JP2009079025A - アルブチン配合皮膚外用剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、高度精製が成されていないアルブチンが広いpH範囲で安定に配合され、安全性、保湿効果に優れたポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上の特性を生かしつつ、かつ、経時安定性にも優れた皮膚外用剤を提供することにある。
【解決手段】(a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含有することを特徴とする皮膚外用剤を提供することである。
【選択図】 なし
【解決手段】(a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含有することを特徴とする皮膚外用剤を提供することである。
【選択図】 なし
Description
本発明は、美白効果、保湿効果に優れた皮膚外用剤に関するものであり、更に詳しくは、アルブチンが安定に配合され、保存安定性に優れた皮膚外用剤に関する。
アルブチンはチロシナーゼの阻害活性を持っており、化粧品などの分野において美白剤としてよく用いられている。しかしながら、化粧品などの皮膚外用剤として用いる場合には、親水性が高く、皮膚吸収性が悪いなどの欠点があった。そこで、親油性の高い保湿性の物質等、他の成分と混合することで、肌への吸収性を向上させ、美白効果を高める工夫が求められていた。
一方、従来報告されている、皮膚に対して保湿効果を有する親油性の物質として、オリーブ油等の植物油、ラノリン等の動物由来の脂質等が挙げられる。また、皮膚に対して保湿効果を有する親水性の物質として、グリセリン、1,3−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の水溶性多価アルコール、ヒアルロン酸及びキサンタンガム等の多糖類、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子、ピロリドンカルボン酸塩、アミノ酸に代表される低分子量の天然保湿因子、植物抽出エキス等が挙げられる。
このように皮膚に対する保湿効果を有する物質として、様々な物質が存在するが、近年、安全性を重要視する風潮等から、動物由来の物質や、化学合成品は避けられる傾向にある。そして、天然物由来の物質や、微生物による発酵生産物が好ましいとされている。さらには、生体のみならず環境にも負荷の少ない生分解性素材が、期待され注目を浴びている。
生分解性素材の中でも、微生物が生産するバイオポリマーが有望視されている。バイオポリマーの中でも、アミノ酸が縮重合して構成されるポリアミノ酸と呼ばれる一群のバイオポリマーには、様々な機能が見出されており、その潜在能力に注目が集まっている。従来、ポリアミノ酸として、ポリ−γ−グルタミン酸(以下、「PGA」と表記する)、ポリ−ε−リジンおよびシアノファイシンの3種類が同定されている。
PGAは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。PGAは、古くから日本人に親しまれている納豆の糸引きの主体物質として知られる、吸水性のポリアミノ酸であるが、このように親しまれてきた背景として、その魅力的な機能性によるところが大きい。PGAの魅力的な機能としては、生分解性及び高吸水性を兼ね備えている点が知られている。これらの機能を利用して、上述した化粧料をはじめ、医療品、食品等、種々の分野、用途で用いられることが期待されている。
PGAとしては、L−グルタミン酸及びD−グルタミン酸の両光学異性体が不規則に結合してなるPGAが一般的であるが、L−グルタミン酸のみが結合してなるPGA(特許文献1、非特許文献1〜3)や、D−グルタミン酸のみが結合してなるPGA(非特許文献4)も報告されている。また、特許文献2では、PGAの架橋体を吸水性樹脂として用いている。
PGA架橋体は、PGAの一部が架橋した構造を有するものであり、その基本骨格は、アミノ基とカルボン酸が脱水縮合したポリペプチドからなるものである。PGA架橋体は、水を吸収して膨潤し、いったん吸収した水は荷重をかけても放出しにくいという性質を持っている。このようにPGA架橋体は高い保水性を有するとともに、生分解性があることでも知られている。
PGA架橋体の化粧料への応用として、例えば特開2001−72764号公報(特許文献3)ではPGA架橋体の化粧料素材としての使用性や生分解性が示され、また特開2003−12442号公報(特許文献4)では、使用時にべたつかないとともに、肌や毛髪へのなじみがよく、保湿効果に優れたPGA架橋体を配合した化粧料が示されている。
しかしながら、PGA架橋体を単純に化粧料組成物中に配合したのでは、長期経時において、加水分解による組成物の粘度低下が生じ、使用感が悪いという問題があった。
なお、本明細書では、説明の便宜のため、D−グルタミン酸及びL−グルタミン酸が結合してなるPGAを「DL−PGA」と表記する。また、D−グルタミン酸のみからなるPGAを「D−PGA」と表記し、L−グルタミン酸のみからなるPGAを「ポリ−γ−L−グルタミン酸」又は「L−PGA」と表記する。
上記従来のPGAを含有する皮膚外用剤では、所望の品質を有する化粧料を安定して製造することが困難であり、さらにアルブチンの美白効果を十分に発揮できないという問題点を有する。
上述のように、現在、製品化されているDL−PGAは、化学的にヘテロなポリマーである。具体的には、PGAは、納豆菌やその類縁菌から生産されているが、D−グルタミン酸及びL−グルタミン酸が不規則に結合しており、その含有比率や、配列は生産菌の培養毎に変動する。一般に、ポリアミノ酸の構造的特徴(構成するアミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など)は、その機能に強く影響を与える。上記DL−PGAは、分子毎に構造が異なるため、その性質も分子毎に異なる。これでは、所望の品質を有するDL−PGAを安定して製造することが困難である。
また、DL−PGAの保湿性は不十分であるため、皮膚外用剤としての実用化には大きな課題が残る。
ところで、従来、L−PGAを含む皮膚外用剤を製造したという報告はない。これには次の理由が考えられる。
一般に、PGAを用いて皮膚外用剤を製造する場合、保湿性が要求されるため、高分子量のPGAが不可欠である。一方で、従来、液体培養では、平均分子量が大きいL−PGAは得られていない。これでは、L−PGAを含有する皮膚外用剤を製造することを着想することすら困難である。
また、工業的な用途のPGAは、液体培養によって製造可能であることが要求される。平板培養では一度に大量の微生物を培養することが難しく、平板培地上からL−PGAを回収すると効率が悪いからである。
具体的には、L−PGAを合成する生物として、非特許文献1では好アルカリ性細菌Bacillus haloduransが開示され、非特許文献2ではヒドラが開示されている。しかし、これらの生物により合成されるL−PGAの分子量は10万程度であり、極めて小さい。
また、特許文献1及び非特許文献3では、好塩性古細菌であるNatrialba aegyptiacaは、平板培地で培養すれば、分子量10万〜100万程度のL−PGAを生産することが報告されている。しかし、当該Natrialba aegyptiacaが液体培養条件下で合成するL−PGAは、分子量10万程度であり、かつ、その合成効率は極めて低い。
一方、これまで得られているD−PGAは、産業上の利用に適していない。
何故なら、非特許文献4で開示されているD−PGAを合成する菌は、強い病原性を有する炭疸菌Bacillus anthracisだからである。産業上利用するPGAの製造に、炭疸菌を使用することは極めて不適切である。
ところで、特許文献2にはDL−PGAの架橋体が吸水性樹脂として用いられているが、DL−PGAの架橋体を皮膚外用剤として用いることは困難である。
特許文献2に開示されているDL−PGA架橋体の原料であるDL−PGAは、バチルス・ズブチルス等の納豆菌やその類縁菌によって合成されている。これでは原料となるDL−PGAの品質が一定しないため、安定して架橋体を得ることが困難である。本発明者らの検討においてもDL−PGAの架橋体は得られなかった。これは、上述のようにDL−PGAは、分子毎にその構造が異なるためであると考えられる。つまり、PGAの架橋体を作製する際の架橋効率は分子の構造に依存しており、分子毎の構造が不規則に異なる場合は、架橋効率が著しく低下する。よって、分子毎に構造が異なるDL−PGAを架橋させることは困難であり、架橋体の収率も極めて低いものとなる。
従って、DL−PGAの架橋体を用いても、所望の品質の皮膚外用剤を安定して製造することは困難である。
一方で、従来、L−PGAの架橋体を得たという報告はない。
これは、上述のように、液体培養では、平均分子量が大きいL−PGAは得られていないためである。低分子量の有機化合物の架橋体を得ることが極めて困難であることは技術常識であるため、当業者は、低分子量のL−PGAの架橋体を得ることを着想することすら困難である。そのため、L−PGAの架橋体を得ることを試みたという報告すら無い。 また、D−PGAの架橋体は、仮に得ることができたとしても、上述のようにD−PGAの生産菌は、現在炭疸菌のみであるため、産業上の利用に適していない。
本発明の課題は、上記のような課題に鑑み、高度精製が成されていないアルブチンが広いpH範囲で安定に配合され、安全性、保湿効果に優れたポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上の特性を生かしつつ、かつ、経時安定性にも優れた皮膚外用剤を提供することにある。
本発明者らは上記課題の解決のため、高い保湿性を有し、所望の品質を安定して製造することができる、天然物由来の生分解性素材を得るべく鋭意検討を行なった。その結果、高い分子量を有するL−PGAを独自に開発した。そして、当該L−PGAは、L−グルタミン酸のみが結合してなるため、光学活性が均一であり、かつ、分子量が高いことから優れた保湿性を有することから、皮膚外用剤に、ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上を含有させることで、上記課題を解決することができることを見出した。
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
1.(a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
2.ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、及び/または、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩がそれぞれアルカリ金属塩である1の皮膚外用剤。
3.動植物または微生物から有機溶剤、アルコール類、水からなる群より選ばれる1種以上を用いて抽出して得られる天然エキスからなる群より選ばれる1種以上を含有することを特徴とする1または2の皮膚外用剤。
4.保湿剤を含有することを特徴とする1〜3のいずれかの皮膚外用剤。
5.保湿剤が多価アルコール、糖類、ベタイン、尿素、ピロリドンカルボン酸またはその塩、アミノ酸類、ムコ多糖類からなる群より選ばれる1種以上である4の皮膚外用剤。
2.ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、及び/または、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩がそれぞれアルカリ金属塩である1の皮膚外用剤。
3.動植物または微生物から有機溶剤、アルコール類、水からなる群より選ばれる1種以上を用いて抽出して得られる天然エキスからなる群より選ばれる1種以上を含有することを特徴とする1または2の皮膚外用剤。
4.保湿剤を含有することを特徴とする1〜3のいずれかの皮膚外用剤。
5.保湿剤が多価アルコール、糖類、ベタイン、尿素、ピロリドンカルボン酸またはその塩、アミノ酸類、ムコ多糖類からなる群より選ばれる1種以上である4の皮膚外用剤。
本発明に係る皮膚外用剤は、以上のように、(a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含む。そのため、所望の品質を有する化粧料組成物を、安定に提供することができるという効果を奏する。
本発明により、使用感、保湿効果に優れたアルブチン配合皮膚外用剤を得ることができる。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。
〔本発明に係る皮膚外用剤〕
本発明に係る皮膚外用剤はa)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含めばよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
本発明に係る皮膚外用剤はa)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含めばよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
まず本発明で用いられる(a)成分としてのポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩およびその塩について説明する。
L−PGAは、L−グルタミン酸が結合してなるため、光学活性が均一であり、分子毎の性質も均一である。よって、L−PGAから得られるL−PGA架橋体も、所望の品質で安定に製造することができる。そのため、ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上を用いることで、所望の品質を有する皮膚外用剤を提供することができる。
さらに、ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩は、保湿性に優れているため、本発明に係る皮膚外用剤は、保湿剤及び/又は化粧料として好適に用いることができる。
本発明に係る皮膚外用剤を保湿剤として用いる場合、具体的には、フェイスケア製品、ハンドケア製品、ボディケア製品、フットケア製品、ヘッドケア製品、及びヘアケア製品、ネイルケア製品、又はマウスケア製品等として、好適に用いることができる。
また、本発明に係る皮膚外用剤を化粧料として用いる場合、具体的には、乳液、美容液、クリーム、ローション、洗顔料、メイク落とし等のフェイスケア製品、ハンドケア製品の他、ボディケア製品、フットケア製品、ヘッドケア製品、及びヘアケア製品、ネイルケア製品、又はマウスケア製品等として、好適に用いることができる。
なお、本明細書において、「皮膚」とは、顔、首、胸、背中、腕、脚、手および頭皮の皮膚が意図される。
(L−PGA)
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAは、L−グルタミン酸が結合してなるホモポリマーであり、その構造は下記式(1)にて示される構造を有する。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAは、L−グルタミン酸が結合してなるホモポリマーであり、その構造は下記式(1)にて示される構造を有する。
(式(1)においてnは重合数を示す)
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAの平均分子量としては、皮膚外用剤の用途等に応じて、適宜選択すればよいが、1万以上がよく、好ましくは10万以上、より好ましくは50万以上、さらに好ましくは100万以上がよい。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAの平均分子量としては、皮膚外用剤の用途等に応じて、適宜選択すればよいが、1万以上がよく、好ましくは10万以上、より好ましくは50万以上、さらに好ましくは100万以上がよい。
L−PGAの平均分子量が高ければ高いほど、当該L−PGAを含む皮膚外用剤の保湿性が向上するので、保湿性をさらに向上させたい場合は、(a)成分としてのL−PGAの平均分子量としては、100万以上がよく、好ましくは130万以上、より好ましくは200万以上、さらに好ましくは350万以上である。
L−PGAの平均分子量が高ければ高いほど、当該L−PGAを含む皮膚外用剤の保湿性が向上する。そのため、L−PGAの平均分子量の上限値は特に限定されるものではない。本発明に係る化粧料組成物に含まれる(a)成分としてのL−PGAの平均分子量としては、化粧料組成物の用途等に応じて、適宜選択すればよいが、好ましくは1000万以下、より好ましくは500万以下、さらに好ましくは400万以下であればよいが、特に限定されない。
なお、本明細書において「平均分子量」とは、プルラン標準物質の分子量換算にて算出した数平均分子量(Mn)を意図する。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAとしては、従来公知の種々の方法で得たL−PGAを用いればよく、例えば、L−PGAを生産する微生物(以下、単に「L−PGA生産微生物」と表記する)を用いて得たL−PGAを用いればよい。
(L−PGA生産微生物)
L−PGA生産微生物としては、L−PGAを合成する微生物である限り限定されるものではなく、L−PGA生産微生物の野生型、その変異株、又は、遺伝子組換え技術により、L−PGAの生産能力を付与、又は強化された微生物を用いればよい。中でも、好塩菌又はその変異処理株が好ましい。好塩菌としての性質を有していれば、好熱菌、高度好熱菌、好冷菌、好酸菌、好圧菌および低温生育菌等を用いてもよい。好塩菌は、低度好塩菌(0.2〜0.5MのNaCl濃度で生育)、中度好塩菌(0.5〜2.5MのNaCl濃度で生育)、高度好塩菌(2.5〜5.2MのNaCl濃度で生育)の3種類に分類され、いずれを用いてもよいが、高度好塩菌が好ましい。なお、好塩菌は、他の微生物が生育不可能な高塩条件下においても生育可能であることから、無菌操作無しで培養することができる。
L−PGA生産微生物としては、L−PGAを合成する微生物である限り限定されるものではなく、L−PGA生産微生物の野生型、その変異株、又は、遺伝子組換え技術により、L−PGAの生産能力を付与、又は強化された微生物を用いればよい。中でも、好塩菌又はその変異処理株が好ましい。好塩菌としての性質を有していれば、好熱菌、高度好熱菌、好冷菌、好酸菌、好圧菌および低温生育菌等を用いてもよい。好塩菌は、低度好塩菌(0.2〜0.5MのNaCl濃度で生育)、中度好塩菌(0.5〜2.5MのNaCl濃度で生育)、高度好塩菌(2.5〜5.2MのNaCl濃度で生育)の3種類に分類され、いずれを用いてもよいが、高度好塩菌が好ましい。なお、好塩菌は、他の微生物が生育不可能な高塩条件下においても生育可能であることから、無菌操作無しで培養することができる。
また、L−PGA生産微生物としては、古細菌であってもよい。古細菌としては、上述の高度好塩菌に分類される高度好塩古細菌の他、好熱古細菌、メタン菌(メタン生成古細菌)等が挙げられるが、L−PGAを生産可能である限り、いずれの古細菌を用いてもよい。古細菌の中でも高度好塩古細菌が好ましい。
高度好塩古細菌としては、例えば、Halobacterium(ハロバクテリウム)属、Haloarcula(ハロアルクラ)属、Haloferax(ハロフェラックス)属、Halococcus(ハロコッカス)属、Halorubrum(ハロルブルム)属、Halobaculum(ハロバキュラム)属、Natrialba(ナトリアルバ)属、Natronomonas(ナトロノモナス)属、Natronobacterium(ナトロノバクテリウム)属、Natronococcus(ナトロノコッカス)属等が挙げられるが、Natrialba属が好ましく、Natrialba aegyptiaca(ナトリアルバ エジプチアキア)がさらに好ましい。N. aegyptiacaは、高塩環境下で発生する脱水現象から、巧みに身を守るためにL−PGAを生産すると考えられている(例えばF. F. Hezayen, B. H. A. Rehm, R. Eberhardt, A. Steinbuchel, Polymer production by two newly isolated extremely halophilicarchaea: application of a novel corrosion-resistant bioreactor, Applied Microbiology and Biotechnology, 2000, 54,319参照)。また、N. aegyptiaca の中でも、Natrialba aegyptiaca(ナトリアルバ エジプチアキア)0830−82株(受託番号:FERMBP−10747)、Natrialba aegyptiaca(ナトリアルバ エジプチアキア)0830−243株(受託番号:FERM BP−10748)、及び、Natrialba aegyptiaca(ナトリアルバ エジプチアキア)0831−264株(受託番号:FERM BP−10749)からなる群から選択される少なくとも一つの菌株を用いることがさらに好ましい。N.aegyptiacaを用いれば、より分子量の大きいL−PGAを得ることができる。特に、N. aegyptiaca FERMBP−10747 、N. aegyptiacaFERM BP−10748、N. aegyptiaca FERM BP−10749は、いずれもの菌株も平均分子量130万以上のL−PGAを、液体培養条件下で合成することができる。よって、L−PGAの架橋体の収率がよく、また、L−PGAの製造効率もよい。
N. aegyptiaca FERM BP−10747、N. aegyptiaca FERM BP−10748、及び、N. aegyptiaca FERM BP−10749は、特願2006−142685に記載の変異処理方法及びスクリーニング方法に基づいて、本発明者らが独自に見出したN. aegyptiacaの変異株である。なお、本明細書において、単に「N. aegyptiaca」と表記したときは、N. aegyptiacaの変異株をもその意味に含む。
このように、本発明に係る皮膚外用剤に含ませる(a)成分としてのL−PGAとしては、平均分子量の大きいL−PGAを生産する微生物を、上記スクリーニング方法により選抜して用いてもよく、さらに、上記変異処理方法で微生物に変異処理を施した上で、上記スクリーニング方法により選抜した微生物を用いてもよい。
(変異処理方法)
ここで、上述の特願2006−142685記載の変異処理方法により、L−PGA生産性が向上した微生物の変異株を作製する一実施形態について説明する。
ここで、上述の特願2006−142685記載の変異処理方法により、L−PGA生産性が向上した微生物の変異株を作製する一実施形態について説明する。
上記変異処理方法としては、例えば、遺伝子組換えによる方法、細胞又は胞子に対して、変異原性のある薬剤を接触させる方法、X線又はγ線等の放射線、紫外線等を照射する方法等、従来公知の方法を用いればよい。上記変異原性のある薬剤としては、例えばN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホン酸(EMS)等のアルキル化剤を挙げることができる。本発明者らは、NTGを用いて、L−PGA生産微生物に変異処理を施した。なお、L−PGA生産微生物に対して、上述の変異処理を施す場合には、変異処理後の菌株の生存率が1%以下となる程度の強度で行なうことが好ましいが、特に限定はされるものではない。
例えば、本発明者らは、N.aegyptiaca(JCM11194)を親株として、まずPGA生産用の培地で培養した後、NTG溶液で培養し、さらにPGA生産用の培地で培養した。このとき、生存率が1%以下となるNTG溶液の濃度等の条件を見出し、生存した菌体を変異株として得た。
ここで、PGA生産用の培地としては、当該変異処理方法に供する菌株がPGAを生産可能な培地である限り限定されるものではないが、本発明者らは、22.5重量% NaCl、2重量% MgSO4・7H2O、0.2重量% KCl、3重量% Trisodium Citrate、1重量% Yeast Extract、0.75重量% Casamino acidの組成のPGA生産用液体培地を用いた。
培養条件は、特に限定されるものではないが、例えば本発明者らは、3mlの上記PGA生産用液体培地を含む18ml試験管で、37℃ 300rpmで3日間培養した後、得られた培養液0.5mlを、50mlの上記PGA生産用液体培地を含む500ml容坂口フラスコに植菌し、37℃ 180rpmで5日間培養した。
培養条件は、特に限定されるものではないが、例えば本発明者らは、3mlの上記PGA生産用液体培地を含む18ml試験管で、37℃ 300rpmで3日間培養した後、得られた培養液0.5mlを、50mlの上記PGA生産用液体培地を含む500ml容坂口フラスコに植菌し、37℃ 180rpmで5日間培養した。
また、上記NTG溶液の組成としては、当該変異処理方法に供する菌株の生存率が1%になるように、適宜設定すればよく、特に限定されるものではない。例えば本発明者らは、NTG(東京化成株式会社)の飽和溶液、70重量%、50重量%、20重量%、10重量%の水溶液を、上記PGA生産用液体培地で培養した菌株を懸濁液に、当該懸濁液の1/10量添加して当該懸濁液を培養した。当該懸濁液を作製する際に、菌株を懸濁させる液体は、特に限定されるものではないが、本発明者らは、100mM クエン酸緩衝液(pH6.0)を用いた。具体的には、上記PGA生産用液体培地による培養で得られた培養液から、3000rpmで5分間遠心分離して、菌体を回収した後、100mM クエン酸緩衝液(pH6.0)を加え懸濁した。この遠心分離から懸濁までの操作を3度繰り返して懸濁液を得た。NTG溶液による培養条件は、特に限定されるものではない。例えば、本発明者らは、42℃ 150rpmで1時間培養した。
NTG溶液による培養後の菌株を培養するPGA生産用の培地としては、特に限定されるものではなく、上記PGA生産用液体培地を用いてもよいが、本発明者らは、PGA生産用寒天培地(10% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid、2% Agar)に播種して37℃で5日間培養した。これにより、N.aegyptiaca(JCM11194)を親株として、当該変異処理方法に供した場合、70重量%のNTG溶液を用いたとき、生存率が1%以下となった。
(スクリーニング方法)
次に、上記スクリーニング方法について説明する。なお、上記スクリーニング方法に供する菌株は、上記変異処理方法により変異処理を施した菌株を供してもよく、当該変異処理方法を施していない野生株を供してもよい。
次に、上記スクリーニング方法について説明する。なお、上記スクリーニング方法に供する菌株は、上記変異処理方法により変異処理を施した菌株を供してもよく、当該変異処理方法を施していない野生株を供してもよい。
上記スクリーニング方法は、塩感受性の高いL−PGA生産微生物を選抜することで行なう。具体的には、L−PGA生産微生物が、通常、L−PGAを生産することが困難な塩濃度下で、L−PGA生産微生物を培養し、ムコイド状を示すコロニーを目安に選抜すればよい。塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛及び鉄等の、従来公知のものを用いればよいが、好ましくはナトリウムである。
なお、本明細書において「ムコイド状」とは、コロニーが粘性を示す状態を意図し、具体的には、微生物が、ポリペプチド鎖の主柱に共有結合した単糖や多糖鎖側鎖を有する高分子を生産して、当該微生物のコロニーが粘性を示す状態を意図する。つまり、上記スクリーニング方法では、L−PGAと多糖とが結合することで粘性状態、即ちムコイド状を示すコロニーを目安に選抜すればよい。
また、本明細書において「塩感受性」とは、微生物が、L−PGAの生産を開始する塩濃度を意図する。そして、「塩感受性が高い」とは、微生物が、L−PGAの生産を開始する塩濃度が低いことを意図する。つまり、上記スクリーニング方法では、より少ない塩濃度でL−PGAを生産する菌株を選抜する。具体的には、NaClが5重量%以上20重量%以下、好ましくは7重量%以上15重量%以下で、L−PGAを生産する菌株を選抜することが好ましい。
従来、液体培養条件下で、PGA生産微生物をスクリーニングすることは困難であった。何故なら、例えばN. aegyptiacaは、固体培地表面でムコイド状のコロニーを形成すると、コロニー同士が融合するため、シングルコロニーの分離が困難だったからである。さらに、シングルコロニーの分離可能であったとしても、一株ずつ液体培養し、L−PGAの生産の有無を確認するために、膨大な時間と労力が必要であった。つまり、本発明に係る皮膚外用剤は、本発明者らが独自に見出したスクリーニング方法により得た、高分子量のL−PGA生産菌を用いることで、初めて可能となった全く新たな皮膚外用剤である。
ここで、上記変異処理方法により得たN. aegyptiacaの変異株から、L−PGAの生産能に優れた菌株をスクリーニングする方法の一例を説明するが、これに限定されるものではない。
まず、上記スクリーニング方法に供する変異株を、従来公知の栄養培地で培養するとよい。栄養培地としては、特に限定されるものではないが、例えば肉汁、ペプトン、大豆粉、Yeast Extract、Casamino acid、アミノ酸類またはそれらの混合物などを含有する培地、または必要な栄養素類を含有する無機合成培地などの寒天平板培地を用いればよい。また、PGA生産微生物がPGAを生産しやすい培地を用いてもよい。当該PGAを生産しやすい培地としては、特に限定されるものではないが、例えば22.5重量% NaCl、2重量% MgSO4・7H2O、0.2重量% KCl、3重量% Trisodium Citrate、1重量% Yeast Extract、0.75重量% Casamino acid、2重量% Agarからなる寒天培地(以下、「PGA生産用寒天培地A」と表記する)を用いればよい。培養期間は特に限定されるものではないが、2〜4日間が好ましい。
次に、L−PGA生産微生物がL−PGAを生産しにくい培地を用いて、当該変異株を培養して、当該培地においてもL−PGAを生産する菌株を選抜すればよい。上記L−PGAを生産しにくい培地としては、L−PGA生産微生物がL−PGAを生産しにくい組成である限り限定されるものではない。具体的には、当該培地中の塩濃度を低くするとよい。例えば、本発明者らは、10重量%のNaClを含む固体培地を用いた。これは、N. aegyptiacaは、10重量%以上の塩を含む培地で生育すること自体は可能であるが、20重
量%以上の塩を含む培地で培養しない限り、L−PGAを生産しない株が多いからである。また、N. aegyptiacaは、NaClの濃度が10重量%の固体培養条件下では、ムコイド状を示さない。さらに、液体培養よりも固体培養の方が、一菌体当たりのL−PGA生産量が10倍以上高い。
量%以上の塩を含む培地で培養しない限り、L−PGAを生産しない株が多いからである。また、N. aegyptiacaは、NaClの濃度が10重量%の固体培養条件下では、ムコイド状を示さない。さらに、液体培養よりも固体培養の方が、一菌体当たりのL−PGA生産量が10倍以上高い。
より具体的には、本発明者らは、10重量% NaCl、2重量% MgSO4・7H2O、0.2重量% KCl、3重量% Trisodium Citrate、1重量% Yeast Extract、0.75重量% Casamino acid、2重量% Agarからなる寒天培地(以下、「PGA生産用寒天培地B」と表記する)を用いた。このときの培養条件は、特に限定されるものではないが、例えば、温度は37℃とすればよく、培養期間は4〜6日とすればよい。
なお、PGA生産用寒天培地B等のL−PGAを生産しにくい培地を用いて、菌株を培養する間は、併せてPGA生産用寒天培地A等のL−PGAを生産しやすい培地を用いて、スクリーニングに供する菌株のL−PGA生産能を、並行して確認することが好ましい。
選抜した菌株は、さらにL−PGAを生産しやすい培地で培養して、L−PGA生産能の再現性を確認することが好ましい。当該確認には、例えば上記PGA生産用寒天培地Aを用いて培養すればよい。
このようにして塩感受性の高い菌株を選抜することができる。
次に、選抜した塩感受性の高い菌株を、PGA生産用の液体培地で培養して、L−PGAの生産量を測定し、さらにL−PGA生産量の高い菌株を再選抜するとよい。
このとき、既に、L−PGAを良好に生産するL−PGA生産微生物が選抜されているため、液体培養による選抜を容易に行なうことができる。これは上述の塩感受性の高い菌株を選抜する方法が、他のPGA生産微生物を選抜する方法に比べて優れている点の一つである。つまり、当該選抜方法を行なわずに、液体培養による選抜のみで、L−PGAを生産可能な微生物又はその変異株を入手することは、当業者にとって容易でない。何故なら、固体培養で得られるコロニーを、それぞれ液体培養して、L−PGAの生産量を確認する必要があるからである。この作業は天文学的数字になるため、事実上不可能であることは当業者であれば容易に理解できる。本発明者らは鋭意努力し、L−PGAを液体培養で生産できる微生物又はその変異株を容易に入手する方法を見出した。
L−PGA生産量の高い菌株を再選抜するときに用いる、PGA生産用の液体培地としては、特に限定されるものではないが、上述の変異処理方法で用いたPGA生産用液体培地を用いればよい。培養条件は、特に限定されるものではなく、例えば、本発明者らは上記PGA生産用液体培地を用いて、37℃、1180rpmで4日間培養することにより、L−PGAの生産能に優れた菌株を選抜した。また、一度小さい系で培養した後に、系を大きくして培養してもよい。例えば、本発明者らは、菌株のシングルコロニーを、1白金耳掻き取り、3mlの上記PGA生産用液体培地を入れた18ml容試験管に植菌して、37℃、300rpmで3日間培養した。そして、得られた培養液0.5mlを、50mlの上記PGA生産用液体培地を入れた500ml容坂口フラスコに植菌して、37℃、180rpmで3日間培養した。
次に、液体培地中のL−PGAを測定して、より多くのL−PGAを生産した菌株を選抜すればよい。
液体培地中のL−PGAの量を測定する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、硫酸銅やエタノールを用いてL−PGAを沈澱させて、当該沈殿物の重量測定、又は、Kijerder法による総窒素の測定を行なう方法(M. Bovarnick, J. Biol. Chem., 145巻、 415頁、1942年)、塩酸加水分解後のグルタミン酸量を測定する方法(R.D. Housewrigt, C.B. Thorne, J. Bacteriol.,60巻、89頁、1950年)、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法(M. Bovarnick et al., J. Biol. Chem., 207巻、593頁、1954年)が挙げられる。中でも、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法を用いることが好ましい。
上記比色法で用いる塩基性色素としては、例えばクリスタルバイオレット、アニリンブルー、サフラニンオー、メチレンブルー、メチルバイオレット、トルイジネブルー、コンゴレッド、アゾカルマイン、チオニン、ヘマトキシリンなどが挙げられるが、サフラニンオーが好ましい。本発明者らは、1/5倍希釈したサフラニンオーを用いて、液体培地中のL−PGAの量を測定して、親株と比較してL−PGAの生産能が高い菌株を選抜した。
これまで説明した変異処理方法及びスクリーニング方法により、本発明者らは、30,000株をスクリーニングして、その結果、3株のL−PGA生産変異株を得た。
このようにして得られた菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ナトリアルバ エジプチアキア(Natrialba aegyptiaca)0830−82株(受託機関名:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日:平成18年4月4日、受託番号:FERM BP−10747)、ナトリアルバ エジプチアキア(Natrialba aegyptiaca)0830−243株(受託機関名:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日:平成18年4月4日、受託番号:FERM BP−10748)、またはナトリアルバ エジプチアキア(Natrialba aegyptiaca)0831−264株(受託機関名:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日:平成18年4月4日、受託番号:FERM BP−10749)として寄託されている。
当該3株はいずれも、親株であるJCM11194株より優れたL−PGA生産能を有し、高分子量のL−PGAを工業的なスケールで製造することができる。例えば、上述の二段階に分けた培養によれば、JCM11194株は、培養液1Lあたり0.61gのL−PGAを生産したが、0831−264株は、4.99gのL−PGAを生産した。
(L−PGAの製造方法)
次に、L−PGAの製造方法として、N. aegyptiacaを用いた場合について例示するが、本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAを得る方法は、これに限定されるものではない。
次に、L−PGAの製造方法として、N. aegyptiacaを用いた場合について例示するが、本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAを得る方法は、これに限定されるものではない。
N. aegyptiacaを培養する培地は、当該N. aegyptiacaが生育可能で、かつ、L−PGAを合成可能である培地である限り、特に限定されるものではないが、液体培地であることが好ましい。液体培地を用いれば、一度に大量にN. aegyptiacaを培養できるため、L−PGAの製造効率が極めて向上する。
N. aegyptiacaの培養に用いる培地の成分は、N. aegyptiacaが摂取可能な炭素源及び無機塩類を含めばよく、必要に応じてYeast Extract等、その他の栄養物を添加すればよい。例えば、本発明者らは、後述する実施例において、22.5% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acidの培地を用いてN. aegyptica FERM BP−10749を培養している。なお、Yeast Extractを培地に添加する場合、その濃度は0.1重量%以上10重量%以下であることが好ましく、0.5重量%以上5.0重量%以下がさらに好ましい。
N. aegyptiacaは高度好塩菌であるので、L−PGAの製造に用いるN. aegyptiacaの生育特性に応じて、培地に塩を添加してもよい。培養時の塩濃度は10重量%以上30重量%以下、好ましくは15重量%以上25重量%以下で培養すればよい。
N. aegyptiacaの培養に用いる培地のpHは、特に限定されるものではないが、5.0以上10以下が好ましく、さらに好ましくは6.0以上8.5以下である。なお、pHの調整には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸、これらの水溶液等を用いればよいが、pHを調整可能な限り限定されるものではない。
培地を作製した後は、通常の方法で殺菌した後に、L−PGAの生産に用いるN. aegyptiacaを添加して培養すればよい。なお、培地の殺菌は、従来公知の方法で行なえばよく、例えば、110〜140℃で8〜20分行なえばよい。なお、培地のNaClの濃度を飽和濃度にすることで、殺菌工程を省略することもできる。上述のように、N. aegyptiacaは高度好塩菌であるため、飽和濃度のNaCl存在下でも生育可能であるが、他の微生物は生育不可能であるからである。
N. aegyptiacaを液体培養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養等を行なうことが好ましい。また、培養温度は、特に限定されるものではないが、25℃以上50℃以下が好ましく、30℃以上45℃以下がさらに好ましい。
N. aegyptiacaの培養期間は、他の培養条件、目的とするL−PGAの生産量に応じて適宜設定すればよく特に限定されるものではなく、例えば2〜4日間程度でよい。
上述の培養条件等に基づいてN. aegyptiacaの培養を行なうと、L−PGAは、主として菌体外に蓄積される。
N. aegyptiacaを培養した後の培地から、L−PGAを分離、回収する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。例えば、(1)固体培養物から20%以下の食塩水により抽出分離する方法(例えば特開平3−30648号公報を参照)、(2)硫酸銅による沈殿法(例えばThrone. B.C., C.C. Gomez,N.E. Nouesand R.D. Housevright: J. Bacteriol.,68巻、307頁、1954年を参照)、(3)アルコール沈殿法(例えばR.M. Vard, R.F. Anderson and F.K. Dean: Biotechnologyand Bioengineering,5巻、41頁、1963年を参照)、(4)架橋化キトサン成形物を吸着剤とするクロマトグラフィー法(例えば特開平3−244392号公報を参照)、(5)分子限外濾過膜を使用する分子限外濾過法、(6)上記(1)〜(5)を適宜組み合わせた方法などが挙げられる。また、これらの方法は、L−PGAの生産にN. aegyptiaca以外の微生物を用いた場合にも適用することができる。このようにして分離、回収したL−PGAは、L−PGA含有液として後述のL−PGA架橋体の製造に用いてもよく、必要に応じて、スプレードライ、凍結乾燥等、従来公知の方法で粉末にしてもよい。
以下に、N. aegyptiacaを培養した後の培地からL−PGAを分離、回収する方法の一例を説明するが、これに限定されるものではない。
まず、遠心分離等により、N. aegyptiacaを培養した後の培養液から菌体を取り除き、次に、得られた上清から、エタノール等の低級アルコールを加えることで、L−PGAを沈殿させるとよい。当該沈殿物は、適宜緩衝液に溶解させた上で、透析等により、不純物を除去することが好ましい。なお、本発明者らは、後述する実施例でも示すように、菌体を回収した後の上清に、3倍量の水を加えて希釈して、さらに、pHを3.0に調整した後、5時間、室温で攪拌した上で、3倍量のエタノールを加えることで沈殿物を回収した。また、当該沈殿物を0.1mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)に溶解させ、これを透析する
ことにより、不純物を除去した。
ことにより、不純物を除去した。
透析を行なっても、核酸やタンパク質が混入していることが考えられるため、DNase処理、RNase処理、Proteinase処理等を行なうことが好ましい。また、これらの処理後、さらに透析等の精製処理をすることで、より高純度のL−PGAを得ることができる。
以上により、L−PGAを含有する溶液を得ることができる。さらに、得られた溶液に対して凍結乾燥等を行なえば、粉末状のL−PGA架橋体を得ることができる。また、必要に応じて、さらに、当該溶液の精製を行なってもよい。精製は、従来公知の方法で行なえばよく、例えば上述の透析を行なってもよく、陰イオン交換樹脂を用いればよい。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGAは、塩の状態であってもよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等を用いることができる。
(L−PGA架橋体)
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体は、L−PGA分子同士の架橋構造を有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体は、L−PGA分子同士の架橋構造を有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
本明細書において「架橋構造」とは、直鎖状の高分子化合物の分子同士が、物理的あるいは化学的な方法で連結した構造を意図する。また、本明細書において「架橋体」とは、架橋構造を有することで、物理的、化学的性質が変化した高分子化合物のことを意図する。
つまり、L−PGA架橋体は、L−PGAの分子同士が、共有結合によって、3次元状に連結している。具体的には、L−PGAの分子間で、上記式(1)におけるH以外のいずれかの元素同士が共有結合することにより、L−PGA分子同士が3次元状に連結している。換言すれば、本発明に係るL−PGA架橋体は、L−PGA分子同士が3次元状に繋がったポリマー、即ち、L−PGAを構成分子とするネットワークポリマーである。なお、L−PGAの分子間で、一方のL−PGA分子における、上記式(1)に示すNと、他方のL−PGA分子における、上記式(1)の最右端に示すCとが結合したものは、L−PGAの分子同士の重合であって、「架橋構造」の意図するところではない。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を構成する、L−PGAの平均分子量は、その分子同士が架橋している限り、限定されるものではないが、1万以上がよく、好ましくは10万以上、より好ましくは50万以上、さらに好ましくは100万以上がよい。
L−PGAの平均分子量が高ければ高いほど、得られるL−PGA架橋体の吸水倍率が向上するので、給水倍率をさらに向上させたい場合は、(a)成分としてのL−PGA架橋体を構成する、L−PGAの平均分子量は、100万以上がよく、好ましくは130万以上、より好ましくは200万以上であり、さらに好ましくは350万以上である。
分子量が100万以上であれば、原料であるL−PGAからハイドロゲルを製造したときのゲル化率が向上するため、ハイドロゲルの収率を向上させることができる。
L−PGAの平均分子量が高ければ高いほど、得られるL−PGA架橋体の吸水倍率が向上する。そのため、本発明に係るL−PGA架橋体を構成するL−PGAの平均分子量の上限値は特に限定されるものではない。本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を構成する、L−PGAの平均分子量としては、化粧料組成物の用途等に応じて、適宜選択すればよいが、好ましくは1000万以下、より好ましくは500万以下、さらに好ましくは400万以下であればよいが、特に限定されない。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体の吸水倍率は、特に限定されるものではないが、後述する本発明に係るL−PGA架橋体の製造方法によれば、例えば10倍以上5000倍以下、特に1900倍以上4400倍以下のものを好適に得ることができる。特に、PGAを材料した吸水性樹脂として、吸水倍率が3300倍より大きいものは、上記特許文献2においてDL−PGAを用いても得ることができなかった、画期的なPGA性の生分解性吸水性樹脂である。
なお、本明細書において「吸水倍率」とは、物質が、水等の親水性液体を含んで膨潤することによる重量の増加率を意図する。L−PGA架橋体の吸水倍率は、例えば次のように算出すればよい。即ち、L−PGA架橋体の粉末を、当該L−PGA架橋体が膨潤するために十分な量の水に入れ、4℃にて1週間静置させることで十分に膨潤させた後、80メッシュの金網で水切りした後のL−PGAの湿重量から、当該L−PGA架橋体の粉末の乾燥重量を引いた値を、当該L−PGA架橋体の粉末の乾燥重量で割って算出することができる。
なお、本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体としては、L−PGAのみからなる架橋体であることが好ましいが、DL−PGA分子やD−PGA分子を含んでいてもよい。ただし、製造するL−PGA架橋体毎の品質を安定にするため、その含有量は0重量%以上20重量%以下であることが好ましい。
(L−PGA架橋体の製造方法)
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を製造する方法は、L−PGAの分子同士を架橋させる架橋工程を含んでいればよい。L−グルタミン酸のみからなる、光学活性が均一なL−PGAを原料として、これを架橋させることで、L−PGA架橋体の分子毎の性質が均一となる。よって、所望の品質を有するL−PGA架橋体を安定して製造することができる。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を製造する方法は、L−PGAの分子同士を架橋させる架橋工程を含んでいればよい。L−グルタミン酸のみからなる、光学活性が均一なL−PGAを原料として、これを架橋させることで、L−PGA架橋体の分子毎の性質が均一となる。よって、所望の品質を有するL−PGA架橋体を安定して製造することができる。
L−PGAは、溶媒に溶解させてL−PGAの溶液を作製した上で、架橋反応に供すればよい。L−PGAを溶解させる溶媒としては、L−PGAを溶解させることができる限り限定されるものではないが、例えば、水、アルコール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル等が挙げられ、中でも、水、メチルアルコール、エチルアルコールが好ましく、水がさらに好ましい。これらの溶媒に溶解させるときのL−PGAの濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは1重量%以上10重量%以下であり、さらに好ましくは2重量%以上8重量%以下であり、特に好ましくは2重量%以上7重量%以下である。また、L−PGAの溶液のpHは、特に限定されるものではないが、5.0以上9.0以下が好ましく、さらに好ましくはpH6.0以上8.0以下である。
L−PGAの溶液に架橋反応を施すと、当該溶液中でL−PGAの架橋体が形成され、当該L−PGA架橋体が当該溶媒を含んで膨潤することで、ハイドロゲルが得られる。これは後述するL−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルの態様の一つである。さらに、当該ハイドロゲルを凍結乾燥等することによって、溶媒成分を除去することによって、当該溶媒成分を含まないL−PGA架橋体を得ることができる。
上述したL−PGA架橋体を製造する方法によれば、架橋反応において、例えば、50%以上100%以下、特に70%以上100%以下のゲル化率でL−PGAを得ることができる。
なお、本明細書において「ゲル化率」とは、原料として用いたL−PGAの重量に対する、架橋反応によって架橋体を形成したL−PGAの重量の百分率を意図する。換言すれば、「ゲル化率」とは、原料として用いたL−PGAに対して、得られるL−PGA架橋体ひいてはハイドロゲルの収率を表す。具体的には、架橋反応によって得たハイドロゲルの乾燥重量を、当該架橋反応に供したL−PGAの乾燥重量で割って得た数値に、百を乗じて算出する。
L−PGAの架橋反応の方法は、L−PGAの分子同士を架橋させることができる限り限定されるものではなく、従来公知の方法で行なえばよい。例えば、架橋剤を用いてもよく、放射線を用いてもよいが、中でも放射線を用いることが好ましい。放射線を用いれば、架橋反応後に、架橋剤を除去する操作を必要とせず、高純度のL−PGA架橋体を製造することができる。
L−PGAの架橋反応で、使用可能な放射線としては、特に限定されるものではなく、α線、β線、γ線、電子線、中性子線、X線等を用いればよい。中でも、γ線が好ましい。γ線は、例えばコバルト60を線源とする照射装置等、従来公知の方法、機器を用いて発生させればよい。
また、L−PGAに照射する放射線の照射線量は、0.5kGy以上20kGy以下が好ましく、さらに好ましくは2kGy以上10kGy以下であり、特に好ましくは3kGy以上7kGy以下であるが、製造するL−PGA架橋体の用途等に応じて適宜設定すればよい。一般に照射線量が多ければ硬質のハイドロゲルを得ることができ、照射線量が少なければ軟質のハイドロゲルを得ることができる。
また、L−PGAの架橋に放射線を用いる場合、L−PGAの溶液を放射線透過性容器に入れて用いればよい。放射線透過性容器としては、特に限定されるものではなく、例えばガラス製バイアル瓶等、ガラス製容器等を用いることができる。
L−PGAの溶液を放射線透過性容器に入れた後は、そのまま放射線を照射してもよいが、予め、当該溶液に対して窒素を用いてバブリングしておくことが好ましい。当該溶液中に含有される酸素を除去することで、架橋反応の阻害を防ぐことができる。
なお、L−PGAの架橋に架橋剤を用いる場合は、エポキシ化合物、カルボン酸基及び/又はカルボキシレート基を含有する多糖、アミノ酸等、従来公知の架橋剤を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば、エポキシ化合物としては、グリセリントリグリシジルエーテル、ジ−グリセリンポリグリシジルエーテル、ポリ−グリセリンポリグリシジルエーテル、ポリオキシエチレンソルビトールポリグリシジルエーテル、多糖類としては、グルコースとフルクトースとガラクトースとグルクロン酸とからなる混合物、ラムノースとグルコースとガラクトースとグルクロン酸とからなる混合物、及びヒアルロン酸を主成分とするポリカルボン酸、アミノ酸としては、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、アスパラギン酸、リシン、アルギニン、及びこれらの混合物が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、適宜2種類以上を混合して用いてもよい。
また、本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を製造するために用いるL−PGAは、塩の状態であってもよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等を用いることができる。中でも、ナトリウム塩が好ましい。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体を製造するために用いるL−PGAとしては、従来公知の種々の方法で得たL−PGAを用いればよく、例えば、上述のL−PGAを用いればよい。
なお、DL−PGA分子やD−PGA分子を含んだ、L−PGA架橋体を製造する場合は、DL−PGA分子及び/又はD−PGA分子を、上述のL−PGAの溶液に混合した上で、上述の架橋反応に当該溶液を供すればよい。
本発明に係る皮膚外用剤に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体として、L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルを用いてもよい。
なお、本明細書において「ハイドロゲル」とは、ポリマーが水等の溶媒を含むことにより膨潤して形成したゲルを意図する。換言すれば、ポリマーと溶媒等の水分とを主成分とするポリマーの溶媒膨潤体である。ハイドロゲルは、多量の水を含んでおり、液体と固体との中間の状態にある物質であり、流動性がない点で液体と異なる。また、押す等して加圧しても、ハイドロゲル中の溶媒が滲み出ることはない。
つまり、L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルとは、L−PGA架橋体と溶媒とを主成分とする溶媒膨潤体と言える。
L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルは、上述のL−PGA架橋体の製造方法において説明した通り、水等の溶媒にL−PGAを溶解した溶液に、架橋反応を施すことで、得ることができる。
また、上述の粉末状のL−PGA架橋体に、水等の溶媒を加えることにより、L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルを得ることができる。このとき、当該溶媒の量を少量とした上でハイドロゲルを得ておけば、さらに水等の溶媒を吸収可能な、吸水性に優れたハイドロゲルを得ることができる。また、L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルに吸収された溶媒は、当該ハイドロゲルから滲み出ることがないため、保湿性に優れている。
L−PGA架橋体を含んでなるハイドロゲルは、所定の形状に均一に造粒してもよく、また、不定形破砕状、球状等であってもよい。また、衛生分野のみならず、多種多様な分野においても利用可能である。例えば、皮膚外用剤のみならず、紙オムツ等のトイレタリー品、体液吸収体等の医療品等、土壌改良剤として好適に利用することもできる。
本発明に係る化粧料組成物に含まれる(a)成分としてのL−PGA架橋体は、塩の状態であってもよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等を用いることができる。
(皮膚外用剤の組成)
本発明において、(a)成分としてのポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上の配合量は、0.0001〜10%が好ましく、更に好ましくは0.0005〜3%である。
本発明において、(a)成分としてのポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上の配合量は、0.0001〜10%が好ましく、更に好ましくは0.0005〜3%である。
本発明に係る皮膚外用剤は、(a)成分としてのポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上を、従来公知の溶媒に溶解して作製すればよい。本発明に係る皮膚外用剤の作製に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、水等を使用すればよい。
次に(b)成分としてのアルブチンについて説明する。
アルブチンはチロシナーゼの阻害活性を持っており、化粧品などの分野において美白剤としてよく用いられている。しかしながら、化粧品などの皮膚外用剤として用いる場合には、親水性が高く、皮膚吸収性が悪いなどの欠点があった。そこで、他の成分と混合することで、肌への吸収性を向上させ、美白効果を高める工夫が求められていた。
アルブチンは、上述の通り美白効果に優れ安全性が高い事から、美白化粧料を主体とした皮膚外用剤に用いられている。
本発明により、皮膚外用剤に、ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上を含有させることで、優れた使用感・保湿効果が得られ、更にアルブチンの美白効果が高まることを見出した。
本発明で使用するアルブチンは、化学合成品、植物由来のいずれでも構わない。
本発明の皮膚外用剤へのアルブチンの配合量は0.01〜20%が好ましく、更に好ましくは0.5〜10%である。
本発明で使用するアルブチンは、化学合成品、植物由来のいずれでも構わない。
本発明の皮膚外用剤へのアルブチンの配合量は0.01〜20%が好ましく、更に好ましくは0.5〜10%である。
また、本発明に係る皮膚外用剤は、使用の目的等に応じて適宜、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に一般的に用いられる添加剤、例えば、炭化水素類、油脂類等の油性成分、ロウ類、シリコーン類、アルコール類、脂肪酸、酸化防止剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、薬剤、精製水等の水性成分、植物の抽出物、中和剤、L−PGA及びL−PGA架橋体以外の保湿剤、増粘剤、防腐剤、界面活性剤、香料、着色剤、各種皮膚栄養剤等の添加物を添加してもよい。
以下に、これらの添加物の具体例を挙げるが、これに限定されるものではない。また、これらの添加物は、単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。
上記炭化水素類としては、例えば、流動パラフィン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリン等が挙げられる。
上記油脂類としては、例えば、アボガド油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ラノリン、ヒマシ油、オリーブ油、グレープシード油、カカオ油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油等の植物油脂類等が挙げられる。
上記ロウ類としては、例えば、ホホバ油、カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、鯨ロウ等が挙げられる。
上記シリコーン類としては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチフェニルシロキサン等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、フィトステロール、セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類、エタノール等の低級アルコール類が挙げられる。
上記脂肪酸としては、例えば、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、ラノリン脂肪酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸等の高級脂肪酸等が挙げられる。
上記酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、フィチン等が挙げられる。
上記抗菌剤としては、例えば、上記安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、パラオキシ安息香酸アルキルエステル、ヘキサクロロフェン等が挙げられる。
上記紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、ケイ皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、3−(4’−メチルベンジリデン)−d−カンファー、3−ベンジリデン−d、1−カンファー、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、2−フェニル−5−メチルベンゾキサゾール、2、2’−ヒドロキシ−5−メチルフェニルベンゾトリアゾール、2−(2’−ヒドロキシ−5’−t−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、2−(2’−ヒドロキシ−5’−メチルフェニルベンゾトリアゾール、ジベンザラジン、ジアニソイルメタン、4−メトキシ−4’−t−ブチルジベンゾイルメタン、5−(3,3−ジメチル−2−ノルボルニリデン)−3−ペンタン−2−オン等が挙げられる。
上記薬剤としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、タウリン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸、又は、これらのアルカリ金属塩と塩酸塩;アシルサルコシン酸(例えばラウロイルサルコシンナトリウム)、グルタチオン、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等の有機酸;ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、γ−オリザノール、アラントイン、グリチルリチン酸(塩)、グリチルレチン酸およびその誘導体、ヒノキチオール、ビサボロール、ユーカルプトーン、チモール、イノシトール、サイコサポニン、ニンジンサポニン、ヘチマサポニン、ムクロジサポニン等のサポニン類、パントテニルエチルエーテル、エチニルエストラジオール、L−アスコルビン酸、トラネキサム酸、セファランチン、プラセンタエキス等が挙げられる。
上記各種皮膚栄養剤としては、ビタミンAおよびその誘導体、ビタミンB2、パントテン酸及びその誘導体、ナイアシン、ビオチン及びこれらの混合物が挙げられる。
上記中和剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール、トリエタノールアミン等が挙げられる。
上記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビンタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ソルビンタンセスキオレエート、ソルビンタンモノライレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、1−ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノオレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシチエレンヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリン等のノニオン界面活性剤や、グリシン型、アルキルアミノベタイン、イミダゾリン型、L−アルギニン型、L−リジン型等の両性界面活性剤が挙げられる。
上記L−PGA及びL−PGA架橋体以外の保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール、グルコース、ソルビトール、デキストリン、トレハロース、乳糖等の糖類及びその誘導体、グルタミン酸ナトリウム、ケラチン誘導体、コラーゲン誘導体、トリメチルグリシン等のアミノ酸類及びその誘導体、カルボキシビニルポリマー、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等の水溶性高分子、海藻エキス、酵母エキス、保湿作用を有する各種植物エキス、及びこれらの混合物等、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸コレステリル等のエステル類、ポリアクリル酸ナトリウム、結晶性セルロース、各種植物精油及びこれらの混合物が挙げられる。また、上述の植物油脂類、ロウ類、脂肪酸類、高級アルコール類も保湿剤として使用できる。
上記増粘剤としては、例えば、キサンタンガム等の水溶性多糖類、ヒドロキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等の水溶性セルロース類、プルラン、ポリアクリル酸ナトリウム等の水溶性高分子等が挙げられる。
上記防腐剤としては、パラベン、サリチル酸、安息香酸塩、フェノキシエタノール、グルコン酸クロルヘキシジン等が挙げられる。
上記香料としては、バニリン、オレンジフレーバー、レモンフレーバー、ミルクフレーバーゲラニオール、リナロール等が挙げられる。
上記着色料としては、水溶性のタール系色素、水不溶性のタール系色素、クチナシ系色素、ベニバナ系色素、ウコン系色素、パプリカ色素、アナトー色素、コチニール色素等の天然色素、酸性、塩基性色素が挙げられる。
さらに、例えば、ギシギシ、クララ、コウホネ、オレンジ、セージ、ノコギリソウ、ゼニアオイ、センブリ、タイム、トウキ、トウヒ、バーチ、スギナ、ヘチマ、マロニエ、ユキノシタ、アルニカ、ユリ、ヨモギ、シャクヤク、アロエ、クチナシ、サワラ、ホワイトリリー等の植物の抽出物等を添加してもよい。
また、本発明の皮膚外用剤には、通常、化粧料等の外用組成物に配合され得る以下の成分を、本発明の所期の効果を損わない限りにおいて好ましく配合することができる。
本発明において好ましくは、美白効果、保湿効果の増強のために、動植物または微生物から有機溶剤、アルコール類、水からなる群より選ばれる1種以上を用いて抽出して得られる天然エキスからなる群より選ばれる1種以上を含有させることが好ましい。これら天然エキスとしては、サッカロマイセスなどの酵母、糸状菌、バクテリア、牛胎盤、人胎盤、人臍帯、酵母、牛コラーゲン、牛乳由来蛋白、シルク、小麦、大豆、牛血液、ブタ血液、鶏冠、カミツレ、キュウリ、コメ、シアバター、シラカバ、茶、トマト、ニンニク、ハマメリス、バラ、ヘチマ、ホップ、モモ、アンズ、レモン、キウイ、ドクダミ、トウガラシ、クララ、ギシギシ、コウホネ、セージ、ノコギリ草、ゼニアオイ、センキュウ、センブリ、タイム、トウキ、トウヒ、バーチ、スギナ、ヘチマ、マロニエ、ユキノシタ、アルニカ、ユリ、ヨモギ、シャクヤク、アロエ、アロエベラ、オウゴン、オウバク、ベニバナ、サンシシ、シコン、タイソウ、チンピ、ニンジン、ヨクイニン、ハトムギ、クチナシ、サワラ、カモミラ、メリッサ、ビワ、甘草、西河柳、ジャトバ等の動植物・微生物およびその一部から有機溶媒、アルコール、多価アルコール、水、水性アルコール等で抽出または加水分解して得た天然エキスが挙げられる。天然エキスを含有させる場合の配合量は、0.001〜10重量%が好ましく、更に好ましくは0.005〜5重量%である。
本発明の皮膚外用剤には好ましくは、更に保湿効果を高める為に保湿剤を配合する事が好ましい。保湿剤としては、マルチトール、ソルビトール、グリセリン、プロピレングリコール、1、3−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリコール等の多価アルコール、ピロリドンカルボン酸及びそのアルカリ金属塩、乳酸及びそのアルカリ金属塩、クエン酸及びそのアルカリ金属塩などの有機酸およびその塩、ヒアルロン酸ソーダなどヒアルロン酸およびその塩、酵母および酵母抽出液の加水分解物、酵母培養液、乳酸菌培養液など醗酵代謝産物、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、セリシン等の水溶性蛋白、コラーゲン加水分解物、カゼイン加水分解物、シルク加水分解物等のペプチド類およびその塩;トレハロース、キシロビオース、マルトース、蔗糖、ブドウ糖、植物性粘質多糖等の糖類・多糖類およびその誘導体、水溶性キチン、キトサン、ペクチン、コンドロイチン硫酸およびその塩等のグリコサミノグリカンおよびその塩;グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、アスパラギン酸、チロシン、バリン、ロイシン、アルギニン、グルタミン、プロリン、ヒドロキシプロリン、タウリン等のアミノ酸、ベタイン、尿素等を挙げる事ができる。保湿剤を含有させる場合の配合量は、0.001〜20重量%が好ましく、更に好ましくは0.01〜10重量%である。
本発明の皮膚外用剤は、例えば皮膚化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料等として用いてもよい。本発明の皮膚外用剤の剤型は特に限定されるものでなく、任意の剤型をとり得る。本発明に係る皮膚外用剤を、例えば皮膚化粧料に使用する場合には、皮膚化粧料成分として一般に使用されている界面活性剤、油分、保湿剤、皮膜形成剤、油ゲル化剤、金属酸化物、有機紫外線吸収剤、無機金属塩類、有機金属塩類、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、他の増粘剤、薬効成分、色素、香料等の添加剤成分と任意に組み合わせて配合することにより、種々の形態、例えば水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油2層系、水−油−粉末3層系、油/水(O/W)型乳化化粧料、水/油(W/O)型乳化化粧料等であり、用途としては、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧水、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤などが挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、以下の実施例に示す「%」は全て「重量%」である。
〔製造例1;ポリ−γ−L−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptica(受託番号:FERM BP−10749)のL乾燥アンプルに、0.4mlのPGA生産用液体培地(22.5% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid)を加えて懸濁液を得た。0.2mlの当該懸濁液を、PGA寒天培地(10% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid、2% Agar)に接種し、37℃で3日間培養して、シングルコロニーを得た。
Natrialba aegyptica(受託番号:FERM BP−10749)のL乾燥アンプルに、0.4mlのPGA生産用液体培地(22.5% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid)を加えて懸濁液を得た。0.2mlの当該懸濁液を、PGA寒天培地(10% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid、2% Agar)に接種し、37℃で3日間培養して、シングルコロニーを得た。
次に、5本の18ml容試験管に、それぞれ、3mlのPGA生産液体培地(22.5% NaCl、2% MgSO4・7H2O、0.2% KCl、3% Trisodium Citrate、1% Yeast Extract、0.75% Casamino acid、pH7.2)を入れ、さらに、上記シングルコロニーを白金耳で1白金耳掻き取り植菌した。植菌後の試験管を、37℃、300rpmで3日間培養して、さらに、得られた培養液0.5mlを、50ml PGA生産液体培地を入れた500ml容坂口フラスコ10本にそれぞれ植菌し、37℃で5日間培養した。培養後、得られた培養液を遠心し、菌体を取り除いて上清を回収した。
次に、回収した上清に3倍量の水を加え希釈した後、1N硫酸でpHを3.0に調整した。pHを調整した後、室温で5時間攪拌した。その後、3倍量のエタノールを加えて遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物がL−PGAである。
回収したL−PGAを0.1mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に溶解して、これを、低分子物質等の不純物を除去するために透析した。次に、透析後の液体に含まれる核酸を除去するために、当該液体に、MgCl2が1mM、DNaseI(TAKARA社製)が10U/ml、RNaseI(NIPPON GENE社製)が20μg/mlとなるように加えて、37℃で2時間インキュベートした。次いでタンパク質を除去するために、核酸を除去した後の液体にProteinase K(TAKARA社製)を3U/mlとなるように添加して、37℃で5時間インキュベートしてProteinase K処理を行なった。
Proteinase K処理の後、超純水で透析し、低分子物質を除去した。次に、L−PGAを陰イオン交換樹脂(Q sepharose Fast Flow、GE ヘルスケア バイオサイエンス社製)に吸着させ、0.5MのNaCl水溶液で洗浄した後、1MのNaCl水溶液で溶出した。得られた溶液を、さらに超純水で透析し、透析後の溶液を凍結乾燥することにより、L−PGAのナトリウム塩(以下、「L−PGA・Na塩」と表記する)を得た。なお、超純水は、MilliQ(Millipore社製の純水製造装置)で作製した。
〔製造例2;ポリ−γ−L−グルタミン酸の分子量分析−1〕
製造例1で得たL−PGA・Na塩の平均分子量を、GPC分析にて測定した。その結果、Mw=7,522,000、Mn=3,704,000、Mw/Mn=2.031であることが確認された(プルラン換算)。
製造例1で得たL−PGA・Na塩の平均分子量を、GPC分析にて測定した。その結果、Mw=7,522,000、Mn=3,704,000、Mw/Mn=2.031であることが確認された(プルラン換算)。
なお、GPC分析は、以下の条件で行なった。装置:HLC−8220GPC(東ソー社製)、カラム:TSKgelα−M(東ソー社製)、流速:0.6ml/min、溶出液:0.15M NaCl水溶液、カラム温度:40℃、注入量:10μl、検出器:示差屈折計。
〔製造例3;ポリ−γ−L−グルタミン酸の分子量分析−2〕
製造例1において、1.0MのNaCl水溶液溶出した後、さらに、1N HClを用いて、pHを2.0に調製した以外は、製造例1と同様の操作を行なって得たL−PGA・Na塩の平均分子量をGPC分析により測定した。その結果、Mw=2,888,000、Mn=1,327,000、Mw/Mn=2.176、であることが確認された(プルラン換算)。なお、本製造例におけるGPC分析は、製造例2と同様の操作で行なった。
製造例1において、1.0MのNaCl水溶液溶出した後、さらに、1N HClを用いて、pHを2.0に調製した以外は、製造例1と同様の操作を行なって得たL−PGA・Na塩の平均分子量をGPC分析により測定した。その結果、Mw=2,888,000、Mn=1,327,000、Mw/Mn=2.176、であることが確認された(プルラン換算)。なお、本製造例におけるGPC分析は、製造例2と同様の操作で行なった。
〔製造例4;ポリ−γ−L−グルタミン酸の分子量分析−3〕
製造例1において、1.0MのNaCl水溶液溶出した後、さらに、1N HClにを用いて、pHを1.9に調製した以外は、製造例1と同様の操作を行なって得たL−PGA・Na塩の平均分子量をGPC分析により測定した。その結果、Mw=2,325,000、Mn=1,032,000、Mw/Mn=2.253、であることが確認された(プルラン換算)。なお、本製造例におけるGPC分析は、製造例2と同様の操作で行なった。
製造例1において、1.0MのNaCl水溶液溶出した後、さらに、1N HClにを用いて、pHを1.9に調製した以外は、製造例1と同様の操作を行なって得たL−PGA・Na塩の平均分子量をGPC分析により測定した。その結果、Mw=2,325,000、Mn=1,032,000、Mw/Mn=2.253、であることが確認された(プルラン換算)。なお、本製造例におけるGPC分析は、製造例2と同様の操作で行なった。
〔製造例5;ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の作製〕
製造例1で得たL−PGA・Na塩の5%水溶液を作製した。
製造例1で得たL−PGA・Na塩の5%水溶液を作製した。
次に、L−PGA・Na塩水溶液を、窒素を用いて3分間バブリングした後、蓋付き10mlサンプル瓶に、2ml分取して蓋を閉めた。
次に、サンプル瓶に、線源をコバルト60とするγ線照射装置を用いてγ線を照射した。照射線量は、5kGyとなるように照射した。γ線照射後に得られた生成物を、サンプル瓶から取り出し、余分な水分を80メッシュの金網で水切りした後、凍結乾燥することで、L−PGA架橋体粉末を得た。なお、上記余分な水分には、未架橋のL−PGAが含まれており、当該水切りは、未架橋のL−PGAを除去することが主たる目的である。
(実施例)
以下の処方に従ってアルブチン配合品を製造し、使用感・保湿効果を評価した。使用感・保湿効果の試験・評価方法は、以下の通りである。
以下の処方に従ってアルブチン配合品を製造し、使用感・保湿効果を評価した。使用感・保湿効果の試験・評価方法は、以下の通りである。
(製造方法)
(実施例1)美容液の製造
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
(実施例1)美容液の製造
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.001
精製水 全体で100となる量
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.001
精製水 全体で100となる量
(実施例2)美容液の製造
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.001
精製水 全体で100となる量
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.001
精製水 全体で100となる量
(実施例3)美容液の製造
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まない美容液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.001
精製水 全体で100となる量
ソルビット 4.0
ジプロピレングリコール 6.0
ポリエチレングリコール 1500 5.0
POE(20)オレイルアルコールエーテル 0.5
ショ糖脂肪酸エステル 0.2
メチルセルロース 0.2
アルブチン 5.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.001
精製水 全体で100となる量
(実施例4)乳液の製造
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例5)乳液の製造
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例6)乳液の製造
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まない乳液も常法により製造した。
(組成) (重量%)
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.005
精製水 全体で100となる量
グリセリルエーテル 1.5
ショ糖脂肪酸エステル 1.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.0
スクワラン 7.5
ジプロピレングリコール 5.0
アルブチン 4.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例7)クリームの製造
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,000,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例8)クリームの製造
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、L-PGA又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
L-PGA又はその塩(平均分子量1,300,000) 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例9)クリームの製造
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。コントロールとして、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩を含まないクリームも常法により製造した。
(組成) (重量%)
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.005
精製水 全体で100となる量
プロピレングリコール 6.0
フタル酸ジブチル 19.0
ステアリン酸 5.0
モノステアリン酸グリセリン 5.0
モノステアリン酸ソルビタン 12.0
モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン 38.0
エデト酸ナトリウム 0.03
アルブチン 6.0
ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 0.005
精製水 全体で100となる量
(実施例10)官能評価
実施例1〜9を用いて官能評価を行った。なお、ポリ−γ―L―グルタミン酸溶液又はその塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 を含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、シワや乾燥の気になる20〜40歳のパネル10人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
実施例1〜9を用いて官能評価を行った。なお、ポリ−γ―L―グルタミン酸溶液又はその塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体又はその塩 を含まない比較例も同時に評価した。官能評価は、シワや乾燥の気になる20〜40歳のパネル10人を1群として実施例及び比較例をそれぞれ1日2回,3カ月間連続使用してもらい、3カ月後の肌状態についてアンケート調査をして行った。
表1及び表2より、本発明のアルブチンを配合した皮膚外用剤は、使用感・保湿効果に優れている。比較例に示すようにポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上を含まないものは使用感・保湿効果が低いものであった。
以上、本発明を実施例に基づいて説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明に係る皮膚外用剤は、以上のように、(a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含む。そのため、所望の品質を有する化粧料組成物を、安定に提供することができるという効果を奏する。
本発明により、安全にかつ広いpHの範囲で経時着色が少なく、使用感、保湿効果に優れたアルブチン配合皮膚外用剤を得ることができ、産業の発展に寄与する。
Claims (5)
- (a)ポリ−γ−L−グルタミン酸、ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体およびポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩の中から選ばれる1種または2種以上と、(b)アルブチンを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
- ポリ−γ−L−グルタミン酸の塩、及び/または、ポリ−γ−L−グルタミン酸架橋体の塩がそれぞれアルカリ金属塩である請求項1に記載の皮膚外用剤。
- 動植物または微生物から有機溶剤、アルコール類、水からなる群より選ばれる1種以上を用いて抽出して得られる天然エキスからなる群より選ばれる1種以上を含有することを特徴とする請求項1または2に記載の皮膚外用剤。
- 保湿剤を含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の皮膚外用剤。
- 保湿剤が多価アルコール、糖類、ベタイン、尿素、ピロリドンカルボン酸またはその塩、アミノ酸類、ムコ多糖類からなる群より選ばれる1種以上である請求項4に記載の皮膚外用剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007298989A JP2009079025A (ja) | 2007-09-03 | 2007-11-19 | アルブチン配合皮膚外用剤 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2007227891 | 2007-09-03 | ||
JP2007298989A JP2009079025A (ja) | 2007-09-03 | 2007-11-19 | アルブチン配合皮膚外用剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=40654069
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JP2007298989A Pending JP2009079025A (ja) | 2007-09-03 | 2007-11-19 | アルブチン配合皮膚外用剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2009079025A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104886866A (zh) * | 2015-06-27 | 2015-09-09 | 香志光 | 一种养生美白鞋及其制作方法 |
FR3118578A1 (fr) * | 2021-01-07 | 2022-07-08 | Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques Seppic | Composition pharmaceutique comprenant comme agent épaississant une composition qui présente des propriétés épaississantes de milieux polaires |
-
2007
- 2007-11-19 JP JP2007298989A patent/JP2009079025A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104886866A (zh) * | 2015-06-27 | 2015-09-09 | 香志光 | 一种养生美白鞋及其制作方法 |
FR3118578A1 (fr) * | 2021-01-07 | 2022-07-08 | Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques Seppic | Composition pharmaceutique comprenant comme agent épaississant une composition qui présente des propriétés épaississantes de milieux polaires |
WO2022148660A1 (fr) * | 2021-01-07 | 2022-07-14 | Societe D'exploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques Seppic | Composition pharmaceutique comprenant comme agent épaississant une composition qui présente des propriétés épaississantes de milieux polaires |
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