CN110346500B - 一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析血清中单糖组成的检测方法。本发明涉及使用单模微波蛋白水解仪将血清中的多糖复合物的糖链部分降解为单糖，再应用阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析单糖组分。本发明技术方案的优点是：水解过程快速，10分钟快速完成样品处理；一次可降解10个样品；微波酸水解使用传统方法相同的酸且用量少，只需10μL 3 mol/L HCl；并且每次只需2μL的血清；操作步骤简单易学，无需衍生，直接上样。另外，本发明的分析方法具有良好的重复性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法。
背景技术
血清和尿液是最受欢迎的样本来源。目前为止，血清中总数30000种蛋白质，只有约500种被识别。而有文献报道，用MS分析，从10名健康志愿者采集的尿液中，有超过1500中蛋白质被识别出来，其中将近一半的蛋白质是膜蛋白。由于血清中蛋白质含量较尿液中多，且大部分蛋白质是糖蛋白，蕴含着丰富的生物信息。有文献报道，糖链在细胞内可修饰调控蛋白质和脂类等多糖复合物非糖链部分的结构与功能，在细胞外环境参与免疫应答、感染和癌症的发生、发展等过程中的细胞识别，但是对其作用机制还不清楚。长期以来，血清中单糖的分析对于测定某些疾病状态和某些药物产品的效果是必需的。CEM Discover单模微波蛋白水解仪集合了微波这种高效的能量和Pico-Tag工作站真空/气体交换端口两者的优点，在血清降解方面达到了更高效的效果，而这种方法还没有被报道用于血清的单糖组成分析。而且我们目前使用单模微波蛋白水解仪水解血清样品没有相关的报道，只有微波水解蛋白质成氨基酸的相关报道。微波酸水解方法比传统水解多糖的方法高效快速，一次可降解10个样品，且使用和传统方法相同的酸来降解样品。高效阴离子交换色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)结合使用促进了单糖的定量，而无需预先衍生化。CarboPac PA10色谱柱是一种强阴离子交换柱，可在高pH下分离单糖，而脉冲安培检测可提供灵敏而特异的检测，消除大多数非碳水化合物基质成分的干扰。有相关文献报道阴离子色谱-脉冲安培法可以用于多种植物多糖的单糖组成分析，但没有文献报道阴离子色谱-脉冲安培法用于水解后的血清单糖组成分析。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法，测定的血清降解所得单糖包括岩藻糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖和甘露糖中的至少一种。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)取待测血清至微波水解管，加入水，混匀后再加入HCl或TFA；
(2)对混合后的样品使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；
(3)微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；
(4)离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；
(5)得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；
(6)离心后的上清液进行阴离子交换色谱-脉冲安培法分析，得到色谱图；
(7)制备多种单糖的标准曲线；
(8)将步骤(6)得到的色谱图与步骤(7)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测血清中的单糖组分。
进一步的：所述步骤(1)中待测血清的体积为2-10μL。
进一步的：所述步骤(1)中所用的酸为0.1mol/L-10mol/L HCl或0.1mol/L-4.0mol/L TFA。
进一步的：所述步骤(2)中微波酸水解的条件是：功率80w-100w，温度80℃-100℃，水解时间5min-15min。
进一步的：所述步骤(2)中微波酸水解的条件是：功率为100w，温度为100℃，水解时间10min。
进一步的：所述步骤(6)中的色谱条件为：
分析柱：Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10,4.0mm×250mm，
保护柱：Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10,4.0mm×50mm，
淋洗液：0-18min 18mM NaOH，
流速：1.0mL/min，
进样体积：10μL，
柱温：30℃。
进一步的：所述步骤(7)中的单糖包括岩藻糖，半乳糖胺，葡萄糖胺，半乳糖，葡萄糖和甘露糖中的至少一种。
进一步的：所述步骤(6)中单糖标准曲线的浓度范围为0.00005mg/mL-0.05mg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：本发明技术方案水解过程快速，10分钟快速完成样品处理；一次可降解10个样品；微波酸水解使用传统方法相同的酸且用量少，只需10μL 3mol/L HCl；并且每次只需2μL的血清；操作步骤简单易学(无需衍生，直接上样)。另外，本发明的分析方法具有良好的重复性。
附图说明
图1表明微波对单糖的影响；
图2表明酸对血清微波酸水解的影响；其中A-0.01mg/mL混合单糖标准品、B-2mol/L TFA、C-3mol/L HCl；
图3是不同浓度HCl水解某肾癌患者血清离子色谱图；其中，A-0.005mg/mL混合单糖标准品、B-0mol/L HCl、C-1mol/L HCl、D-2mol/L HCl、E-3mol/L HCl、F-4mol/L HCl和G-5mol/L HCl；
图4是不同浓度HCl对血清微波酸水解的峰面积柱状图；
图5表明血清量对微波酸水解的影响；其中，A-0.01mg/mL混合单糖标准品、B-2μL、C-5μL和D-10μL；
图6是某患者不同血清量峰面积柱状图；
图7是某肾癌患者血清单糖分离色谱图。
具体实施方式
实施例1
一、微波对单糖的影响
1、0.1mg/mL 6种单糖(岩藻糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖和甘露糖)混合标准品分成两组A、B，每份10μL。在不加酸的条件下，A组不通过CEM单模微波蛋白水解仪微波，B组在功率100w、温度100℃的条件下微波水解10分钟；
2、将A、B蒸干后，加入200μL去离子水，离心后，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，实验重复三次。
对得到的峰面积做柱状图(如图1所示)，对得到的结果进行t-检验，p>0.05，证明两者之间没有显著差异，说明微波本身对单糖的性质没有太大影响，不会造成单糖的损失。
二、不同酸对血清微波酸水解的影响
(1)随机取10例患者血清，每例血清取2份，分别取2μL至微波水解管，加入去离子水至10μL，混匀后再加入10μL 6mol/L HCl或4mol/L TFA；
(2)在功率100w、温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；
(3)微波酸水解后的样品用20μL去离子水转移到1.5mL离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；
(4)每管加100μL甲醇，离心浓缩除残留HCl，重复三次；
(5)得到的干燥样品每管用150μL去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/L NaOH淋洗液冲洗柱子；
从图2可以看出除血清中游离的葡萄糖外，TFA降解得到的其他单糖含量很少。另外，TFA降解产生的杂质也较多。
对10例患者血清微波水解后所得6种单糖峰面积计算均值发现，TFA整体的降解效率比HCl降解效率低，TFA对碱性糖(GalN和GlcN)的降解效率很低(见表1)。因此，需要根据具体需要检测哪种单糖选择合适的条件，而本发明需要对6种单糖均进行检测，所以还是选择3mol/L HCl。
表1降解所得六种单糖峰面积
三、HCl浓度对血清微波酸水解的影响
(1)随机取10例患者血清，每例血清取6份，分别取2μL至微波水解管，加入去离子水至10μL，混匀后再加入10μL HCl，使其终浓度分别为0mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L和5mol/L；
(2)在功率100w、温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；
(3)微波酸水解后的样品用20μL去离子水转移到1.5mL离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；
(4)每管加100μL甲醇，离心浓缩除残留HCl，重复三次；
(5)得到的干燥样品每管用150μL去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/L NaOH淋洗液冲洗柱子；
实验重复三次，对10例患者血清微波水解后所得6种单糖峰面积计算均值，以不同单糖为横坐标，以峰面积为纵坐标作柱状图(如图4所示)。从图3和图4很明显的看出，低浓度的HCl对血清降解得到单糖的效果较差。对碱性糖(GalN和GlcN)来说，4mol/L HCl的降解效果最好，但是会损失中性糖(Fuc、Gal、Glc和Man)，导致含量降低，而2mol/L HCl对碱性糖的降解效率又太低。因此，选择3mol/L HCl对碱性糖降解效率不至于太低，又不会损失太多的中性糖。
四、血清体积对血清微波酸水解的影响
(1)随机取10例患者血清，每例取3份，分别取2、5、10μL至微波水解管，加入去离子水至10μL，混匀后再加入10μL HCl，使其终浓度为3mol/L；
(2)在功率100w，温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；
(3)微波酸水解后的样品用20μL去离子水转移到1.5mL离心管中，重复三次，离心浓缩除酸；
(4)每管加100μL甲醇，离心浓缩除残留HCl，重复三次；
(5)得到的干燥样品每管用150μL去离子水溶解，转速13000r/min，离心5min，取上清，待用于阴离子交换色谱分析，分析完成，用200mmol/L NaOH淋洗液冲洗柱子；
图5和图6显示，相同体积，相同浓度的酸水解条件下，虽然血清量增加，得到的单糖组分的峰面积值增加，但是10μL血清样品微波酸水解之后得到的各单糖组分的峰面积并没有比5μL多一倍，5μL血清样品得到的各单糖组分的峰面积也不是2μL血清的2.5倍，甘露糖的含量甚至几乎没有变化。因此，本发明选择2μL血清用于单糖组分的分析。而且，从离子色谱图也可以看出，血清量越多，所含杂质越多，但是即便是2μL血清也可以测出6种单糖且分离度也较好。
五、重复性实验
(1)随机取1例肾病患者血清，取6份至微波水解管，每份分别取2μL，加入去离子水至10μL，混匀后再加入10μL 6mol/L HCl；
(2)在功率100w，温度100℃的条件下，使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解10min；
(3)微波水解后的血清放置24小时后用于阴离子交换色谱分析，混匀后重复进样6针。
从表2和色谱图7可以看出，保留时间RSD和峰面积RSD均较小，说明重复性比较好。
表2方法的重现性测定
实施例2
本发明提供的基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法具体包括以下步骤：
(1)取血清样品2μL至微波水解管，加入水至10μL，混匀后再加入10μL HCl或者TFA；所述HCl的浓度为3mol/L，所述TFA浓度为4mol/L；
(2)对混合样品使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；微波酸水解的条件是：功率为100w，温度为100℃，水解时间为10min；
(3)微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；
(4)离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；
(5)得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；
(6)离心后的上清液进行阴离子交换色谱-脉冲安培法分析，得到色谱图；
(7)制备多种单糖的标准曲线；
(8)将步骤(6)得到的色谱图与步骤(7)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测血清中的单糖含量。
所述色谱条件具体为：
分析柱:Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10,4.0mm×250mm；
保护柱:Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10,4.0mm×50mm；
淋洗液：0-18min 18mmol/L NaOH；
检测器：电化学检测器(P/N 072043)，标准糖电位；
工作电极：金电极(P/N 0061875)；
参比电极：Ag/AgCl；
模式：IntAmp
流速：1.0mL/min；
进样体积：10μL；
柱温：30℃；
运行时间：18min。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种基于微波酸水解的阴离子交换色谱-脉冲安培法检测血清中单糖含量的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
(1) 取待测血清至微波水解管，加入水，混匀后再加入3mol/L HCl；
(2) 对混合后的样品使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；微波酸水解的条件是：功率为100 w，温度为100 ℃，水解时间为10min；
(3) 微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；
(4) 离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；
(5) 得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；
(6) 离心后的上清液进行阴离子交换色谱-脉冲安培法分析，得到色谱图；
(7) 制备多种单糖的标准曲线；
(8) 将步骤(6)得到的色谱图与步骤(7)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测血清中的单糖组分；
所述单糖包括岩藻糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中待测血清的体积为2-10 μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中的色谱条件为：
分析柱：Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10, 4.0 mm×250 mm，
保护柱：Thermo Scientific Dionex Carbo PACTM PA10, 4.0 mm×50 mm，
淋洗液：0-18 min 18 mM NaOH，
流速：1.0 mL/min，
进样体积：10 μL，
柱温：30 ℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(7)中单糖标准曲线的浓度范围为0.00005 mg/mL-0.05mg/mL。
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