CN106290683B - 一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，包括以下步骤：（1）分别取待测单质糖的标准品且配制成一系列浓度梯度的标准溶液；（2）HPLC‑RID标准曲线的建立：将步骤（1）所配制的标准溶液分别进样于HPLC‑RID系统进行检测，根据峰面积与标准溶液浓度的对应关系分别建立标准曲线；（3）金霉素发酵液的预处理：取适量金霉素发酵液，加入与所取金霉素发酵液等体积量的乙腈，摇匀，过滤取滤液作为样品；（4）金霉素发酵液的HPLC‑RID测定：将步骤（3）所得样品按照步骤（2）的方法进行测定再通过计算得出金霉素发酵液中待测单质糖的浓度。本发明能准确地检测金霉素发酵液中的12种单质糖并准确定量，对实际生产过程能精细地提供指导发酵的数据。

Description

一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法。
背景技术
目前金霉素发酵液中糖含量的检测均为关于总糖的检测方法，而且总糖的检测方法多年来一直沿用传统的碘量法，不但工作量大，测定时间长，不能及时给生产提供准确、可靠的分析数据，而且其检测试剂价格昂贵，采用碘量法测定金霉素发酵液总糖的检测成本较高。有时为了降低成本，往往只测定一次就得出结论，测定结果误差率高，不能满足分析检测要求。
更为重要的是，碘量法只能检测出金霉素发酵液中的总糖含量，无法对其中的多种糖成分进行检测。气相色谱法虽然可以分别测定不同糖的含量，灵敏度高，但由于糖难以气化，必须进行衍生化反应才可检测，而在衍生化的过程中步骤繁琐，条件要求高，特别是对于热不稳定单糖或寡糖，在样品预处理过程中易产生其他副反应或样品挥发，从而降低分析的准确度，同时也影响样品分析处理速度。高效液相色谱(HPLC)系统通常配备紫外检测器或荧光检测器，但由于糖类没有紫外吸收，为此常采用衍生化处理，将糖类组分转变为带发色基团的分子，不仅过程繁琐、反应时间长，且可能导致不稳定基团的解离，给最终的测定结果带来偏差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，能准确地检测金霉素发酵液中的12种单质糖并准确定量，对实际生产过程能精细地提供指导发酵的数据。
本发明采用如下技术方案：
一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制：分别取待测单质糖的标准品且配制成一系列浓度梯度的标准溶液；所待测单质糖即金霉素发酵液中所含的各种糖；其中标准溶液浓度梯度的数值范围应能覆盖这种糖在金霉素发酵液中可能有的浓度大小的范围；
(2)HPLC-RID标准曲线的建立：将步骤(1)所配制的标准溶液分别进样于HPLC-RID系统进行检测，设定检测条件，利用empower软件，根据峰面积与标准溶液浓度的对应关系分别建立标准曲线；每种待测单质糖都需建立自己的标准曲线，其中标准溶液浓度以及与标准溶液浓度对应的峰面积的数值采集7组，其中每个浓度的标准溶液都要测定一次得出峰面积；HPLC为高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)的简称，RID为示差折光检测器(Refractive Index Detector)的简称；
(3)金霉素发酵液的预处理：取适量金霉素发酵液，加入与所取金霉素发酵液等体积量的乙腈，摇匀，过滤取滤液作为样品；
(4)金霉素发酵液的HPLC-RID测定：将步骤(3)所得样品按照步骤(2)的方法进行测定，分别通过峰面积及标准曲线计算出样品中待测单质糖的浓度，再通过样品中待测单质糖的浓度及样品体积计算出金霉素发酵液中待测单质糖的浓度。
上述的检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，所述待测单质糖包括果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、异麦芽糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
上述的检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，所述步骤(1)中标准溶液的浓度梯度范围为0～2000μg/mL；各种待测单质糖的标准溶液的浓度梯度范围应能覆盖这种待测单质糖在金霉素发酵液中可能有的浓度大小的范围。
上述的检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，所述步骤(2)中的检测条件如下：色谱柱：糖柱，3.5μm 4.6mm X 250mm；柱温：50℃；流动相：乙腈和氨水的体积比为3:1的混合溶剂；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
上述的检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，所述步骤(3)中过滤采用0.45μm的滤膜。
本发明的有益效果如下：
(1)金霉素发酵液的生产过程中，需要随时检测其中的糖含量，以指导控制整个发酵过程。传统的碘量法在金霉素发酵液的生产中普遍应用，但碘量法存在以下缺点：1)只能检测出金霉素发酵液中的总糖含量，不能检测金霉素发酵液中所含的多种单质糖的含量，无法提供精细的指导数据；2)所用试剂昂贵，增加生产成本；3)检测步骤复杂，耗时长，难以提供金霉素发酵液即时的单质糖含量数据，以致对生产中的调整控制产生误导。气相色谱法虽然可以分别测定不同单质糖的含量，灵敏度高，但由于糖难以气化，必须进行衍生化反应才可检测，而在衍生化的过程中步骤繁琐，条件要求高，在样品预处理过程中易产生其他副反应或样品挥发，从而降低分析的准确度，同时也影响样品分析处理速度；可见气相色谱法存在与碘量法2)和3)所述的基本相同的缺点。高效液相色谱(HPLC)系统通常配备紫外检测器或荧光检测器，但由于糖类没有紫外吸收，为此常采用衍生化处理，将糖类组分转变为带发色基团的分子，不仅过程繁琐、反应时间长，且可导致不稳定基团的解离，给测定结果带来偏差。本发明采用示差折光检测器(Refractive Index Detector,RID)代替紫外检测器或荧光检测器进行检测，示差折光检测器尤其适合无紫外吸收的有机物，诸如糖类，所以检测样品不需衍生化，就可以直接测定，检测过程简单，对糖类检测的灵敏度高，其检测限可达10-8g/mL，能够满足金霉素发酵液的分析测定要求。
(2)本发明首先通过金霉素发酵液中所含有的各种待测单质糖对应的标准品，配制成一系列浓度梯度的标准溶液，然后进样到HPLC-RID系统中，分别建立各种待测单质糖标准品对应的标准曲线。每种糖的标准曲线建立完成之后，可以一直沿用，在以后检测金霉素发酵液的过程中无需再次进行标准曲线的建立，直接将预处理后的金霉素发酵液进样，进行检测即可，十分方便，省力省时，能够提供即时的金霉素发酵液所含单质糖的检测数据，而且是十分精细的各种单质糖的浓度数据，方便对金霉素发酵液进行实时检测，在不符合生产预期时，及时进行控制调整，提高生产过程的可控性，同时提高产品的质量。
附图说明
图1为待测单质糖标准品的高效液相色谱图；
图2为金霉素发酵液样品的高效液相色谱图；
图中：A——鼠李糖；B——果糖；C——L-(+)-甘露糖；D——葡萄糖；E——蔗糖；F——麦芽糖；G——乳糖；H——异麦芽糖；I——蔗果三糖；J——麦芽三糖；K——蔗果四糖；L——蔗果五糖。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，
1、材料与试剂
果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、异麦芽糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、乙腈、氨水
2、测定方法
一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，包括以下步骤：
(1)待测单质糖的标准溶液的配制(共计12种糖)：分别取果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、异麦芽糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的标准品，以超纯水为溶剂，配制成一系列浓度梯度的标准溶液；其中标准溶液浓度梯度的数值范围应能覆盖这种单质糖在金霉素发酵液中可能有的浓度大小的范围，所述12种待测单质糖标准溶液浓度梯度的的数值范围设置如下：
果糖：1～800μg·mL-1
甘露糖：1～450μg·mL-1
葡萄糖：1～406μg·mL-1
蔗糖：0.6～1603μg·mL-1
乳糖：1.2～906μg·mL-1
鼠李糖：1～250μg·mL-1
异麦芽糖：1～804μg·mL-1
麦芽糖：0.9～2000μg·mL-1
麦芽三糖：0.8～1999μg·mL-1
蔗果三糖：1.1～409μg·mL-1
蔗果四糖：1.2～256μg·mL-1
蔗果五糖：1～260μg·mL-1
根据上述标准溶液浓度梯度的的数值范围，具体浓度梯度设置如表1：
表1所述12种待测单质糖的标准溶液的浓度梯度
(2)HPLC-RID标准曲线的建立：将步骤(1)所配制的标准溶液分别进样于HPLC-RID系统进行检测，设定检测条件，
检测条件如下：色谱柱：糖柱，3.5μm 4.6mm X 250mm；柱温：50℃；样品室温度：27℃；流动相：乙腈和氨水的体积比为3:1的混合溶剂；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；运行时间：30min。
如图1所示为12种待测单质糖标准品的高效液相色谱图，利用empower软件，根据峰面积与标准溶液浓度的对应关系分别建立标准曲线；每种待测单质糖都需建立自己的标准曲线，其中标准溶液浓度以及与标准溶液浓度对应的峰面积的数值采集7组，其中每个浓度的标准溶液测定一次得出峰面积；HPLC为高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography)的简称，RID为示差折光检测器(Refractive Index Detector)的简称；
如下表2所示，给出了所述12种待测单质糖的标准曲线方程，可以看出，所述12种待测单质糖的相关系数均在0.98以上，线性较好，线性范围也比较大，检出限在0.31～0.63μg·mL-1之间，灵敏度比较高。
表2所述12种待测单质糖的标准曲线方程
(3)金霉素发酵液的预处理：使用移液器取5mL发酵液于10mL容量瓶中，加入等体积量的乙腈5mL，3200r/min、30min摇匀，使用0.45μm的滤膜过滤，取滤液作为样品，供检测用；
(4)金霉素发酵液的HPLC-RID测定：将步骤(3)所得样品按照步骤(2)的方法进行测定，得到12种待测单质糖各自的峰面积，然后分别通过峰面积及标准曲线计算出样品中这12种待测单质糖的浓度C，再通过样品中待测单质糖的浓度C及样品体积计算出金霉素发酵液中待测单质糖的浓度S，计算公式(1)如下：
S＝2C (1)
式中：
C为样品溶液中待测单质糖的浓度；
S为金霉素发酵液中待测单质糖的浓度。
图2为金霉素发酵液样品的高效液相色谱图，可以看出，各种待测单质糖的分离度比较高，分离效果比较好，所述待测单质糖的浓度结果如表3所示(该金霉素发酵液样品为金霉素发酵过程中某个时期的发酵液样品，其中没有检测到果糖、麦芽三糖和鼠李糖三种组分)。
表3金霉素发酵液中待测单质糖的浓度结果
所述12种待测单质糖的不同浓度的回收率结果如表4所示，回收率均在83％～101％之间，回收率较好。
表4回收率实验
综上所述，本发明所述的检测方法对金霉素发酵液的处理简单，经稀释、过滤，即满足检测的需要，最大限度的去除了影响回收率的步骤，回收率高，由图2可以看出，所述待测单质糖被完全分离，分离效果好、分离度高，提高了检测结果的准确性。

Claims (2)

1.一种检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）标准溶液的配制：分别取待测单质糖的标准品且配制成一系列浓度梯度的标准溶液；
（2）HPLC-RID标准曲线的建立：将步骤（1）所配制的标准溶液分别进样于HPLC-RID系统进行检测，设定检测条件，根据峰面积与标准溶液浓度的对应关系分别建立标准曲线；
（3）金霉素发酵液的预处理：取适量金霉素发酵液，加入与所取金霉素发酵液等体积量的乙腈，摇匀，过滤取滤液作为样品；
（4）金霉素发酵液的HPLC-RID测定：将步骤（3）所得样品按照步骤（2）的方法进行测定，分别通过峰面积及标准曲线计算出样品中待测单质糖的浓度，再通过样品中待测单质糖的浓度及样品体积计算出金霉素发酵液中待测单质糖的浓度；
所述待测单质糖包括果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、异麦芽糖、麦芽糖、麦芽三糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖；
所述步骤（1）中标准溶液的浓度梯度范围为0~2000 μg/mL；
所述步骤（2）中的检测条件如下：色谱柱：糖柱，3.5μm 4.6mm × 250mm；柱温：50℃；流动相：乙腈和氨水的体积比为3:1的混合溶剂；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。
2.根据权利要求1所述的检测金霉素发酵液中单质糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤（3）中过滤采用0.45μm的滤膜。
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CN109030656A (zh) * 2018-08-17 2018-12-18 华仁药业股份有限公司 醋酸盐复方电解质注射液中葡萄糖有关物质的检测方法

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