CN102225198A - 一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用,该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶;其中,壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万~100万uku。本药物组合物中两个单药的相互作用关系为协同增效作用。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的死亡率在我国高居第二位、仅次于心脑血管疾病,近年每年新增肿瘤患者250万人,北京市发病率年增2.58%。由于环境、食物、水污染的加剧以及生活方式的改变,人类普遍感受到肿瘤的威胁。除了常规的外科手术、化疗、放疗,人类正积极寻求其它低毒副作用的治疗与辅助治疗方法。
原发性肝癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤,发病率在全球呈上升趋势,每年新发病例约62万例,死亡约60万例[1],位居全球肿瘤相关死亡的第3位。我国是原发性肝癌大国,发病率与死亡率均居世界之首,我国每年发病人数约34.7万例,占全球的55%,死亡人数约32.3万例,约占全球的54%,在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌,位居第二[2]。
外科手术切除是治疗原发性恶性肿瘤的首选手段,但由于原发性恶性肿瘤起病隐蔽、进展迅速、早期诊断率低,大多数患者在确诊时已经局部或远处转移,无法得到有效的手术治疗。放疗因其屏蔽作用不能保证肿瘤周围的正常组织不受损害而导致各种严重的并发症。化疗是治疗中晚期恶性肿瘤的常用方法之一,可以起到姑息性治疗作用,但目前临床上使用的化疗药物都具有明显的毒副作用、价格昂贵、易产生耐药性,同时治疗效果也不尽如人意。
中药或天然药物抗肿瘤作用大多是通过多靶点、多效应来阻断肿瘤发生、发展的多个环节而发挥作用,同时中药具有毒副作用低、价格低廉和耐药性低等优点,因此中药抗肿瘤的研究在国内外倍受重视[3]。从中药或天然药物中探寻、分离提取抗癌作用强、毒副作用小、抑瘤谱广、价格便宜的天然化合物,是研究新的抗肿瘤药物的重要途径。
壳寡糖(chitosan,CTS)是由2-10个2-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接组成的寡糖,是甲壳素脱乙酰基后进一步的降解产物,具有良好的生物相容性和生物可降解性,水溶性好,易吸收,而且无毒副作用。壳寡糖有多种生物功能,已应用于医药、食品、农业、化妆品等各个领域。在日本、美国等国家,将壳寡糖作为功能性食品成分广泛地应用于保健食品。近年来,国内外研究证实壳寡糖及其衍生物具有抑制癌细胞及肿瘤生长等作用[4],作为抗肿瘤药,吸收率高、长期口服无毒副作用是其优点,但抑瘤率较低是它最大的弱点。
蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)亦称蚓激酶(lumbro kinase,LK),是从蚯蚓提取的一种具有纤维蛋白溶解活性的蛋白水解酶,口服可以进入血流,临床上口服用于溶解血栓(蚓激酶胶囊、普恩福、博洛克);无明显毒副作用,也见于保健食品(龙舒泰精制地龙胶囊)。
目前国内外对壳寡糖、蚯蚓纤溶酶抗肿瘤的研究仅限于单药的研究,虽然两个单药无毒副作用或无明显毒副作用,但抗肿瘤的作用也相对较弱,在实验动物、在临床应用效果也不够理想。能否在利用其安全性的同时、大幅度提高抗肿瘤效果,使之成为理想的抗肿瘤新药。
发明内容
抗肿瘤治疗周期长、影响因素多,特别是中晚期患者机体已经衰弱,因此抗肿瘤药的安全性和抗肿瘤效果是两个并重的指标。从中药或天然药物分离提取抗肿瘤有效成分,选择低毒副作用的有效成分,试验它们不同的配方组合以求大幅度提高抗肿瘤效果,是开拓抗肿瘤新药的有效途径。本发明采用体内和体外实验相结合,以人肝癌SMMC-7721细胞株和小鼠肝癌H22移植瘤为模型,进一步研究壳寡糖-蚯蚓纤溶酶不同配比组合物的抑瘤效果、抑瘤机理以及对动物的毒副作用,旨在保持无毒副作用-无明显毒副作用的基础上,显著提高新的药物组合物的抗肿瘤效果。
本发明的目的是通过以下方式实现的:
一种抗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶(又称蚓激酶);其中,壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万~100万uku,优选为100g∶10万~70万uku,进一步优选100g∶10万~30万uku,最优选100g∶20万~30万uku。本发明所采用的原料可为壳寡糖或蚯蚓纤溶酶不同程度提取、提纯的粗制品、精制品及其衍生物或其它含壳寡糖、含蚯蚓纤溶酶的复方或者混合物。采用的壳寡糖聚合度为2~10。
本发明所述的壳寡糖和蚯蚓纤溶酶可直接混合制成散剂或加入药学可接受的辅料制成口服制剂。所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂;胶囊剂优选肠溶胶囊,颗粒剂优选肠溶颗粒剂、片剂优选肠溶片剂。
该药物组合物的服用剂量为成人日服壳寡糖300~4500mg和蚯蚓纤溶酶600~3000uku。
本发明所述的抗肿瘤的药物组合物可在制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中应用。特别是在制备治疗或预防乳腺癌、胃癌、肺癌、直肠癌、食道癌、肝癌、胰腺癌的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中应用。
本发明所使用的壳寡糖具体可通过以下方法制备得到:酶解法制备的食品级壳寡糖的水溶液,超过滤,合并滤过液,冷冻干燥,得聚合度2-10的壳寡糖白色粉末。
所使用的蚯蚓纤溶酶可通过以下方法制备得到:新鲜赤子爱胜蚓为原料,匀浆、NaCl溶液抽提,用活化的大孔阴离子交换树脂交换、洗涤、洗脱,洗脱液超过滤、洗涤、浓缩,冷冻干燥,即得。
本发明通过以下4个方面探讨其抗癌功效:
1.体外试验
①取对数生长期人肝癌SMMC-7721的单细胞悬液,细胞浓度3×104个/ml接种96孔板、每孔200μl,培养24h.后加入不同浓度的单药或药物组合物继续培养24h.、48h.、72h.,吸弃上清、MTT法测定癌细胞增殖抑制率。
②单细胞悬液接种细胞瓶,生长贴壁后加入不同浓度单药或药物组合物继续培养48h.,在倒置显微镜下观察细胞形态;同时胰蛋白酶消化收集细胞,测定细胞凋亡率。
2.体内试验
给昆明种小鼠皮下注射定量荷瘤鼠腹水细胞,制备鼠肝癌H22移植瘤模型。分别用单药或者不同配方的药物组合物给药20天,停药24h后处死动物:①剥离瘤块计算抑瘤率;②取出肝、肾,固定、切片、HE染色,作组织病理学观察;③眼眶采血、生化检测肝肾功能;④剥离脾脏称重、计算脾指数。
3.抗肿瘤机制的探讨
不同浓度的单药或药物组合物加入人肝癌SMMC-7721细胞培养孔、继续培养48h,提取细胞RNA,用RT-PCR测定细胞Bcl-2基因表达的变化。扩增得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳,用ImageJ软件进行定量分析。
鼠肝癌H22移植瘤的荷瘤鼠,经不同浓度的单药或药物组合物灌胃治疗20天后,处死动物、剥离瘤块,固定、切片,用免疫组化的方法检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达。
4.在晚期肿瘤患者的初步临床应用
经过反复的动物试验和多名健康志愿者口服试验、确证本发明药物组合物的安全性后,应31名晚期肿瘤患者和家属的要求,自愿服用本发明药物组合物,观察其疗效和安全性。
与现有技术比较本发明的有益效果:
1.通过对实验动物的观察和动物肝肾的组织病理观察、肝肾功能生化检测以及脾指数计算证实,本发明药物组合物无明显毒副作用。本发明的药物组合物用于晚期肿瘤患者,长者连续18个月,同样未出现明显毒副作用。
2.本发明的药物组合物与两个单药体外、体内的抗肿瘤效果相比:十分显著地提高癌细胞增殖抑制率;十分显著地提高抑瘤率;十分显著地提高肿瘤细胞凋亡率;十分显著地下调Bcl-2 mRNA的表达和下调Bcl-2蛋白的表达。
3.本发明的药物组合物中两个单药的相互作用性质为协同作用。
因此,本发明药物组合物用于制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品,具有十分良好的应用前景与显著的社会效益和经济效益。
附图说明
图1-1.单药壳寡糖抑制人肝癌SMMC-7721细胞的量效曲线
图1-2.单药蚯蚓纤溶酶抑制人肝癌SMMC-7721细胞的量效曲线
图1-3.药物组合物壳寡糖-蚯蚓纤溶酶联合抑制SMMC-7721细胞的时效曲线
图中,1.1mg/ml壳寡糖,2.2mg/ml壳寡糖,3.2.5uku/ml蚯蚓纤溶酶,4.1mg/ml壳寡糖+2.5uku/ml蚯蚓纤溶酶,5.2mg/ml壳寡糖+2.5uku/ml蚯蚓纤溶酶,6.5uku/ml蚯蚓纤溶酶,7.1mg/ml壳寡糖+5uku/ml蚯蚓纤溶酶,8.2mg/ml壳寡糖+5uku/ml蚯蚓纤溶酶
图2-1.生理盐水对照组肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,生理盐水对照组细胞大小均一,呈上皮型贴壁生长,外形为梭形或多角形,轮廓清晰,细胞间结构紧密,折光性好,生长旺盛。
图2-2.1mg/ml壳寡糖引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,1mg/ml壳寡糖处理48h后,细胞形态未见明显改变,细胞密度略有降低,其余较对照组没有明显变化。
图2-3.3uku/ml蚯蚓纤溶酶引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,3uku/ml蚯蚓纤溶酶处理48h后,细胞形态未见明显改变,细胞密度略有降低。图2-4.5uku/ml蚯蚓纤溶酶引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,5uku/ml蚯蚓纤溶酶处理48h后,细胞出现皱缩、逐渐变圆,细胞密度降低,细胞间接触变松,折光性及贴壁能力变弱。
图2-5.1mg/ml壳寡糖-3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,1mg/ml壳寡糖-3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用48h后,细胞明显皱缩,细胞体积变小,密度明显降低。
图2-6.1mg/ml壳寡糖-5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用引起肝癌SMMC-7721细胞形态的变化
图中,1mg/ml壳寡糖-5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用48h后,细胞皱缩严重、体积明显缩小,失去正常多角形的形态,细胞间排列疏松,折光性及贴壁能力变弱。
图3-1.生理盐水对照组对SMMC-7721细胞凋亡的影响
生理盐水对照组细胞凋亡率(2.36%);
图3-2.3uku/ml蚯蚓纤溶酶对SMMC-7721细胞凋亡的影响
3uku/ml蚯蚓纤溶酶处理48h后细胞凋亡率(15.22%)
图3-3.1mg/ml壳寡糖对SMMC-7721细胞凋亡的影响
1mg/ml壳寡糖处理48h.后细胞凋亡率(7.46%)
图3-4.1mg/ml壳寡糖-3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合对SMMC-7721细胞凋亡的影响
1mg/ml壳寡糖-3uku/ml蚯蚓纤溶酶联合处理细胞48h,凋亡率(23.46%)。药物组合物组凋亡率与单药组、与对照组差异均十分显著(p<0.01)。
图4-1.生理盐水对照组移植瘤
图4-2.壳寡糖组(150mg/kg·d)移植瘤,抑瘤率17.13%。
图4-3.蚯蚓纤溶酶组(1000uku/kg·d)移植瘤,抑瘤率18.65%。
图4-4.壳寡糖(150mg/kg·d)联合蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg·d)组移植瘤,抑瘤率49.07%。由图4-1、4-2、4-3、4-4可见各组药物对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。
图5-1.生理盐水组肝脏切片(×200)
图5-2.壳寡糖组(150mg/kg·d)肝脏切片(×200)
图5-3.蚯蚓纤溶酶组(1000uku/kg·d)肝脏切片(×200)
图5-4.壳寡糖(150mg/kg·d)联合蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg·d)组肝脏切片(×200)
图6-1.生理盐水组小鼠肾脏切片(×200)
图6-2.壳寡糖组(150mg/kg·d)小鼠肾脏切片(×200)
图6-3.蚯蚓纤溶酶组(1000uku/kg·d)肾脏切片(×200)
图6-4.壳寡糖(150mg/kg·d)联合蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg·d)组肾脏切片(×200)
图7-1.人肝癌细胞Bcl-2 mRNA的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图7-2.人肝癌细胞Bcl-2基因表达的半定量分析
图7-1和7-2显示各组药物对人肝癌SMMC-7721细胞Bcl-2 mRNA表达的下调。
其中,M.Maker、1.空白对照、2.0.5mg/ml壳寡糖组、3.1mg/ml壳寡糖组、4.3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、5.0.5mg/ml壳寡糖+3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、6.1mg/ml壳寡糖+3uku/ml蚯蚓纤溶酶组。
图8-1.模型组移植瘤Bcl-2蛋白表达(×200)
图中,模型组肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达增强(Bcl-2蛋白染成黄色-棕黄色)
图8-2.蚯蚓纤溶酶组(1000uku/kg·d)Bcl-2蛋白表达(×200)
图8-3.壳寡糖组(150mg/kg·d)Bcl-2蛋白表达(×200)
图8-4.壳寡糖(150mg/kg·d)-蚯蚓纤溶酶(1000uku/kg·d)组Bcl-2蛋白表达(×200)
具体实施方式
试验例1单药和药物组合物的制备
1.壳寡糖的制备
壳寡糖,酶解法生产、食品级,梭子蟹壳为原料,购自潍坊海之源生物制品公司。将食品级壳寡糖溶于蒸馏水成10%溶液,100ml溶液置于MSC400杯式超滤器(上海摩速科学器材)、超滤膜切割分子量2KD,加压、搅拌过滤;补加少量蒸馏水继续加压、搅拌过滤,合并滤过液、冷冻干燥,即得。成品为白色粉末,分子量低于2000D,收得率55%左右。取适量样品HPLC分析[8],Waters糖柱,流动相为乙腈∶水=50∶50(含3‰氨水),流速为1mL/min。以葡聚糖标准品制作标准曲线,实测样品聚合度为2-9。
2.蚯蚓纤溶酶的制备
以新鲜赤子爱胜蚓为原料,采用离子交换法直接从蚯蚓匀浆提取[专利号ZL 2009 10026780.6一种利用离子交换树脂直接提取蚯蚓纤溶酶的工业化生产方法]。步骤为:①新鲜或冷冻赤子爱胜蚓,在0.14mol/L NaCl溶液中匀浆并搅拌提取2小时,随即4000g离心或过滤除去沉淀,得蚯蚓粗提液。②无离子水调节蚯蚓粗提液的电导率1-5ml/Ω,已活化的大孔阴离子交换树脂装柱、上样、进行动态离子交换,用电导率1-5ml/Ω NaCL液洗涤。③用0.5~4.5mol/L pH 5-6的NaCl溶液梯度洗脱、收集纤溶酶洗脱峰。④洗脱液通过超过滤洗涤、浓缩,冷冻干燥,即得。⑤产品质量符合国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z:按干品计算效价不低于12000单位/mg(即12uku/mg),比活力不低于20000单位/mg蛋白质(即20uku/mg ptrotein)。纤维蛋白平板法[9]实测纤溶酶效价:25uku/mg。
试验例2不同单药和药物组合物对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用
1.人肝癌SMMC-7721细胞的培养
细胞株购自上海细胞所。
将SMMC-7721细胞接种于含适量的培养液(RPIM-1640加10%热灭活的小牛血清)的培养瓶内,置37℃、5%CO2培养箱内培养。胰酶消化法传代细胞,每2~3天传代1次,取对数生长期细胞用于实验。
2.统计学方法
采用统计学软件SPSS 13.0对相关数据进行分析,两样本均数比较采用成组t检验,计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05为有统计学意义。
根据Weeb系数[5]来判定联合应用药物的相互作用关系:预估效应C=A×B,其中A、B分别指两个单药作用的细胞实际存活率。当两药联合作用的细胞实际存活率<C时,联合用药表现为协同作用;当C≤联合用药组细胞实际存活率<A和B时,联合用药表现为相加作用。
3.人肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制试验
(1)单药对人肝癌细胞的增殖抑制试验(MTT法)
取对数生长期人肝癌细胞,胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液、3×104个/ml,接种于96孔板内、200μl/孔,其中3个孔留作空白对照,在37℃、5%CO2培养24h。取出96孔板,加入不同浓度梯度的蚯蚓纤溶酶或壳寡糖200μl,使每孔蚯蚓纤溶酶终末浓度分别为0.625uku/ml、1.25uku/ml、2.5uku/ml、5uku/ml、10uku/ml,每孔壳寡糖终末浓度分别为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml,阴性对照组每孔加入200μl普通培养液,空白孔加200μl普通培养液不加细胞。每个浓度设4个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h,弃上清,每孔加入5mg/ml MTT 20μl,继续温育4h,吸弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl,振荡10min,用自动酶标读数仪,在波长570nm处测定各孔吸光值(A),取4个复孔的平均值。以药物浓度为横轴,A值为纵轴绘制细胞生长曲线,并计算药物作用24h、48h、72h的增殖抑制率。
抑制率=[1-(实验组平均A值-空白孔平均A值)/(阴性对照组平均A值-空白孔平均A值)]×100%。
试验结果表明:
1、壳寡糖对SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用,但是作用较弱。(见图1-1)
2.蚯蚓纤溶酶对SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用(P<0.05),作用比壳寡糖强,具有时间、剂量依赖性。(见图1-2)
(2)药物组合物对人肝癌细胞增殖抑制试验(MTT法)
根据上一项单药抑制试验结果,计算得出各组的IC50值,选择合适的壳寡糖、蚯蚓纤溶酶浓度配比组成联合用药的组合物,重复MTT法,绘制细胞增殖曲线,计算壳寡糖、蚯蚓纤溶酶以及壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶作用24h、48h、72h的细胞增殖抑制率。
本试验选择的药物组合物配比为:1mg/ml壳寡糖、2mg/ml壳寡糖分别与2.5uku/ml蚯蚓纤溶酶、5uku/ml蚯蚓纤溶酶联合作用。(见图1-3)
试验结果表明:1.壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶的四种药物组合物、不同时段对癌细胞的增殖抑制率均显著提高,与对应浓度的两个单药组相比,差异都十分显著(P<0.01)。(见图1-3)
2.1mg/ml壳寡糖联合2.5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纤溶酶,作用24h、48h和72h,各组的细胞的存活率均高于预计值C、低于相应单药组A和B的实际存活率,两种组合物中两个单药的相互作用性质为相加作用。(见表1、图1-3)
3.2mg/ml壳寡糖联合2.5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纤溶酶,作用24h、48h和72h,各组细胞的存活率均低于预计值C,更低于相应单药组A和B的实际存活率,两种组合物中两个单药的相互作用性质为协同作用。(见表1,图1-3)
表1.药物组合物作用于SMMC-7721细胞的存活率和C值(%)
*预计存活率:对应两个单药组的实际存活率A和B(源自图1-3的数据),A×B=C(预计存活率)。
试验例3各组药物对人肝癌SMMC-7721细胞形态的影响
用试验例2相同的方法培养的人肝癌SMMC-7721细胞,进入对数生长后用0.5%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,以3×104个/ml浓度接种于培养瓶中,每瓶加培养液6ml,根据MTT实验结果设立六组:对照组、1mg/ml壳寡糖组、3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、5uku/ml蚯蚓纤溶酶组、1mg/ml壳寡糖联合3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、1mg/ml壳寡糖联合5uku/ml蚯蚓纤溶酶组,于37℃、5%CO2条件下培养48h。在倒置显微镜下观察各试验组与对照组X细胞形态的变化。
两个药物组合物比三个单药组更显著地引起:癌细胞密度降低、细胞皱缩、体积缩小、折光性及贴壁力下降;其中1mg/ml壳寡糖-5uku/ml蚯蚓纤溶酶对癌细胞的抑制效果最强。(见图2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6)
试验例4各组药物对SMMC-7721细胞凋亡的影响
用试验例2相同的方法培养的人肝癌SMMC-7721细胞,进入对数生长期后用0.5%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,以3×104个/ml浓度接种于培养瓶中,每瓶加培养液4ml。根据MTT实验结果,设立四组:对照组、1mg/ml壳寡糖组、3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、1mg/ml壳寡糖联合3uku/ml蚯蚓纤溶酶组,细胞于37℃、5%CO2条件下培养48h。0.25%胰蛋白酶消化、离心收集细胞,用PBS洗涤2次,离心、吸尽上清液,用200μl结合缓冲液悬浮细胞,加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI混匀,4℃避光,反应30min,再加入300μl结合缓冲液,立即送流式细胞仪检测。
在FACS Vantage SE型流式细胞仪(美国Becton公司)用流式细胞术检测细胞凋亡率。
试验结果表明:①对照组凋亡率2.36%;单药1mg/mL壳寡糖凋亡率7.46%;单药3uku/ml蚯蚓纤溶酶凋亡率15.22%;组合物1mg/mL壳寡糖-3uku/ml蚯蚓纤溶酶凋亡率达23.6%。②三个试验组凋亡率与对照组比较差异均十分显著。③药物组合物组凋亡率与两个单药组、与对照组比较,差异均十分显著(P<0.01)。
(见图3-1、3-2、3-3、3-4)
试验例5各组药物对小鼠肝癌H22移植瘤的影响
1.动物试验和统计学方法
(1)动物试验方法
鼠H22肝癌细胞复苏后,在体外培养2~3代,接种于小鼠腹腔、体内传代1次,第2次传代小鼠在7~10天颈椎脱臼处死,无菌抽吸腹水,离心洗涤,用Hanks工作液稀释至活细胞数为1×108个/ml,备用。
昆明种小鼠32只随机分为4组,每组8只。取H22肝癌细胞悬液接种于小鼠后肢皮下,每只0.5ml。24h后每天分别给各组小鼠灌胃0.2ml的药物或生理盐水,连续给药20天,同时观察动物体况。停药后次日,颈椎脱臼处死,采血,剥离瘤块,称重,计算抑瘤率。
动物分组和给药剂量:壳寡糖组150mg/kg·d;蚯蚓纤溶酶组1000uku/kg·d;壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶组壳寡糖150mg/kg·d+蚯蚓纤溶酶1000uku/kg·d;对照组每日0.2ml生理盐水灌胃。
(2)统计学方法
采用统计学软件SPSS 13.0对相关数据进行分析,两样本均数比较采用成组t检验,计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05为有统计学意义。
用两药相互作用系数CDI(coefficient of drug in interaction)评价两药相互作用性质,CDI按下式计算:CDI=AB/(A×B)。其中:AB=两药联合组的D/对照组D值,A或B=单药组A或B的D/对照组D值。D为各组平均瘤重。若CDI<1.0,则单药联合作用性质为协同,CDI<0.7为显著协同;CDI=1.0则两药联合作用性质为相加;若CDI>1.0则两药联合作用性质为拮抗[6][7]。
2.各组药物对移植瘤的抑瘤率(见表2、图4-1、4-2、4-3、4-4)
(1)对照组平均瘤重>1g,说明造模成功,肿瘤生长良好。
(2)单药壳寡糖组、蚯蚓纤溶酶组,平均瘤重均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。壳寡糖组、蚯蚓纤溶酶组,抑瘤率差异不显著(P>0.05)。
(3)壳寡糖-蚯蚓纤溶酶的组合物对小鼠H22瘤体的生长有明显的抑制作用,抑瘤率达到49.07%,与两个单药组、与对照组比较,差异十分显著(P<0.01)。
(4)药物组合物的CDI值为0.75,小于1.0,表明其中两个单药相互作用性质为协同作用,接近显著协同作用(CDI=0.70)。
(5)同时观察到药物组合物组小鼠活动自如、皮毛光滑、食量正常,提示壳寡糖联合蚯蚓纤溶酶对肿瘤生长有显著抑制作用,但并不产生明显毒副作用。
表2.各组药物对小鼠H22移植瘤的抑制作用(x±S)
*与生理盐水组比较P<0.01;**与壳寡糖组、蚯蚓纤溶酶组比较P<0.01;
Δ药物组合物组脾指数升高,但与其它三组差异无统计学意义p>0.05。
3.各组药物对动物的安全性
实验结束,处死四组小鼠,眼眶采血、离心、作生化测定;分别取出各组肝、肾,切块、固定、切片、HE染色,作组织病理学观察;摘取脾脏、称重、计算脾指数。
试验结果显示:
①肝肾组织病理观察结果表明:三组药物即壳寡糖、蚯蚓纤溶酶和本发明的药物组合物对动物的肝肾组织均未产生明显的不良影响。(详见图5-1、5-2、5-3和5-4;图6-1、6-2、6-3、6-4)
②肝肾功能生化检测结果表明:各组动物肝肾功能均在正常范围内,即壳寡糖、蚯蚓纤溶酶和本发明的药物组合物对肝肾功能均没有明显的不良影响。(见表3)
③脾指数检查结果表明:药物组合物组脾指数比单药组、对照组升高,但差异无统计学意义。(见表2)
表3.各组药物对小鼠肝肾功能的影响
试验例6药物组合物抑瘤机理的探讨
1.在体外对人肝癌SMMC-7721细胞Bcl-2 mRNA的表达的影响
细胞培养
取对数生长期的SMMC-7721细胞,0.5%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,接种96孔板,每孔6×104个细胞。根据MTT实验结果设立六组:对照组、0.5mg/ml壳寡糖组、1mg/ml壳寡糖组、3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、0.5mg/ml壳寡糖联合3uku/ml蚯蚓纤溶酶组、1mg/ml壳寡糖联合3uku/ml蚯蚓纤溶酶组。加药后,细胞用RPMI-1640培养液(Gibco),在37℃、5%CO2培养箱(REVCO)中继续培养48h,用Trizol(Invitrogen)提取细胞RNA.
基因表达测定
Bcl-2基因的表达用RT-PCR测定。提取的细胞RNA用无RNA酶的水溶解后,取0.2-2μg RNA,反转录成cDNA.然后取1μl cDNA作为模板,进行PCR实验。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司、目的基因和内参引物购自上海生物工程有限公司。
Bcl-2基因的引物:
上游引物:5’-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’
下游引物:5’-GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3’
β-actin作为对照,引物序列:
上游引物5’-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3’
下游引物5’-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3
扩增得到的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳,用ImageJ软件分析目的基因的扫描灰度与β-action基因的灰度比值进行基因表达的半定量分析。
试验结果表明:药物作用于人肝癌SMMC-7721细胞48小时,单药壳寡糖和蚯蚓纤溶酶均能下调细胞Bcl-2 mRNA的表达,与对照组比较差异显著(p<0.05);两种药物组合物使Bcl-2 mRNA的表达显著下调,与对照组差异十分显著(P<0.01),其中高剂量组合物(1mg/ml壳寡糖联合3uku/ml蚯蚓纤溶酶)与对照组、与两个单药组差异均十分显著(P<0.01)。(见图7-1、7-2)
2.在体内对鼠肝癌H22组织Bcl-2蛋白表达的影响
试验例五药物治疗试验的各组荷瘤鼠,试验观察20天后处死,剥离皮下肿瘤组织,同时取对照组肿瘤样本,将肿瘤块浸泡10%福尔马林溶液固定,脱水、石蜡包埋,切成4μm的薄片。切片烘干、脱蜡、脱水、用柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)进行抗原微波修复。
用免疫组织化学法检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达。即用型SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒、购自北京中杉生物技术有限公司;抗体Bcl-2、购自北京中山生物技术有限公司。
镜检结果判断:细胞凋亡相关基因Bcl-2蛋白的表达定位于阳性瘤细胞的细胞膜或者胞浆,被染成黄色或棕黄色。Bcl-2染色切片在高倍显微镜下观察具有代表性的5个视野,分别计数100个细胞,共计500个细胞,并计算阳性细胞百分率。
试验结果表明:1.生理盐水对照组肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达增强。2.壳寡糖组、蚯蚓纤溶酶组以及药物复合物治疗组Bcl-2蛋白的表达减弱,与生理盐水组差异均十分显著性(P<0.01)。3.壳寡糖组与蚯蚓纤溶酶组比较,Bcl-2蛋白的表达没有显著差异(P>0.05)。4.药物组合物组Bcl-2蛋白表达显著下调,与两个单药组、与生理盐水对照组比较,差异均十分显著(P<0.01)。(见表4、图8-1、8-2、8-3、8-4)
表4.各组药物对小鼠H22瘤组织中Bcl-2蛋白表达的影响
*单药组与生理盐水组比较P<0.01;**药物组合物组与单药组、与对照组比较P<0.01。
试验例7药物组合物在晚期肿瘤患者的初步临床应用
1、一般资料:
31例晚期肿瘤患者,年龄39-82岁,平均69岁,女19例、男12例,其中乳房癌7例、胃癌6例、肺癌6例、直肠癌5例、食道癌4例、肝癌2例、胰腺癌1例。31名志愿者中,部分患者此前已放弃治疗。
2、治疗方法:
每位患者餐前0.5-1小时口服本发明的药物组合物的胶囊或颗粒制剂;由壳寡糖(聚合度2-9)100g+蚯蚓纤溶酶28万uku+辅料适量,制剂而成。患者每次口服制剂含:壳寡糖250mg+蚯蚓纤溶酶700uku,日服3次,连续1个月为1疗程。
3、治疗结果:
(1)31例晚期肿瘤患者口服本发明药物组合物1-18个月均未发现明显毒副作用。
(2)28例晚期肿瘤患者连续口服本品1.5个月、病情得到显著缓解;24例患者连续服用本品3个月,病情显著好转。
(3)2例晚期肿瘤患者(乳腺癌、胃癌),连续服用本品半年后肿瘤接近痊愈。
病例1.孙xx女81岁,右乳浸润性导管癌晚期,胸部溃疡深及肋骨,新生肿块直径约5cm、中心部变软,胸骨、肋骨疼痛剧烈,体质衰弱、长期卧床。当溃疡灶出血严重时,创面洒云南白药、口服“保险子”维系生命,已放弃治疗。口服本品1.5个月,病情明显缓解;连续服用本发明药物组合物的胶囊制剂6个月,胸部溃疡完全愈合,新生肿块消退,骨疼痛显著减轻,可以下床走动。
病例2.黄xx男73岁,贲门区腺癌、直径5-6cm、进展期、已转移;口服化疗药、毒副反应严重、被迫停药,面条已难通过。口服本发明药物组合物的颗粒制剂1.5个月,病情明显缓解;连续服用本品6个月,干饭菜肴吞食自如,胸骨后疼痛明显减轻;连续服用本品12个月,胃镜复查贲门区肿块消失、粘膜光整;饮食、体况正常,正常下地干农活。
病例3.王xx 男62岁,肺中央型鳞癌晚期,癌肿直径5-6cm、气管被压缩2/3,纵隔淋巴结肿大,肺功能差。连续服用本发明药物组合物的胶囊制剂4个月,其间化疗2次,病情明显缓解、精神和体力明显恢复,可独自上下五楼。复查:肿瘤灶缩小至1.5cm、气管恢复圆形。患者化疗期间同时服用本品,毒副反应明显轻于同批化疗的其它肿瘤患者。
病例4.章xx男69岁,食道鳞状细胞癌,并患II型糖尿病和高血压,食道癌根治手术后8个月胸骨后疼痛加剧,颈部、耳后等多处浅表淋巴结肿胀、疼痛;诊断为肿瘤复发、转移。服用本发明药物组合物的颗粒制剂1.5个月,浅表淋巴结明显变软、体积缩小1/2左右,胸骨后疼痛也明显减轻。
病例5.朱xx男78岁,原发性肝癌,贴近肝动脉未能手术。化疗结束1个月后、甲胎蛋白回升至2350ng/ml,服用本发明药物组合物的胶囊制剂1.5个月,甲胎蛋白降至1456ng/ml,其间未作其它治疗。
病例6.盛xx女39岁,右乳浸润性导管癌,经过改良根治术-Auchincloss、FEC化疗、25次放疗,此后2个月、右侧胸壁出现复发结节、右侧内乳和锁骨上多发淋巴结转移。服用本发明药物组合物的胶囊制剂1个月、患者体况好转,连续服用3个月胸壁复发结节消失、上述淋巴结已不能触及、患者体况明显好转。
实施例1
取壳寡糖(聚合度2-10)1000g,蚯蚓纤溶酶(实测25uku/mg)280万uku均匀混合,加入淀粉等常规辅料,40~45℃干燥、制粒、包肠溶膜,再灌装肠溶胶囊制得肠溶胶囊剂。共制得本药物组合物的肠溶胶囊8000粒,每两粒肠溶胶囊含壳寡糖250mg、含蚯蚓纤溶酶700uku。
实施例2
取壳寡糖(聚合度2-10)1000g,蚯蚓纤溶酶(实测15uku/mg)200万uku均匀混合,加入淀粉等常规辅料,40~45℃干燥、制粒,再压片制得片剂。共制得本药物组合物的片剂5000片,每两片制剂含壳寡糖400mg、含蚯蚓纤溶酶800uku。
实施例3
取壳寡糖(聚合度2-10)1000g,蚯蚓纤溶酶(实测12.5uku/mg)500万uku均匀混合,加入常规辅料按照常规工艺制备得到蜜丸。共制得本药物组合物的蜜丸10000丸,每丸含壳寡糖100mg、含蚯蚓纤溶酶500uku。
实施例4
取壳寡糖(聚合度2-10)100g,蚯蚓纤溶酶(实测17.5uku/mg)20万uku均匀混合,直接制得本药物组合物的散剂。共得本药组合物的散剂250包,每包含壳寡糖400mg、含蚯蚓纤溶酶800uku。
实施例5
取壳寡糖(聚合度2-10)1500g,蚯蚓纤溶酶(实测20uku/mg)1000万uku均匀混合,加入淀粉等常规辅料,40~45℃干燥、制粒、包肠溶膜,制得得本药物组合物的肠溶颗粒剂。共得肠溶颗粒剂1000包,每包肠溶颗粒剂含壳寡糖1500mg、含蚯蚓纤溶酶1000uku。
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Claims (10)
1.一种抗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的有效成分包括壳寡糖和蚯蚓纤溶酶;其中,壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万~100万uku。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于药物组合物中壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万~70万uku。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于药物组合物中壳寡糖和蚯蚓纤溶酶的用量比为100g∶10万~30万uku。
4.根据权利要求1、2或3所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于所述的壳寡糖聚合度为2~10。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于壳寡糖和蚯蚓纤溶酶直接混合制成散剂或加入药学可接受的辅料制成口服制剂。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于所述的胶囊剂为肠溶胶囊,颗粒剂为肠溶颗粒剂,片剂为肠溶片剂。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的服用剂量为成人日服壳寡糖300~4500mg和蚯蚓纤溶酶600~3000uku。
9.权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中的应用。
10.权利要求1所述的抗肿瘤的药物组合物在制备治疗或预防乳腺癌、胃癌、肺癌、直肠癌、食道癌、肝癌、胰腺癌的药物或辅助抗肿瘤的保健食品中的应用。
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