CN104198418A - 金霉素效价的高通量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种金霉素效价的高通量测定方法，包括金霉素标准溶液的制备、金霉素标准曲线的绘制、金霉素样品发酵液的预处理、效价检测、根据所测得的吸光度值获取效价含量。本发明采用的试剂用量少，只需要少量草酸盐酸就可，节约了检测的试剂成本同时也减轻了污水处理负担，具有操作简便，避免操作繁琐的优点。

Description

金霉素效价的高通量测定方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵产物抗生素含量的测定技术，特别是涉及一套金霉素产生菌金色链霉菌筛选和调优过程中发酵产物金霉素效价的高通量测定方法。 

背景技术

金霉素是一种广谱抗菌素，以其有效性和经济性两大特点，在众多动物用药中独占鳌头，目前已成为全球动物用抗生素的首选品种。为提高金霉素产品的产量和质量，使公司效益最大化，除发酵设备的更新之外，还需做大量的高产菌种选育和工艺改进等方面的研发试验，为发酵大生产提供优质高产菌株和发酵、提炼等方面工艺改进提供数据参考。而限制研发试验量和试验进程的主要因素，除了摇瓶量做不大受限制之外，检测方法跟不上需求也是一大因素，因此寻找并建立一个简便、快速、又准确可信的检测方法十分重要。 

目前药典中规定金霉素效价检测主要采用的是微生物检定法和高效液相色谱法。微生物效价检定要求环境条件高、检测时间长、操作繁琐；高效液相色谱法则仪器价格昂贵、检测费用高、检测时间长。因这两种检测方法的缺点所在，尤其是检测时间长这点使得其检测样品量非常有限，无法满足大规模筛选和调优过程中一次性检测大量样品的需要，从而阻碍筛选和调优的试验进程。 

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一套金霉素产生菌金色链霉菌筛选和调优过程中发酵产物金霉素效价的高通量测定方法。该方法检测金霉素效价具有仪器设备投入少、操作简便、试剂用量少且快速，重现性好，结果准确，而且所用试剂对人和环境无毒害，具有一定的优越性，可一次性检测大量样品，加速和提高金霉素筛选和调优的试验进程和效率。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下方案实现： 

一套金霉素产生菌金色链霉菌筛选和调优过程中发酵产物金霉素效价的高通量测定方法，其特征在于，包括如下步骤： 

步骤1、金霉素标准溶液的制备：精密称取金霉素标准品适量，用0.01mol/l盐酸溶液溶解，并制成浓度分别为6u/ml、12u/ml、18u/ml、24u/ml、30u/ml的金霉素标准溶液； 

步骤2、金霉素标准曲线的绘制：在波长267±1nm处，以0.01mol/l盐酸溶液作为空白溶液调节仪器零点，分别测定步骤1中所制得的各浓度溶液所对应的吸光度A，以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标，作直线回归和相关性分析，并绘制标准曲线图表(要求：相关系数r≥0.999，即R²≥0.998)； 

步骤3、金霉素样品发酵液的预处理：取适量体积待检测的样品发酵液，加入同样量5％草酸溶液进行振荡处理后，过滤； 

步骤4、吸取步骤3中所得的滤液100ul至50ml容量瓶中，加入0.01mol/l盐酸溶液定容至刻度，摇匀； 

步骤5、效价检测：以0.01mol/l盐酸溶液为参比溶液，在波长267±1nm处进行分光光度计校正后，直接测定步骤4中容量瓶中的溶液的吸光度； 

步骤6、根据所测得的吸光度值，在步骤2中所制得标准曲线表上查得相应的浓度值，浓度值×1000＝样品效价含量(u/ml)。 

本发明的显著优点如下： 

一是采用该发明测定方法，仪器设备投入少，只需要一台紫外分光光度计； 

二是采用该发明测定方法，具有操作简便，避免的操作繁琐，减轻劳动强度； 

三是采用该发明测定方法，试剂用量少，只需要少量草酸盐酸就可，节约了检测的试剂成本同时也减轻了污水处理负担； 

四是采用该发明测定方法，样品处理及测定程序简单，便于实现高通量快速检测，降低了样品因测定时间过长导致组份变化而引起检测误差； 

五是采用该发明测定方法可一次性检测大量样品，能加速金霉素筛选和调优试验的进程； 

六是采用该发明测定方法，其结果的重现性好、准确度高，能提高金霉素筛选和调优试验的效率，此外该测定方法还适于作为金霉素生产过程中中间产品的检测方法。 

附图说明

图1为本发明金霉素标准曲线图。 

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。 

金霉素效价的高通量测定方法，其包括如下步骤： 

步骤1、金霉素标准溶液的制备：精密称取金霉素标准品适量，用0.01mol/l盐酸溶液溶解，并制成浓度分别为6u/ml、12u/ml、18u/ml、24u/ml、30u/ml的金霉素标准溶液； 

步骤2、金霉素标准曲线的绘制：在波长267±1nm处，以0.01mol/l盐酸溶液作为空白溶液调节仪器零点，分别测定步骤1中所制得的各浓度溶液所对应的吸光度A，以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标，作直线回归和相关性分析，并绘制标准曲线图表(要求：相关系数r≥0.999，即R²≥0.998)。 

所得回归直线和方程式及相关性，具体见金霉素标准曲线图1； 

步骤3、金霉素样品发酵液的预处理：取适量体积待检测的样品发酵液3个，加入同样量5％草酸溶液进行振荡处理后，过滤； 

步骤4、分别吸取步骤3中所得的滤液100ul至50ml容量瓶中，加入0.01mol/l盐酸溶液定容至刻度，摇匀,每个样品分别做6个重复； 

步骤5、效价检测：以0.01mol/l盐酸溶液为参比溶液，在波长267±1nm处进行分光光度计校正后，直接测定步骤4中容量瓶中的溶液的吸光度； 

步骤6、根据所测得的吸光度值，代入在步骤2中所制得标准曲线图中的方程式Y＝27.933X-0.095，计算出容量瓶中溶液相应的浓度值或直接在标准曲线表上查得相应的浓度值，浓度值×1000＝样品效价含量(u/ml)。结果见表2。 

表2样品检测重现性的结果 

由图1可以看出金霉素浓度在6～30u/ml范围内，在波长267±1nm处，所得线性直线回归方程为：Y＝27.933X-0.095，且相关系数R²＝1.000，即R²大于0.998，说明其吸光度与浓度呈良好的线性关系。 

由表2可以看出，用此方法检测金霉素溶液浓度，相对标准偏差RSD不大于5％，具有良好的重现性。 

采用该方法检测金霉素效价具有仪器设备投入少、操作简便、试剂用量少且快速，重现性好，结果准确，而且所用试剂对人和环境无毒害，具有一定的优越性，可一次性检测大量样品，加速和提高金霉素筛选和调优的试验进程和效率。 

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

Claims (1)

1.金霉素效价的高通量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、金霉素标准溶液的制备：精密称取金霉素标准品适量，用0.01mol/l盐酸溶液溶解，并制成浓度分别为6u/ml、12u/ml、18u/ml、24u/ml、30u/ml的金霉素标准溶液；

步骤2、金霉素标准曲线的绘制：在波长267±1nm处，以0.01mol/l盐酸溶液作为空白溶液调节仪器零点，分别测定步骤1中所制得的各浓度溶液所对应的吸光度A，以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标，作直线回归和相关性分析，并绘制标准曲线图表，要求：相关系数r≥ 0.999；

步骤3、金霉素样品发酵液的预处理：取适量体积待检测的样品发酵液，加入同样量5%草酸溶液进行振荡处理后，过滤；

步骤4、吸取步骤3中所得的滤液100ul至50ml容量瓶中，加入0.01mol/l盐酸溶液定容至刻度，摇匀；

步骤5、效价检测：以0.01mol/l盐酸溶液为参比溶液，在波长267±1nm处进行分光光度计校正后，直接测定步骤4中容量瓶中的溶液的吸光度；

步骤6、根据所测得的吸光度值，在步骤2中所制得标准曲线表上查得相应的浓度值，浓度值×1000=样品效价含量（u/ml）。