of Bacteriology，1999，Vol.181，6600-6606.

非专利文献3：Hezayen，F.F.，B.H.A.Rehm，B.J.Tindall and A.Steinbuchel，Transfer of Natrialba asiatica BlT to Natrialba taiwanensis sp.nov.and description of Natrialba aegyptiaca sp.nov.，a novel extremelyhalophilic，aerobic，non-pigmented member of the Archaea from Egypt thatproduces extracellular poly(glutamic acid)，International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology，2001，51，1133-1142.

非专利文献4：Weber，J.，Poly(gamma-glutamic acid)s are the majorconstituents of nematocysts in Hydra(Hydrozoa，Cnidaria)，Journal ofBiological Chemistry，1990，Vol.265，9664-9669.

非专利文献5：皮肤与美容，36,210(2004)

发明内容

本发明是以所述课题为背景的发明。即，本发明的目的在于提供一种高生产光学纯度均一的聚—γ—L—谷氨酸的微生物或其变异株，和使用该微生物的高分子量的聚—γ—L—谷氨酸的生产方法及高分子量且光学纯度均一的聚—γ—L—谷氨酸。

另外，本发明的目的还在于稳定地提供一种具有需要质量的L—PGA交联体。

另外，本发明的目的还在于稳定地提供一种具有需要质量的皮肤外用剂。

本发明人等进行了潜心研究，结果发现，利用以下所示的手段可以解决所述课题，以至完成本发明。即，本发明由以下结构构成。

1.一种微生物，其中，

在液体培养条件下，生产分子量为130万以上的聚—γ—L—谷氨酸。

2.根据1所述的微生物，其中，

聚—γ—L—谷氨酸的分子量为200万以上。

3.根据1所述的微生物，其中，

聚—γ—L—谷氨酸的分子量为350万以上。

4.根据1～3中任意一项所述的微生物，其中，

诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物而得到。

5.根据4所述的微生物，其中，

在NaCl浓度为10％(w/v)以下的固体培养条件下呈粘液(mucoid)状。

6.根据4或5所述的微生物，其中，

微生物为嗜盐菌。

7.根据4～6中任意一项所述的微生物，其中，

嗜盐菌为极端嗜盐菌。

8.根据4～7中任意一项所述的微生物，其中，

极端嗜盐菌是古细菌。

9.根据3～8中任意一项所述的微生物，其中，

极端嗜盐性古细菌为Natrialba aegyptiaca。

10.根据1～9中任意一项所述的微生物，其中，

微生物为Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)。

11.一种高分子量聚—γ—L—谷氨酸的制造方法，其中，

培养在1～10中任意一项所述的微生物，利用其培养液收集高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。

12.根据11所述的高分子量聚—γ—L—谷氨酸的制造方法，其中，

培养液中的盐浓度为5～30W/V％。

13.一种高分子量的聚—γ—L—谷氨酸，其是利用权利要求11或12所述的制造方法而得到的。

14.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为130万以上。

15.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为200万以上。

16.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为350万以上。

17.一种微生物，其中，

微生物为Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)。

18.一种聚—γ—L—谷氨酸生产变异株的筛选方法，其中，

至少包括下述(a)～(c)的各工序：

(a)诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物的工序，

(b)在母株没有形成粘液状菌落的条件的固体培养条件下培养诱变处理后的该微生物，筛选呈粘液状的变异株的工序，

(c)在液体培养条件下培养在(b)中筛选出的变异株，进一步筛选出比母株显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株的工序。

19.一种聚—γ—L—谷氨酸生产变异株的筛选方法，其中，

至少包括下述(a)～(c)的各工序：

(a)诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物的工序，

(b)在NaCl浓度为15％(w/v)以下的固体培养条件下培养诱变处理后的该微生物，筛选呈粘液状的变异株的工序，

(c)在液体培养条件下培养在(b)中筛选出的变异株，进一步筛选出比母株显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株的工序。

20.一种聚—γ—L—谷氨酸交联体，其中，

具有聚—γ—L—谷氨酸分子之间的交联结构。

21.根据20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其中，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为100万以上。

22.根据20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其中，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为200万以上。

23.根据20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其中，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为350万以上。

24.根据20～23中任意一项所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其中，

吸水倍率为10倍以上、5000倍以下。

25.一种水凝胶(hydrogel)，其中，

含有20～24中任意一项所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体而成。

26.一种聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

包括使聚—γ—L—谷氨酸的分子之间交联的交联工序。

27.根据26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

在所述交联工序中，通过照射放射线使聚—γ—L—谷氨酸的分子之间交联。

28.根据27所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

所述放射线为γ射线。

29.根据26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

所述交联工序中的凝胶化率为50％以上、100％以下。

30.根据26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

还包括使用Natrialba aegyptiaca合成所述聚—γ—L—谷氨酸的聚—γ—L—谷氨酸合成工序。

31.根据30所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其中，

所述Natrialba aegyptiaca为从Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、以及Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)构成的组中选择的至少一种菌株。

32.一种皮肤外用剂，其中，

含有聚—γ—L—谷氨酸及聚—γ—L—谷氨酸交联体中的至少一种。

33.根据32所述的皮肤外用剂，其中，

所述皮肤外用剂为化妆品。

34.根据32所述的皮肤外用剂，其中，

所述皮肤外用剂为保湿剂。.

本发明的进一步的其他目的、特征及优点可以利用以下所示的记载明确。另外，可以通过参照附图的以下说明来理解本发明的好处。

附图说明

图1是表示变异株聚—γ—L—谷氨酸生产率的图。

图2是表示聚—γ—L—谷氨酸·Na盐的IR分析结果的图。

图3是表示聚—γ—L—谷氨酸的游离(free)体的IR分析结果的图。

图4是表示聚—γ—L—谷氨酸的H—NMR的光谱(500MHz)的图。

图5是表示在本发明的实施例中得到的L—PGA的H—NMR的光谱的图。

图6是表示在本发明的实施例中，使用2重量％L—PGA·Na盐水溶液得到的L—PGA交联体的吸水倍率与在L—PGA交联体的制作中照射的γ射线的照射线量之间的关系的探讨结果的图。

图7是表示在本发明的实施例中，使用2重量％L—PGA·Na盐水溶液得到的L—PGA交联体的吸水倍率与在L—PGA交联体的制作中照射的γ射线的照射线量之间的关系的探讨结果的图。

图8是表示在本发明的实施例中的保湿性评价结果的图。

图9是表示在本发明的实施例中的人皮肤粗糙试验的结果的图。

具体实施方式

对本发明的一个实施方式的说明如下所述。其中，本发明的范围不被这些说明所限制，即使在以下的例示以外，可以在不破坏本发明的宗旨的范围内适当地变更。

<1；聚—γ—L—谷氨酸高生产微生物或其变异株、使用该微生物的聚—γ—L—谷氨酸的制造法及高分子量聚—γ—L—谷氨酸>

本发明的“聚—γ—L—谷氨酸”是指仅由L—谷氨酸构成的均聚物。其结构为式(1)所示的结构。在式(1)中，n表示聚—γ—L—谷氨酸的聚合数。

本发明的“分子量”是指利用支链淀粉标准物质的分子量换算算出的数均分子量(Mn)。优选为130万以上，更优选为200万以上，进而优选为350万以上。

本发明的“微生物”只要是生产高分子量的聚—γ—L—谷氨酸的微生物即可，没有特别限定。可以使用野生型的微生物或利用这些变异株及基因重组技术造成的微生物。优选嗜盐菌或其诱变处理株。只要具有作为嗜盐菌的性质，则可以为嗜热菌、极端嗜热菌、嗜冷菌、嗜氧菌、嗜压菌及低温生长菌等。本发明的嗜盐菌为要求0.2M以上的NaCl浓度最适宜增殖的原核生物。嗜盐菌只要是低度嗜盐菌(以0.2—0.5M的NaCl浓度生长)、中度嗜盐菌(以0.5—2.5M的NaCl浓度生长)、极端嗜盐菌(以2.5—5.2M的NaCl浓度生长)即可。优选为极端嗜盐菌。

本发明的“嗜盐菌”也可以为“古细菌”。“古细菌”包括极端嗜盐古细菌(有时也称为嗜盐古细菌)、嗜热古细菌、甲烷菌(甲烷生成古细菌)等，但只要是能够生产聚—γ—L—谷氨酸的古细菌即可，没有特别限定。优选极端嗜盐古细菌。其中，嗜盐性古细菌占了极端嗜盐菌的大半。极端嗜盐古细菌例如可以举出Halobacterium属、Haloarcula属、Haloferax属、Halococcus属、Halorubrum属、Halobaculum属、Natrialba属、Natronomonas属、Natronobacterium属、Natronococcus属等，优选Natrialba属，进而优选Natrialba aegyptiaca。

“粘液状”是指菌落为粘性状态，是指内含共价键合于多肽链的主链上的单糖或多糖链侧链的高分子。本发明的“粘液状”是指聚—γ—L—谷氨酸与多糖结合而成的粘性状态的菌落。

本发明的最重要的公开内容之一是显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物的获取方法。另外，还有显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物的筛选方法。微生物可以进行诱变处理，也可以不进行。更优选进行诱变处理。

在本发明的显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物的获取方法或筛选方法中，重要的公开内容为筛选盐感性高的聚—γ—L—谷氨酸生产微生物。该筛选方法通常只要在难以生产聚—γ—L—谷氨酸的盐浓度下培养聚—γ—L—谷氨酸生产微生物，以显示粘液状的菌落为基准实施筛选即可。其中，也可以在该筛选工序之前或筛选工序中，实施诱变处理。

在此所述的“盐感性”是指微生物对开始聚—γ—L—谷氨酸的生产的盐浓度的敏感性。盐感性高的微生物或其变异株是指例如即使在5％～20％(W/V)NaCl中也生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株，优选即使在7％～15％(W/V)NaCl浓度中也生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株。

盐是指钠、钾、镁、锰、钙、锌及铁等普通的盐即可，没有必要限定。其中，优选钠。

另外，作为诱变处理方法，可以举出例如利用基因重组的方法、使细胞或芽孢接触具有变异原性的药剂的方法、另外还有照射X射线或γ射线之类的放射线、紫外线等的方法等。作为在使其接触所述药剂的方法中使用的药剂，例如可以举出N—甲基—N’—硝基—N—亚硝基胍(NTG)、乙基甲烷磺酸(EMS)等烷基化剂。在实施这些诱变处理的情况下，优选诱变处理后的微生物的生存率成为1％以下左右的强度，但没有特别限定。

筛选得到的微生物或其变异株也可以接着进一步筛选能够用液体培养生产聚—γ—L—谷氨酸的株。

本发明的更有利的点在于，容易获得能够在液体培养中生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物或其变异株。不实施所述筛选方法而实施利用液体培养的筛选，获得能够在液体培养中生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物或其变异株，这对于从业者而言，是不容易的。这是因为，必须将利用固体培养得到的每个菌落进行液体培养，来确认其聚—γ—L—谷氨酸的生产量。该操作是天文数字，事实上是不可能的，这对于从业者而言可以很容易地理解。本发明人等进行了潜心努力，发现了可以容易地获得能够利用液体培养来生产聚—γ—L—谷氨酸的微生物或其变异株的所述筛选方法。利用本发明，由于可以用液体培养生产聚—γ—L—谷氨酸，所以聚—γ—L—谷氨酸的工业化变得容易，因此能够对产业的发展作出很大贡献。

通过液体培养利用本发明得到的微生物或其变异株，可以以工业规模制造高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。

液体培养方法只要在能够使筛选出来的微生物或其变异株生长，能够生产高分子量的聚—γ—L—谷氨酸的条件下培养即可，没有特别限定。例如在培养筛选出来的微生物或其变异株时，在利用通常的方法例如110～140℃、8～20分钟对培养基进行杀菌之后，向培养基中添加变异株。其中，在为极端嗜盐菌的情况下，由于即使在作为其他微生物不可能生长的条件的NaCl浓度条件下也可以生长，所以也可以省略杀菌工序。

在进行液体培养的情况下，只要利用振荡培养、通气搅拌培养等进行即可。此时的培养温度为25～50℃，优选为30～45℃。另外，培养基的pH可以利用氢氧化钠、氢氧化钾、氨、盐酸、硫酸或它们的水溶液等来调整，只要能够进行pH调整即可，没有限定。培养pH为pH5.0—9.0，优选以pH6.0—8.5培养即可。另外，培养期间通常为2～4天左右即可，但只要能够生产聚—γ—L—谷氨酸即可，没有任何限定。另外，也可以根据微生物或其变异株的生长特性，在培养时添加盐。培养时的盐浓度为10～30％，优选以15～25％培养即可。

如果这样地进行培养，则聚—γ—L—谷氨酸主要被蓄积于菌体外。

在从该培养物分离、提取聚—γ—L—谷氨酸时，可以采用公知的方法(1)利用20％以下的盐水从固体培养物中萃取分离的方法(特开平3—30648号公报)、(2)利用硫酸铜的沉淀法(Throne.B.C.，C.C.Gomez，N.E.Nouse and R.D.Housevright：J.Bacteriol.，68卷，307页，1954年)、(3)醇沉淀法(R.M.Vard，R.F.Anderson andF.K.Dean：Biotechnology and Bioengineering，5卷，41页，1963年)、(4)将交联化壳聚糖成形物作为吸附剂的色谱法(特开平3—244392号公报等)、(5)使用分子超滤膜的分子超滤法、(6)适当地组合所述(1)～(5)的方法等。也可以将这样地进行分离、提取而成的产物作为聚—γ—L—谷氨酸的含有液。根据需要，也可以利用公知的方法实施喷雾干燥、冻干等操作，形成粉末。

以下举出微生物尤其是Natrialba aegyptiaca的例子，详细记述，但本发明不被其所限定。

以下说明的是：诱变处理嗜盐菌尤其是Natrialba aegyptiaca，从而获得在液体培养条件下显著地生产高分子量的聚—γ—L—谷氨酸的微生物或其变异株的方法，使用该微生物或其变异株的聚—γ—L—谷氨酸的制造方法以及高分子量的聚—γ—L—谷氨酸的获取方法。

Natrialba aegyptiaca被报道为在固体培养下只生产分子量为10～100万左右的聚—γ—L—谷氨酸。另一方面，Natrialba aegyptiaca在液体培养条件下只能生产少量的聚—γ—L—谷氨酸，不容易大量生产，同时得到的聚—γ—L—谷氨酸的分子量也仅为10万(特表2002—517204号公报以及F.F.Hezayen，B.H.A.Rehm，B.J.Tindall and Steinbuchel，Int.J.Syst.E.，51，1133(2001))。

即使筛选出能够在液体培养条件下生产聚—γ—L—谷氨酸的菌株，由于Natrialba aegyptiaca在固体培养基表面形成粘液状的菌落，所以菌落与菌落融合，难以分离出单菌落。即使分离出了单菌落，也不得不对每一株进行液体培养，以便确认聚—γ—L—谷氨酸的有无，这需要庞大的时间和劳力，直至本发明都是不可能的。

Natrialba aegyptiaca可以在内含10％(w/v)以上的盐的培养基上生长，但仅限于为了生产聚—γ—L—谷氨酸而添加20％(w/v)以上的盐的情况。另外，在NaCl浓度为10％(w/v)的固体培养条件下不呈粘液状。进而，与液体培养相比，固体培养的每个菌体的聚—γ—L—谷氨酸生产量高达10倍以上。就是说，本古细菌为了巧妙地保护自己不在高温环境下发生脱水现象而生产聚—γ—L—谷氨酸(Appl.Microbiol.Biotechnol.，54,319(2000))。

本发明人等进行了潜心努力，结果发现，利用本发明改良的Natrialbaaegyptiaca在母株几乎不生产聚—γ—L—谷氨酸的条件，即NaCl浓度为10％(w/v)的液体培养条件下呈粘液状，在液体培养条件下，比母株更加显著地生产聚—γ—L—谷氨酸。

进而，还发现即使该变异株在液体培养条件下，也会大量生产高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。

本发明不限定于Natrialba aegyptiaca。即，本发明公开了，如果在生产聚—γ—L—谷氨酸的全部嗜盐菌中，采用与上述相同的筛选方法，则均可以获得在液体培养条件下比母株更加显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株。利用本发明，可以获取过去不能获得的变异株。另外，由于嗜盐菌可以在高盐条件下生长，所以可以不在无菌操作下进行培养。这有助于培养工序的成本削减，所以是有希望的物质生产系统。利用本发明，由于可以大量地生产聚—γ—L—谷氨酸，所以能够对产业的发展作出很大贡献。

在将这些微生物作为母株，形成提高聚—γ—L—谷氨酸生产量的微生物时，采用的是通常进行的诱变处理方法。作为该诱变处理方法，可以举出例如利用基因重组的方法、使细胞或芽孢与具有变异原性的药剂接触的方法、另外还有照射X射线或γ射线之类的放射线、紫外线等的方法等。作为在使其接触所述药剂的方法中使用的药剂，例如可以举出N—甲基—N’—硝基—N—亚硝基胍(NTG)、乙基甲烷磺酸(EMS)等烷基化剂。在实施这些诱变处理的情况下，优选诱变处理后的微生物的生存率成为1％以下左右的强度，但没有特别限定。

例如，用铂接种环刮取一铂接种环N.aegyptiaca(JCM11194)的单菌落，接菌于3ml的PGA生产液体培养基—1(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠(Trisodium Citrate)、1％酵母提取物(Yeast Extract)、0.75％酪蛋白氨基酸(Casaminoacid))/18ml容积试管，在37℃、300rpm下培养3天。将得到的培养液0.5ml接菌于50ml的PGA生产液体培养基—1/500ml容积坂口烧瓶，在37℃、180rpm下培养5天。以3000rpm离心得到的培养液5分钟，收集菌体。向收集得到的菌体中加入100mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)，再次悬浮。反复进行3次该操作。分别加入将已悬浮的溶液的1/10量的饱和NTG溶液(东京化成株式会社)用灭菌水稀释成70％、50％、20％、10％而成的溶液，在42℃、150rpm下培养1小时。处理后，接种于PGA生产琼脂—1(10％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)，在37℃下培养5天。通过将条件设定为生存率在1％以下来获得。

作为聚—γ—L—谷氨酸高生产株获得方法，用通常公知的营养培养基例如内含肉汁、蛋白胨、大豆粉、酵母提取物、酪蛋白氨基酸或它们的混合物等的培养基或者内含必要的营养素类的无机合成培养基等琼脂平板培养基，优选用PGA生产琼脂—1培养2～4天。之后，将在PGA生产琼脂培养基—1中出现的菌落，分别一一地取到PGA生产琼脂培养基—1及PGA生产琼脂培养基—2(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)这两个琼脂平板培养基，静置培养2～4天。

可以举出下述方法：在PGA生产琼脂培养基—1上筛选形成粘液状菌落的变异株，接着接菌于PGA生产液体培养基—1(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸)，在37℃、180rpm下培养4天，对培养基中的聚—γ—L—谷氨酸进行定量，由此获得与野生株相比聚—γ—L—谷氨酸的生产率提高的变异株的方法等。

上述方式得到的菌株，作为Natrialba aegyptiaca0830—82株(保藏机构名：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏日：2006年4月4日，保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca0830—243株(保藏机构名：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏日：2006年4月4日，保藏编号：FERM BP—10748)及Natrialbaaegyptiaca0831—264株(保藏机构名：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏日：2006年4月4日，保藏编号：FERM BP—10749)，被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

利用所述的培养基培养聚—γ—L—谷氨酸的生产率提高的变异株时，省略无菌操作，向培养基中添加变异株。在进行液体培养的情况下，优选利用振荡培养、通气搅拌培养等在好氧条件等下进行。此时的培养温度为30～50℃，优选为30～45℃。另外，培养基的pH可以利用氢氧化钠、氢氧化钾、氨、盐酸、硫酸或它们的水溶液等来调整，只要能够进行pH调整即可，没有限定。培养pH为5.0—9.0，优选以pH6.0—8.5培养。另外，培养期间通常为2～4天左右即可。另外，培养时的NaCl浓度为10～30％，优选以15～25％培养。另外，最好在酵母提取物浓度为0.1～10％、优选为0.5～5.0％浓度下培养。另外，即使在固体培养的情况下，与前期液体培养的情况相同，采用的是培养温度为30～50℃，优选为35～45℃，培养时的pH为5.0—9.0，优选为pH6.0—8.5，培养时的NaCl浓度为10—30％，优选为15—25％，酵母提取物浓度为0.1—10％，优选为0.5～5％浓度。

作为培养液中的聚—γ—L—谷氨酸的定量方法，已知有：使用硫酸铜或乙醇使其从内含聚—γ—L—谷氨酸的样品中沉淀，进行该沉淀物的重量测定及利用Kijerder法的总氮的测定的方法(M.Bovarnick，J.Biol.Chem.，145卷，415页(page)，1942年)；测定盐酸水解之后的谷氨酸量的方法(R.D.Housewrigt，C.B.Thorne，J.Bacteriol.，60卷，89页，1950年)；以及利用与碱性色素的定量结合的比色法(M.Bovarnick er al.，J.Biol.Chem.，207卷，593页，1954年)，优选利用与碱性色素的定量结合的比色法。

作为碱性染料，可以举出结晶紫(crystal violet)、苯胺蓝(anilin blue)、藏红(safranine)O、亚甲蓝、甲基紫(methyl violet)、甲苯胺蓝(toluidineblue)、刚果红(congo red)、偶氮卡红(azocarmine)、硫堇(thionine)、苏木精(hematoxylin)等，优选藏红O。

在从该培养物中分离、提取聚—γ—L—谷氨酸时，只要使用所述的公知的方法即可。例如，离心分离培养液，去除菌体。接着，向得到的上清液中加入3倍量的水进行稀释，然后将pH调整至3.0。调整pH之后，在室温下搅拌5小时。然后，加入3倍量的乙醇，将聚—γ—L—谷氨酸作为沉淀物收集。使沉淀物溶解于0.1mM Tris—HCl缓冲液(pH8.0)中，利用透析除去低分子物质。透析后，为了对得到的液体进行核酸除去，进行DNase、RNase处理，接着，为了除去蛋白质，进行蛋白酶处理。在蛋白酶处理之后，利用透析除去低分子物质。透析后，利用冻干等，得到干燥聚—γ—L—谷氨酸即可。另外，根据需要，也可以进行使用阴离子交换树脂来纯化，但也可以在普通的条件下纯化。

本发明的最重要的另一个公开内容之一是高分子量的聚—γ—L—谷氨酸和其取得方法。可以使用Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERMBP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)，取得高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。

可以通过用所述的方法培养上述3种菌株，纯化聚—γ—L—谷氨酸，获得数均分子量＝1,300,000以上的高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。这样的高分子量聚—γ—L—谷氨酸是利用本发明首次能够生产的。进而，还可以生产200万以上、尤其是350万以上的聚—γ—L—谷氨酸。得到的聚—γ—L—谷氨酸为均一的光学纯度且高分子量的聚—γ—L—谷氨酸，所以也可以优选用于化妆品用途等中。

<2；聚—γ—L—谷氨酸交联体、其制造方法以及内含其而成的水凝胶>

[本发明中的L—PGA交联体]

本发明中的L—PGA交联体只要具有L—PGA分子之间的交联结构即可，对其他具体结构没有特别限定。

由于L—PGA只由L—谷氨酸构成，所以光学活性均一，而且每一分子的性质也均一。因此，可以稳定地得到具有需要质量的L—PGA交联体。就是说，本发明中的L—PGA交联体是只由L—谷氨酸构成的均聚物，其结构具有所述式(1)所示的结构。

在本说明书中，“交联结构”是指直链状的高分子化合物的分子之间利用物理或化学方法连接而成的结构。另外，在本说明书中，“交联体”是指通过具有交联结构而物理、化学性质改变的高分子化合物。

在本发明中的L—PGA交联体中，L—PGA的分子之间利用共价键连接成3维状。具体而言，在L—PGA的分子之间，通过所述式(1)中的H以外的任意一个元素之间共价键合，L—PGA分子之间被连接成3维状。换言之，本发明中的L—PGA交联体为L—PGA分子之间连成3维状的聚合物，即，将L—PGA作为构成分子的网状聚合物。此外，在L—PGA的分子之间，一个L—PGA分子中的所述式(1)所示的N与另一个L—PGA的分子中的所述式(1)的最右端所示的C进行键合而成的是L—PGA分子之间的聚合，而不是指“交联结构”。

本发明中的构成L—PGA交联体的L—PGA的平均分子量只要该分子之间交联即可，没有限定，优选为100万以上，进而优选为200万以上，更优选为350万以上。如果分子量为100万以上，则从作为原料的L—PGA制造水凝胶时的凝胶化率提高，所以可以提高水凝胶的收率。

L—PGA的平均分子量越高，则得到的L—PGA交联体的吸水倍率越提高。所以，对本发明中的构成L—PGA交联体的L—PGA的平均分子量的上限值没有特别限定。其中，如果利用后述的L—PGA的制造方法，则可以得到例如平均分子量600万、最大1500万的L—PGA。

此外，在本说明书中，“平均分子量”是指用支链淀粉标准物质的分子量换算算出的数均分子量(Mn)。

对本发明中的L—PGA交联体的吸水倍率没有特别限定，而如果利用后述的本发明中的L—PGA交联体的制造方法，则可以很好地得到例如10倍以上、5000倍以下，特别是1900倍以上、4400倍以下的吸水倍率。尤其作为将PGA作为材料的吸水性树脂，吸水倍率大于3300倍的吸水性树脂是在上述专利文献1中即使使用DL—PGA也不能得到的划时代的PGA性的生物降解性吸水性树脂。

此外，在本说明书中，“吸水倍率”是指物质含有水等亲水性液体而溶胀引起的重量的增加率。例如如下所述地算出本发明中的L—PGA交联体的吸水倍率即可。即，可以将L—PGA交联体的粉末加入足以溶胀该L—PGA交联体的量的水中，在4℃下静置1周，使其充分地溶胀，然后用80目的金网甩去水，之后用L—PGA的湿重量减去该L—PGA交联体的粉末的干燥重量，用该L—PGA交联体的粉末的干燥重量除所得的值，由此算出吸水倍率。

另外，本发明中的L—PGA交联体优选为仅由L—PGA构成的交联体，但也可以含有DL—PGA分子或D—PGA分子。其中，为了使制造的每个L—PGA交联体的质量稳定，其含量优选为0重量％以上、20重量％以下。

[本发明中的L—PGA交联体的制造方法]

本发明中的L—PGA交联体的制造方法只要包括使L—PGA的分子之间交联的交联工序即可。将仅由L—谷氨酸构成的旋光性均一的L—PGA作为原料，通过使其交联，可以使L—PGA交联体的每个分子的性质成为均一。因而，可以稳定地制造具有需要质量的L—PGA交联体。

只要在使L—PGA溶解于溶剂中制作L—PGA的溶液的基础上，将其提供到交联反应即可。作为使L—PGA溶解的溶剂，只要能够溶解L—PGA即可，没有限定，但例如可以举出水、醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯等，其中，优选水、甲醇、乙醇，进而优选水。对在这些溶剂中溶解时的L—PGA的浓度没有特别限定，优选为1重量％以上、10重量％以下，进而优选为2重量％以上、8重量％以下，特别优选为2重量％以上、7重量％以下。另外，对L—PGA的溶液的pH没有特别限定，优选为5.0以上、9.0以下，进而优选为pH6.0以上、8.0以下。

如果向L—PGA的溶液实施交联反应，则在该溶液中形成L—PGA的交联体，通过该L—PHA交联体含有该溶剂而溶胀，可以得到水凝胶。这是后述的本发明中的水凝胶的方式之一。进而，通过冻干该水凝胶等，通过除去溶剂成分，可以得到不含有该溶剂成分的L—PGA交联体。此外，本发明中的水凝胶如后所述。

如果利用本发明中的L—PGA交联体的制造方法，在所述的交联反应中，例如可以以50％以上、100％以下，尤其是70％以上、100％以下的凝胶化率得到L—PGA。

此外，在本说明书中，“凝胶化率”是指利用交联反应形成交联体的L—PGA的重量相对作为原料使用的L—PGA的重量的百分率。换言之，“凝胶化率”表示得到的L—PGA交联体以至于水凝胶相对于作为原料而使用的L—PGA的收率。具体而言，用提供于该交联反应的L—PGA的干燥重量除利用交联反应而得到的水凝胶的干燥重量所得的数值乘以一百，由此，算出凝胶化率。

L—PGA的交联反应的方法只要能够使L—PGA的分子之间交联即可，没有特别限定，只要用过去公知的方法进行即可。例如，可以使用交联剂，也可以使用放射线，但其中，优选使用放射线。如果使用放射线，则在交联反应之后，不需要除去交联剂的操作，可以制造高纯度的L—PGA交联体。

作为在本发明中的L—PGA交联体的制造方法中可以使用的放射线，没有特别限定，只要使用α射线、β射线、γ射线、电子射线、中子射线、X射线等即可。其中，优选γ射线。γ射线只要使用例如将钴60作为线源的照射装置等过去公知的方法、仪器使其发生即可。

另外，向L—PGA照射的放射线的照射线量优选为0.5kGy以上、20kGy以下，进而优选为2kGy以上、10kGy以下，特别优选为3kGy以上、7kGy以下，但也可以根据制造的L—PGA交联体的用途等适当地设定。通常照射线量越多，则越可以得到硬质的水凝胶，照射线量越少，则越可以得到软质的水凝胶。例如，在照射线量为1kGy、3kGy的情况下，可以得到即使放置于平板上也可以自然地向水平方向扩展的流动性高的水凝胶，在照射线量为5kGy、7kGy时，可以得到即使放置于平板上也不会向水平方向扩展的可以静置的流动性低的水凝胶。

另外，在L—PGA的交联中使用放射线的情况下，只要将L—PGA的溶液放入放射线透过性容器中使用即可。作为放射线透过性容器，没有特别限定，例如可以使用玻璃制微量瓶(vial)等玻璃制容器等。

在将L—PGA的溶液放入放射线透过性容器之后，也可以直接照射放射线，但优选预先对该溶液使用氮鼓泡(nitrogen bubbling)。通过除去在该溶液中含有的氧，可以防止妨碍交联反应。

此外，在L—PGA的交联中使用交联剂的情况下，只要使用环氧化合物、含羧酸基及/或羧酸酯基的多糖、氨基酸等过去公知的交联剂即可，没有特别限定。例如，作为环氧化合物，可以举出甘油三缩水甘油基醚、二—甘油聚缩水甘油基醚、聚—甘油聚缩水甘油基醚、聚氧乙烯山梨糖醇聚缩水甘油基醚，作为多糖类，可以举出葡萄糖、果糖、半乳糖及葡萄糖醛酸构成的混合物、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸构成的混合物、以及以透明质酸为主要成分的多聚羧酸，作为氨基酸，可以举出聚天冬氨酸、聚赖氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸以及它们的混合物。它们可以单独使用，也可以适当地混合使用2种以上。

作为在本发明中的L—PGA交联体的制造方法中使用的L—PGA，只要L—PGA分子之间能够交联，则没有限定，但如上所述，优选为平均分子量大的L—PGA。

另外，在本发明中的L—PGA交联体的制造方法中使用的L—PGA也可以为盐的状态，例如可以使用钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等。其中，优选钠盐。

作为在本发明中的L—PGA交联体的制造方法中使用的L—PGA，只要使用利用过去公知的各种方法得到的L—PGA即可，例如只要使用利用生产L—PGA的微生物而得到的L—PGA即可。

作为生产L—PGA的微生物，只要是合成L—PGA的微生物即可，没有限定，只要使用生产L—PGA的微生物的野生型、其变异株或利用基因重组技术赋予或强化了L—PGA的生产能力的微生物即可。其中，使用在嗜盐菌、优选在嗜盐古细菌、进而优选在极端嗜盐古细菌中具有L—PGA的生产能力的微生物。

另外，作为极端嗜盐古细菌，例如可以举出极嗜盐菌属(Halobacterium属)、亲盐杆菌属(Haloarcula属)、富盐杆菌属(Haloferax属)、盐球属(Halococcus属)、盐红菌属(Halorubrum属)、盐棒菌属(Halobaculum属)、盐无色菌属(Natrialba属)、盐碱古菌属(Natronomonas属)、嗜盐碱杆菌属(Natronobacterium属)、盐碱球菌属(Natronococcus属)等，优选盐无色菌属(Natrialba属)，进而优选Natrialba aegyptiaca，进而优选使用由Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)构成的组中选择的至少一种菌株。如果使用N.aegyptiaca，则可以得到分子量更大的L—PGA。尤其N.aegyptiaca FERM BP—10747、N.aegyptiaca FERMBP—10748、N.aegyptiaca FERM BP—10749的任意一种菌株均可以在液体培养条件下合成平均分子量100万以上的L—PGA。因而，L—PGA的交联体的收率好，另外，L—PGA的制造效率也好。

此外，N.aegyptiaca FERM BP—10747、N.aegyptiaca FERM BP—10748以及N.aegyptiaca FERM BP—10749是本发明人等基于后述的实施例2中记载的筛选方法及诱变处理方法，独自发现的N.aegyptiaca的变异株。这样，在本发明中的L—PGA交联体的制造方法中，也可以基于所述筛选方法及/或诱变处理方法，筛选并使用生产平均分子量大的L—PGA的N.aegyptiaca。其中，在本说明书中，在简单地记载成“N.aegyptiaca”时，其意义也包括N.aegyptiaca的变异株。

以下对使用N.aegyptiaca作为L—PGA的制造方法的一个实施方式的情况进行说明，但不限定于此。

培养N.aegyptiaca的培养基可以生长该N.aegyptiaca，而且只要是可以合成L—PGA的培养基即可，没有特别限定，优选为液体培养基。如果使用液体培养基，则由于可以大量地培养N.aegyptiaca，所以极大地提高了L—PGA的制造效率。

在N.aegyptiaca的培养中使用的培养基的成分只要含有N.aegyptiaca可以摄取的碳源及无机盐类即可，只要根据需要添加酵母提取物等其他营养物即可。例如，在后述的实施例中，本发明人等使用22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸的培养基，培养N.aegyptiaca FERM BP—10749。此外，在向培养基中添加酵母提取物的情况下，其浓度优选为0.1重量％以上、10重量％以下，进而优选为0.5重量％以上、5.0重量％以下。

由于N.aegyptiaca是极端嗜盐菌，所以也可以与在L—PGA的制造中使用的N.aegyptiaca的生长特性相对应，向培养基中添加盐。只要以培养时的盐浓度为10重量％以上、30重量％以下，优选为15重量％以上、25重量％以下培养即可。

对N.aegyptiaca的培养中使用的培养基的pH没有特别限定，但优选为5.0以上、10以下，进而优选为6.0以上、8.5以下。此外，pH的调整中只要使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨、盐酸、硫酸、它们的水溶液即可，只要能够调整pH即可，没有限定。

在制作培养基之后，只要在用通常的方法杀菌之后，添加用于生产L—PGA的N.aegyptiaca来培养即可。此外，培养基的杀菌只要用过去公知的方法进行即可，例如在110～140℃下进行8～20分钟即可。此外，通过使培养基的NaCl浓度成为饱和浓度，也可以省略杀菌工序。这是因为，如上所述，由于N.aegyptiaca为极端嗜盐菌，所以即使在饱和浓度的NaCl存在下也可以生长，而其他微生物则不可能生长。

在液体培养N.aegyptiaca的情况下，优选进行振荡培养、通气搅拌培养。另外，对培养温度没有特别限定，优选为25℃以上、50℃以下，进而优选为30℃以上、45℃以下。

N.aegyptiaca的培养期间只要对应于其他培养条件、目标L—PGA生产量来适当地设定即可，没有特别限定，例如为2～4天左右即可。

如果基于所述的培养条件等进行N.aegyptiaca的培养，则L—PGA主要被蓄积于菌体外。

对从培养N.aegyptiaca之后的培养基分离、收集L—PGA的方法没有特别限定，只要使用过去公知的方法即可。具体而言，可以使用在所述<1>栏中记载的(1)～(6)的方法。

以下对从培养N.aegyptiaca之后的培养基分离、收集L—PGA的方法的一例进行说明，但不限定于此。

首先，利用离心分离等，从培养N.aegyptiaca之后的培养液去除菌体，接着，多所得到的上清，加入乙醇等低级醇，使L—PGA沉淀即可。该沉淀物优选在使其适当地溶解于缓冲液中的基础上利用透析等除去杂质。此外，如后述的实施例所示，本发明人等向收集菌体后的上清中加入3倍量的水，进行稀释，进而将pH调整成3.0，之后在室温下搅拌5小时，在此基础上通过加入3倍量的乙醇收集沉淀物。另外，使该沉淀物溶解于0.1mM Tris—HCl缓冲液(pH8.0)，通过对其进行透析，除去杂质。

认为由于即使进行了透析，也混入了核酸或蛋白质，所以优选进行DNase、RNase处理、蛋白酶处理等。另外，在这些处理之后，通过进一步进行透析等纯化处理，可以得到纯度更高的L—PGA。

利用以上，可以得到内含L—PGA的溶液。进而，对得到的溶液进行冻干等，可以得到粉末状的L—PGA交联体。另外，根据需要，也可以进行该溶液的纯化。纯化可以利用过去公知的方法进行，例如可以进行所述的透析，只要使用阴离子交换树脂即可。

此外，在制造内含DL—PGA分子或D—PGA分子的L—PGA交联体的情况下，在所述的L—PGA的溶液中混合DL—PGA分子及/或D—PGA分子的基础上，向所述的交联反应中提供该溶液即可。

[本发明中的水凝胶]

本发明中的水凝胶含有所述的本发明中的L—PGA交联体而成。本发明中的水凝胶由于内含L—PGA交联体而成，所以为无色透明，还具有生物降解性。

此外，在本说明书中，“水凝胶”是指通过聚合物内含水等溶剂进行溶胀形成的凝胶。换言之，是以聚合物和溶剂等水分作为主要成分的聚合物的溶剂溶胀体。水凝胶是含有大量的水、处于液体与固体的中间状态的物质，在流动性方面与液体不同。另外，即使进行挤压等加压，水凝胶中的溶剂也不会渗出。

就是说，本发明中的水凝胶可以说是以L—PGA交联体与溶剂为主要成分的溶剂溶胀体。

如本发明中的L—PGA交联体的制造方法中所述，本发明中的水凝胶可以通过向在水等溶剂中溶解L—PGA所得的溶液实施交联反应而得到。

另外，通过向所述的粉末状的L—PGA交联体中加入水等溶剂，可以得到本发明中的水凝胶。此时，只要在使该溶剂的量为少量的基础上得到水凝胶，就能够得到可以进一步吸收水等溶剂的吸水性出色的水凝胶。另外，在本发明中的构成水凝胶的L—PGA交联体中吸收的溶剂由于不从该水凝胶渗出，所以本发明中的水凝胶的保湿性出色。

本发明中的水凝胶也可以均一地造粒成规定的形状，另外，也可以为不定形破碎状、球状等。另外，不仅可以在卫生领域，而且还可以用于多种多样的领域。例如，可以用作作为保湿剂的化妆品、纸尿片等卫生用品、体液吸收体等医疗品等，还可以用作土壤改良剂。

作为保湿剂的化妆品，可以举出面部护理制品、手部护理制品、身体护理制品、头部护理制品以及头发护理制品、指甲护理制品或嘴部护理制品等。

以下显示实施例，进一步详细说明本发明的实施方式。当然，本发明不限定于以下实施例，具体细节可以为各种方式。进而，本发明不限定于所述的实施方式，可以在发明范围内进行各种变更，本发明的技术范围也包括适当地组合公开的各技术手段得到的实施方式。

<3；皮肤外用剂>

[本发明中的皮肤外用剂]

本发明中的皮肤外用剂只要含有L—PGA及L—PGA交联体中的至少一种即可，其他具体结构不被特别限定。

L—PGA由于是L—谷氨酸结合而成的，所以旋光性均一，每个分子的性质也均一。因而，也能以理想的质量稳定地制造从L—PGA得到的L—PGA交联体。因此，通过使用L—PGA及L—PGA交联体中的至少一种，可以稳定地提供具有理想质量的皮肤外用剂。

进而，由于L—PGA及L—PGA交联体的保湿性出色，所以本发明中的皮肤外用剂可以优选用作保湿剂及/或化妆品。

在将本发明中的皮肤外用剂用作保湿剂的情况下，具体而言，可以优选用作面部护理制品、手部护理制品、体部护理制品、头部护理制品以及头发护理制品、指甲护理制品或嘴部护理制品等。

另外，将本发明中的皮肤外用剂用作化妆品的情况下，具体而言，可以优选用作乳液、美容液、霜、化妆水、洗面品、卸妆品等脸部护理制品，手部护理制品，除此以外，还有身体护理制品、足部护理制品、头部护理制品以及头发护理制品、指甲护理制品或嘴部护理制品等。

此外，在本说明书中，“皮肤”是指脸、颈、胸、背、手臂、脚、手及头皮的皮肤。另外，在本说明书中，“皮肤外用剂”是指为了改善干燥、粗糙皮肤等皮肤状态或者抑制皮肤状态的恶化而使用的物质。

(L—PGA)

本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA是结合有L—谷氨酸而成的均聚物，其结构具有所述式(1)所示的结构。

作为本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA的平均分子量，只要对应皮肤外用剂的用途等适当地选择即可，优选为130万以上，更优选为200万以上，进而优选为350万以上。

L—PGA的平均分子量越高，则内含该L—PGA的皮肤外用剂的保湿性越提高。因此，对L—PGA的平均分子量的上限值没有特别限定。此外，如果利用后述的L—PGA的制造方法，则可以得到平均分子量600万、最大1500万的L—PGA。

此外，所述“平均分子量”如上述<1>栏的定义所述。

作为本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA，只要使用利用过去公知的各种方法得到的L—PGA即可，例如只要使用生产L—PGA的微生物(以下简单地记载成“L—PGA生产微生物”)得到的L—PGA即可。

(L—PGA生产微生物)

作为L—PGA生产微生物，只要是合成L—PGA的微生物即可，没有限定，只要使用L—PGA生产微生物的野生型、其变异株或利用基因重组技术赋予或强化了L—PGA的生产能力的微生物即可。具体而言，可以很好地使用所述<1>、<2>栏中记载的L—PGA生产微生物。

此外，过去在液体培养条件下难以筛选PGA生产微生物。这是因为，如果N.aegyptiaca在固体培养基表面形成粘液状的菌落，则由于菌落之间融合，所以难以分离单菌落。进而，即使可以分离单菌落，也不得不对每一株进行液体培养，来确认L—PGA的有无，所以需要庞大的时间和劳力。就是说，本发明中的皮肤外用剂是通过使用利用本发明人等独自发现的筛选方法得到的高分子量的L—PGA生产菌才开始成为可能的全新的皮肤外用剂。

(L—PGA的制造方法)

L—PGA的制造方法可以优选使用上述<1>、<2>栏中记载的方法，因此在此省略对其说明。

可以利用以上方式得到内含L—PGA的溶液。进而，如果对得到的溶液进行冻干等，则可以得到粉末状的L—PGA交联体。另外，根据需要，也可以进一步进行该溶液的纯化。纯化只要用过去公知的方法进行即可，例如可以进行上述的透析，只要使用阴离子交换树脂即可。

(L—PGA交联体)

本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体只要具有L—PGA分子之间的交联结构即可，对其他具体结构没有特别限定。

对所述“交联结构”及“交联体”的定义与上述<2>栏相同。

构成本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体的L—PGA的平均分子量只要其分子之间交联即可，没有限定，优选为100万以上，更优选为200万以上，进而优选为350万以上。如果分子量为100万以上，则从作为原料的L—PGA制造水凝胶时的凝胶化率提高，所以可以提高水凝胶的收率。

L—PGA的平均分子量越高，则得到的L—PGA交联体的吸水倍率越提高。因此，对构成本发明中的L—PGA交联体的平均分子量的上限值没有特别限定。

对本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体的吸水倍率没有特别限定，而如果利用后述的本发明中的L—PGA交联体的制造方法，则可以很好地得到例如10倍以上、5000倍以下，特别是1900倍以上、4400倍以下的吸水倍率。尤其作为将PGA作为材料的吸水性树脂，吸水倍率大于3300倍的吸水性树脂是在所述专利文献2中即使使用DL—PGA也不能得到的划时代的PGA性的生物降解性吸水性树脂。

所述“吸水倍率”如上述<2>栏所述。

此外，作为本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体，优选为只由L—PGA构成的交联体，但也可以含有DL—PGA分子或D—PGA分子。其中，为了使制造的每个L—PGA交联体的质量稳定，其含量优选为0重量％以上、20重量％以下。

[L—PGA交联体的制造方法]

本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体的制造方法只要包括使L—PGA的分子之间交联的交联工序即可，具体而言，与所述<2>栏的说明相同。

作为为了制造本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体而使用的L—PGA，只要使用利用过去公知的各种方法得到的L—PGA即可，例如只要使用所述的L—PGA即可。

此外，在制造内含DL—PGA分子或D—PGA分子的L—PGA交联体的情况下，在所述的L—PGA的溶液中混合DL—PGA分子及/或D—PGA分子的基础上，向所述的交联反应中提供该溶液即可。

作为本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA交联体，也可以使用内含L—PGA交联体而形成的水凝胶。具体而言，例如可以使用上述<2>栏记载的内容。

(皮肤外用剂的组成)

对本发明中的皮肤外用剂中内含的L—PGA及L—PGA交联体中的至少一种的浓度没有特别限定，在只含有L—PGA的情况下，优选为0.00001～30重量％，进而优选为0.0001～20重量％，在只含有L—PGA交联体的情况下，优选为0.00001～30重量％，进而优选为0.0001～20重量％，在含有L—PGA及L—PGA交联体的情况下，其总量优选为0.00001～30重量％，进而优选为0.0001～20重量％。如果在该范围内，则臭味少，色调也好。进而，还由于发挥高保湿性，所以作为保湿剂及/或化妆品，可以得到更有用的皮肤外用剂。

本发明中的皮肤外用剂只要将L—PGA及L—PGA交联体中的至少一种溶解于过去公知的溶剂来制作即可。作为在本发明中的皮肤外用剂的制作中使用的溶剂，没有特别限定，只要使用水等即可。

另外，也可以根据使用目的等，在不破坏本发明的效果的范围内，适当地向本发明中的皮肤外用剂中添加通常在化妆品、医药辅助品、医药品等皮肤外用剂中通常使用的添加剂，例如烃类、油脂类等油性成分，蜡类、硅酮类、醇类、脂肪酸、抗氧剂、抗菌剂、紫外线吸收剂、药剂、净化水等水性成分，植物的提取物、中和剂、L—PGA及L—PGA交联体以外的保湿剂，增稠剂、防腐剂、表面活性剂、香料、着色剂、各种皮肤营养剂等添加物。

以下举出这些添加物的具体例，但不限定于此。另外，这些添加物可以单独使用，也可以混合使用2种以上。

作为上述烃类，例如可以举出液体石蜡、三十碳烷、微晶蜡、地蜡(ceresine wax)、石蜡、凡士林等。

作为上述油脂类，例如可以举出鳄梨油(avocado oil)、山茶油、澳洲坚果(macadamia nut)油、橄榄油、羊毛脂、蓖麻油、橄榄油、葡萄籽油、可可油、椰子油、树蜡、荷荷巴油等植物油脂类。

作为上述蜡类，例如可以举出荷荷巴油、巴西棕榈蜡、小烛树蜡(candelilla wax)、蜂蜡、鲸蜡等。

作为上述硅酮类，例如可以举出二甲基聚硅氧烷、甲基苯基硅氧烷等。

作为上述醇类，例如可以举出辛醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、胆固醇、植物甾醇、鲸蜡醇(cetanol)、硬脂醇、己基肉桂醛(hexyldecanol)、辛基十二烷醇等高级醇类，乙醇等低级醇类。

作为上述脂肪酸，例如可以举出癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸、羊毛脂脂肪酸、亚油酸、亚麻酸、月桂酸、油酸、异硬脂酸等高级脂肪酸等。

作为上述抗氧剂，例如可以举出丁基羟基甲苯、生长酚、非丁等。

作为上述抗菌剂，例如可以举出上述苯甲酸、水杨酸、山梨酸、对羟基苯甲酸烷基酯、六氯双酚基甲烷等。

作为上述紫外线吸收剂，例如可以举出对氨基苯甲酸系紫外线吸收剂、氨茴酸系紫外线吸收剂、水杨酸系紫外线吸收剂、桂皮酸系紫外线吸收剂、二苯甲酮系紫外线吸收剂、糖系紫外线吸收剂、3—(4’—甲基亚苄基)—d—樟脑、3—亚苄基—d、1—樟脑、尿刊酸、尿刊酸乙酯、2—苯基—5—甲基苯并噁唑、2，2’—羟基—5—甲基苯基苯并三唑、2—(2’—羟基—5’—叔辛基苯基)苯并三唑、2—(2’—羟基—5’—甲基苯基)苯并三唑、ジベンザラジン、联茴香酰甲烷、4—甲氧基—4’—叔丁基苯甲酰基甲烷、5—(3，3—二甲基—2—降冰片烯基)—3—戊烷—2—酮等。

作为药剂，例如可以举出甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、牛磺酸、精氨酸、组氨酸等氨基酸，或者，它们的碱金属盐和盐酸盐；酰替肌氨酸(例如月桂酰肌氨酸)、谷胱甘肽、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸等有机酸；烟酰胺，烟酸苄基酯，γ—谷维素，尿囊素，干草酸(盐)，干草次酸及其衍生物，目柏醇，没药醇，桉树脑醇(ユ—カルプト—ン)，百里酚，肌醇，柴胡皂苷、胡萝卜皂角苷、丝瓜皂角苷、无患子皂角苷等皂角苷类，泛酰乙醚、乙炔雌二醇、凝血酸、熊果苷、千金藤素、胎盘萃取物等。

作为上述各种皮肤营养剂，可以举出维生素A及其衍生物、维生素B2、泛酸及其衍生物、烟酸、生物素及它们的混合物。

作为上述中和剂，没有特别限定，例如可以举出氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、2—氨基—2—甲基—1—丙醇、2—氨基—2—甲基—1，3—丙二醇、三乙醇胺等。

作为上述表面活性剂，例如可以举出聚环氧乙烷月桂基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯硬脂酰醚、聚氧乙烯油酰基醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧烷基烯丙基醚、聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、聚环氧乙烷衍生物、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、山梨糖醇酐倍半油酸酯、山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酰酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、1—聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇酐、聚乙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯羊毛脂等非离子系表面活性剂，或甘油型、烷基氨基甜菜碱型、咪唑啉型、L—藻蛋白宁型、L—蓖麻蛋白型等双性表面活性剂。

作为所述L—PGA及L—PGA交联体以外的保湿剂，例如可以举出甘油、丙二醇、1，3—丁二醇、聚乙二醇等多元醇，葡萄糖、山梨糖醇、糊精、海藻糖、乳糖等糖类及其衍生物，谷氨酸钠、角蛋白衍生物、胶原衍生物、三甲基甘氨酸等氨基酸类及其衍生物，羧基乙烯基聚合物、硫酸软骨素钠、透明质酸钠、吡咯烷酮羧酸钠、乳酸钠等水溶性高分子，海藻萃取物、酵母萃取物、具有保湿作用的各种植物萃取物以及它们的混合物等，棕榈酸异丙基酯、肉豆蔻酸异丙基酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、油酸辛基十二烷基酯、油酸胆固醇基酯等酯类，聚丙烯酸钠、结晶性纤维素、各种植物精油以及它们的混合物。另外，还可以将所述的植物油脂类、蜡类、脂肪酸类、高级醇类用作保湿剂。

作为上述增稠剂，例如可以举出苍耳烷等水溶性多糖类，羟甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素等水溶性纤维素类，支链淀粉、聚丙烯酸钠等水溶性高分子等。

作为上述防腐剂，例如可以举出对羟基苯甲酸酯、水杨酸、苯甲酸、苯氧基乙醇、葡糖酸氯已定等。

作为上述香料，例如可以举出香草醛、橙香精(orange flavor)、柠檬香精(lemon flavor)、牛奶香精(milk flavor)、香茅醇、沉香醇等。

作为上述着色料，可以举出水溶性的焦油系色素、水不溶性的焦油系色素、栀子系色素、染料红花系色素、糖醛酸内酯系色素、辣椒粉色素、胭脂树橙、胭脂虫红色素等天然色素，酸性、碱性色素。

还可以添加例如羊蹄、クララ、日本萍蓬草、香橙、鼠尾草、欧蓍草、锦葵、当药、百里香、当归、干橙皮、バ—チ、笔头菜、丝瓜、欧洲七叶树、虎耳草、山金车花、百合、艾蒿、芍药、芦荟、栀子、花柏、白百合等植物的萃取物等。

以下显示实施例，进一步详细说明本发明的实施方式。当然，本发明不限定于以下实施例，具体细节可以为各种方式。进而，本发明不限定于所述的实施方式，可以在发明所示的范围内进行各种变更，本发明的技术范围也包括适当地组合公开的各技术手段得到的实施方式。

另外，在本说明书中记载的全部学术文献及专利文献在本说明书中作为参考引用。此外，以下实施例所示的“％”全部为“重量％”。

实施例

以下显示实施例具体说明本发明，但本发明不限定于实施例。

(实施例1；NTG诱变处理方法)

用铂接种环刮取一铂接种环N.aegyptiaca(JCM11194，从独立行政法人理化学研究所购入)的单菌落，接菌于3ml的PGA生产液体培养基—1(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸，pH7.2)/18ml容积试管，在37℃、300rpm下培养3天。将得到的培养液0.5ml接菌于50ml的PGA生产液体培养基—1/500ml容积坂口烧瓶，在37℃、180rpm下培养5天。将得到的培养液以3000rpm离心5分钟，收集菌体。向收集的菌体中加入100mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)，再次悬浮。反复进行该操作3次。分别加入用灭菌水将已悬浮的溶液的1/10量的饱和NTG溶液(东京化成株式会社)稀释为70％、50％、20％、10％而形成的溶液，在42℃、150rpm下培养1小时。处理后，接种于PGA生产琼脂培养基—1(10％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)，在37℃下培养5天。

将条件设定成生存率为1％以下(饱和NTG溶液为70％的条件)。

(实施例2；聚—γ—L—谷氨酸高生产菌筛选)

将利用生存率为1％以下的条件得到的菌落接种于PGA生产琼脂培养基—1(10％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)以及PGA生产琼脂培养基—2(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)，37℃下培养6天。培养后，选择即使在PGA生产液体培养基—1的培养条件下也能生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株，再次将得到的变异株接种于PGA生产琼脂培养基—1上，确认重现性。用铂接种环刮取—铂接种环确认过再现性的变异株的单菌落，接菌于3ml的PGA生产液体培养基—1/18ml容积试管，在37℃、300rpm下培养3天。将得到的培养液0.5ml接菌于50ml的PGA生产液体培养基—1/500ml容积坂口烧瓶，在37℃、180rpm下培养3天，将培养基中的聚—γ—L—谷氨酸进行1/5倍稀释，利用safranine法测定。筛选与母株相比聚—γ—L—谷氨酸的生产率提高的变异株。利用上述方法筛选30,000株，结果，获得3株聚—γ—L—谷氨酸高生产变异株。

这样地进行得到的菌株作为Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)，被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心中。

(实施例3；变异株的聚—γ—L—谷氨酸生产率比较)

利用实施例2的培养条件培养在实施例2中得到的0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)与母株(JCM11194)。如图1所示，FERM BP—10749在培养液中显示出4.99g/L的聚—γ—L—谷氨酸的生产率。与此相对，母株为0.61g/L的生产率。

(实施例4；聚—γ—L—谷氨酸的纯化)

用铂接种环刮取一铂接种环按照上述实施例得到的保藏编号：FERMBP—10749的单菌落，接菌于3ml的PGA生产液体培养基—1(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸)/18ml容积试管×5支，在37℃、300rpm下培养3天。将得到的培养液0.5ml接菌于50ml的PGA生产液体培养基—1/500ml容积坂口烧瓶×10支，在37℃下培养5天。将得到的培养液离心，除去菌体。接着，向得到的上清液中加入3倍量的水稀释，然后将pH调整至3.0。在pH调整之后，在室温下搅拌5小时。然后，加入3倍量的乙醇，进行离心分离，将聚—γ—L—谷氨酸作为沉淀物收集。使沉淀物溶解于0.1mM Tris—HCl缓冲液(pH8.0)中，为了除去高分子物质而进行透析。透析之后，为了从得到的液体中出除去核酸，按照MgCl₂为1mM、DNaseI(TAKARA公司制)为10U/ml、RNaseI(NIPPON GENE公司制)为20μg/ml的方式加入相应物质，在37℃下培养2小时。接着，为了除去蛋白质，在37℃下培养5小时进行3U/ml蛋白酶K(TAKARA公司制)处理。在蛋白酶K处理后，用MilliQ水透析除去低分子物质。透析之后，使聚—γ—L—谷氨酸吸附于阴离子交换树脂、Q sepharose Fast Flow(AmershamBiosciences公司制)，洗涤之后，用1M NaCl洗脱。用MilliQ水透析所得到的溶液，并冻干透析后的溶液，由此，得到聚—γ—L—谷氨酸·Na盐。

(实施例5；聚—γ—L—谷氨酸·Na盐的GPC分析)

利用GPC分析测定得到的聚—γ—L—谷氨酸·Na盐的平均分子量。另外，还进行IR分析。

GPC分析的结果，确认为Mw＝7,522,000、Mn＝3,704,000、Mw/Mn＝2.031(支链淀粉换算)。

其中，所述GPC的分析条件如下所述。

装置：HLC—8220GPC(东曹公司制)

柱：TSKgelα—M(东曹公司制)

流速：0.6ml/min

洗脱液：0.15M NaCl水溶液

柱温度：40℃

注入量：10μl

检测器：差示折射计

IR分析的结果显示为Na盐(图2)。

(实施例6；聚—γ—L—谷氨酸的游离体的GPC分析及IR分析)

在实施例4的聚—γ—L—谷氨酸纯化工序中，使其吸附于阴离子交换树脂、Q sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences公司制)，洗涤之后用1M NaCl洗脱，然后利用1N HCl将聚—γ—L—谷氨酸含有液的pH调整成pH2.0。然后，用MilliQ水透析并冻干，由此，得到聚—γ—L—谷氨酸·游离体。利用GPC分析测定所得到的聚—γ—L—谷氨酸游离体的平均分子量。另外，还进行IR分析。

GPC分析的结果，确认为Mw＝2,888,000、Mn＝1,327,000、Mw/Mn＝2.176(支链淀粉换算)。

其中，所述GPC的分析条件如实施例5所述。

IR分析的结果显示为游离体(图3)。

(实施例7；聚—γ—L—谷氨酸的结构确认)

图4是在实施例4中得到的聚—γ—L—谷氨酸的H—NMR的光谱(500MHz)。使用重水进行测定。

(实施例8；聚—γ—L—谷氨酸的制造)

在Natrialba aegyptiaca(保藏编号：FERM BP—10749)的L干燥安瓿中，加入0.4ml的PGA生产液体培养基(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸)，得到悬浮液。将0.2ml的该悬浮液接种于PGA琼脂培养基(10％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸、2％琼脂)，在37℃下培养3天，得到单菌落。

接着，分别向5支18ml容积试管中，加入3ml的PGA生产液体培养基(22.5％NaCl、2％MgSO₄·7H₂O、0.2％KCl、3％柠檬酸三钠、1％酵母提取物、0.75％酪蛋白氨基酸，pH7.2)，接着，用铂接种环刮取一铂接种环上述单菌落，接菌。接菌后的试管在37℃、300rpm下培养3天，进而将得到的培养液0.5ml接菌于10支已加入了50mlPGA生产液体培养基的500ml容积坂口烧瓶中，在37℃下培养5天。培养后，离心所得到的培养液，除去菌体，收集上清。

接着，向收集的上清中加入3倍量的水稀释，然后用1N硫酸将pH调整至3.0。在pH调整之后，在室温下搅拌5小时。然后，加入3倍量的乙醇，进行离心分离，收集沉淀物。该沉淀物为L—PGA。

使收集的L—PGA溶解于0.1mM Tris—HCl缓冲液(pH8.0)中，为了除去低分子物质等杂质而进行透析。接着，为了除去透析后的液体中含有的核酸，向该液体中按照MgCl₂为1mM、DNaseI(TAKARA公司制)为10U/ml、RNaseI(NIPPON GENE公司制)为20μg/ml的方式添加相应物质，在37℃下培养2小时。接着，为了除去蛋白质，向除去核酸之后的液体中加入3U/ml蛋白酶K(TAKARA公司制)，在37℃下培养5小时，进行蛋白酶K处理。

在蛋白酶K处理后，用超纯水透析，除去低分子物质。接着，使L—PGA吸附于阴离子交换树脂(Q sepharose Fast Flow，GE HealthcareBioscience公司制)，用0.5M的NaCl水溶液洗涤之后，用1M NaCl水溶液洗脱。进一步用超纯水透析得到的溶液，并冻干透析后的溶液，由此，得到L—PGA的钠盐(以下记载为“L—PGA·Na盐”)。其中，超纯水用MilliQ(Millipore公司制的纯水制造装置)制作。

(实施例9；聚—γ—L—谷氨酸的分子量分析—1)

利用GPC分析测定在实施例8中得到的L—PGA·Na盐的平均分子量。结果，确认为Mw＝7,522,000、Mn＝3,704,000、Mw/Mn＝2.031(支链淀粉换算)。

其中，所述GPC的分析条件如下所述。

装置：HLC—8220GPC(东曹公司制)

柱：TSKgel α—M(东曹公司制)

流速：0.6ml/min

洗脱液：0.15M NaCl水溶液

柱温度：40℃

注入量：10μl

检测器：差示折射计

(实施例10；聚—γ—L—谷氨酸的分子量分析—2)

在实施例8中，吸附于阴离子交换树脂的L—PGA的洗脱是用0.7M、0.8M、1.0M的NaCl水溶液的逐级洗脱，除此以外，利用GPC分析测定进行与实施例8相同的操作得到的L—PGA·Na盐的平均分子量。结果确认为：利用0.7M NaCl水溶液的洗脱得到的L—PGA·Na盐为Mw＝2,135,000、Mn＝1,021,000、Mw/Mn＝2.091；利用1.0M NaCl水溶液的洗脱得到的L—PGA·Na盐为Mw＝7,522,000、Mn＝3,704,000、Mw/Mn＝2.031(支链淀粉换算)。其中，本实施例中的GPC分析利用与实施例9相同的操作进行。

(实施例11；聚—γ—L—谷氨酸的结构确认)

将在实施例8中得到的L—PGA·Na盐提供到H—NMR，分析其结构。将其结果示于图5。其中，利用H—NMR的分析利用以下条件进行。装置：傅立叶转换核磁共振装置(BRUKER制AVENCE500)，测定溶剂：重水，样品溶液浓度：0.5～1.0％，¹H共振频率：500MHz，化学位移基准：TSP(三甲基甲硅烷基丙酸钠—2，2，3，3—d4)，δ＝0.0ppm。

(实施例12；水凝胶的制作和吸水倍率的评价)

在本实施例中，使用在实施例8及实施例10中得到的L—PGA·Na盐这2种来探讨用于使L—PGA交联的γ射线的照射线量、照射γ射线的L—PGA·Na盐水溶液的浓度和所得到的L—PGA交联体的吸水倍率之间的关系。

首先，对这2种L—PGA·Na盐，分别制作成2重量％水溶液及2重量％水溶液，得到共4种L—PGA·Na盐水溶液。

接着，使用氮对各L—PGA·Na盐水溶液进行3分钟鼓泡，然后分别取2ml装于带盖的10ml样品瓶中，盖上盖子。如后所述，在本实施例中，为了对6种γ射线照射线量进行探讨，对该4种L—PGA·Na盐水溶液分别制作6只该样品瓶，共制作24只。

接着，使用线源为钴60的γ射线照射装置，向各样品瓶照射γ射线。对于该6只样品瓶，照射线量分别为照射1kGy、3kGy、5kGy、7kGy、10kGy、20kGy。从样品瓶中取出经γ射线照射后得到的生成物，用80目的金网甩去多余的水分，并冻干，由此，得到L—PGA交联体粉末。其中，上述多余的水分中含有未交联的L—PGA，该甩去水分的主要目的是为了除去未交联的L—PGA。

接着，为了使该L—PGA交联体粉末溶胀而向足够量的水中加入得到的L—PGA交联体粉末，静置1周。静置后，通过用80目的金网过滤，除去未交联的L—PGA，得到水凝胶。

用本实施例得到的水凝胶的湿重量减去在该水凝胶的制作中使用的L—PGA交联体粉末的干燥重量得到一个值，并用该L—PGA交联体的粉末的干燥重量除所得的值，由此，算出利用本实施例得到的L—PGA交联体的吸水倍率。

将算出的L—PGA的吸水倍率与在L—PGA交联体的制作中照射的γ射线的照射线量之间的关系的比较结果示于表1、表2、图6及图7。表1及图6是在制作L—PGA交联体时使用2重量％的L—PGA·Na盐水溶液的情况，图6是将表1所示的数值绘成曲线图而成的结果。表2及图7是在制作L—PGA交联体时使用5重量％的L—PGA·Na盐水溶液的情况，图7是将表2所示的数值绘成曲线图而成的结果。另外，表1及表2所示的数值是从上述2种L—PGA·Na盐得到的L—PGA交联体的吸水倍率的平均值。其中，在图6及图7中，纵轴表示吸水倍率，横轴表示γ射线的照射线量。

[表1]

 

照射线量	1kGy	3kGy	5kGy	7kGy	10kGy	20kGy
							吸水倍率	220	2480	4400	1900	370	240

[表2]

 

照射线量	1kGy	3kGy	5kGy	7kGy	10kGy	20kGy
							吸水倍率	10	2560	3900	2400	1400	300

如表1、表2、图6及图7所示，可以确认在本实施例中得到的L—PGA交联体的吸水倍率为10倍～4400倍。

(实施例13；凝胶化率的评价)

在本实施例中，探讨为了使L—PGA交联而使用的γ射线的照射线量与从L—PGA制作水凝胶时的凝胶化率的关系。

首先，测定在实施例12中使用的γ射线照射前的L—PGA·Na盐的干燥重量(将该干燥重量作为“投入的L—PGA重量”)。接着，测定在实施例12中得到的L—PGA交联体的粉末的干燥重量(将该重量作为“交联L—PGA重量”)。接着，算出交联L—PGA重量相对加入L—PGA重量的比例(％)，将其作为凝胶化率。表3所示的值为使用上述4种L—PGA·Na盐水溶液而制作的水凝胶的凝胶化率的、向该L—PGA盐水溶液照射的γ射线的每一种照射线量的平均值。

[表3]

 

照射线量	1kGy	3kGy	5kGy	7kGy	10kGy	20kGy
							凝胶化率	35	90	98	94	90	86

[实施例14；根据聚—γ—L—谷氨酸水凝胶的批间差得出的吸水倍率]

利用与实施例8记载的方法相同的方法，进行3次L—PGA(将得到的L—PGA分别作为批次A、批次B、批次C)的制造。利用与实施例12所述的方法相同的方法，将γ射线的照射线量设为5kGy，由批次A～C的L—PGA，制作水凝胶。进而，利用与实施例12记载的方法相同的方法，算出由批次A～C的L—PGA得到的水凝胶的吸水倍率。将其结果示于表4。

[表4]

 

批次	A	B	C
				吸水倍率	4400	4160	3900

如表4所示，确认了重复性高，即使使用不同批次的L—PGA也可以稳定地制造一定性质的水凝胶。

(比较例1；使用聚—γ—DL—谷氨酸的水凝胶的制作)

使用平均分子量为150万～250万及400万～600万这2种DL—PGA钠盐(和光纯药制)，除此以外，进行与实施例12相同的操作，尝试制造DL—PGA水凝胶。但是，所有DL—PGA钠盐均不能得到DL—PGA的水凝胶。因而，在从DL—PGL获得DL—PGA的水凝胶时的凝胶化率如表5所示，全部为零。此外，由于不能获得DL—PGA交联体，所以不能算出吸水倍率。

[表5]

 

照射线量	1kGy	3kGy	5kGy	7kGy	10kGy	20kGy
							L—PGA	35	90	98	94	90	86
DL—PGA	0	0	0	0	0	0

(实施例15；聚—γ—L—谷氨酸交联体的制作)

制作在实施例8中得到的L—PGA·Na盐的5％水溶液。

接着，使用氮对各L—PGA·Na盐水溶液进行3分钟鼓泡，然后分别取2ml装于带盖的10ml样品瓶中，盖上盖子。

接着，使用线源为钴60的γ射线照射装置，向样品瓶照射γ射线。以照射线量为5kGy的方式进行照射。从样品瓶中取出经γ射线照射后得到的生成物，用80目的金网甩去多余的水分，之后通过冻干，得到L—PGA交联体粉末。其中，所述多余的水分中含有未交联的L—PGA，该甩去水分的主要目的是除去未交联的L—PGA。

(实施例16；利用干燥皮肤粗糙模型对聚—γ—L—谷氨酸的保湿性进行评价)

按照试验皮肤(东洋纺织株式会社制：Code No.LSE—002)配套部件随带的操作说明，取出LSE(Living Skin Equivalent)组织。接着，将该LSE组织置于分析盘(所述试验皮肤附带)内，在干燥状态(在调整成温度为37℃、相对湿度为15％RH的CO₂培养箱内)下静置7小时。由此，获得角质层的水分蒸发后的干燥皮肤粗糙模型(以下记载为“干燥LSE组织”)。

接着，分别利用微量移液器向各干燥LSE组织的表面各滴注70μl的0.5％DL—PGA水溶液、2.5％DL—PGA水溶液、0.5％L—PGA、2.5％L—PDA水溶液。其中，作为L—PGA，使用在实施例8中得到的L—PGA·Na盐。另外，作为DL—PGA，使用和光纯药制的DL—PGA·Na盐。

接着，在置有干燥LSE组织的分析盘下部，添加分析培养基(附带于所述试验皮肤配套部件)600μl，然后静置于调整成温度37℃、相对湿度15％RH的CO₂培养箱内，培养24小时。然后，从CO₂培养箱中取出干燥LSE组织，按照上述试验皮肤配套部件附带的操作说明，将内含四氮唑盐(MTT)试药0.333g/ml的分析培养基(附带于上述试验皮肤配套部件)的混合液600μl放入分析盘，通过在调整成温度37℃、相对湿度15％RH的CO₂培养箱内培养3小时，向该干燥LSE组织实施MTT处理。

在MTT处理之后，使用Biopsy Punch(东洋纺织公司制；直径8mm)，将干燥LSE组织的中央部连同该干燥LSE组织的下部的聚碳酸酯膜一起打穿。接着，将打穿的切片移至试管，加入300μl0.04N盐酸—异丙醇，在暗处静置2小时。接着，搅拌该试管中的溶液，充分地使其混合，然后3,000rpm下离心5分钟，得到上清。接着，通过测定572nm的吸光度算出在该上清200μl中含有的蓝紫色甲暨(formazan)的量。

结果示于图8。图8是保湿性评价结果的图，纵轴表示当将未实施干燥处理的LSE组织中提取的甲暨的量设为100％时的甲暨的量(吸光度)，横轴表示各样品的种类。其中，在图8中，“干燥未处理”表示没有实施干燥处理的LSE组织，“无试剂”是指没有对实施了干燥处理的LSE组织滴注纯水、DL—PGA水溶液及L—PGA水溶液的任意一种。即，图8表示对干燥未处理的样品直接实施MTT处理并测定甲暨的量的结果、以及对所述的干燥LSE组织直接实施MTT处理并测定甲暨的量的结果。

需要说明的是，利用在本实施例中记载的方法得到的吸光度(甲暨的量)与皮肤粗糙改善效果有密切的关系，是可以定量地、简易且经济地实施人的干燥皮肤粗糙的状态评价的有效的干燥皮肤粗糙改善评价方法。

从图8可知，在滴注过去被用作保湿剂的市售的DL—PGA的2.5％水溶液时，结果甲暨的量即皮肤粗糙的恢复率为30％，与此相对，滴注L—PGA的2.5％水溶液，结果显示60％的皮肤粗糙恢复率。这样，与过去的市售品相比，L—PGA显示出约2倍的皮肤粗糙恢复率，显示具有高保湿性。

(实施例17；利用人皮肤粗糙试验的聚—γ—L—谷氨酸交联体水凝胶的保湿效果)

通过使0.5％SDS溶液接触人上臂内部10分钟，进行SDS处理，形成皮肤粗糙的状态。另一方面，将在实施例16中得到的L—PGA交联体粉末混合于水中，成为0.15％，得到水凝胶。

接着，将该水凝胶涂布于上述皮肤粗糙的状态的人上臂内部，在室温(23℃)、湿度45％的恒温恒湿房间内静置1小时。接着，用角质层水分量测定器(IBS株式会社制，商品名：スキコン)测定静置后的人上臂内部(样品D)的皮肤角质层水分量。

对SDS处理前的人上臂内部(样品A)实施SDS处理之后、对该水凝胶涂布前的人上臂内部(样品B)实施SDS处理之后，涂布水来代替该水凝胶，并在上述恒温恒湿房间中，对在与上述条件相同的条件下静置之后的人上臂内部(样品C)进行同样的皮肤角质层水分量测定。

结果示于图9。图9是表示人皮肤粗糙试验的结果的图，纵轴表示皮肤角质层水分量，横轴表示样品的种类。在图9中，A～D分别对应上述样品A～D。

如图9所示，对于样品D，得到了高皮肤角质层水分量，显示角质层水分量得到恢复。

此外，在用于实施发明的最佳方式的项中完成的具体的实施方式或实施例只是为了明确本发明的技术内容，不应该限定于这样的具体例而被狭义地解释，在本发明的精神和后面记载的发明范围内，可以实施各种变更。

产业上的可利用性

通过本发明，利用液体培养等可大量地配制均一的光学纯度且高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。更具体而言，利用本发明，可以在每1L培养液中以高达4.99g以上的生产率取得数均分子量为130万以上而且均一光学纯度的聚—γ—L—谷氨酸。

如上所述，本发明中的L—PGA交联体具有L—PGA分子之间的交联结构。因此，具有能够以理想质量稳定地提供生物降解性及吸水性出色的L—PGA交联体的效果。

另外，如果利用本发明中的L—PGA交联体的制造方法，则包括使L—PGA分子之间交联的交联工序。因此，具有能够以理想质量稳定地提供生物降解性及吸水性出色的L—PGA交联体的效果。进而，由于由L—PGA得到L—PGA交联体时的凝胶化率高，所以具有能够以高制造效率制造L—PGA交联体的效果。

另外，本发明中的水凝胶含有本发明中的L—PGA而成。因此，具有能够稳定地制造具有理想质量的水凝胶的效果。

如上所述，本发明中的皮肤外用剂含有L—PGA及L—PGA交联体中的至少一种。因此，具有能够稳定地提供具有理想质量的皮肤外用剂的效果。即，所述L—PGA只由L—谷氨酸结合而成，所以旋光性均一而且分子量高，具有出色的保湿性，可以通过在皮肤外用剂中含有L—PGA及/或L—PGA的交联体，稳定地提供具有理想质量的皮肤外用剂。

另外，L—PGA及L—PGA交联体具有出色的保湿性，所以尤其具有可以提供用作化妆品、保湿剂的皮肤外用剂的效果。

根据本发明，用液体培养等可大量地配制均一的旋光性且高分子量的聚—γ—L—谷氨酸，培养也非常容易，所以会给产业界带来极大的帮助。

另外，本发明中的L—PGA交联体及本发明中的水凝胶可以应用于纸尿片等卫生领域、医疗领域、建筑领域、食品领域、农业·园艺领域等广泛的领域。

进而，根据本发明，利用均一的旋光性且高分子量的聚—γ—L—谷氨酸、聚—γ—L—谷氨酸的交联体，可提供具有保湿性高于现有制品的皮肤外用剂，尤其会为化妆品业界带来极大的帮助。

Claims (34)

1.一种微生物，其特征在于，

在液体培养条件下，生产分子量为130万以上的聚—γ—L—谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，

聚—γ—L—谷氨酸的分子量为200万以上。

3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，

聚—γ—L—谷氨酸的分子量为350万以上。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的微生物，其特征在于，

诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物而得到。

5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，

在NaCl浓度为10％(w/v)以下的固体培养条件下呈粘液状。

6.根据权利要求4或5所述的微生物，其特征在于，

微生物为嗜盐菌。

7.根据权利要求4～6中任意一项所述的微生物，其特征在于，

嗜盐菌为极端嗜盐菌。

8.根据权利要求4～7中任意一项所述的微生物，其特征在于，

极端嗜盐菌为古细菌。

9.根据权利要求3～8中任意一项所述的微生物，其特征在于，

极端嗜盐性古细菌为Natrialba aegyptiaca。

10.根据权利要求1～9中任意一项所述的微生物，其特征在于，

微生物为Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)。

11.一种高分子量聚—γ—L—谷氨酸的制造方法，其特征在于，

培养权利要求1～10中任意一项所述的微生物，利用其培养液回收高分子量的聚—γ—L—谷氨酸。

12.根据权利要求11所述的高分子量聚—γ—L—谷氨酸的制造方法，其特征在于，

培养液中的盐浓度为5～30W/V％。

13.一种高分子量的聚—γ—L—谷氨酸，其是利用权利要求11或12所述的制造方法而得到的。

14.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为130万以上。

15.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为200万以上。

16.一种聚—γ—L—谷氨酸，其平均分子量为350万以上。

17.一种微生物，其特征在于，

微生物为Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)、或者Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)。

18.一种聚—γ—L—谷氨酸生产变异株的筛选方法，其特征在于，

至少包括下述(a)～(c)的各工序：

(a)诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物的工序，

(b)在母株不形成粘液状菌落的条件的固体培养条件下培养诱变处理后的该微生物，筛选呈粘液状的变异株的工序，

(c)在液体培养条件下培养在(b)中筛选出的变异株，进一步筛选出与母株相比能更显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株的工序。

19.一种聚—γ—L—谷氨酸生产变异株的筛选方法，其特征在于，

至少包括下述(a)～(c)的各工序：

(a)诱变处理具有聚—γ—L—谷氨酸的生产能力的微生物的工序，

(b)在NaCl浓度为15％(w/v)以下的固体培养条件下培养诱变处理后的该微生物，筛选呈粘液状的变异株的工序，

(c)在液体培养条件下培养在(b)中筛选出的变异株，进一步筛选出与母株相比能更显著地生产聚—γ—L—谷氨酸的变异株的工序。

20.一种聚—γ—L—谷氨酸交联体，其特征在于，

具有聚—γ—L—谷氨酸分子之间的交联结构。

21.根据权利要求20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其特征在于，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为100万以上。

22.根据权利要求20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其特征在于，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为200万以上。

23.根据权利要求20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其特征在于，

所述聚—γ—L—谷氨酸的平均分子量为350万以上。

24.根据权利要求20所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体，其特征在于，

吸水倍率为10倍以上、5000倍以下。

25.一种水凝胶，其特征在于，

含有权利要求20～24中任意一项所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体。

26.一种聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

包括使聚—γ—L—谷氨酸的分子之间交联的交联工序。

27.根据权利要求26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

在所述交联工序中，通过照射放射线使聚—γ—L—谷氨酸的分子之间交联。

28.根据权利要求27所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

所述放射线为γ射线。

29.根据权利要求26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

所述交联工序中的凝胶化率为50％以上、100％以下。

30.根据权利要求26所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

还包括使用Natrialba aegyptiaca合成所述聚—γ—L—谷氨酸的聚—γ—L—谷氨酸合成工序。

31.根据权利要求30所述的聚—γ—L—谷氨酸交联体的制造方法，其特征在于，

所述Natrialba aegyptiaca为从Natrialba aegyptiaca 0830—82株(保藏编号：FERM BP—10747)、Natrialba aegyptiaca 0830—243株(保藏编号：FERM BP—10748)以及Natrialba aegyptiaca 0831—264株(保藏编号：FERM BP—10749)构成的组中选择的至少一种菌株。

32.一种皮肤外用剂，其特征在于，

含有聚—γ—L—谷氨酸及聚—γ—L—谷氨酸交联体中的至少一种。

33.根据权利要求32所述的皮肤外用剂，其特征在于，

所述皮肤外用剂为化妆品。

34.根据权利要求32所述的皮肤外用剂，其特征在于，

所述皮肤外用剂为保湿剂。

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