JP2016520697A - ヘパラン硫酸 - Google Patents

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Abstract

構造的および機能的に関連した単離されたヘパラン硫酸の新規クラスが開示されている。この新規クラスのヘパラン硫酸は、ＦＧＦ２を結合して、かつ幹細胞の多能性／多分化能を維持しながらその増殖を促進することが見出されている。【選択図】図１

Description

本発明は、ヘパラン硫酸に関し、排他的にではないが、特に、ＦＧＦ２を結合するヘパラン硫酸に関する。
細胞に基づく療法におけるヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）使用の主な欠点は、治療目的に十分な細胞数を達成することの難しさである。細胞外マトリクス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）基質の使用および線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）を使用することを含む、現在の戦略は、より多い細胞計数を与えるが、細胞集団中の分化した前駆細胞の増加をもたらす。
ｈＭＳＣの少ない数は、骨髄単核細胞の０．０１％から０．０００１％と同じくらいの少なさでありえ、その広範囲にわたる使用を妨げる。さらに、現在のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖戦略は、より低い質および機能と共に、移植に十分な細胞を導く多分化能性の損失をもたらすことになる。
Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ 第８巻 第５号 ４６３〜４７１ページ、１９９８）は、ＦＧＦ２と相互作用する能力があると報告されるＨＳ２と呼ばれるヘパラン硫酸（ＨＳ：ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ）を記載している。ＨＳ２は、Ｂｒｉｃｋｍａｎ（前掲）によって記載されたように、胎生期１０日目のネズミ科動物細胞のヘパランプロテオグリカンから入手可能である。ＨＳ２は、約２５ｋＤａの分子量を有するとして記載されており、したがって、１個の二糖につき４００Ｄａの平均分子量と仮定すると、約６０個の二糖からなる。ＨＳ２の二糖組成は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ 第８巻 第５号 ４６３〜４７１ページ、１９９８）、ＷＯ２０１０／０１１１８５に記載されている。ＨＳ２の亜硝酸およびヘパランリアーゼ消化プロファイルは、図２９および３０に示されている。
Ｍａｃｃａｒａｎａら（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ Ｈｅｐａｒｉｎ／Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．第２６８巻、第３２号、第１５番、２３８９８〜２３９０５ページ、１９９３）は、ヒト大動脈からのヘパリンまたはＨＳから生成されたいくつかの小さいオリゴ糖によってＦＧＦ−２の結合を調べる実験を記載している。１つの八糖画分（Ｂ２）を使用して、構造を八糖のものと考え、これを、本発明者らはＨＳ−８と名づけた。これは、本発明のＨＳ−８ではなく、その命名は完全に偶然の一致によることに留意しなければならない。
ブタ腸粘膜からのヘパリン、１つの試料は出発物質のＮ−脱硫酸化と共に選択的な６−Ｏ−脱硫酸化およびその後の再Ｎ−硫酸化によって生成され、もう１つの試料はアルカリ条件下で選択的２−Ｏ−脱硫酸化によって得られた、選択的にＯ−脱硫酸化されたヘパリンの２つの試料、ヒト大動脈から単離された低く硫酸化されたＨＳ、およびウシ腎臓からのＨＳを使用して、偶数または奇数の数の短鎖長のオリゴ糖が生成された。
偶数の数のオリゴ糖は、亜硝酸での部分的な脱アミノ切断を通した解重合によってヘパリンから生成され、結果として生じる２，４−アンヒドロ−Ｄ−マンノース残基は、ＮＡＢ３Ｈ４で還元された。標識されたオリゴ糖は分離され、４〜１４個の糖からの偶数の数の種および２０〜２４個の糖を含む画分が生成された。選択的に６−Ｏ−脱硫酸化されたヘパリンも同様に処理され、４〜１２糖が得られた。単離および脱塩されたオリゴ糖に穏やかな酸処理が行われた。奇数の数のヘパリンオリゴ糖は、ヘパリナーゼＩでの２０〜２４単位の糖のさらなる処理によって得られた。
４〜１４マーのオリゴ糖は、Ｎ−アセチル化されたＧｌｃＮ単位によって占められた部位での切断を含む異なる戦略によってヒト大動脈ＨＳから生成された。試料は、Ｎ−脱アセチル化され、次いで、亜硝酸で脱アミノ化された。この処理は、無置換のＧｌｃＮ単位の脱アミノ反応およびグルコサミニド結合の切断を導くが、Ｎ−硫酸化されたＧｌｃＮ単位は完全なままである。この産物は、（（−ＧｌｃＮＡｃ）−（ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮａｃ）ｎ配列から誘導される）ＧｌｃＡ−［１−３Ｈ］ａＭａｎＲ二糖および（（−ＧｌｃＮａｃ）−ＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＳＯ３−ＨｅｘＡ）ｎ−ＧｌｃＮａｃ配列から誘導される）ＧｌｃＡ−（ＧｌｃＮＳＯ３−ＨｅｘＡ）ｎ−［１−３Ｈ］ａＭａｎＲオリゴ糖を含む。
これらの処理によって生成されるオリゴ糖は、両方とも短く、かつそれらの調製のプロセスによって化学的に修飾され、このことは、これらを本発明のＨＳと区別する。
本発明は、ヘパラン硫酸製剤、ヘパラン硫酸ＨＳ８に関する。ＨＳ８は、ＦＧＦ２を結合して、かつ幹細胞の多能性／多分化能を維持しながらその増殖を促進することが見出されている。ＨＳ８とは、構造的および機能的に関連した単離されたヘパラン硫酸の新規クラスを指す。本発明者らは、短いコンセンサス配列（ＹＣＫＮＧＧＦ）を共有するＦＧＦ２に由来するヘパリン結合ドメインへの結合の一般的な特性を有するＨＳ８クラスの数種類の密接に関連したメンバーを同定した。ＨＳ８クラスのメンバーは、幹細胞の増殖を刺激することおよびコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｌｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）について濃縮することができる。
本発明の一態様では、ヘパラン硫酸ＨＳ８が提供される。ＨＳ８は、単離された形態または実質的に精製された形態で提供されうる。これは、ヘパラン硫酸成分が少なくとも８０％のＨＳ８、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つである組成物を提供することを含みうる。
好ましい実施形態では、ＨＳ８は、ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを結合する能力がある。ペプチドは、この配列の一方または両方の端に１個または複数のさらなるアミノ酸を有していてもよい。例えば、ペプチドは、この配列の一方または両方の端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のうちのいずれかのアミノ酸を有していてもよい。
一部の実施形態では、ＨＳ８は、
・ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）、または
・ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）
のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、またはからなる、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力がある。
他の実施形態では、ポリペプチドは、ＦＧＦ２タンパク質である。一部の実施形態では、ＨＳ８は、配列番号１、２またはＦＧＦ２タンパク質のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するまたはからなるペプチドに、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭのうちの１つよりも小さいＫＤで結合する。
ＨＳ８は、
（ｉ）ＹＣＫＮＧＧＦのアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ、
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ、
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ、
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ、
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収するステップ
を含みうる、本明細書中に記載の本発明者らの方法によって取得、同定、単離または濃縮されうる。
一部の実施形態では、該支持体に接着しているポリペプチドは、
・ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）、または
・ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）
から選択されるアミノ酸配列を含みうるまたはからなりうる。
本発明者らの方法において、該混合物は、市販の供給源から得られるグリコサミノグリカンを含んでいてもよい。１つの好適な供給源は、ヘパラン硫酸画分、例えば、市販のヘパラン硫酸である。１つの好適なヘパラン硫酸画分は、ブタ腸粘膜からのヘパリンの単離中に得ることができる（例えば、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． − 時に「Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ」と呼ばれる）。
他の好適なヘパラン硫酸の供給源は、任意の哺乳動物（ヒトまたはヒト以外）からのヘパラン硫酸、特に、腎臓、肺または腸粘膜からのヘパラン硫酸を含む。一部の実施形態では、ヘパラン硫酸は、ブタまたはウシの腸粘膜、腎臓または肺由来である。
本発明の別の態様では、上記の態様のうちのいずれか１つによるＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質を含む組成物が提供される。
本発明の一態様では、上記の態様によるＨＳ８を含む医薬組成物または医薬が提供される。医薬組成物または医薬は、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤をさらに含んでいてもよい。
一部の実施形態では、医薬組成物は、組織、例えば、破損した骨の修復および／または再生を含む、治療の方法における使用のためのものである。一部の実施形態では、医薬組成物または医薬は、ＦＧＦ２タンパク質をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物または医薬は、間葉系幹細胞をさらに含んでいてもよい。
本発明の別の態様では、ＨＳ８は、医療の方法における使用のために提供される。医療の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒、組織の修復および／もしくは再生、結合組織の修復および／もしくは再生、骨の修復および／もしくは再生ならびに／または哺乳動物もしくはヒトにおける骨の修復および／もしくは再生の方法を含んでいてもよい。
本発明の関連態様では、医療の方法における使用のための医薬の製造におけるＨＳ８の使用が提供される。一部の実施形態では、医療の方法は、哺乳動物またはヒトにおける破損した骨の修復および／または再生を含む。
本発明のさらなる態様では、バイオマテリアルおよびＨＳ８を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼが提供される。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ８でコーティングされる。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ８で含浸される。インプラントまたはプロテーゼは、ＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞でさらにコーティングまたは含浸されてもよい。
本発明の別の態様では、生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを形成する方法であって、バイオマテリアルをＨＳ８でコーティングするまたは含浸させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、バイオマテリアルをＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞のうちの一方または両方でコーティングするまたは含浸させることをさらに含む。
本発明の別の態様では、患者において骨折を治療する方法であって、患者への治療有効量のＨＳ８の投与を含む方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、骨折の周囲の組織にＨＳ８を投与することを含む。一部の実施形態では、該方法は、骨折の周囲の組織へのＨＳ８の注入を含む。こうした方法において、ＨＳ８は、ＨＳ８および薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物または医薬として製剤化されてもよい。
一部の実施形態では、該方法は、患者にＦＧＦ２タンパク質を投与することをさらに含んでいてもよい。こうした方法において、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質は、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質ならびに薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物として製剤化されてもよい。
一部の実施形態では、該方法は、患者に間葉系幹細胞を投与することをさらに含んでいてもよい。こうした方法において、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞のうちの少なくとも２つは、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞のうちの少なくとも２つならびに薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物中に製剤化されてもよい。
好ましくは、ＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞は、それぞれ治療有効量で提供される。一部の実施形態では、骨折を治療する方法は、治療有効量のＨＳ８、および／またはＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞を、ＨＳ８、および／またはＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞ならびに薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物として製剤化するステップをさらに含み、ここで、該医薬組成物は、患者に投与される。
本発明の別の態様では、患者において骨折を治療する方法であって、バイオマテリアルおよびＨＳ８を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを患者の骨折の部位またはその周囲の組織内に外科的に埋め込むことを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ８でコーティングされる。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＨＳ８で含浸される。一部の実施形態では、インプラントまたはプロテーゼは、ＦＧＦ２タンパク質および間葉系幹細胞のうちの一方または両方でさらに含浸される。
本発明のさらなる態様では、ＨＳ８を含む培地が提供される。
本発明の別の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養におけるＨＳ８の使用が提供される。本発明の関連態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合組織の増殖におけるＨＳ８の使用が提供される。本発明の別の関連態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで結合組織を増殖させる方法であって、間葉系幹細胞を、外因的に添加されたＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。
本発明のさらに別の態様では、こうした治療を必要とするヒトまたは動物の患者における組織の修復、置換または再生のための方法であって、
（ｉ）間葉系幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳ８と接触させて前記細胞が組織を形成するのに十分な一定期間培養すること；
（ｉｉ）前記組織を回収すること；
（ｉｉｉ）前記組織を傷害または疾患の部位で患者の体内に埋め込んで、患者において組織を修復、置換または再生すること
を含む方法が提供される。
組織は、結合組織、例えば、骨、軟骨、腱、または脂肪であってもよい。一部の実施形態では、該方法は、培養中の間葉系幹細胞を外因性のＦＧＦ２タンパク質と接触させることをさらに含む。
本発明の別の態様では、ＨＳ８の存在下における間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養によって得られる組織が提供される。一部の実施形態では、該組織は、ＨＳ８およびＦＧＦ２タンパク質の存在下における間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養によって得られる。
本発明のさらなる態様では、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞を培養する方法であって、幹細胞をＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。
本発明の一部の態様では、幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。ＨＳ８は、好ましくは、外因性であってかつ単離され、かつ補助剤として、例えば、培地の一部として、培養物に添加される。
好ましい実施形態では、ＨＳ８と接触しながら培養された幹細胞は、個体数が増大し、すなわち、幹細胞の数が増加し、かつ培養物中の高い割合の細胞が親幹細胞の多分化能または多能性の特性（例えば、幹細胞の型に特徴的な特定の組織型に分化する幹細胞の能力）を維持する。例えば、好ましくは、培養物中の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つの幹細胞が、親幹細胞の多分化能または多能性の特性を示す。好ましくは、ＨＳ８は、多分化能または多能性である培養物中の細胞の割合（例えば、百分率）を上昇させるために作用する。これは、多分化能または多能性である出発培養物中の細胞の数に対して相対的に測定されてもよい。一部の実施形態では、多分化能または多能性の細胞の割合の上昇は、外因性のＨＳ８の存在が欠けていることのみによって異なる対応する培養条件下におかれる幹細胞の対照培養物に対して比較されてもよい。幹細胞培養物は、任意選択でＦＧＦ２を含んでいても、または含んでいなくてもよい。
一部の好ましい実施形態では、該方法は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数、すなわち、単一の前駆細胞由来の幹細胞のコロニーを形成する能力がある単一の幹細胞の数における増加を提供する。この増加は、ＣＦＵである、培養物中の細胞の百分率における増加、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つの増加として測定されうる。この増加は、培養の期間にわたって、１回の継代にわたって、または選択された回数の継代、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上の継代にわたって測定されてもよく、最初の培養物におけるＣＦＵの数に対して相対的に増加の決定がされる。
したがって、本発明の培養方法は、幹細胞の増殖および幹細胞数の増大を可能にし、ここで、高い割合の後代細胞が多分化能もしくは多能性かつ／またはＣＦＵである。したがって、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における幹細胞増殖中の多能性または多分化能な幹細胞の多能性または多分化能な状態の損失の防止または低減を提供する。これは、後代細胞における幹細胞特性の損失が一般的である既存の幹細胞培養法を超えて有利である。したがって、本発明の方法は、薬、診断および研究における使用のために多数の幹細胞を得る手段を提供する、幹細胞培養物を多分化能／多能性な幹細胞および／またはＣＦＵについて濃縮する手段を提供する。
したがって、本発明の方法は、幹細胞培養物の増殖および増大を可能にすると同時に、多能性もしくは多分化能および／またはＣＦＵである、より高い割合（例えば、百分率）の細胞を有するように培養物を濃縮する。
本発明の一態様では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養においてコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、ＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏでヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養において間葉系幹細胞および／またはコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、該方法が、培養された細胞が増殖し、かつＭＳＣの集団が増大するように、ＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏでヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養することを含み、増大したＭＳＣ集団が、
・ＭＳＣ集団の≦２％が、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲのうちのいずれかを発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧４０％が、ＣＤ４９ａを発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧５０％が、ＳＳＥＡ−４を発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧２０％が、ＳＴＲＯ−１を発現する
ことを特徴とする方法が提供される。
本発明の別の態様では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養において間葉系幹細胞および／またはコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、該方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＣをヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養すること、およびＭＳＣを継代することを含み、１回または複数回の継代後にＭＳＣ集団が、
・ＭＳＣ集団の≦２％が、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲのうちのいずれかを発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧４０％が、ＣＤ４９ａを発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧５０％が、ＳＳＥＡ−４を発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧２０％が、ＳＴＲＯ−１を発現する
ことを特徴とする方法が提供される。
本明細書中に記載の方法によって得られるまたは製造される幹細胞またはＭＳＣの集団または培養物。
・ＭＳＣ集団の≦２％が、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲのうちのいずれかを発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、かつ
・ＭＳＣ集団の≧４０％が、ＣＤ４９ａを発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧５０％が、ＳＳＥＡ−４を発現し、かつ／または
・ＭＳＣ集団の≧２０％が、ＳＴＲＯ−１を発現する
ことを特徴とする、ＭＳＣの集団または培養物。
一部の実施形態では、ＣＤ４９ａを発現するＭＳＣ集団の百分率は、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％または７０％のうちの１つまたは複数よりも高くてもよくまたはそれと等しくてもよい。
一部の実施形態では、ＳＳＥＡ−４を発現するＭＳＣ集団の百分率は、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％のうちの１つまたは複数よりも高くてもよくまたはそれと等しくてもよい。
一部の実施形態では、ＳＴＲＯ−１を発現するＭＳＣ集団の百分率は、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％のうちの１つまたは複数よりも高くてもよくまたはそれと等しくてもよい。
一部の実施形態では、必要とされる継代の回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれよりも多い継代のうちのいずれかであってもよい。
本明細書中に記載の幹細胞の培養の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞を単離および／または維持するステップを含んでいてもよい。例えば、本明細書中に記載の方法は、
・動物またはヒトから、幹細胞、例えば、間質細胞または骨髄間質細胞を得るステップ、
・幹細胞を単離するステップ、
・ＳＴＲＯ−１を発現しているＭＳＣを、例えば、フローサイトメトリーまたは磁気、または蛍光活性化細胞選別によって、分離および／または単離するステップ、
・ＳＴＲＯ−１＋ｂｒｉｇｈｔＭＳＣを、例えば、フローサイトメトリーまたは磁気または蛍光活性化細胞選別によって、分離および／または単離するステップ、
・ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１０６＋ ＭＳＣを、例えば、フローサイトメトリーによる細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、分離および／または単離するステップ、
・例えば凍結保存による、幹細胞の保存ステップ
のうちの１つまたは複数も含んでいてもよい。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養もしくは増殖前に動物もしくはヒトから得られた細胞または濃縮／増殖された幹細胞の保存を含みうる。
本発明のさらに別の態様では、予め決定された量のＨＳ８および予め決定された量のＦＧＦ２を含むキットオブパーツが提供される。キットは、予め決定された量のＨＳ８を含む第１の容器および予め決定された量のＦＧＦ２を含む第２の容器を含んでいてもよい。キットは、予め決定された量の間葉系幹細胞をさらに含んでいてもよい。キットは、医療の方法における使用のために提供されてもよい。医療の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒、結合組織の修復および／もしくは再生、骨の修復および／もしくは再生ならびに／または哺乳動物もしくはヒトにおける骨の修復および／もしくは再生の方法を含んでいてもよい。キットは、医療を提供するためにＨＳ８、ＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞を別個、連続または同時に投与するための説明書と共に提供されてもよい。
本発明のさらなる態様では、医療の方法における同時、別個または連続の使用のための、治療有効量の
（ｉ）ＨＳ８と、
（ｉｉ）ＦＧＦ２タンパク質、
（ｉｉｉ）間葉系幹細胞
のうちの一方または両方とを含む製品が提供される。医療の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒、結合組織の修復および／もしくは再生、骨の修復および／もしくは再生ならびに／または哺乳動物もしくはヒトにおける骨の修復および／もしくは再生の方法を含んでいてもよい。製品は、任意選択で、共投与のための組み合わされた製剤として製剤化されてもよい。
本発明のさらなる態様は、以下に記載されている。
本発明の一態様では、ＦＧＦ２に対する高い結合親和性を有するＧＡＧが提供される。より好ましくは、ＧＡＧは、ヘパラン硫酸（ＨＳ）である。一実施形態では、ＹＣＫＮＧＧＦのアミノ酸配列を含むＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインを含むポリペプチドが固体支持体に結合され、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体の形成が可能にされた、本明細書中に記載の方法に従うことによって、ＨＳは、ブタ腸粘膜から得られるＧＡＧ混合物から単離された（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｔｉ、ＵＳＡから入手可能、例えば、ＩＮＷ−０８−０４５、Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ Ｉ、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂ Ｉｎｃ、ＨＯ−０３１０２、ＨＯ−１０５９５、１０×１００ｍｇ）。ＧＡＧ−ポリペプチド複合体からのＧＡＧ成分の解離は、本明細書において「ＨＳ８」と呼ばれる固有のＨＳの単離をもたらした。一実施形態では、ＨＳ８は、ポリペプチドＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）を固体支持体に結合し、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体を形成させ、かつＧＡＧ−ポリペプチド複合体からＧＡＧ成分を解離させることによって単離されるＨＳである。
本発明者らは、ＨＳ８が、哺乳動物（ヒトおよびヒト以外）の組織および／または細胞外マトリクスを含む、複数の供給源から得られるＨＳ画分から得られうることを確信している。
したがって、本発明の一態様では、ＨＳ８が提供される。ＨＳ８は、単離または精製された形態で提供されてもよい。別の態様では、ＨＳ８を含む培地が提供される。
本発明のさらに別の態様では、ＨＳ８を、任意選択で、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物または医薬が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物または医薬は、ＦＧＦ２タンパク質をさらに含んでいてもよい。傷害または疾患の予防または治療における使用のための、ＨＳ８を含む医薬組成物または医薬が提供される。傷害または疾患の予防または治療のための医薬の製造におけるＨＳ８の使用も提供される。
本発明のさらなる態様では、その治療を必要とする患者において傷害または疾患を予防または治療する方法であって、患者に有効量のＨＳ８を投与することを含む方法が提供される。投与されるＨＳ８は、好適な医薬組成物または医薬中に製剤化されてもよく、かつ薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤をさらに含んでいてもよい。任意選択で、医薬組成物または医薬は、ＦＧＦ２タンパク質も含んでいてもよい。
本発明の別の態様では、ＨＳ８を骨前駆細胞または骨幹細胞に投与することを含む、骨形成（骨細胞および／または骨組織の形成）を促進または阻害する方法が提供される。
本発明の別の態様では、ＨＳ８を軟骨前駆細胞または軟骨幹細胞に投与することを含む、軟骨組織の形成（軟骨形成）を促進または阻害する方法が提供される。
骨形成または軟骨組織の形成を刺激または阻害する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、任意選択で外因的に添加されたＦＧＦ２タンパク質の存在下において、骨または軟骨の前駆細胞または幹細胞をＨＳ８と接触させることによって行われてもよい。前駆細胞または幹細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。組織形成が促進される場合、形成された組織はヒトまたは動物の患者内への埋め込みのために回収および使用されてもよい。
したがって、本発明の一態様では、ＨＳ８（すなわち、外因性のＨＳ８）の存在下における、および任意選択でＦＧＦ２（すなわち、外因性のＦＧＦ２）の存在下における、間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養によって得られる結合組織が提供される。結合組織は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靭帯または腱であってもよい。
ＨＳ８を使用する疾患の予防または治療は、組織、特に、結合組織、例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靭帯または腱などの修復、再生または置換を含んでいてもよい。
これらの組織のうちの１つの悪化を有する患者において、悪化の部位で組織の成長、増殖および／または分化を刺激するために、その部位へのＨＳ８の投与が使用されてもよい。例えば、投与の部位に、またはその近くに存在する間葉系幹細胞の刺激は、好ましくはＦＧＦ２もその部位に存在するときに、間葉系幹細胞の増殖および適切な結合組織への分化を導き、それによって、損傷した組織の置換／再生および傷害の治療を可能にしうる。
代替的に、ＨＳ８と接触させて間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物から得られた結合組織は、回収されて、損傷または悪化した組織を置換するために、傷害または疾患の部位に埋め込まれてもよい。損傷または悪化した組織は、任意選択で最初に傷害または疾患の部位から切除されてもよい。
別の態様では、幹細胞、好ましくは、間葉系幹細胞、およびＨＳ８を含む医薬組成物が提供されてもよい。傷害、疾患または悪化の部位での組成物の投与、例えば、注入は、その部位での組織の再生を可能にする。
したがって、ＨＳ８は、治療を必要としている患者への、任意選択でＦＧＦ２および／または幹細胞と組み合わせた、ＨＳ８の直接適用によってもたらされる、組織の修復、再生および／または置換を含む、ｉｎ ｖｉｖｏにおける創傷治癒（例えば、瘢痕組織または破損した骨の治癒）に有用である。ＨＳ８は、組織の修復、再生および／または置換を必要とする患者内への埋め込みに好適な組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製においても有用である。
本発明の別の態様では、幹細胞を培養するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。ＨＳ８は、培養された細胞と接触される外因性のＨＳ８であることが好ましい。ＨＳ８は、培地の一部として提供されてもよくまたは別々に培養物に添加されてもよい。該方法は、幹細胞の増殖を含むことが好ましい。該方法は、複数の集団倍加または継代、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０回のうちの１つの集団倍加または継代にわたる、幹細胞の多能性または多分化能の状態の維持を含むことが好ましい。
一実施形態では、幹細胞の培養物を増大させるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、単一の幹細胞を１×１０３個を超える幹細胞の集団に増大させることを含み、幹細胞培養物をＨＳ８と接触させることを含む方法が提供される。
別の実施形態では、１ｃｍ２あたり約２０００細胞および５０００細胞の間の最初の培養物の大きさから、少なくとも１×１０３倍多い幹細胞を含む増大された培養物の大きさまで幹細胞の培養物を増大させるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、幹細胞培養物をＨＳ８と接触させることを含む方法が提供される。一部の実施形態では、最初の培養物の大きさおよび増大された培養物の大きさの間で増大させるための培養時間は、４０日、３０日、２５日のうちの１つよりも短い。
別の実施形態では、幹細胞の培養においてコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を増加させるｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、幹細胞をＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＣＦＵは、ＣＤ４９ａ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＳＴＲＯ−１、またはＣＤ９０のうちの１種または複数を発現する。
別の実施形態では、間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養においてＳＴＲＯ−１またはＳＴＲＯ−１＋ｂｒｉｇｈｔ細胞の割合を高めるために方法であって、間葉系幹細胞をＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。
別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における幹細胞増殖中の多分化能幹細胞の多分化能状態の損失を防止または低減するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、幹細胞をＨＳ８と接触させて培養することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、培養物中に幹細胞を少なくとも１０回の集団倍加の間、維持することを含む。
本明細書中に示されているように、ＨＳ８は、ＦＧＦ２を安定化する特性を有し、かつそれによってＦＧＦ２の作用を延長する。ＨＳ８は、培地中でＦＧＦ２が分解するのを防止する（図４６）。これは、ＦＧＦ２製剤、および培地を含むＦＧＦ２の製剤の保存に有用に適用されうる。
したがって、本発明の一態様では、増殖因子および単離されたＨＳ８を含む組成物が提供される。増殖因子は、タンパク質増殖因子であってもよく、ＦＧＦ２であることが好ましい。組成物は、単離されたＦＧＦ２および単離されたＨＳ８を含んでいてもよい。一部の実施形態では、組成物は、培地であってもよい。他の実施形態では、組成物は、ＦＧＦ２を含む医薬組成物または医薬であってもよい。
組成物は、容器内にＦＧＦ２および単離されたＨＳ８を含むＦＧＦ２製剤であってもよい。好適な容器は、ボトル、バイアル、チューブまたはシリンジでありうる。
増殖因子の安定性を高める方法であって、増殖因子を、単離されたＨＳ８と接触させることを含む方法も提供される。
増殖因子の安定性は、その半減期の期間、すなわち、所定の組成物中の増殖因子の半分が分解されるおよび／またはその活性を失うのにかかる時間の長さで測定されうる。増殖因子は、タンパク質増殖因子であることが好ましく、より好ましくはＦＧＦ２である。ＨＳ８は、ＦＧＦ２の半減期を維持および延長するために働く。該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、単離されたＨＳ８を増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）と、例えば、増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）組成物の調製、その保存または輸送の一部として、接触させることを含んでいてもよい。代替的に、該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、単離されたＨＳ８を［組織内に天然に存在するまたは外因的に組織に添加される］増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）が存在する組織に投与することによって、単離されたＨＳ８を増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）と接触させることを含んでいてもよい。該方法は、組織に外因性の増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）を添加するステップも含んでいてもよい。
単離されたＨＳ８を含む（または単離されたＨＳ８が添加されている）所定の組成物中または組織内でのＦＧＦ２の安定性は、ＨＳ８を含まない（または単離されたＨＳ８が添加されていない）比較可能な組成物に対して比較されうる。
上記の組成物および方法において、ＨＳ８は、本明細書中に記載のように、精製されてもよい。ＦＧＦ２は、単離および／もしくは精製されてもよく、単離されなくてももしくは部分的に単離されてもよく、例えば、細胞外マトリクス材料の一部、または細胞の構成物中に存在していてもよい。単離または精製されたＦＧＦ２は、組換えＦＧＦ２であってもよい。組換えＦＧＦ２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｇｉｂｃｏ；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどのいくつかの製造業者から市販されている。
任意選択で、現在の態様および実施形態は、（Ｂｒｉｃｋｍａｎら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ 第８巻 第５号 ４６３〜４７１ページ、１９９８）によっておよびＷＯ２０１０／０１１１８５に記載されているような）ＨＳ１またはＨＳ２を含まない。一部の実施形態では、本発明によるヘパラン硫酸は、ＨＳ２、および／または図２９による亜硝酸二糖消化プロファイルを有するヘパラン硫酸、および／または図３０による亜硝酸二糖消化プロファイルを有するヘパラン硫酸を含まない。
好ましい実施形態の説明
本発明者らは、ＨＳ８と呼ばれる、ヘパラン硫酸分子の新規クラスを同定した。本発明者らは、ＨＳ８が以下の有利な特性を有することを示している：
・ＨＳ８は、ＳＴＲＯ１を発現している間葉系幹細胞（ＭＳＣ）について濃縮する（図１２、図１４）；
・ＨＳ８は、ＳＴＲＯ−１＋ｖｅ親和性で単離されたＭＳＣおよびプラスチックへの接着性によって単離されたＭＳＣの増殖の増加をもたらす（図１７、１８、１９、２０）。
・ＨＳ８を欠乏したヘパラン硫酸（ＨＳ８−ｖｅ画分）とは対照的に、ＨＳ８は、ヒトＭＳＣの国際的に認識された定義と一致する表面マーカー発現パターンを有するヒトＭＳＣの集団について濃縮する（図２２）；
・ＨＳ８とのｈＭＳＣの培養物は、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１の高レベルの発現を有するヒトＭＳＣ集団を提供する（図２２）。対照的に、ｈＭＳＣへの培養補助剤としてのＦＧＦ−２の添加は、ＳＴＲＯ−１を発現するｈＭＳＣの割合に対して負に影響し、ｈＭＳＣの多分化能性の損失をもたらす（図２２、２３および２５）。
・ＨＳ８は、ＣＦＵ−Ｆ形成を増加させる；
・ＨＳ８は、ＦＧＦ−２媒介性のＭＳＣの増殖を促進する（図２６）；
・ＨＳ８は、ＥＲＫ経路のＦＧＦ２媒介性シグナル伝達を維持させる。
・ＨＳ８は、間葉系幹細胞の増殖を促進する（図４２および４３）
ＨＳ８
本発明は、ＨＳ８と呼ばれる一クラスのヘパラン硫酸分子に関する。ＨＳ８分子は、ＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインに相当するポリペプチドに結合する１種または複数のＧＡＧを含む化合物の混合物を濃縮する方法によって入手可能である。特に、ＨＳ８分子は、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを含むまたはからなるドメインである、ＦＧＦ２のヘパラン結合ドメインに結合するヘパラン硫酸について濃縮することによって得られうる。濃縮のプロセスは、ＨＳ８を単離するために使用されてもよい。
本発明は、ＨＳ８で濃縮された化合物の混合物、およびこうした混合物を使用する方法にも関する。
ここに記載の方法によって入手可能であることに加えて、ＨＳ８は、機能的および構造的に定義もされうる。
機能的に、ＨＳ８は、ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、またはからなる、ペプチドを結合する能力がある。ペプチドは、このペプチドの一方または両方の端に１個または複数のさらなるアミノ酸を含んでいてもよい。例として、ペプチドは、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）であってもよい。
好ましくは、ＨＳ８は、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭのうちの１つよりも小さいＫＤで該ペプチドを結合する。
好ましくは、ＨＳ８は、１００μＭ未満のＫＤ、より好ましくは、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、または１０μＭのうちの１つよりも小さいＫＤでＦＧＦ２タンパク質も結合する。ＨＳ８とＦＧＦ２タンパク質との間の結合は、以下のアッセイ方法によって決定されうる。
ＦＧＦ２は、ブロッキング溶液（ＳＡＢ中に０．２％のゼラチン）中に３μｇ／ｍｌの濃度で溶解され、ブロッキング溶液中に０〜３μｇ／ｍｌの希釈系列が確立される。ヘパリンで予めコーティングされたヘパリン／ＧＡＧ結合プレートの３通りずつのウェル内に２００μｌのＦＧＦ２の各希釈物の分注；３７℃で２時間インキュベートされ、ＳＡＢで注意深く３回洗浄されて、２００μｌの２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化された抗ＦＧＦ２がブロッキング溶液中に添加される。３７℃で１時間のインキュベーション、ＳＡＢで注意深く３回洗浄し、２００μｌの２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰがブロッキング溶液中に添加される。３７℃で３０分間のインキュベーション、ＳＡＢでの注意深い３回の洗浄、残液を除去するために軽くたたき、２００μｌの発色試薬（ＳｉｇｍａＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸）が添加される。吸光度を４０５ｎｍで１時間以内で読み取りながら室温で４０分間インキュベートする。
このアッセイにおいて、結合は、吸光度を測定することによって決定されてもよく、かつ添加されたヘパラン硫酸の非存在下におけるＦＧＦ２タンパク質、またはＦＧＦ２タンパク質を結合しないヘパラン硫酸を添加されたＦＧＦ２タンパク質などの対照に対して相対的に決定されてもよい。
配列番号１などのＹＣＫＮＧＧＦを含むペプチドと、またはＦＧＦ２タンパク質と、高い親和性で結合する相互作用を示すヘパラン硫酸の選択を含む方法によってＨＳ８が他のヘパラン硫酸および／またはＧＡＧから選択されうることに関して、かつ非特異的な結合とは対照的に、ＨＳ８の結合は、特異的であることが好ましい。
本発明によるＨＳ８は、好ましくは、幹細胞の多能性または多分化能を維持しながらその増殖を増加させる。
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析後のＨＳ８の二糖組成は、図４４および４５に示されている。
本発明によるＨＳ８は、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析によって決定されるような、ＨＳ８が保持された種について図４５に各二糖についてまたはＨＳ８が保持された種について図４４に示される、標準化された百分率の値の±１０％（より好ましくは、±９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％のうちの１つ）の範囲内の二糖組成を有するヘパラン硫酸を含む。
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化の完了および結果として生じる二糖断片のその後のキャピラリー電気泳動分析によって決定されるようなＨＳ８の二糖組成は、以下のいずれか１つによる二糖組成を有しうる：
または
または
または
または
または
好ましい実施形態において、挙げられる８種の二糖の合計重量百分率は、１００％（任意選択で、±３．０％以下、または±２．０％以下、±１．０％以下、±０．５％以下）である。
ＨＳ３と呼ばれる（ＷＯ２０１０／０３０２４４に記載される）、増殖因子ＢＭＰ２に高い親和性を有するとして単離されたＨＳとのＨＳ８の比較は、ＨＳ３と比較されるＨＳ８の構造的相違点は、以下の二糖の量によって特徴付けされることを明らかにする：ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ＳおよびΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ。特に、ＨＳ８は、ＨＳ３よりも高い百分率組成のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ、およびＨＳ３よりも低い百分率組成のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳを有する。
したがって、ＨＳ８は、１５．５±４．０以下、または±３．５以下、または±３．０以下、または±２．５以下、または±２．０以下、±１．５以下、または±１．０以下、または±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓの百分率組成を有することによって特徴付けされうる。ＨＳ８は、さらにまたはあるいは、１５．７±４．０以下、または±３．５以下、または±３．０以下、または±２．５以下、または±２．０以下、または±１．５以下、または±１．０以下、または±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳの百分率組成を有することによって特徴付けされうる。
ＨＳ８は、１２．７±１．５以下、±１．０以下、または±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓの百分率組成を有することによっても特徴付けされうる。
ＨＳ８は、７．２または±２．０以下、±１．５以下、±１．０以下、または±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳの百分率組成を有することによっても特徴付けされうる。
ＨＳ８は、６．５±１．５以下、±１．０以下、または±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓの百分率組成を有することによっても特徴付けされうる。
ＨＳ８は、８．９±０．５以下、または±０．２５以下、または±０．１以下のΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓの百分率組成を有することによっても特徴付けされうる。
これらの実施形態では、残りの二糖成分の百分率組成は、上に挙げられている通り、または図４４もしくは４５に示されている通り±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％のうちの１つであってもよい。
ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでのＨＳ８の消化ならびに／または二糖のキャピラリー電気泳動分析は、実施例１８に従って行われることが好ましい。
ヘパリンリアーゼ酵素でのＨＳ製剤の消化は、以下のように行われうる：ＨＳ製剤（１ｍｇ）は、（１０ｍＭの酢酸カルシウムを含む）５００μＬの酢酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中にそれぞれ溶解され、各２．５ｍＵの３種の酵素が添加される；試料は、試料チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃で一晩（２４時間）インキュベートされる；さらに各２．５ｍＵの３種の酵素が試料に添加され、この試料は、試料チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃でさらに４８時間インキュベートされる；消化物は、加熱（１００℃、５分）によって停止され、次いで、凍結乾燥される；消化物は、５００μＬの水中に再懸濁され、分析用に一定分量（５０μＬ）が分取される。
ＨＳ製剤の消化からの二糖のキャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、以下のように行われうる：キャピラリー電気泳動オペレーティングバッファーは、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４の水溶液を２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏの溶液に添加してｐＨ３．５にすることによって作製される；カラム洗浄液は、（５０％ｗ／ｗのＮａＯＨから希釈された）１００ｍＭのＮａＯＨである；オペレーティングバッファーおよびカラム洗浄液は、０．２μｍの酢酸セルロースメンブレンフィルターを取り付けたフィルターユニットを使用して、両方とも濾過される；二糖の保存溶液（例えば、１２種）は、水中に二糖を溶解（１ｍｇ／ｍＬ）することによって調製される；標準のための較正曲線は１０μｇ／１００μＬの各二糖を含むすべての標準を含む混合物を調製することによって決定され、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５μｇ／１００μｌを含む希釈系列が調製される；２．５μｇの内標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）を含む。ＨＳの消化物は水で希釈され（５０μＬ／ｍＬ）、同一の内標準が各試料に添加される（２．５μｇ）。溶液は、凍結乾燥され、水（１ｍＬ）中に再懸濁される。試料は、ＰＴＦＥ親水性ディスポーザブルシリンジフィルターユニットを使用して濾過される。
分析は、キャピラリー電気泳動機器を使用して、取り付けられた未コーティングのシリカキャピラリーチューブ上、２５℃で、２０ｍＭのオペレーティングバッファーを使用して、３０ｋＶのキャピラリー電圧で行われる。試料は、陰極（逆極性）端で流体力学的な注入を使用してキャピラリーチューブに導入される。各流動の前に、キャピラリーは、１００ｍＭのＮａＯＨ（２分）、および水（２分）で洗い流され、オペレーティングバッファー（５分）で予め調整される。バッファー補充システムは、一貫した容量、ｐＨおよびイオン濃度が確実に維持されるように、入口および出口のチューブにおいてバッファーを置換する。水のみのブランクは、試料シークエンスの最初、中間および最後のいずれもにおいて流動される。吸光度は、２３２ｎｍでモニターされる。すべてのデータは、データベースに保存され、その後、検索および再加工される。２通りずつまたは３通りずつでの消化／分析が行われてもよく、ＨＳ消化物中の二糖の標準化された百分率は、分析の結果の相加平均として算出される。
一部の実施形態では、ＨＳ８は、１８から２７ｋＤａの範囲内の（相加）平均分子量を有する。一部の実施形態では、これは、２０から２５ｋＤａ、２１から２５ｋＤａ、２１から２４ｋＤａ、２１から２３ｋＤａ、２０から２４ｋＤａ、２０から２３ｋＤａ、または２０から２２ｋＤａのうちの１つであってもよい。
一部の実施形態では、ＨＳ８鎖は、少なくとも２５個の二糖単位を含む。一部の実施形態では、これは、少なくとも２６個の二糖、少なくとも２７個の二糖、少なくとも２８個の二糖、少なくとも２９個の二糖、少なくとも３０個の二糖、少なくとも３１個の二糖、少なくとも３２個の二糖、少なくとも３３個の二糖、少なくとも３４個の二糖、少なくとも３５個の二糖、少なくとも３６個の二糖、少なくとも３７個の二糖、少なくとも３８個の二糖、少なくとも３９個の二糖、少なくとも４０個の二糖、少なくとも４１個の二糖、少なくとも４２個の二糖、少なくとも４３個の二糖、または少なくとも４４個の二糖のうちの１つであってもよい。
ＨＳ８を同定するために、本発明者らは、ヘパリン結合ドメインを有する特定のポリペプチドに対する結合を示すグリコサミノグリカン分子について濃縮することを含む方法を使用した。単離されたＧＡＧの混合物および／または分子は、次いで、同定され、ヘパリン結合ドメインを含むタンパク質を発現している細胞および組織の増殖および分化をモジュレートするそれらの能力について試験される。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における、細胞および組織の増殖および分化に対する特定のＧＡＧ糖配列の効果の調節された分析を可能にする。この方法は、参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００４６９（ＷＯ２０１０／０３０２４４）に記載されている。本発明者らは、ＦＧＦ２に高い結合を有するＧＡＧを単離および特徴付けするために、この方法を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）に適用した。
したがって、ＨＳ８を同定するために、本発明者らは、ヘパリン／ヘパラン結合ドメインを有するタンパク質に結合する能力のあるグリコサミノグリカンを単離する方法を用意した。該方法は、
（ｉ）ヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意すること；
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させること；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収すること
を含む。
本発明者らは、細胞または組織の増殖または分化をモジュレートするそれらの能力によって同定された単離されたグリコサミノグリカンも用意した。これを行うため、彼らは、細胞および／または組織の増殖および／または分化を刺激または阻害する能力のあるグリコサミノグリカンを同定する方法を用意した。該方法は、
（ｉ）ヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意すること；
（ｉｉ）該ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させること；
（ｉｉｉ）混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離すること；
（ｉｖ）ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させること；
（ｖ）解離されたグリコサミノグリカンを回収すること；
（ｖｉ）回収されたグリコサミノグリカンを、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質が存在する細胞または組織に添加すること；
（ｖｉｉ）細胞の増殖、細胞の分化、１種または複数のタンパク質マーカーの発現のうちの１つまたは複数を測定すること
を含む。
本発明者らは、これらの方法を使用して、ＦＧＦ２に結合する能力のあるＧＡＧを同定した（これを彼らはＨＳ８と呼んだ）。ここで、本発明者らの方法において使用されたポリペプチドは、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）のヘパリン結合ドメインを含んでいた。
本発明者らの方法において、ＧＡＧを含む混合物は、合成のグリコサミノグリカンを含んでいてもよい。しかし、細胞または組織から得られたＧＡＧが好ましい。例えば、混合物は、細胞外マトリクスを含んでいてもよく、ここで、細胞外マトリクス材料は、ｉｎ ｓｉｔｕで（すなわち、それが得られるヒトもしくは動物の体内の組織から直接に）生組織をかき集めることによって、またはヒトもしくは動物の体から抽出された（生または死）組織をかき集めることによって得られる。代替的に、細胞外マトリクス材料は、培養中に増殖した細胞から得られてもよい。細胞外マトリクス物質は、結合組織または結合組織細胞、例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、靭帯または腱から得られてもよい。一実施形態では、ブタ粘膜からの市販のヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ）が使用された。
ＧＡＧ成分は、組織もしくは細胞試料または、当業者によく知られている、一連の日常的な分離ステップ（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）による抽出物から抽出されうる。
ＧＡＧ混合物は、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸を含みうる、異なる型のグリコサミノグリカンの混合物を含んでいてもよい。好ましくは、固体支持体と接触されるＧＡＧ混合物は、ヘパラン硫酸について濃縮される。ヘパラン硫酸が濃縮されたＧＡＧ画分は、ＧＡＧ混合物においてカラムクロマトグラフィー、例えば、弱い、中程度の、または強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、ならびに強力な高圧液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、と共に適切な画分の選択を行うことによって得られうる。
回収されたＧＡＧは、ＧＡＧを同定するため、例えば、ＧＡＧの組成もしくは配列を決定するため、またはＧＡＧの構造特性を決定するために、さらなる分析に供されうる。ＧＡＧ構造は、一般には非常に複雑であり、現在利用可能な分析技法を考慮しても、ＧＡＧ配列構造を正確に決定することはほとんどの場合不可能である。
しかし、回収されたＧＡＧ分子を、部分的なまたは完全な糖消化（例えば、亜硝酸による化学なもの、またはヘパリナーゼＩＩＩなどのリアーゼを用いた酵素的なもの）に供して、ＧＡＧに特有であり特徴的な糖断片が得られうる。特に、二糖（または四糖）を得るための消化が、ＧＡＧの特有の二糖「指紋」をもたらす、得られる二糖のそれぞれの百分率を測定するために使用されうる。
ＧＡＧの硫酸化のパターンが決定され、ＧＡＧ構造を決定するために使用されうる。例えば、ヘパラン硫酸に関しては、アミノ糖における硫酸化のパターンならびにＣ２位、Ｃ３位およびＣ６位における硫酸化のパターンがヘパラン硫酸を特徴付けるために使用されうる。
二糖分析、四糖分析および硫酸化の分析が、それぞれＧＡＧについての独特のスペクトルをもたらすものであるＨＰＬＣ、質量分析およびＮＭＲなどの他の分析技法と併せて使用されうる。これらの技法を組み合わると、ＧＡＧの決定的な構造的特徴付けがもたらされうる。
例えば、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ＨＳ８が由来するもの）およびＨＳ３（ＢＭＰ２結合ＨＳ）と比較したＨＳ８の１ＨＮＭＲスペクトルが図３１および３２に示されている。本発明によるＨＳ８は、図３１または３２のＨＳ８スペクトルに対応する１ＨＮＭＲスペクトルを有しうる。一部の実施形態では、本発明によるＨＳ８は、４．０〜３．５ｐｐｍにおけるスペクトルが図３２のＨＳ８のものに対応する１ＨＮＭＲスペクトルを有しうる（３．８〜３．７ｐｐｍの最高線）。一部の実施形態では、本発明によるＨＳ８は、約３．８ｐｐｍにおけるピークおよび／または約３．７ｐｐｍにおけるピークを有しうる。一部の実施形態では、例えば、図３２に示されている通り、ＨＳ８はその独特のメチンおよび／またはメチレン１ＨＮＭＲスペクトルによって他のＨＳ８と区別されうる。
ＧＡＧとヘパリン結合ドメインとの間の親和性の高い結合相互作用により、ＧＡＧが親和性の高い結合相互作用に寄与する特定の糖配列を含有することが示される。さらなるステップは、ＧＡＧの完全なもしくは部分的な糖配列、または結合相互作用に関与するＧＡＧの重要な部分を決定することを含みうる。
ＧＡＧ−ポリペプチド複合体は、グルコサミノグリカン鎖を溶解する薬剤、例えばリアーゼを用いた処理に供されうる。リアーゼ処理により、ポリペプチドとの結合相互作用に関与しない結合したＧＡＧの部分が切断されうる。ポリペプチドとの結合相互作用に関与するＧＡＧの部分はリアーゼ作用から保護されうる。リアーゼの除去後、例えば、洗浄ステップの後にポリペプチドに結合したままであるＧＡＧ分子が、ポリペプチドの特異的な結合パートナー（「ＧＡＧリガンド」）である。短いＧＡＧ分子の方が複雑さが少ないので、ＧＡＧリガンドの解離および回収後に、ＧＡＧリガンドの構造的特徴付けの程度がより高くなることが予測されうる。例えば、糖配列（すなわち、ＧＡＧリガンドに含有される単糖の一次（直鎖）配列）、硫酸化パターン、二糖および／または四糖消化分析、ＮＭＲスペクトル、質量分析スペクトルならびにＨＰＬＣスペクトルのいずれかの組合せにより、ＧＡＧリガンドの高レベルの構造的特徴付けがもたらされうる。
本明細書で使用される場合、「濃縮すること（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」、「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」などの用語は、それにより、混合物の相対的な組成が、１つまたは複数の実体によってもたらされるその混合物の画分が増加する一方で１つまたは複数の異なる実体によってもたらされる混合物の画分が減少するように変更される（または変更された）プロセス（または状態）を示す。濃縮によって単離されたＧＡＧは純粋である、すなわち、実質的にただ１つの型のＧＡＧを含有するものでありうる、または異なる型のＧＡＧの混合物のままでありえ、該混合物は、ヘパリン結合ドメインに結合する特定のＧＡＧを、出発混合物と比較して大きな割合で有する。
同定されたＧＡＧは、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質が発現または含有される細胞または組織と接触させた場合に機能的効果を示すことが好ましい。機能的効果は、モジュレートまたは強化する効果でありうる。
機能的効果は、ある特定の型の細胞の増殖もしくはある１つの細胞型から別の細胞型への分化、または１つもしくは複数のタンパク質マーカーの発現を促進する（刺激する）または阻害するものでありうる。例えば、ＧＡＧは、細胞増殖を促進しうる、すなわち、細胞数の増加もしくは幹細胞の特殊化した細胞型（例えば、結合組織における間葉系幹細胞）への分化を促進しうる、または、細胞の多分化能もしくは分化の状態を示すタンパク質マーカー（例えば、アルカリホスファターゼ活性、ＲＵＮＸ２、オステリックス、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、ＳＯＸ９、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質２、（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（Ｃｏｌｌ２ａ）およびＳＯＸ９の検出などのマーカー）の発現を促進または阻害しうる。
本明細書で使用される場合、「モジュレートする効果」という用語は、別の１つまたは複数のプロセスにおける第２の実体の正常な機能が、第１の実体が存在することによって改変される場合に、第１の実体が第２の実体に対して有する効果を意味するものと理解される。モジュレートする効果はアゴニスト性であってもアンタゴニスト性であってもよい。
モジュレートする効果は、強化する効果でありうる。「強化する効果」という用語は、効力を増大させる効果を意味するものと理解される。本発明の好ましい実施形態では、「強化する効果」という用語は、第１の実体が第２の実体に対して有する、別の１つまたは複数のプロセスにおけるその第２の実体の効力の増大をもたらす効果を指す。本発明のさらに好ましい実施形態では、強化する効果とは、単離されたＧＡＧのヘパリン結合因子に対する効果を意味するものと理解され、前記効果により、前記ヘパリン結合因子の効力が増大する。
本明細書で使用される場合、「接触させる」プロセスは、２つ以上の別個の実体を物理的近傍にさせることを含む。「接触させる」プロセスは、２つ以上の別個の実体を、それらの２つ以上の別個の実体の一部が分子レベルで相互作用することが可能になるのに十分な条件下でそれに十分な時間にわたって極めて近傍にさせることを含む。本明細書で使用される場合、「接触させる」プロセスは、１つまたは複数のＧＡＧおよびヘパリン結合因子のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドを有する化合物の混合物を極めて近傍にさせることを含むことが好ましい。「接触させる」プロセスの例は、混合、溶解、膨潤、洗浄を含む。好ましい実施形態では、ＧＡＧ混合物とポリペプチドの「接触」は、互いに対して高い親和性を示すＧＡＧとポリペプチドの間で、共有結合によるものであってよいが非共有結合によるものであることが好ましい複合体が形成されるのに十分である。
ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを有する選択されたタンパク質の完全長のまたは完全長に近い一次アミノ酸配列を含んでいてもよい。ヘパリン結合ドメインをＧＡＧ混合物から遮蔽する可能性をもたらす、より長いポリペプチドにおいて生じうるフォールディングにより、ポリペプチドについては短いことが好ましい。好ましくは、ポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有することになり、かつ任意選択でペプチドのＮ末端およびＣ末端の一方またはそれぞれに１個または複数のアミノ酸を含む。これらのさらなるアミノ酸は、ポリペプチドを固体支持体に結合するために必要とされる、ポリペプチドへのリンカーまたは結合分子の付加を可能にしうる。
本発明者らの方法の好ましい実施形態では、ヘパリン結合ドメイン内のアミノ酸の数に加えて、ポリペプチドは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個のさらなるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸のうちの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％を占める。ポリペプチドを固体支持体の表面に接着するために、ポリペプチドは、分子タグを含むように改変されることが好ましく、かつ固体支持体の表面は、その分子タグに高い親和性を有する、すなわち、分子タグおよびプローブが結合対を形成する、対応する分子プローブを組み込むように改変される。タグおよび／またはプローブは、抗体、細胞受容体、リガンド、ビオチン、これらの構造体の任意の断片もしくは誘導体、上記の任意の組合せ、またはプローブが結合するようにもしくはこれ以外の場合には特異性と関連するように設計または構成されうる任意の他の構造体のうちのいずれか１つから選択されうる。タグおよびプローブとしての使用に好適な好ましい結合対は、ビオチンおよびアビジンである。
ポリペプチドは目的のタンパク質由来であり、それは、この場合はＦＧＦ２である。「由来」とは、ポリペプチドが、目的のタンパク質中に存在するヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含むために、選出、選択または調製されることを意味する。ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、例えば、ＧＡＧ結合に対するヘパリン結合ドメイン配列における変化の効果を調べるために、目的のタンパク質から見出されるものから改変されてもよい。
本明細書において、該タンパク質は、ＦＧＦ２である。好ましいヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列は、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）［これは、ヒトＦＧＦ２のアミノ酸１５７〜１７２において見出される］、または配列ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）を有する配列である。
特定のポリペプチドのアミノ酸配列における小さなバリエーションがその部分の本来の機能性の維持を可能にしうることは、当業者によって理解される。ペプチド中の特定のアミノ酸残基を、等配電子的および／または等電子的な他のアミノ酸残基で置換することは、無置換のペプチドの特定の特性を維持または改良のいずれかをしてもよいことも理解される。これらのバリエーションも、本発明の範囲内に包含される。例えば、アミノ酸アラニンは、ペプチドの１つまたは複数の特性を維持しながら、時にアミノ酸グリシンと置換されてもよい（その逆もまた同様である）。用語「等配電子的」は、２つの実体間の空間的類似性を指す。穏やかに上昇された温度で等配電子的である基の２つの例は、イソプロピルおよびｔｅｒｔ−ブチル基である。用語「等電子的」は、２つの実体間の電子的類似性を指し、例は、２つの実体が、同一の、または同様の、ｐＫａの機能性を有する場合である。
ヘパリン結合ドメインに対応しているポリペプチドは、合成物または組換え体であってもよい。
固体支持体は、共有結合または非共有結合を通して、直接的または間接的に、分子が結合されうる表面を有するいかなる基質であってもよい。固体支持体は、表面に結合されたプローブに物理的な支持を提供することができる任意の基質材料を含んでいてもよい。それは、マトリクス支持体であってもよい。材料は、一般に、表面へのプローブの結合、およびその後のあらゆる処理、取扱い、またはアッセイの実施中に生じる加工に関連した条件に耐えることができる。材料は、天然に存在していても、合成であっても、または天然に存在する材料の改変形態であってもよい。固体支持体は、プラスチック材料（ポリマー、例えば、ポリ（塩化ビニル）、シクロオレフィンコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）などを含む）などであってもよく、いずれも、単独でまたは他の材料と組み合わせて使用される。さらなる硬質の材料、例えば、ガラスが考えられてもよく、これは、シリカを含み、かつさらに、例えば、バイオガラスとして利用できるガラスを含む。採用されうる他の材料は、多孔性材料、例えば、調節された細孔ガラスビーズなど、を含む。１つまたは複数の官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基のうちのいずれかを有することのできる、例えば、その表面上に組み込まれる、当技術分野において既知の任意の他の材料も意図される。
好ましい固体支持体は、カラムの表面上に固定されたポリペプチドを有するカラムを含む。その表面は、カラムの壁であってもよく、かつ／またはカラムの中央のスペース内にパックされたビーズによって提供されてもよい。
ポリペプチドは、固体支持体上に固定されていてもよい。固定化の方法の例は、吸着、共有結合性結合、包括および膜限局を含む。本発明の好ましい態様では、ポリペプチドおよびマトリクスの間の相互作用は、実質的に恒久的である。本発明のさらに好ましい実施形態では、ペプチドおよびマトリクスの間の相互作用は、イオン交換クロマトグラフィーに対して好適に不活性である。好ましい配置では、ポリペプチドは、固体支持体の表面に結合される。当業者は、２つの実体を互いに物理的および／または化学的に結合するために選択する多数の選択肢を有するはずであることが理解される。これらの選択肢は、本発明の範囲内にすべて包含される。好ましい配置では、ポリペプチドは、ストレプトアビジンとのビオチンの相互作用を通して固体支持体に吸着される。この配置の代表的な例では、ビオチンの分子は、ポリペプチドに共有結合で結合され、その結果、ビオチン−ポリペプチドコンジュゲートは、固体支持体に共有結合で結合されているストレプトアビジンに結合する。別の配置では、ポリペプチドとビオチン、および／またはマトリクスとストレプトアビジンの分子を連結するためにスペーサーまたはリンカー部分が使用されてもよい。
ＧＡＧ混合物を固体支持体と接触させることによって、ＧＡＧ−ポリペプチド複合体の形成が可能にされる。これらは、固体支持体から混合物の残りを除去することによって、例えば、固体支持体を洗浄して非結合材料を溶出させることによって、混合物の残りから分離される。カラムが固体支持体として使用される場合、ＧＡＧ混合物の非結合成分は、カラムに結合したＧＡＧ−ポリペプチド複合体を残して、カラムから溶出されうる。
特定のオリゴ糖が非特異的な様式でポリペプチドと相互作用しうることが理解される。ある特定の実施形態では、非特異的な様式でポリペプチドと相互作用するオリゴ糖は、含まれていてもよく、またはヘパリン結合因子の影響をモジュレートする１種または複数のＧＡＧで濃縮された化合物の混合物から除去されてもよい。非特異的な相互作用の例は、好適な大きさおよび／または形にされた分子のポケット内での一時的な限局である。さらに、これらのオリゴ糖は、ペプチドと全く相互作用を示さないオリゴ糖よりも遅く溶出されうることが理解される。そのうえ、非特異的に結合する化合物は、特異的な様式で（例えば、イオン性の相互作用を通して）結合する化合物の場合のようにそれらを溶出させるための同一の外部から刺激の入力を必要としなくてもよいことが理解される。本発明者らの方法は、オリゴ糖の混合物をその混合物の成分：特異的な様式でポリペプチドに結合するもの；非特異的な様式でポリペプチドに結合するもの；およびポリペプチドに結合しないものに分離することができる。これらの名称は、各ＧＡＧ−ペプチド対について操作上定められる。
ＧＡＧおよびポリペプチドの結合が生じる固体支持体の表面に存在する条件（例えば、塩濃度）を変化させることによって、ヘパリン結合ドメインに最も高い親和性および／または特異性を有するＧＡＧが選択されうる。したがって、目的のタンパク質および／または目的のタンパク質のヘパリン結合ドメインに高い結合親和性を有するＧＡＧが得られうる。結合親和性（Ｋｄ）は、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満のうちの１つから選択されてもよい。
記載の方法によって得られるＧＡＧは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、一範囲の適用において有用でありうる。ＧＡＧは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞もしくは組織、またはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞もしくは組織の培養のいずれかにおける細胞または組織の成長および／または増殖および／または分化の刺激または抑制における使用のために提供されてもよい。
ＧＡＧは、こうした目的のための製剤として提供されてもよい。例えば、記載の方法によって得られるＧＡＧを含む、すなわち、ＨＳ８を含む培地が提供されてもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＳ８の存在下での細胞または組織の培養から得られる細胞または組織は、回収されて、治療を必要とするヒトまたは動物の患者内に埋め込まれてもよい。したがって、細胞および／または組織の埋め込みの方法が提供されてもよく、該方法は、
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞および／または組織をＨＳ８と接触させて培養するステップ、
（ｂ）細胞および／または組織を回収するステップ、
（ｃ）治療を必要とするヒトまたは動物の対象内に細胞および／または組織を埋め込むステップ
を含む。
細胞は、パート（ａ）においてＨＳ８と接触させて、細胞または組織の成長、増殖または分化を可能にするために十分な一定期間培養されてもよい。例えば、この一定期間は、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日または少なくとも４０日から選択されてもよい。
別の実施形態では、ＨＳ８は、傷害または疾患の予防または治療を含む、医療の方法における使用のために製剤化されてもよい。ＨＳ８および薬学的に許容される賦形剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物または医薬が提供されてもよい。こうした医薬組成物または医薬は、損傷または疾患の予防または治療のために提供されてもよい。傷害または疾患の予防または治療のための医薬の製造におけるＨＳ８の使用も提供される。任意選択で、本発明による医薬組成物および医薬は、ＧＡＧが結合するヘパリン結合ドメインを有する目的のタンパク質（すなわち、ＦＧＦ２）も含んでいてもよい。さらなる実施形態では、医薬組成物および医薬は、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞をさらに含んでいてもよい。
傷害または疾患の治療は、細胞または組織、例えば、結合組織（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、腱または靭帯）の修復、再生または置換を含んでいてもよい。組織の修復のために、ＨＳ８を含む医薬組成物または医薬は、新しい組織の成長、増殖および／または分化を刺激して傷害の修復をもたらすためにまたは病態を治癒させるもしくは軽減する（例えば、病態の症状の軽減をもたらす）ために、傷害または疾患の部位に直接に投与されてもよい。組織の修復または再生は、医薬組成物または医薬中に幹細胞を組み合わせることによって向上されてもよい。
組織の置換のために、ＨＳ８は、患者における傷害または疾患の部位での埋め込み用の細胞および／または組織を作製するために、細胞および／または組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養中に細胞および／または組織と接触されてもよい。細胞または組織の移植は、傷害または疾患のある組織の置換によって患者において損傷または疾患のある組織の修復を行うために使用されうる。これは、傷害／疾患のある組織の切除ならびにＨＳ８と接触させて細胞および／または組織を培養することによって調製された新しい組織の埋め込みを含んでいてもよい。
本発明による医薬組成物および医薬は、したがって、
（ａ）ＨＳ８；
（ｂ）幹細胞と組み合わせたＨＳ８；
（ｃ）ＨＳ８によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えば、配列番号１）を含むタンパク質と組み合わせたＨＳ８；
（ｄ）ＨＳ８によって結合されるヘパリン結合ドメイン（例えば、配列番号１）を含むタンパク質および幹細胞と組み合わせたＨＳ８；
（ｅ）ＨＳ８と接触させた細胞または組織の培養物から得られる組織または細胞
のうちの１つを含んでいてもよい。
ＨＳ８は、身体組織の修復または再生、特に、骨再生、神経再生、骨格組織構築、心血管系傷害の修復、ならびに胚および成体幹細胞の自己複製および増殖において使用されてもよい。したがって、ＨＳ８は、骨関節炎、軟骨置換、あらゆる種類の破損した骨（例えば、脊柱円板融合処置、長骨破損、頭蓋欠損）、重大なまたは癒合しない骨欠損の再生を含む、広範囲にわたる疾患および傷害を予防または治療するために使用されうる。
組織の修復、再生または置換におけるＨＳ８の使用は、創傷治癒、例えば、創傷治癒の促進、瘢痕または骨組織の治癒および組織移植における使用を含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、ＨＳ８を含む生物学的スキャフォールドを提供する。一部の実施形態では、本発明の生物学的スキャフォールドは、整形外科、血管、プロテーゼ、皮膚および角膜の用途で使用されてもよい。本発明によって提供される生物学的スキャフォールドは、持続放出性薬物送達装置、生体弁、生体弁尖頭、薬物溶出ステント、血管移植片、創傷治癒または皮膚移植片ならびに整形外科用のプロテーゼ、例えば、骨、靭帯、腱、軟骨および筋肉を含む。本発明の好ましい実施形態では、生物学的スキャフォールドは、内側（および／または外側）の表面が、カテーテルに結合された１種または複数のＧＡＧ化合物（ＨＳ８を含む）を含むカテーテルである。
別の態様では、本発明は、アジュバントとしての使用のために記載された方法によって単離される１種または複数のＧＡＧ（ＨＳ８を含む）を提供する。アジュバントは、免疫アジュバントであってもよい。
別の態様では、本発明は、１種または複数のＧＡＧを含む化合物の混合物を含む薬学的に許容される製剤であって、前記混合物がＨＳ８に関して濃縮されている、製剤を提供する。別の態様では、本発明は、別個、同時または連続の投与のための、
（ｉ）ＨＳ８に関して濃縮されている、１種または複数のＧＡＧを含む化合物の混合物；および
（ｉｉ）ＦＧＦ２
を含む薬学的に許容される製剤を提供する。好ましい一実施形態では、該製剤は、１種または複数のＧＡＧを含む化合物の混合物を含み、前記混合物は、本質的な混加物中のＨＳ８およびＦＧＦ２に関して濃縮されており、治療を必要とする患者に同時に投与される。
本発明の別の態様では、組織の修復、または再生における使用のためにキットであって、（ｉ）予め決定された量のＨＳ８、および（ｉｉ）予め決定された量のＦＧＦ２を含むキットが提供される。
本発明の濃縮された混合物の化合物は、薬学的に許容されるその塩として対象に投与されうる。例えば、本発明の濃縮された混合物の化合物のベースの塩は、これらに限定されないが、薬学的に許容される陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどで形成されたものを含む。本発明は、その範囲内に、陽イオン性の塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩を含む。
カルボン酸基を有する本発明の濃縮された混合物の化合物が、投与可能なプロドラッグの形態で送達されてもよいことは理解されよう。ここで、その酸性基は、エステル化され（−ＣＯ２Ｒ’の形態を有す）る。用語「プロドラッグ」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、−ＯＲ’基から−ＯＨ基、またはそこからカルボン酸の陰イオンへの変換に特に関する。したがって、本発明のプロドラッグは、細胞内への薬物吸着および／または薬物送達を促進するために働きうる。プロドラッグのｉｎ ｖｉｖｏでの変換は、リパーゼおよびエステラーゼなどの細胞酵素によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでのエステル加水分解などの化学切断によって促進されうる。本発明の態様による医薬および医薬組成物は、疾患または傷害の部位での注入を含むがこれらに限定されない、いくつかの経路による投与用に製剤化されてもよい。医薬および組成物は、液体または固体の形態で製剤化されてもよい。液体製剤は、注入による、ヒトまたは動物の身体の選択された領域への投与用に製剤化されてもよい。
個体に対する利益を示すのに十分である、「治療有効量」での投与が好ましい。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療中の傷害または疾患の性質および重症度に依存することになる。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般的な開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に知られている他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中で見出されうる。
幹細胞
ＨＳ８と接触させる細胞は幹細胞を含む。
ＨＳ８は、幹細胞の増殖および／もしくは分化、ならびに／または幹細胞の分化系列決定（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）において使用されうる。
本明細書において培養され、記載される幹細胞は、いかなる種類の幹細胞であってもよい。該幹細胞は全能性であっても多分化能（多能性）であってもよい。該幹細胞は任意の組織に由来する胚性幹細胞であっても成体幹細胞であってもよく、また、造血幹細胞であっても神経幹細胞であっても間葉系幹細胞であってもよい。該幹細胞は成体幹細胞であることが好ましい。
本明細書では、幹細胞は、分裂（すなわち、自己再生）し、全能性または多分化能（多能性）を保ち、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する任意の細胞型を意味する。
本発明において培養される幹細胞は、現存する培養物から、または、血液、骨髄、皮膚、上皮もしくは臍帯（通常は廃棄される組織）を含めた任意の成体組織、胚組織または胎児組織から直接得られうる、またはそれに由来しうる。
幹細胞の多分化能は、適切なアッセイを使用することによって決定されうる。そのようなアッセイは、多能性の１つまたは複数のマーカー、例えば、アルカリホスファターゼ活性、ＲＵＮＸ２、オステリックス（ｏｓｔｅｒｉｘ）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、ＢＳＰＩＩ、ＳＯＸ９、アグリカン、ＡＬＢＰ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰα）、脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨シアロタンパク質２、（ＢＳＰＩＩ）、コラーゲン２ａ１（Ｃｏｌｌ２ａ）およびＳＯＸ９の検出を検出することを含んでよい。
一部の好ましい実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞および脂肪細胞などの結合組織および／または骨細胞に分化する能力がある。
間葉系幹細胞は、低侵襲性の技法によって骨髄から容易に得られ、培養物中で増大し、所望の系列に分化しうる。分化は、特定の増殖因子の適用によって誘導されうる。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーメンバータンパク質は、間葉系幹細胞の軟骨形成性分化および骨形成性分化の重要な因子である。
間葉系幹細胞は、ＳＴＲＯ−Ｉなどの選択マーカーを使用して、骨髄再増殖に対するそれらの可能性を示すＣＤ３４＋画分から単離および検出されうる。これらの細胞表面マーカーは、間葉系幹細胞の細胞表面上にのみ見出され、細胞多能性の指標である。
適切な間葉系幹細胞は、骨髄の吸引により回収された骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）から得られうる、またはそれに由来しうる（例えば、Ｗｅｘｌｅｒら、Ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓ ａ ｒｉｃｈ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ’ｓｔｅｍ’ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｄｕｌｔ ｂｌｏｏｄ ａｒｅ ｎｏｔ．ＨＡＥＭＯＰＯＩＥＳＩＳ ＡＮＤ ＬＥＵＣＯＣＹＴＥＳ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １２１（２）：３６８〜３７４、２００３年４月）またはＷｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ（例えば、Ｔａら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｍａｒｋｅｒ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２００９年７月２０日（Ｅｐｕｂ））。
間葉系幹細胞は、当技術分野で周知の通り、適切な分化因子を適用することによりヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞を分化させることによって得られうる。
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、筋肉、腱、靭帯、および脂肪の成分を生成する能力を有する多能性（多分化能）前駆細胞である。これらの初期の前駆細胞は出生後に存在し、幹細胞の特性を示す、すなわち、低い発生率および広範囲にわたる再生可能性を示す。これらの性質に対して、それらの発生の柔軟性と組み合わせて、傷害組織の置換するためのそれらの潜在的使用に関して極めて大きな関心が生じている。本質的に、これらの幹細胞は、培養してそれらの数を増大させ、次いで、傷害部位に移植すること、または足場中／上に播種した後に適切な組織構築物を生成することができる。
したがって、骨格、筋肉、腱、靭帯および血液の修復／再生のための代替の手法は、特定の組織増殖因子の賢明な選択と共に再生を支持およびガイドする伝導性または誘導性足場と組み合わせて、適切な前駆細胞、骨の場合では骨芽前駆細胞（例えば、間葉系幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、骨幹細胞または骨前駆細胞）などを選択し、増大させ、モジュレートすることである。
幹細胞は、任意の動物またはヒト、例えば、非ヒト動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類（げっ歯目の任意の動物由来の細胞を含める）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類または他の非ヒト脊椎動物生物体；および／または非ヒト哺乳動物；および／またはヒトから得られうる。幹細胞はヒトであることが好ましい。任意選択で、幹細胞は非ヒトである。任意選択で、幹細胞は非胚性幹細胞である。任意選択で、幹細胞は全能性ではない。
本発明のさらに別の態様では、本発明の方法のいずれかによって生成される幹細胞または他の細胞、またはその断片もしくは産物を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、医療の方法において有用でありうる。適切な医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤をさらに含んでいてもよい。
本発明の別の態様では、本発明の方法のいずれかによって生成される幹細胞または他の細胞は、医療の方法において使用されてもよく、治療を必要とする個体に治療有効量の前記医薬または医薬組成物を投与するステップを含む医療の方法が提供されることが好ましい。
本発明による培養方法および技法によって得られる幹細胞および他の細胞は、医療の方法において使用するための別の細胞型に分化させるために使用されうる。したがって、分化細胞型は、記載されている培養方法および技法によって得られ、その後分化させた、幹細胞に由来するものであってよく、その産物であるとみなされうる。そのような分化細胞を、任意選択で薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤と共に含む医薬組成物が提供されうる。そのような医薬組成物は、医療の方法において有用でありうる。
間葉系幹細胞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄から最初に単離された、総骨髄単核細胞（ＢＭＭＮＣ）１０４〜１０５個のうちのたったの１つとして存在するものである（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９６６）。これらの細胞は、ＣＦＵ−Ｆ（コロニー形成単位線維芽細胞）集団と称される単一の前駆細胞由来のコロニーを形成する能力がある。ＭＳＣは現在、脂肪組織（ＧｉｍｂｌｅおよびＧｕｉｌａｋ ２００３；Ｚｕｋら、２００１）、臍帯血（Ｂｉｅｂａｃｋら、２００４；Ｅｒｉｃｅｓら、２０００；Ｇｏｏｄｗｉｎら、２００１；Ｋｏｇｌｅｒら、２００４；Ｗａｇｎｅｒら、２００５）および筋肉（Ｊｉａｎｇら、２００２）を含めた多くの他の組織において同定されている。
多分化能ヒト間葉系間質細胞（ＭＳＣ）に関する最小の基準は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙによって詳述されている（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００６）８巻、４号、３１５−３１７）。これにより、ヒトＭＳＣを定義するための３つの基準が提唱されている：プラスチックへの接着性、特定の表面抗原発現および多分化能分化可能性。特に、「第１に、ＭＳＣは、組織培養フラスコを使用して標準の培養条件で維持したときにプラスチック接着性でなければならない。第２に、フローサイトメトリーによって測定して、ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現しなければならない。さらに、これらの細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ クラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現を欠かなければならない（≦２％陽性）。第３に、細胞は、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化条件で骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化できなければならない。」と述べられている。
Ｄｏｍｉｎｉｃｉらも、ＭＳＣをほぼ一意的に同定する生物学的性質は、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織培養物−分化条件を使用して骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に三血球系間葉系分化するそれらの能力であることを述べた。彼らは、骨芽細胞への分化が、アリザリンレッド染色またはフォンコッサ染色によって実証されうること、脂肪細胞分化がオイルレッドＯを用いた染色によって最も容易に実証されうること、および軟骨芽細胞分化が、ＩＩ型コラーゲンに対するアルシアンブルーを用いた染色または免疫組織化学的染色によって実証されうることを確認した。Ｄｏｍｉｎｉｃｉらは、そのようなアッセイのためのキットが市販されていること、および分化の実証は全ての研究者が実行可能であることを述べた。
Ｄｏｍｉｎｉｃｉらは、今後、同様にヒトＭＳＣを定義するために使用されうる新規の表面マーカーを同定することができることも理解している。これらの３種のマーカー：ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１が現在公知である。
Ｒｉｄｅｒらは、ＣＤ４９ａ＋クローンでは未選別胞と比較してＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現が促進されたことを報告し、ＣＤ４９ａ＋クローンが未選別胞と比較して脂肪、骨および軟骨への多系列分化を容易に受けることを実証した。これにより、間葉系幹細胞を濃縮し、骨髄単核幹細胞の不均一なプールから最も多分化能の細胞を選択するための戦略を提供するためのアルファ−１インテグリン（ＣＤ４９ａ）選択の使用が支持される（Ｒｉｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔ（２００７）３８：４４９−４５８）。Ｒｉｄｅｒらは、ＣＦＵ−Ｆ細胞がＣＤ４９ａの発現に関連すること、ＣＤ４９ａを発現するＣＦＵ−Ｆ細胞がＳＴＲＯ−１も同時発現すること、およびＣＤ４９ａがＭＳＣをヒトに加えてラットおよびマウスから単離するために使用されうることも報告した。これは、ＣＤ４９ａが濃縮に対する保存的マーカーであることを示す。
Ｇａｎｇらは、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４が未分化の多能性ヒト胚性幹細胞に対するマーカーとして一般に使用され、また、胚盤胞段階の胚への分割も成体ヒト間葉系幹細胞集団を同定するものであり、ＭＳＣを単離するために使用されうることを報告した（Ｇａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ２００７；１０９：１７４３−１７５１）。Ｇａｎｇらは、クローン原性間質細胞（ＣＦＵ−Ｆ）、いわゆるＳＴＲＯ−１＋ｂｒｉｇｈｔの濃縮における、表面マーカーＳＴＲＯ−１に結合するモノクローナル抗体の使用ことも記載している。
グリコサミノグリカン
本明細書で使用される場合、「グルコサミノグリカン」および「ＧＡＧ」という用語は互換的に使用され、また、オリゴ糖を含み、それらの結合した糖の１つまたは複数がアミノ置換基またはその誘導体を有する分子の大きな集合を指すことが理解される。ＧＡＧの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
本明細書で使用される場合、「ＧＡＧ」という用語は、ＧＡＧコンジュゲートである分子を包含するように拡張される。ＧＡＧコンジュゲートの例は、ペプチド成分がオリゴ糖成分と共有結合したプロテオグリコサミノグリカン（ＰＧＡＧ、プロテオグリカン）である。
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、プロテオグリカンの高度に多様なサブグループであり、タンパク質骨格に共有結合により結合したヘパラン硫酸グルコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は３つの主要な形態：パールカンとして公知の分泌形態、グリピカンとして公知の、原形質膜内に固定された形態、およびシンデカンとして公知の膜貫通形態で存在する。これらは、哺乳動物の細胞表面および大多数の細胞外マトリクスに遍在する構成物である。ＨＳ鎖を、あまり一般的には見出されないコアに結合させることができるアグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質が存在する。
「ヘパラン硫酸」（「ヘパラン硫酸」または「ＨＳ」）は、ゴルジ装置においてＤ−グルクロン酸（ＧＩｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）のタンデムな反復からなる多糖として最初に合成される。新生多糖は、その後、一連のステップ：ＧＩｃＮＡｃのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、ＧＩｃＡからイズロン酸（ＩｄｏＡ）へのＣ５エピマー化、ＩｄｏＡおよびＧＩｃＡのＣ２におけるＯ−硫酸化、Ｎ−スルホグルコサミン（ＧＩｃＮＳ）のＣ６におけるＯ−硫酸化および時々ＧＩｃＮＳのＣ３におけるＯ−硫酸化で修飾されうる。ＨＳのＮ−脱アセチル化／Ｎ−硫酸化、２−Ｏ−硫酸化、６−Ｏ−硫酸化および３−Ｏ−硫酸化は、それぞれ、ＨＳ Ｎ−脱アセチル化酵素／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳＮＤＳＴ）、ＨＳ ２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ２ＳＴ）、ＨＳ ６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（ＨＳ６ＳＴ）およびＨＳ ３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼの特異的作用によって媒介される。修飾ステップのそれぞれにおいて、潜在的な基質のほんの一部のみが修飾され、その結果、大きな配列多様性が生じる。ＨＳのこの構造的な複雑さにより、その配列を決定すること、およびＨＳ構造と機能との間の関係を理解することが難しいものになっている。
ヘパラン硫酸側鎖は、（１→４）グリコシド結合によって結合した、交互に配置されたＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸とＤ−グルコサミンからなる。グルコサミンは、多くの場合、Ｎ−アセチル化またはＮ−硫酸化され、ウロン酸とグルコサミンはどちらもさらにＯ−硫酸化される。特定の結合パートナーに対する特定のＨＳＰＧの特異性は、グルコサミンおよびウロン酸に結合したカルボキシル基、アセチル基および硫酸基の特定のパターンによって生じる。ヘパリンとは対照的に、ヘパラン硫酸は、Ｎ−硫酸基およびＯ−硫酸基よりもＮ−アセチル基を多く含有する。ヘパラン硫酸側鎖は、コアタンパク質のセリン残基に四糖結合（−グルクロノシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→３）−ガラクトシル−β−（１→４）−キシロシル−β−１−Ｏ−（セリン））領域を通じて結合する。
ヘパラン硫酸鎖とコアタンパク質はどちらも、最終的にそれらの生物活性に影響を及ぼす可能性がある一連の修飾を受けうる。ＨＳの複雑さは、核酸の複雑さに勝ると考えられてきた（Ｌｉｎｄａｈｌら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２４９７９；ＳｕｇａｈａｒａおよびＫｉｔａｇａｗａ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０、５１８）。ＨＳ種内の変動は、Ｎ−アセチル化グルコサミンを含有する二糖の硫酸化されていない領域によって分離された、糖残基のランダムでない高度に硫酸化された配列の合成から生じる。Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−スルホグルコサミンへの最初の変換により、グルクロン酸からイズロン酸へのエピマー化およびグルコサミンまたはイズロン酸におけるＯ−硫酸化の複雑なパターンを含めた他の修飾のための焦点が生じる。さらに、修飾されていない、低硫酸化された、Ｎ−アセチル化された配列内では、ヘキサウロン酸残基はグルクロン酸として残るが、高度に硫酸化されたＮ−硫酸化された領域では、Ｃ−５エピマーイズロン酸が優性である。これにより、任意の所与の鎖内の可能性のある潜在的な二糖バリアントの数が限定されるが、それぞれの存在量が限定されない。大多数の修飾は、Ｎ−硫酸化ドメインにおいて、またはそれらのすぐ隣で起こり、したがって、成熟鎖では、低硫酸化のドメインによって分離された高硫酸化の領域が存在する（Ｂｒｉｃｋｍａｎら（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（８）、４３５０−４３５９、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
高度に変動するヘパラン硫酸鎖は、自己分泌、接触分泌およびパラ分泌フィードバックループの複雑な組合せによる増殖の調節および接着因子の細胞への提示を含めた多数の細胞外リガンドの作用のモジュレーションにおいて重要な役割を果たし、したがって細胞内シグナル伝達、およびそれにより幹細胞の分化を制御すると仮定される。例えば、ヘパラン硫酸グルコサミノグリカンは遺伝的に記載されうるにもかかわらず（Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ、８０４頁および８０５頁）、単一の供給源から単離されたヘパラン硫酸グルコサミノグリカンは生物活性が異なりうる。Ｂｒｉｃｋｍａｎら、１９９８、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８、４６３に示されている通り、神経上皮細胞から得たヘパラン硫酸グルコサミノグリカンの２つの別々のプールは、分裂促進的な状態に応じてＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかを特異的に活性化することができた。同様に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）のＦＧＦ−１またはＦＧＦ−２のいずれかと相互作用する能力はＷＯ９６／２３００３に記載されている。この特許出願によると、ＦＧＦ−１と相互作用することができるそれぞれのＨＳは胎齢約１１日〜約１３日のマウス細胞から得られ、一方、ＦＧＦ−２と相互作用することができるＨＳは胎齢約８日〜約１０日に得られる。
上記の通り、ＨＳ構造は非常に複雑であり、ＨＳ間で変動する。実際に、ＨＳ構造の変動は、細胞の増殖を促進し、細胞分化を導くことにおける各ＨＳの異なる活性の寄与において重要な役割を果たすと考えられる。構造的な複雑さは、核酸の複雑さに勝ると考えられ、ＨＳ構造は特定の独特の硫酸化パターンを有する反復二糖単位の連続であると特徴付けることができるにもかかわらず、現在のところ、核酸配列決定のために利用可能なものと同等の、ＨＳ配列構造を決定するために利用可能な標準の配列決定技法は存在しない。重要なＨＳ配列構造を決定するための単純な方法の不在下で、ＨＳ分子は、当業者により、いくつもの分析技法によって積極的に同定され、構造的に特徴付けられる。これらとしては、二糖分析、四糖分析、ＨＰＬＣおよび分子量決定の１つまたは組合せが挙げられる。これらの分析技法は当業者には周知であり、当業者に使用される。
ＨＳから二糖および四糖を作製するための２つの技法として、亜硝酸消化およびリアーゼ消化が挙げられる。これらの消化技法を実施する１つのやり方についての記載が下で純粋に例として提供され、そのような記載は本発明の範囲を限定するものではない。
亜硝酸消化
ヘパラン硫酸の亜硝酸に基づく解重合が完了すると、炭水化物鎖がその個々の二糖成分に最終的に分解される。
例えば、亜硝酸は、０．５ＭのＨ２ＳＯ４および０．５ＭのＢａ（ＮＯ２）２、２５０μｌを別々に氷上で１５分冷却することによって調製されうる。冷却後、Ｂａ（ＮＯ２）２をＨ２ＳＯ４と混合し、ボルテックスした後に遠心分離して硫酸バリウム沈殿物を除去する。ＨＮＯ２、１２５ｍｌをＨ２Ｏ、２０μｌに再懸濁させたＧＡＧ試料に添加し、ボルテックスした後に２５℃で１５分、時々混合しながらインキュベートした。インキュベート後、１ＭのＮａ２ＣＯ３を試料に添加してｐＨ６にした。次に、０．１ＭのＮａＯＨ中０．２５ＭのＮａＢＨ４、１００μｌを試料に添加し、混合物を２０分にわたり５０℃まで加熱する。次いで、混合物を２５℃まで冷却し、酸性化した氷酢酸を試料に添加してｐＨ３にする。次いで、混合物を１０ＭのＮａＯＨで中和し、凍結乾燥によって体積を減少させる。分解の程度検証するために、最終的な試料をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２カラムに流して二糖および四糖を分離する。
リアーゼ消化
ヘパリナーゼＩＩＩは、糖鎖をグルクロニド結合で切断する。一連のヘパリナーゼ酵素（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）はそれぞれ、ある特定のヘパラン硫酸配列を特定の硫酸化認識部位で解重合することにより比較的特異的な活性を示す。ヘパリナーゼＩは、ＨＳ鎖に沿ってＮＳ領域を伴うＨＳ鎖を切断する。これにより、硫酸化ドメインの破壊が導かれる。ヘパリナーゼＩＩＩは、ＮＡドメインを伴うＨＳを解重合させ、その結果、炭水化物鎖が個々の硫酸化ドメインに分離する。ヘパリナーゼＩＩは、主に、変動する硫酸化パターンが見出されるＨＳ鎖のＮＡ／ＮＳ「肩」ドメインで切断する。注：ヘパランポリマーの反復二糖骨格は、アミノ糖グルコサミンと結合したウロン酸である。「ＮＳ」とは、アミノ糖がアミノ基上に硫酸を有し、Ｃ２、Ｃ６およびＣ３の他の基を硫酸化することが可能であることを意味する。「ＮＡ」とは、アミノ基が硫酸化されておらず、アセチル化されたままであることを示す。
例えば、ヘパリナーゼＩＩＩを使用したＮＡ領域における解重合のために、酵素および凍結乾燥したＨＳ試料の両方を、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中に調製する。純粋に例として、ヘパリナーゼＩＩＩをＨＳ １μｇあたり５ｍＵで添加し、３７℃で１６時間インキュベートした後、５分にわたって７０℃まで加熱することによって反応を停止させることができる。
二糖および四糖はカラムクロマトグラフィーによって溶出されうる。
骨折
一部の態様では、本発明は、骨折を治療するためのＨＳ８の治療的使用（ヒトおよび／または獣医学的）に関する。
骨折は、医学的状態である。本出願において、「骨折」は、骨にひびが入った、骨が破損したまたは削れた、骨への損傷または傷害を含む。破損とは、骨における不連続性を指す。骨折は、物理的な影響、もしくは機械的なストレスによってまたは骨粗鬆症もしくは骨関節炎などの医学的状態によって惹起されうる。
骨折の整形外科的分類法は、閉鎖骨折または開放骨折および単純骨折または多断片骨折を含む。閉鎖骨折では、皮膚が完全なままであるのに対して、開放骨折では、骨が創傷部位を貫通して曝露されることもあり、これは、より高い感染のリスクをもたらす。単純骨折は、１本に沿って生じ、骨を２本に分割する傾向がある。多断片骨折は、骨を複数の断片に分割（ｓｐｉｌｔ）する。
他の骨折の型は、圧迫骨折、圧縮骨折、回旋骨折、完全骨折、不全骨折、横骨折、線状骨折、斜骨折および粉砕骨折を含む。
多くの対象において、骨創治癒（骨折癒合）は、天然に生じ、傷害後に開始される。出血は、通常は、凝固ならびに白血球および線維芽細胞の誘引をもたらし、その後、コラーゲン繊維が産生される。この後、コラーゲンマトリクスを骨に変換して骨基質（カルシウムヒドロキシアパタイト）が沈着（石灰化）する。再生された未成熟な骨は、成熟した骨よりも典型的には弱く、時が経過するにつれて、未成熟な骨は、成熟した「層状」骨を産生するためのリモデリングの過程を受ける。完全な骨の治癒過程には、著しく時間がかかり、典型的には、何ヶ月もかかる。
骨折が生じ、ＨＳ８を使用する治療から利益を受けうる骨は、すべての骨型、特に、これらに限定されないが、長骨（例えば、大腿骨、上腕骨、指骨）、短骨（例えば、手根骨、足根骨）、扁平骨（例えば、頭蓋骨、肋骨、肩甲骨、胸骨、下肢帯）、不規則骨（例えば、椎骨）、種子骨（例えば、膝蓋骨）を含むすべての哺乳類の骨を含む。
骨折が生じ、ＨＳ８を使用する治療から利益を受けうる骨は、骨格骨（すなわち、あらゆる骨格の骨）、頭蓋顔面領域の骨、軸骨格の骨（例えば、椎骨、肋骨）、付属器官の骨（例えば、四肢の骨）、骨盤の骨格の骨（例えば、骨盤）を含む。
骨折が生じ、ＨＳ８を使用する治療から利益を受けうる骨は、顎、鼻および頬などの顔の骨を含む、頭部（頭蓋）および頸部の骨も含む。ＨＳ８は、歯または顔または頭蓋の手術中に骨の修復または再生を補助するために使用されてもよく、これは、例えば顎骨を含む、顔および／または口の（歯とは異なるような）骨の再構築を含みうる。
骨折は、骨粗鬆症を有する対象によって示されるような、病理学的な有孔性を含む。
本発明を制限するものではないが、ＨＳ８の一次作用は、創傷部位内の、創傷部位に隣接した、または創傷部位内へ移動させられる細胞上であってもよく、かつ間葉系幹細胞、骨幹細胞、前骨芽細胞もしくは骨芽細胞上、または創傷層内へのもしくは内での移動が見出されるもしくは引き起こされる付属的なもしくは血管性のいかなる細胞上であってもよい。
ＨＳ８ならびにＨＳ８を含む医薬組成物および医薬は、哺乳動物対象における骨折の治療の方法における使用のために提供される。治療は、骨における創傷治癒を含んでいてもよい。治療は、骨の修復、再生および成長を含んでいてもよい。ＨＳ８は、新しい骨成長を促進することによって骨折修復を促進する。ＨＳ８は、骨折修復の速度を向上させるために働き、骨創治癒がより速く起こるのを可能にして傷害からの回復時間の向上をもたらす。治療は、改良された骨強度をもたらしてもよい。
治療は、骨粗鬆症または骨関節炎の治療を含みうる。
ＨＳ８の投与は、骨折の周囲の組織にであることが好ましい。これは、骨折が生じた骨組織への直接の投与を含みうる。投与は、骨もしくは骨折の周囲の結合組織にまたは骨の近くのかつ骨に供給している血管系（例えば、血管）にであってもよい。投与は、傷害の部位に直接であってもよく、創傷の初期の治癒によって形成される仮骨にであってもよい。本発明の医薬および医薬組成物は、いくつかの経路による投与用に製剤化されてもよい。最も好ましくは、ＨＳ８は、注入のための流体または液体の形態で製剤化される。
一部の実施形態では、ＨＳ８は、例えば、創傷部位における埋め込み用の薬物カプセル中に、放出制御製剤として製剤化される。ＨＳ８は、ナノ繊維または生分解性の紙または布などの担体材料（例えば、バイオマテリアル）に結合、上に含浸、または中に吸収されてもよい。
ＨＳ８を含む医薬組成物、医薬、インプラントおよびプロテーゼは、ＦＧＦ２も含んでいてもよい。ＦＧＦ２を結合するＨＳ８の能力のために、ＨＳ８は、創傷部位へのＦＧＦ２の送達を補助するＦＧＦ２の担体として働きうる。
対応する未処理の骨折と比較して骨折の治癒を促進するのに十分である、「治療有効量」での投与が好ましい。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、骨折の性質および重症度に依存することになる。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般的な開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、骨折の性質、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に知られている他の要因を考慮することになる。ＨＳ８用量の単回投与または反復投与は、処方する医師の指導に従って投与されうる。純粋に例として、ＨＳ８は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５ｎｇ／ｍｌおよび任意選択で１０ｎｇ／ｍｌ以上の投与量で送達されうる。個別のＨＳ８投与量は、１ｍｇ未満かつ１μｇを超えるオーダー、例えば、約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約０．５ｍｇ、または約１ｍｇのうちの１つであってもよい。上述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中で見出されうる。
ＨＳ８は、他の治療、例えば、鎮痛薬または抗炎症薬の投与、骨の固定および接着、例えば、ギプス包帯で傷害を受けた四肢を固定すること、外科的介入、例えば、骨を整復すること、または骨を移動させて、ずれ、屈曲もしくは脱臼を補正することなどと一緒に、骨折を治療するために使用されてもよい。外科手術が必要とされる場合には、ＨＳ８は、外科的処置中に骨折に直接投与（例えば、適用）されてもよい。
バイオマテリアル
本発明の医薬組成物および医薬は、ＨＳ８でコーティングおよび／または含浸されたバイオマテリアルの形態をとっていてもよい。インプラントまたはプロテーゼは、バイオマテリアルから形成されてもよい。こうしたインプラントまたはプロテーゼは、細胞の移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ）、骨成長、組織再生、組織再構築および／または組織リモデリングを補助するために外科的に埋め込まれてもよい。
ＨＳ８は、望ましい部位における新しい組織の形成を促進するために、インプラントまたはプロテーゼに適用されてもよい。ヘパラン硫酸は、タンパク質とは異なり、特に壊れにくく、合成バイオスキャフォールドの製造ならびにインプラントおよびプロテーゼへの適用に必要とされる溶媒に耐える極めて良好な能力を有することは理解されよう。
バイオマテリアルは、ＨＳ８でコーティングまたは含浸されていてもよい。含浸は、例えば重合中に、ＨＳ８をバイオマテリアルの構成的な成分と混合すること、またはバイオマテリアル内にＨＳ８を吸収することによって、バイオマテリアルを形成することを含んでいてもよい。コーティングは、バイオマテリアルの表面上にＨＳ８を吸着することを含んでいてもよい。
対象に投与されたまたは埋め込まれたときに、バイオマテリアルは、コーティングまたは含浸されたＨＳ８がバイオマテリアルから放出されるのを可能にしなければならない。バイオマテリアル放出動態は、バイオマテリアルの構造、例えば、多孔性を改変することによって改変されてもよい。
ＨＳ８でバイオマテリアルをコーティングするまたは含浸させることに加えて、１種または複数の生物学的に活性な分子が、バイオマテリアル上に含浸またはコーティングされてもよい。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＯＰ−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３；ＶＥＧＦ；コラーゲン；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種がある。上記の生理活性分子に加えてまたは代替的に、１種または複数のビスホスホネートが、ＨＳ８と共にバイオマテリアル上へ含浸またはコーティングされてもよい。有用なビスホスホネートの例は、エチドロン酸；クロドロン酸；アレンドロン酸；パミドロン酸；リセドロン酸；ゾレドロン酸からなる群から選択される少なくとも１種を含みうる。
ＨＳ８でコーティングまたは含浸されたバイオマテリアルは、医学的および獣医学的な目的において有用でありうる。本発明が患者の生活の質を向上させうるまたは潜在的に動物、例えば、育種における使用のための価値ある競走馬の寿命を延長しうることは理解されよう。
バイオマテリアルは、スキャフォールドまたはマトリクス支持体を提供する。バイオマテリアルは、組織における移植に好適でありうる、または（例えば、溶液中のマイクロカプセルとしての）投与に好適でありうる。
インプラントまたはプロテーゼは、生体適合性、例えば、無毒性および低免疫原性（最も好ましくは、非免疫原性）でなければならない。バイオマテリアルは生分解性であってもよく、それによって、創傷治癒が生じるにつれてバイオマテリアルが分解されて、最終的に対象においてｉｎ ｓｉｔｕに再生された骨のみを残す。代替的に、例えば、大きな不連続性にわたって骨再生を導くためおよび／または骨創治癒中の構造支持体として働くために、非生分解性のバイオマテリアルが使用されてもよく、好結果の創傷治癒後、任意選択の要件であるバイオマテリアルの外科的除去を伴う。
バイオマテリアルは、軟性および／または柔軟性、例えば、ヒドロゲル、フィブリンウェブもしくはフィブリンメッシュ、またはコラーゲンスポンジであってもよい。「ヒドロゲル」は、天然または合成でありうる、有機ポリマーが、凝固または固体化されて水または他の溶液の分子を封入してゲルを形成する三次元の開放格子構造を生じるときに形成される物質である。固体化は、凝集、凝結、疎水性相互作用または架橋結合によって生じうる。
代替的に、バイオマテリアルは、例えば、固体材料、例えば、プラスチックまたは生物学的に不活性な金属、例えば、チタンなどから形成された、相対的に硬質の構造であってもよい。
バイオマテリアルは、架橋されたポリマーによって提供されうる多孔性マトリクス構造を有しうる。マトリクスは、骨成長のために必要とされる栄養素および増殖因子に対して浸透性であることが好ましい。
マトリクス構造は、好適な架橋剤、例えば、カルシウム塩、ポリアクリル酸、ヘパリンで、繊維、例えば、フィブリンもしくはコラーゲン、またはアルギン酸ナトリウムの液境膜の繊維、キトサン、または他の多糖類を架橋することによって形成されてもよい。代替的に、スキャフォールドは、コラーゲンまたはアルギネートによって作製された、当業者に知られている十分に確立された方法を使用して架橋された、ゲルとして形成されてもよい。
マトリクス形成のための好適なポリマー材料は、これらによって限定されないが、アガロース、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ポリカプロラクトン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリグリコリド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシアルカノエート、これらのコポリマー、または酢酸セルロース；酪酸セルロース、アルギネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、スルホン化ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、これらのコポリマーの群から選択されうる非生分解性ポリマーの群から選択されうる生分解性／生吸収性ポリマーを含む。
コラーゲンは、その生体適合性ならびに支持細胞結合および機能の好ましい特性のために、マトリクス構築に有望な材料である（米国特許第５，０１９，０８７号；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｔａｋｉｇａｗａ，Ｔ．；Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｓ．＆Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ． Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ−ｃｏｌｌａｇｅｎ ｎｅｒｖｅ ｇｕｉｄｅ ｔｕｂｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６、４６、１４６１〜１４６７）。臨床的に許容されるコラーゲンスポンジは、マトリクスの一例であり、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから）。
フィブリンスキャフォールド（例えば、フィブリン接着剤）は、代替のマトリクス材料を提供する。フィブリン接着剤は、創傷接合剤として、増殖因子を送達する貯蔵体、および生物学的インプラントの配置および固定における助剤として広範囲にわたる臨床的適用を受けている（Ｒａｊｅｓｈ Ｖａｓｉｔａ、Ｄｈｉｒｅｎｄｒａ Ｓ Ｋａｔｔｉ．Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ．２００６；３（１）：２９〜４７；Ｗｏｎｇ Ｃ、Ｉｎｍａｎ Ｅ、Ｓｐａｅｔｈｅ Ｒ、Ｈｅｌｇｅｒｓｏｎ Ｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３ ８９（３）：５７３〜５８２；Ｐａｎｄｉｔ ＡＳ、Ｗｉｌｓｏｎ ＤＪ、Ｆｅｌｄｍａｎ ＤＳ．Ｆｉｂｒｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ−１）．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．２０００；１４（３）；２２９〜２４２；ＤｅＢｌｏｉｓ Ｃｏｔｅ ＭＦ．Ｄｏｉｌｌｏｎ ＣＪ．Ｈｅｐａｒｉｎ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｉｂｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂａｓｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１９９４；１５（９）：６６５〜６７２）。
参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｕｏｎｇ−Ｖａｎら（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２８（２００７）２１２７〜２１３６）は、ポリカプロラクトンマイクロカプセルからのＨＳの持続性の局所的な送達を記載している。
バイオマテリアルのさらなる例は、ヒドロキシアパタイトまたはヒアルロン酸を組み込んだポリマーである。
ＨＳ８と組み合わせての使用に好適なバイオマテリアルの一例は、ＪＡＸ（商標）骨間隙充填剤（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ）である。Ｊａｘ顆粒剤は、高純度の硫酸カルシウムからなり、その形状を保持して、スキャフォールドに、調節された、顆粒内多孔性および顆粒移動安定性を与える。Ｊａｘ顆粒剤は、体内で安全かつ完全に溶解する。
他の好適なバイオマテリアルは、セラミックまたは金属（例えば、チタン）、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、脱灰された骨基質（ＤＢＭ）、自己移植片（すなわち、患者の組織に由来する移植片）、または同種移植片（患者でない動物の組織に由来する移植片）を含む。バイオマテリアルは、合成的（例えば、金属、フィブリン、セラミック）または生物学的（例えば、動物組織、例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ）、またはヒト）から作製される担体材料）であってもよい。
バイオマテリアルは、さらなる細胞で補助されてもよい。例えば、バイオマテリアルに、未分化の骨前駆細胞、例えば、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、より好ましくは、ヒト間葉系幹細胞を「播種」する（またはそれを共合成する）ことができる。
治療される対象は、いかなる動物またはヒトであってもよい。対象は、哺乳動物であることが好ましく、より好ましくはヒトである。対象は、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他のげっ歯動物（げっ歯目の中の任意の動物からの細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌ウシ、例えば、乳牛、またはウシ属（Ｂｏｓ）の中の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ科（Ｅｑｕｉｄａｅ）の中の任意の動物を含む）、ロバ、およびヒト以外の霊長類）であってもよい。ヒト以外の哺乳動物は、家庭用ペット、または商業的な目的で飼育される動物、例えば、競走馬、または農業用家畜、例えば、ブタ、ヒツジもしくはウシであってもよい。対象は、雄性または雌性でありうる。対象は、患者であってもよい。
本発明の方法は、指示された通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施されてもよい。用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた操作を包含することが意図されるのに対して、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、完全な多細胞生物を用いた操作を包含することが意図される。
細胞の継代
ここに記載されている方法は、培養中の細胞の継代、または分割を含んでいてもよい。該方法は、連続的または継続的な継代を含んでいてもよい。
用語「継代」は、一般に、一定分量の細胞培養物を取り出すプロセス、完全にまたは部分的に細胞を解離させるプロセス、希釈するプロセスおよび培地中に植え付けるプロセスを指しうる。継代は、１回または複数回繰り返されてもよい。一定分量は、細胞培養物の全体または一部を含みうる。一定分量の細胞は、完全にもしくは部分的にコンフルエントであってもよく、またはコンフルエントでなくてもよい。継代は、以下の連なるステップのうちの少なくとも一部を含んでいてもよい：吸引、すすぎ、トリプシン処理、インキュベーション、移動、急冷、再播種および等分。Ｈｅｄｒｉｃｋ Ｌａｂ、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏによって公表されているプロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）が使用されてもよい。
培養中の細胞は、基質またはフラスコから解離、および「分割」されてもよく、組織培地中への希釈および再播種によって、継代培養または継代されてもよい。
継代のプロセスは、少なくとも１回、例えば２回、３回、４回、５回など（以下に記述されるように）、繰り返されうる。場合によっては、これは、何回でも、例えば、限界なく、繰り返されてもよい。最も好ましくは、このプロセスは、３回以上、例えば、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上、１１回以上、１２回以上、１３回以上、１４回以上、１５回以上、１６回以上、１７回以上、１８回以上、１９回以上、２０回以上、２１回以上、２２回以上、２３回以上、２４回以上、２５回以上繰り返される。
細胞は、当技術分野において知られている機械的または酵素的な手段などの、任意の好適な手段によって解離されうる。細胞は、例えば、細胞スクレーパーまたはピペットを使用して、機械的な解離によって剥離されてもよい。細胞は、好適な篩の大きさを通して、例えば、１００ミクロンまたは５００ミクロンの篩を通して、篩分けによって解離されてもよい。細胞は、酵素的解離によって、例えば、回収されたコラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの処理によって、分割されてもよい。この解離は、完全であってもよくまたは部分的であってもよい。
希釈率は、任意の好適な希釈率であってもよい。細胞培養中の細胞は、任意の好適な比で分割されてもよい。例えば、細胞は、１：２以上、１：３以上、１：４以上または１：５以上の比で分割されてもよい。細胞は、１：６以上、１：７以上、１：８以上、１：９以上または１：１０以上の比で分割されてもよい。分割の比は、１：１０以上であってもよい。それは、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０またはそれ以上であってもよい。分割の比は、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５または１：２６またはそれ以上であってもよい。
したがって、幹細胞は、１回または複数回の継代の間、継代されてもよい。例えば、幹細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回またはそれ以上の継代の間、継代されてもよい。幹細胞は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５回またはそれ以上の継代の間、継代されてもよい。幹細胞は、培養で限界なく増殖されてもよい。
継代は、細胞増殖の世代として表されてもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代またはそれ以上の間、増殖させることを可能にするのに好適である。幹細胞は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５世代またはそれ以上の間、増殖されてもよい。
継代は、細胞倍加の回数としても表されうる。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回またはそれ以上の細胞倍加の間、増殖させることを可能にするのに好適である。幹細胞は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５回またはそれ以上の細胞倍加の間、培養されてもよい。
幹細胞は、５を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、２５を超える、３０を超える、４０を超える、４５を超える、５０を超える、１００を超える、２００を超える、５００を超えるまたは８００を超える継代、世代または細胞倍加の間、培養されてもよい。幹細胞は、１００、２００、５００またはそれ以上の継代、世代または細胞倍加の間、維持されてもよい。
一部の実施形態では、各継代において細胞はＨＳ８と接触されてもよい。他の実施形態では、ＨＳ８は、選択された数の継代培養物のみにおいて、例えば、継代培養物の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％のうちの１つにおいて、培地中に存在していてもよい。
増殖された幹細胞は、培養物を播種するのに使用された最初の幹細胞の少なくとも１つの特性を保持しうる。幹細胞は、１回または複数回の継代後にこの特性を保持しうる。これらは、複数回の継代後にそのようにしうる。これらは、上記のような一定回数の継代後にそのようにしうる。
特性は、形態学的性質、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性などを含みうる。特性は、生物活性を含みうる。特に、幹細胞は、細胞表面マーカーなどの、特定の分子マーカーの発現、または発現の維持、によって特徴付けされうる。
マーカーの検出は、当技術分野において知られている任意の手段を通して、例えば、免疫学的に、達成されうる。組織化学的染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが使用されてもよい。
生物活性は、一定回数の継代後の細胞生存率を含みうる。細胞生存率は、多様な方法で、例えば、トリパンブルー排出法によって、試験されうる。生体染色のためのプロトコールは、以下の通りである。好適な容量（２０〜２００μＬ）の細胞懸濁液を適切なチューブに入れ、等量の０．４％トリパンブルーを添加して穏やかに混合し、室温で５分間置かせる。１０μｌの染色された細胞を血球計数器に入れ、生存（染色されていない）細胞および死滅した（染色された）細胞の数を計数する。それぞれの４分の１において染色されていない細胞の平均の数を算出し、２×１０４を乗算して細胞／ｍｌを求める。生存細胞の百分率は、死滅細胞および生存細胞の数で除算された生存細胞の数である。
細胞の生存率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
増殖された幹細胞は、幹細胞型の特性である、系列に分化する能力を保持しうる。特定の系列に分化させるための幹細胞の誘導の方法は、当技術分野において知られており、増殖された幹細胞の能力をアッセイするために使用されうる。増殖された細胞のすべてまたは実質的な部分は、この能力を保持しうる。これは、増殖された幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
増殖された幹細胞は、増殖の間または後に正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、幹細胞が由来した、またはそこから変化したがいかなる実質的な様式にもない、親幹細胞の核型と同一、類似、または実質的に類似の核型である。例えば、転座、染色体損失、欠失などのいかなる全体的異常もあってはならない。
核型は、いくつかの方法によって、例えば、光学顕微鏡法の下で視覚的に、評価されうる。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載のように調製および分析されてもよい。細胞は、標準的なＧバンド分染技術（Ｏａｋｌａｎｄ Ｃａｌｉｆ．にあるＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂなどのルーチン的核型分析サービスを提供する多くの臨床的診断学研究室で利用可能である）を使用して核型決定されてもよく、かつ公表されている幹細胞の核型と比較されてもよい。
増殖された細胞のすべてまたは実質的な部分は、正常な核型を保持しうる。この割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
培地
ＨＳ８（好ましくは単離されたＨＳ８）を含む培地は、いかなる種類であってもよいが液体またはゲルであることが好ましく、他の栄養素および増殖因子（例えば、ＦＧＦ−２）を含んでいてもよい。培地は、液体またはゲルへの再構成用の乾燥された形態、例えば、粉末（ｐｏｗｅｒｅｄ）形態で調製されてもよい。ＨＳ８は、好ましくは、微量でない量で存在することになる。例えば、培地中のＨＳ８の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ培地から約１０００ｎｇ／ｍｌ培地までの間の範囲に及びうる。好ましくは、培地中のＨＳ８の濃度は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、または５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つである。
ヘパラン硫酸の投与量
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の使用において、ＨＳ８は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つ；または約１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、または１ｍｇ以下の；または約０．３〜５μｇ／ｍｌ、０．３〜４、０．３〜３、０．３〜２．５、０．３〜２、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．９、０．３〜０．８、０．３〜０．７、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、１〜２、１〜１．７５、１〜１．５、１〜１．２５、１．２５〜２、１．５〜２、または１．７５〜２μｇ／ｍｌの間の濃度または投与量で使用されうる。
ＦＧＦ２
本明細書において、ＦＧＦ２は、（塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＦＧＦ−βとしても知られる）線維芽細胞増殖因子２を指し、これは、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。
ＦＧＦ２は、多くの組織の基底膜に存在し、シグナル刺激の非存在下において膜を結合したままであると考えられている。ＦＧＦ２は、創傷治癒、腫瘍発生および血管新生に関与していることが示されている。
ＦＧＦ２のチロシンキナーゼ受容体に対する結合は、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）の活性化および細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化に関与しているシグナルカスケードを刺激する（例えば、Ｏｋ−Ｊｉｎ Ｐａｒｋら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８５、（２０１０）３５６８〜３５７４を参照されたい）。
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＦＧＦ２のアミノ酸配列は、図２８に示される（ヘパリン結合ドメイン配列番号１に下線が引かれている）。この配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受託番号ＮＰ＿００１９９７．５（ＧＩ：１５３２８５４６１）の下で入手可能である。
本明細書において、「ＦＧＦ２」は、図２８に例示されるＦＧＦ２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のうちの１つの配列同一性を有するタンパク質またはポリペプチドを含む。
ＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの１つの配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するヘパリン結合ドメインも含むことが好ましい。
ＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドは、完全長のＦＧＦ２タンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートであってもよい。
ＦＧＦ２タンパク質は、任意の動物またはヒト、例えば、ヒト以外の動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスもしくは他のげっ歯動物（げっ歯目の中の任意の動物からを含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌ウシ、例えば、乳牛、またはウシ属の中の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ科の中の任意の動物を含む）、ロバ、およびヒト以外の霊長類または他のヒト以外の脊椎動物の生物；および／またはヒト以外の哺乳動物；および／またはヒトから、または由来であってもよい。
ＦＧＦ２の投与量
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の使用において、ＦＧＦ２は、ＨＳ８と組み合わせて使用されてもよい。本発明の一部の細胞培養法において、外因性のＨＳ２が培養物に添加される。ＦＧＦ２の好適な濃度または投与量は、約５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、９０ｎｇ／ｍｌ以下、８０ｎｇ／ｍｌ以下、７０ｎｇ／ｍｌ以下、６０ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、５ｎｇ／ｍｌ以下のうちの１つ；または約１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、３０ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、５ｍｇ以下、４ｍｇ以下、３ｍｇ以下、２ｍｇ以下、または１ｍｇ以下の；または約０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．１〜１．０、０．１〜１．５、０．１〜０．２．０、０．１〜２．５、０．１〜３．０、０．１〜３．５、０．１〜４．０、０．１〜４．５、０．１〜５．０ｎｇ／ｍｌの範囲の間を含む。
一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＨＳ８の使用は、外因性のＦＧＦ２の添加を排除する。例えば、本発明の一部の細胞培養法において、外因性のＦＧＦ２は、培養物に添加されない。
本発明は、記載の態様および好ましい特徴の組合せを含む。ただし、こうした組合せが明らかに許すことのできないまたは明白に回避される場合を除く。
本明細書中で使用される節の表題は、組織化目的のみのためのものであり、記載の対象事項を限定するものとして解釈されるものではない。
本発明の態様および実施形態は、例として、添付の図を参照しながら、ここで例示されることになる。さらなる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。この文中で言及されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれている。
本発明の原理を例示している実施形態および実験は、ここで、以下の通りである添付の図に関して述べられることになる。
０、２５、５０および１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の濃度におけるＦＧＦ２に対するＨＳ８の選択的な結合を示すグラフである。データ線は、グラフの上から下に、以下の通りである：ＨＳ８＋（５μｇ／ｍｌ）（三角形）、ヘパリン（５μｇ／ｍｌ）（正方形）、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８−（５μｇ／ｍｌ）、ＧＡＧなし（ひし形）。 ＦＧＦ２に対するＨＳ８（５μｇ／ｍｌ）の特異性を示すグラフである。データ線は、グラフの上から下に、以下の通りである：ＨＳ８＋／ＦＧＦ２（ひし形）、ＨＳ８＋／ＦＧＦ１、ＨＳ８−／ＦＧＦ２、ＨＳ８＋／ＦＧＦ７、ＨＳ８＋／ＢＭＰ２、ＨＳ８＋／ＶＥＧＦ、ＳＡＢ／ＦＧＦ２、ＨＳ８＋／ＰＤＧＦＢＢ。 ＨＳ８での処理に応答した、６日目のＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞の数における用量依存的な増加を示すグラフである。棒は、左から右に、以下を表す：対照、ＨＳ８＋ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ ５００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １０００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ ５０００ｎｇ／ｍｌ、ＨＳ８＋ １００００ｎｇ／ｍｌ。 ＨＳ８＋ ５０００ｎｇ／ｍｌ（正方形）および対照（ひし形）に応答した、６日にわたるＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞の増殖を示すグラフである。 ＦＧＦ２ヘパリン結合ドメインペプチドを示す表である。 図６Ａは、種々の量のペプチドについての１分あたりの放射能計数（ＣＰＭ）の図である。図６Ｂは、親和性クロマトグラフィーによるＨＳ８プルダウンの図である。 ＧＡＧ結合親和性アッセイの構成を例示する図である。 ＦＧＦ２に結合している種々のＧＡＧ濃度の最適化の図である。 ＦＧＦ２に結合している種々のＧＡＧを示すグラフである。 図１０Ａは、種々のタンパク質に結合しているＨＳ８（ＨＳ８＋）を示すグラフである。図１０Ｂは、種々のタンパク質に結合しているＨＳ８（−）を示すグラフである。 図１１Ａは、ＦＧＦ２最適化についてのヘパリンビーズアッセイを示すグラフである。図１１Ｂは、外因性のヘパリンとのヘパリンビーズ競合についてのヘパリンビーズアッセイを示すグラフである。図１１Ｃは、ヘパリンビーズアッセイにおける、種々のＧＡＧとの競合の百分率を示すグラフである。 図１２Ａは、それぞれの日のＳＴＲＯ１生存細胞計数を示すグラフである。図１２Ｂは、累積の細胞増殖のＳＴＲＯ１生存細胞計数を示すグラフである。 図１３Ａは、それぞれの日のＨＭ２１生存細胞計数を示すグラフである。図１３Ｂは、累積の細胞増殖のＨＭ２１生存細胞計数を示すグラフである。 図１４Ａは、それぞれの日のＳＴＲＯ１ ＨＭ２１生存細胞計数を示すグラフである。図１４Ｂは、累積の細胞増殖のＳＴＲＯ１ ＨＭ２１生存細胞計数を示すグラフである。 ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）によって評価される、ＦＧＦ２に対する種々のＧＡＧの結合能力を示すグラフである。ＨＳ８（ＨＳ８＋）画分は、ヘパリンとほぼ同様に、かつ未加工の出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８−のフロースルーよりも良好に、ＦＧＦ２を結合する。 ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）によって評価される、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）ＢＭＰ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦに対する種々のＧＡＧの結合能力を示すグラフである。（Ａ）Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、（Ｂ）ＨＳ８、（Ｃ）ＨＳ８− 画分、（Ｄ）ヘパリン。ＨＳ８（ＨＳ８＋）画分は、他のすべてのＨＢＧＦを超えて優先的に、かつヘパリンと同じくらい良好に、ＦＧＦ２を結合する。ＨＳ８−および未加工の出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、いずれのＨＢＧＦにもほとんど選択性を示さない。 ３６時間にわたるＢｒｄＵの取り込みによってモニターされる、ＨＳ８（ＨＳ８＋）に対するヒト間葉系幹細胞の用量反応を示すグラフである。ＦＧＦ２は、投与陽性対照として使用されている。ＨＳ８＋画分は、試験された他のＧＡＧよりも有意により多くの刺激を与える。 （日数で）表示されている時間にわたって（ＦＡＣＳに基づいた）Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ法によってモニターされる、ＨＳ８（ＨＳ８＋）（上）およびＦＧＦ２（下）に対するヒト間葉系幹細胞の用量反応を示すグラフである。ＦＧＦ２は、投与陽性対照として使用されている（下のグラフ）。ＨＳ８は、有意な刺激を与える。 （日数で）表示されている時間にわたって（ＦＡＣＳに基づいた）Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ法によってモニターされる、高くなっていく濃度の種々のＧＡＧに対するヒト間葉系幹細胞の用量反応を示すグラフである。ＨＳ８（ＨＳ８＋）は、より多い細胞数になる傾向がある。 （ＦＡＣＳに基づいた）Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ細胞計数法によってモニターされる、最高７回までの継代における高くなっていく濃度の種々のＧＡＧに対するヒト間葉系幹細胞の用量反応を示すグラフである。ＦＧＦ２単独は、最高の刺激を示す；両方の濃度のＨＳ８（ＨＳ８＋）は、ヘパリンと同様に、より多い細胞数になる傾向がある。 以下のマーカーに基づいた、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）幹細胞の代表的なＦＡＣＳ免疫表現型検査の結果の図である：陰性マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ。 以下のマーカーに基づいた、ｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）幹細胞の代表的なＦＡＣＳ免疫表現型検査の結果の図である：陽性マーカー：ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＴＲＯ−１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ４９ａ。 補助剤なし（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未加工のＣｅｌｓｕｓ ＨＳ（ＣＨＳ）、またはＦＧＦ２単独において７回の継代の間に増殖した、ＦＡＣＳで免疫表現型検査されたｈＭＳＣ幹細胞の定量表である。表は、以下の関連した細胞表面マーカーを発現している細胞の百分率を示している：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＲＯ−１。 補助剤なし（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未加工のＣｅｌｓｕｓ ＨＳ、またはＦＧＦ２（２．５ｎｇ／ｍｌ）単独における４から７回の継代から増殖した、ＦＡＣＳで免疫表現型検査されたｈＭＳＣ幹細胞のグラフである。ＣＤ４９ａ。 補助剤なし（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未加工のＣｅｌｓｕｓ ＨＳ、またはＦＧＦ２（２．５ｎｇ／ｍｌ）単独における４から７回の継代から増殖した、ＦＡＣＳで免疫表現型検査されたｈＭＳＣ幹細胞のグラフである。ＳＳＥＡ−４。 補助剤なし（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、未加工のＣｅｌｓｕｓ ＨＳ、またはＦＧＦ２（２．５ｎｇ／ｍｌ）単独における４から７回の継代から増殖した、ＦＡＣＳで免疫表現型検査されたｈＭＳＣ幹細胞のグラフである。ＳＴＲＯ−１。 図２４Ａは、補助剤なし（対照）、ヘパリン、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８−およびＨＳ８（ＨＳ８＋）を含む培地中で４から７回の継代（Ｐ４、Ｐ７）から増殖したｈＭＳＣの培養後のｈＭＳＣ ＣＦＵアッセイの培養プレートのグラフである。図２４Ｂは、補助剤なし（対照）、ヘパリン、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８−およびＨＳ８（ＨＳ８＋）を含む培地中で４から７回の継代（Ｐ４、Ｐ７）から増殖したｈＭＳＣの培養後のｈＭＳＣ ＣＦＵアッセイの培養プレートの顕微鏡写真である。 補助剤なし（対照）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）、ＨＳ８−、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ヘパリンおよびＦＧＦ２を含む培地中での４から７回の継代（Ｐ４、Ｐ７）から増殖したｈＭＳＣの培養後の、骨細胞（上、アリザリンレッド）および脂肪細胞（下、オイルレッドＯ）に分化するｈＭＳＣの能力を示す顕微鏡写真である。 通常の維持（対照）培地中、または異なる用量のＨＳ８（μｇ／ｍｌ）および一定用量のＦＧＦ−２（０．１５６ｎｇ／ｍｌ）を含む培地での培養後のｈＭＳＣの細胞数を示すグラフである。ＨＳ８は、ＦＧＦ−２媒介性のＭＳＣの増殖を促進する。 ＨＳ８および／またはＦＧＦ−２での刺激後３０分および２４時間におけるＥＲＫ１／２リン酸化およびＦＲＳ２ａリン酸化を示しているウエスタンブロットの図である。ＨＳ８は、ＦＧＦ−２シグナル伝達を持続させる。 ヒトＦＧＦ２のアミノ酸配列の図である。配列番号１は、下線で示されている。 Ｅ１０神経上皮からのヘパラン硫酸（ＨＳ２）の亜硝酸由来の二糖組成の図である。放射標識されたＨＳは、低ｐＨのＨＮＯ２で脱アミノ切断によって解重合された。二糖は、ＧＡＧのＨＮＯ２処理後に単離され、次いで、その試料は、１×１２０ｃｍのＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２カラムに流された。結果として生じた二糖は、ＳＡＸ−ＨＰＬＣによって分画された。二糖組成および次いで各試料中の百分率組成を出すために、ピークの下面積は積分された。 Ｅ１０神経上皮からのヘパラン硫酸（ＨＳ２）のヘパリンリアーゼ処理後の二糖組成の図である。ヘパラン硫酸は、ヘパランリアーゼの混合物で完全に解重合された。結果として生じた不飽和の二糖は、Ｐ−２カラム上で単離され、強力な陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画された。各試料中の各二糖の百分率を算出するために、結果として生じた各曲線の下面積は積分された。数字は、（最初のＧＡＧ試料については）２回の流動および（２．３Ｄ由来の試料については）３回の流動の平均を表す。９７％を超える二糖が、各試料から回収された。 Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３（Ｄ２Ｏ溶液）の１Ｈ ＮＭＲの図である。 Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３（Ｄ２Ｏ溶液）の１Ｈ ＮＭＲのクローズアップの図である。 ５０ｍＭアンモニウム酢酸で溶出された２×Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラム上で分離された、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ ＃１０６９７およびＨＳ８のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラムの図である。 ヘパラン硫酸：Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ ＃１０６９７；保持されていないＢＭＰ２（８４８／ＨＳ３／００１）；保持されたＢＭＰ２（ＨＳ３）（８４８／ＨＳ３／００１）；最初の流動（ＨＳ３−００１−０１）；最後の流動（ＨＳ３−００１−０２）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラムの図である。ＨＳ３製剤は、約１５ｍｌで高いピーク（０．０６〜０．０８）を示す。 ＣｅｌｓｕｓからのＨＳ製剤ＨＳ ＃１０６９７およびＨＳ ＃１０５９５のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩの図である。ヘパリンリアーゼ消化は、２通りずつで行われた。縦線は、２よりも大きい重合度（ｄｐ：ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）での二糖およびオリゴ糖の溶出についてのカットオフを示す。 ５０ｍＭアンモニウム酢酸で溶出された、２×Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅカラム上での、ＨＳ８（１８〜２０ｍｌにある広いピーク）、ＨＳ３−００１−０１（１９〜２０ｍｌにあるピーク）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩクロマトグラムの図である。 ヘパリン結合配列番号１を示すグラフである。 固定化されたヘパリンを結合するＨＳ８の能力を示すグラフである。 親和性クロマトグラフィー（配列番号１で誘導体化されたカラム）によって精製されたＨＳ８を結合するＦＧＦ−２の能力を示すグラフである。これは、未加工の出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭブタ粘膜）、または糖なしの対照、との結合と比較された。 ＨＳ８の存在下におけるプラスチック接着性間葉系幹細胞の６日にわたる増殖を示すグラフである。 未加工のＣｅｌｓｕｓ出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭ）、または非結合ＨＳフロースルー（ＨＳ８−）と比較した、単離されたＨＳ８の存在下におけるＳＴＲＯ−１単離間葉系幹細胞のＢｒＤＵによって測定されるような３６時間にわたる増殖を示すグラフである。 Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳについての標準化された二糖組成を示すグラフである。 ＨＳ３についての標準化された二糖組成を示すグラフである。 Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、ＨＳ８およびＨＳ３の二糖組成を示すグラフである。 Ｃｅｌｓｕｓ、ＨＳ、ＨＳ３およびＨＳ８の百分率二糖組成を示す表である。 ＨＳなし、ヘパリン、ＨＳ８、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（ＨＳＰＭ）またはＨＳ８−の存在下におけるＦＧＦ−２の安定性を示すグラフである。ＦＧＦ−２は、ＨＳ８の存在下で安定化される。 ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ１阻害剤）が、ＨＳ８刺激されたｈＭＳＣの増殖を抑止することを示すグラフである。 ＩＭＢ−Ｒ１（ＦＧＦＲ１中和抗体）が、ＨＳ８刺激されたｈＭＳＣの増殖を阻害することを示すグラフである。 ＩＭＢ−Ｒ１（ＦＧＦＲ１中和抗体）が、ＨＳ８刺激されたｈＭＳＣの増殖を阻害することを示すグラフである。 ＦＧＦ２中和抗体が、ＨＳ８刺激されたｈＭＳＣの増殖を阻害することを示すグラフである。 ＨＳ８補助培地で増大されたヒトＭＳＣは、よりクローン原性（ｃｌｏｎｅｇｅｎｉｃ）（３名の別々のドナー）であることを示すグラフである。 ＨＳ８が、ラットの極めて重要な大きさの頭蓋冠欠損モデルにおいて骨創の治癒を有意に促進することを示すグラフおよびマイクロＣＴ分析である。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、例として、本発明を実施するために本発明者らによって意図される最良の様式の特定の詳細を含む、以下の付随的な説明に記載される。本発明が、これらの特定の詳細に限定されることなく実施されうることは、当業者には明らかであろう。
本発明者らは、診療所において直ちに使用されうるヘパラン硫酸（ＨＳ）製剤のスケールアップに適した市販のブタＣｅｌｓｕｓヘパラン硫酸供給源からの新規ＦＧＦ２結合ＨＳの精製を調べた。
ＦＧＦ２からのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）ペプチド配列ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ［配列番号１］が選択され（Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｇａｎｄｈｉ ＮＳおよびＭａｎｃｅｒａ ＲＬ．、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．２００８ Ｄｅｃ；７２（６）：４５５〜８２）、ＦＧＦ２に結合する特異的なＨＳ種を精製するために使用された。
ペプチドを合成すると、それは、３Ｈヘパリンアッセイにかけられ、用量依存的な様式でニトロセルロース膜に吸収されたペプチドに対する３Ｈヘパリンの特異的結合が３Ｈヘパリンの全計数と比較された。一度ＦＧＦ２−ＨＢＤペプチドに対する３Ｈヘパリンの特異的結合が示されると、そのペプチドは、親和性クロマトグラフィーによってＦＧＦ２に結合するブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳから特異的なＨＳをプルダウンするために使用された。この新しいＨＳ種は、ＨＳ８と命名された（かつ別名ＨＳ８Ｇが与えられた）。
ＨＳ８は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合プレートでＦＧＦ２との結合におけるその特異性について分析され、ＦＧＦ２に対するＨＳ８の特異的な結合が、ヘパリン、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８陰性画分と比較して測定された。
ＧＡＧは、ＧＡＧ結合プレート（５μｇ／ｍｌ）上に播種され、一晩、およびその後、組換えヒトＦＧＦ２（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）と共に、インキュベートされ、ＦＧＦ２に対するＧＡＧの結合の特異性を確認するためにＥＬＩＳＡ法が使用された。
結果は、ＨＳ８が、他のＧＡＧ種と比較して、ＦＧＦ２により多く結合することを明白に示した（図１）。ＦＧＦ２を結合するＨＳ８の能力は、他の増殖因子（ＶＥＧＦ、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ１、およびＦＧＦ７）に対して比較され、これは、ＨＳ８がＦＧＦ２に特異的であることを明らかにした（図２）。
ＨＳ８の生理活性を決定するために、ＨＳ８は、ＳＴＲＯ１ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞増殖アッセイにもかけられた。本発明者らは、ＨＳ８を、独立の培地補助剤として、異なる用量（５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌおよび１００００ｎｇ／ｍｌ）で、短期間のｈＭＳＣの増殖において、コントロールと比較して使用した。外因性の増殖因子のいかなる添加もなしで、本発明者らは、ＨＳ８を用いたｈＭＳＣの用量依存的な増殖を認めた（図３および４）。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨形成、軟骨形成、脂肪形成、筋原性および他の系列に分化するように誘導されうるプラスチック接着性細胞として広範に定義され、最近、名称「多分化能間葉系間質細胞」も、ＭＳＣに対して、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｚｕｌｍａら、２０１１）によって案出された。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、皮膚組織、椎間板、羊水、多様な歯組織、ヒト胎盤および臍帯血において見出されている（Ｓｉら、２０１１およびＺｕｌｍａら、２０１１）。ＭＳＣの治療可能性は、認識されており、骨組織再生および非骨格組織再生などの多くの臨床的適用において使用されてきた。近年、ＭＳＣの免疫抑制性および抗炎症性の効果が記載された。これは、低レベルの主要組織適合複合体−Ｉ分子（ＭＨＣ−１）をそれらの細胞表面上で発現すること、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の両方の活性化および増殖を抑制する能力、および損傷した組織を保護しながら傷害を受けた組織の微小環境を改変することによる、ＭＳＣの弱い免疫原性に起因する（Ｓｉら、２０１１およびＺｕｌｍａら、２０１１）。ＧＶＨＤを治療するために有効に（ａｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ）使用されうる、このＭＳＣによって媒介される免疫抑制は、機序における種間変動を有する（Ｒｅｎら、２００９およびＳｈｉら、２０１０）。サイトカイン感作マウスＭＳＣは、一酸化窒素（ＮＯ）によって媒介され、サイトカイン感作ヒトＭＳＣは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を通して行われた。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸グルコサミノグリカン（ＨＳＧＡＧ）
ヘパリンは、肥満細胞で産生、貯蔵され、それと比較して、ＨＳＧＡＧは全ての動物組織において見出され、ＨＳ鎖が細胞表面またはＥＣＭタンパク質に結合したプロテオグリカンとして存在する。ＨＳは、代謝、輸送、情報伝達、細胞接着、細胞の増殖および分化に影響を及ぼし、全ての器官系を支持する（Ｂｉｓｈｏｐら、２００７およびＧａｎｄｈｉら、２００８）。ヘパリンおよびＨＳは、反復ウロン酸−（１→４）−Ｄ−グルコサミン二糖サブユニットからなる直鎖多糖である。ウロン酸は、Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のいずれかでありうる。さらに、特定の位置における修飾により、異なるＮ−硫酸化複合体配列、Ｏ−硫酸化複合体配列およびＮ−アセチル化複合体配列が生じる［Ｏｒｉら、２００８］。ヘパリン内の最も豊富な二糖はＩｄｏＡ（２Ｓ）−（１→４）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）であり、したがって、鎖長全体を通して高度に負に荷電しており、それにより、ヘパリンのタンパク質との結合における選択性がわずかになる、またはなくなる。他方では、ＨＳは硫酸化されていないＧｌｃＡ−（１→４）−ＧｌｃＮＡ二糖を最も一般的な形態として有し、これにより、硫酸化されていないＮＡドメインの分離したブロックと高度に硫酸化されたヘパリン様ＩｄｏＡ−（１→４）−ＧｌｃＮＳ二糖（ＮＳドメイン）のブロックとが生じる。ＮＡドメインおよびＮＳドメインはＮＡ／ＮＳ移行ドメインによって分離されている。このＨＳ構造の多様性が広範囲の生物学的機能に関与する。
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質およびヘパリン結合ドメイン
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヒトでは２２種のメンバーで構成されるポリペプチド増殖因子の大きなファミリーである。ＥＧＦは、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）として公知のＦＧＦ細胞表面受容体チロシンキナーゼのサブファミリーに結合し、それを活性化することにより、発生、分化、細胞増殖、血管新生および創傷治癒において主要な役割を果たす（Ｏｒｎｉｔｚら、１９９６）。さらに、ＦＧＦは、最もよく研究されているヘパリン結合タンパク質の中に入り、また、ＨＳＧＡＧはＦＧＦＲとの分子会合を導くことによってＦＧＦシグナル伝達を調節する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ、２００１）。さらに、ＦＧＦＲ１によるＦＧＦ２シグナル伝達はＭＳＣ増大のために重要である（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９９）。
ヘパリン／ＨＳとＦＧＦ２の相互作用
種々の試験により、タンパク質のヘパリン／ＨＳ結合部位の一般的な構造的特徴が理解されてきた（Ｇａｎｄｈｉら、２００８；Ｈｉｌｅｍａｎら、１９９８およびＯｒｉら、２００８）。１９８９年にＣａｒｄｉｎおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂが２１種のヘパリン結合タンパク質の分析後にヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を決定するための最初の試みを行い、典型的なヘパリン結合部位が配列ＸＢＢＸＢＸまたはＸＢＢＢＸＸＢＸ（ここで、Ｂは正に荷電したアミノ酸（アルギニン、リシンおよびまれにヒスチジン）であり、Ｘはハイドロパシー残基である）を有する可能性があることを提唱した。次のコンセンサス配列ＴＸＸＢＸＸＴＢＸＸＸＴＢＢは、１９９８年にＨｉｌｅｍａｎらにより、いくつかのタンパク質に関するＸ線およびＮＭＲの比較後に導入された。この配列では、Ｔは回転を定義し、Ｂは塩基性アミノ酸（アルギニンまたはリシン）であり、Ｘはハイドロパシー残基である。
ＧＡＧと、正に荷電した塩基性アミノ酸がヘパリン鎖上の負に荷電した硫酸基またはカルボキシレート基とイオン結合を形成したタンパク質との間に強力なイオン性相互作用が予測される。それらの役割は、ヘパリンとの、および場合によって、ＮＳドメインのようなＨＳ内の高度に硫酸化された領域との相互作用の決定因子としてのものである（Ｆｒｏｍｍら、１９９７およびＯｒｉら、２００８）。さらに、他の種類の結合、すなわち、ファンデルワールス力、水素結合および疎水性相互作用が存在する。これらの結合は、中性アミノ酸も必要なより不均一のＨＳとの相互作用のために役立つ（Ｆｒｏｍｍら、１９９７およびＯｒｉら、２００８）。ＦＧＦ２について考えると、アミノ酸のグルタミンおよびアスパラギンが、イオン結合に加えて、糖のヒドロキシル基と水素結合を形成することによってＨＳとの相互作用に重要な役割を果たす（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）。
これまでに公開された多数の試験によると、ＦＧＦ２のヘパリン結合ドメインとして種々のペプチド配列が存在し、それらは表１にまとめられている。本明細書では、完全なＦＧＦ２配列（２８８ａａ）に従ってアミノ酸が番号付けされた番号付け系が採用される。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
造血細胞移植（ＨＣＴ）は、同種異系ＨＣＴ手技が毎年増加している、血液学的悪性疾患を治療するために使用される集中的な療法である（Ｆｅｒｒａｒａら、２００９）。ＨＣＴの主要な合併症は、主に胃腸管、肝臓、皮膚、および肺に影響を及ぼす免疫学的障害であるＧＶＨＤである。Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ、１９６６〜６７年によると、ＧＶＨＤが生じるには３つの要件、すなわち、１）移植片がＴリンパ球である免疫学的コンピテント細胞を含有しなければならないこと、２）レシピエントが移植ドナーには存在しない組織抗原を発現しなければならないこと、および３）患者が移植された細胞を消滅させるために有効な反応を開始することができてはいけないこと、が満たされるはずである。ＧＶＨＤの病態生理は、骨髄破壊的な前処置レジメンを使用して宿主の欠陥が生じた骨髄を除去すると開始される。損傷した組織によってサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１、ＬＰＳ）が産生されるので、宿主の抗原提示細胞が活性化される。この段階で同種異系ＨＣＴが実施されると、ドナーＴ細胞が活性化され、それにより、より多くのサイトカインが産生され、それにより細胞性および炎症性の反応が導かれ、その結果ＧＶＨＤが生じる。非造血幹細胞；ＭＳＣは、それらの強力な免疫抑制性に起因して同種異系Ｔ細胞応答を低下させ、ＧＶＨＤを改善することができる（Ｌｅ Ｂｌａｎｃら、２００８；Ｍｅｕｌｅｍａｎら、２００９およびＴｏｕｂａｉら、２００９）。
治療目的でのｈＭＳＣのスケールアップの必要
細胞に基づく療法においてｈＭＳＣを使用することの主要な欠点は、すでに診療所で使用されているにもかかわらず十分な細胞数を得ることが難しいことある。骨髄単核細胞の０．０１％〜０．０００１％までの少なさでありうる少数のｈＭＳＣにより、その広範にわたる使用が妨げられる。Ｃａｐｌａｎ、２００９によると、彼らは、異なる年齢のドナーから骨髄を得、分散させ、培養フラスコに置き、後でＣＦＵ−Ｆを計数し、年代に対する有核骨髄細胞あたりのＭＳＣによって示した。有核骨髄細胞あたりのＭＳＣの注目すべき減少が観察され、出生から十代までで１０分の１に減少し、十代から高齢まででさらに１０分の１に減少した。明らかに年齢とともに骨髄中のＭＳＣの数が減少する。さらに、Ｃａｐｌａｎは、これらの減少が、観察される若年のおよび成人の骨折治癒速度と並行することを指摘した。比較すると、骨髄中の造血幹細胞の力価は有核骨髄細胞１０４個あたり１であり、個体の年齢全体を通して一定のままであった。
現行のｈＭＳＣの増大方法
研究者は、ｈＭＳＣの培養において骨髄の微小環境を模倣することができれば、臨床使用のための治療的な数のｈＭＳＣを実現されうると考えた。基本的に、模倣は、２つの広範なやり方、すなわち、ＥＣＭを用いてｈＭＳＣを増殖させること、および外因性増殖因子の補充を用いてｈＭＳＣを増殖させることによって実現されうる。ＥＣＭ基材を使用する場合、ｈＭＳＣ結合および累積的な細胞数の増加が観察されたが（Ｇｒｕｎｅｒｔら、２００７およびＭａｔｓｕｂａｒａら、２００４）、増大した細胞は幹細胞性を欠いた（Ｃｏｏｌら、２００５）。さらに、ＦＧＦ２が外因性増殖因子補助剤として一般に使用され、同様に、標準の培地を用いた対照と比較して顕著な細胞数の増幅が示された（Ｌｉｎｇら、２００６およびＳｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕら、２００６）。ＥＣＭ基材を用いて増殖させた細胞と一致して、ＦＧＦ２を用いて増殖させた細胞でも分化した前駆細胞の量が対照における多分化能ｈＭＳＣと比較して増加した（Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９９およびＷａｌｓｈら、２０００）。したがって、幹細胞性に悪影響を及ぼすことなく治療的な数のｈＭＳＣを実現することができるｈＭＳＣの増殖を促す分子の同定には、ＧＶＨＤを緩和するための骨再生および骨髄移植のためのｈＭＳＣの臨床使用に大きな見込みが示される。
ＨＳ ＧＡＧは、細胞の幹細胞性に影響を及ぼすことなくｈＭＳＣの増殖を改善する
Ｎｕｒｃｏｍｂｅらは、１９９３年に、マウス神経前駆細胞に対するＦＧＦの活性はＨＳ ＧＡＧによって調節され、この相互作用がＦＧＦ２とそれらの受容体の結合に必要であることを示した。さらに、ＨＳＧＡＧとＦＧＦの結合には有意差があり、９日目にはこれらの細胞によって産生されるＨＳ ＧＡＧはＦＧＦ２に優先的に結合し、１１日目までに、ＨＳＧＡＧの結合はＦＧＦ１にシフトした。さらに、これらの独特のヘパラン硫酸は、神経前駆細胞上の細胞表面受容体との相互作用することによってＦＧＦ２と特異的な受容体との結合を媒介する（Ｂｒｉｃｋｍａｎら、１９９５）。１９９８年に、Ｂｒｉｃｋｍａｎらは、不死化した胎齢１０日のマウス神経上皮２．３Ｄ細胞から２つの別々のＨＳプールを単離し、特徴付けることによってこれらの所見をさらに裏付けた。一方のプールは対数増殖期の細胞に由来するものであり、ＦＧＦ−２の活性を増大させた。他方のプールは接触阻止および分化を受けている細胞由来であり、ＦＧＦ１を優先した。我々の研究室によって以前に記載されている通り、ＨＳ２という名称の胚性ＨＳ ＧＡＧ製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで移植した場合にマウスにおいて多分化能を著しく失うことなくｈＭＳＣの増殖を増加させ、骨形成の増加を導いた。この証拠は、ＥＣＭ成分ＨＳ ＧＡＧが多分化能に悪影響を及ぼすことなくｈＭＳＣの増殖を改善することを示唆している。したがって、ＨＳ２と比較して、臨床環境での使用のために容易にスケーラブルでありうる、ＦＧＦ２に対して高い結合親和性を有し、細胞の増殖に対するＦＧＦ２の活性を強化するＨＳバリアントが特に必要とされている。
結果
ＦＧＦ−２に対する結合親和性が高いヘパラン硫酸のカラムクロマトグラフィーによる単離（ＨＳ８）
診療所において容易に使用されうるＨＳ製剤をスケールアップするために、ＦＧＦ２結合ＨＳ２を精製する戦略に沿って、市販のブタＣｅｌｓｕｓヘパラン硫酸供給源（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ、ＵＳＡ）から別のＦＧＦ２結合ＨＳを精製する可能性を探求した。表１に示されているこれらのペプチド配列のうち、ＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤと命名された１５７ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ１７２（Ｇａｎｄｈｉら、２００８）を使用した。
［３Ｈ］ヘパリンアッセイ
ペプチドを合成した際に、それらを３Ｈヘパリンアッセイに供し、ＦＧＦ２−ＨＢＤ−ペプチドのヘパリンに結合する能力を試験した。既知量のペプチドまたは飽和量のペプチドを同一のニトロセルロース膜上で乾燥した。ます風乾し、次いで真空乾燥器中、８０℃で４５分さらに乾燥した。次いで、膜を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、計数バイアル中、４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ中０．１μＣｉの［３Ｈ］ヘパリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）と共に１６時間インキュベートした。その後、膜を洗浄し、放射活性をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒによって決定した。
既知量のペプチド（配列番号１）を使用した場合、これらは用量依存的にＣＰＭの増加を示した。ＢＭＰ２−ＨＢＤを陽性対照として使用した［図６（Ａ）］。しかし、最も高い計数は、ニトロセルロース膜が５００μｇ／ｍｌのペプチド溶液中に飽和したものであった場合に示された。５００μｇ／ｍｌの溶液レベルの各ペプチドについてニート［３Ｈ］ヘパリンのうちのＣＰＭの百分率を算出した。ＢＭＰ２−ＨＢＤ（７．２％）が最も高く、その次にＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤ（４．９７％）であった。［３Ｈ］ヘパリンアッセイから得られた結果に従って、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＧＦ２−Ｇａｎｄｈｉ−ＨＢＤを使用して、ブタＣｅｌｓｕｓ ＨＳ由来のＦＧＦ２に対する高い親和性結合性ＨＳ（ＨＳ８）をプルダウンした。クロマトグラムが図６（Ｂ）に示されている。
ＨＳ８の特徴付け
ＧＡＧ結合親和性アッセイ
ＨＳ８を、９６ウェルＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、ＵＫ）を用い、ＦＧＦ２および他のタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との結合におけるその親和性に供し、ＨＳ８＋のＦＧＦ２との特異的な結合をヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）およびＨＳ８陰性画分と比較して測定した。ＧＡＧＳをＧＡＧ結合プレート（２．５〜１０μｇ／ｍｌ）上に播種し、一晩置き、標準のアッセイ緩衝液（ＳＡＢ）中０．２％のＦｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。
次いで、０〜１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ２、ウェルあたり２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートし、その後、２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化一次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウェルあたり２００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。次のステップでは、プレートを２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ）、ウェルあたり２００μｌと共に３７℃で３０分インキュベートした。一晩インキュベーションからこのステップまで、各ステップの間にプレートをＳＡＢで３回洗浄した。最後に、ＳｉｇｍａＦＡＳＴ ｐ− Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）、ウェルあたり２００μｌと共に４０分インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度をＶｉｃｔｏｒ３ １４２０ ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって読み取った。
試験した３種の濃度（２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）の全てにおいて全てのＧＡＧのＦＧＦ２との結合が、ＦＧＦ２の量が増加するとともに同様に増加し、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２で飽和に達した（図８）。異なるＧＡＧをＦＧＦ２との結合に関して試験した場合、結果は、ＨＳ８＋が、他のＧＡＧ種と比較して、ＦＧＦ２に対して最も高い結合の親和性を有することを明白に示した（図９）。１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２ポイントにおけるＣｅｌｓｕｓ ＨＳ：ＨＳ８＋の差異の倍率を比較した場合、比は１；１．５１であった。
次いで、ＨＳ８＋画分およびＨＳ８（−）画分の異なるタンパク質に結合する能力を試験した（図１０）。ＨＳ８＋は、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦＢＢ、ＦＧＦ１、およびＦＧＦ７と比較してＦＧＦ２との結合に高い親和性を有する［図１０（Ａ）］。他方では、ＨＳ８（−）画分は、他のタンパク質と比較してＦＧＦ１との結合に最大の親和性を有する［図１０（Ｂ）］。
種々のＧＡＧの、ヘパリンとＦＧＦ２について競合する能力を、Ｏｎｏら、１９９９により改変されたこのアッセイで試験した。既知濃度のＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と異なる濃度のＧＡＧをマイクロチューブ中、室温（ＲＴ）で３０分混合した。
このビーズ溶液［２０μｌのヘパリン−アガロースビーズ（Ｉ型、Ｓｉｇｍａ）およびポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］４０μｌを添加し、ＲＴで３０分混合した。ヘパリンビーズを、遠心分離により（２０００ｒｐｍ、１分）、ＢＳＡ−ＰＢＳ（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を用いて３回、およびＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、各チューブに１：５００ ビオチン化抗ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌを添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。上記の通り洗浄した後、１：１０のＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌを添加し、ＲＴで３０分混合した。停止液（２ＮのＨ２ＳＯ４、５０μｌ）を加え、遠心分離後の上清１００μｌを９６ウェルプレートに移した。４５０ｎｍでの吸光度をＶｉｃｔｏｒ３ １４２０ ｍｕｌｔｉ ｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒによって読み取った。
まず、添加したヘパリンビーズの量との結合に必要なＦＧＦ２の量をＦＧＦ２最適化によって測定し、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２用量を実験の次のセットのために選択した［図１１（Ａ）］。
次いで、競合アッセイにおいて使用するＧＡＧの範囲を得るために、まず、種々の量のヘパリンを使用した。ヘパリン５０μｇの添加が内部のヘパリンのビーズへの結合と競合させるためにほぼ十分であった［図１１（Ｂ）］。したがって、０〜５０μｇの範囲のＧＡＧＳを競合アッセイにおいて使用した［図１１（Ｃ）］。競合の百分率を考慮した場合、ヘパリンは、５０μｇを添加した場合に最も競合的であり、これは約１３％に達し、その後、ＨＳ８＋、４３％、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、５０％およびＨＳ８（−）、６３％と続いた。
増殖アッセイ
このアッセイでは、２１歳のラテンアメリカ系男性ドナーに由来するｈＭＳＣの２種の変形を使用した。ＳＴＲＯ１陽性細胞を磁気活性化細胞選別によって単離し（５〜７回の継代）、ＨＭ２１細胞を従来のプラスチック接着性によって単離した（５回の継代）。細胞を、１ｃｍ２あたり細胞３０００個の播種密度で播種し、２４時間にわたってプレートに結合させた。次いで、異なる濃度のＨＳ８＋を独立の培地補助剤として５０〜１００００ｎｇ／ｍｌで使用し、陽性対照として、２．５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を培地に添加した。２日または３日で培地交換を実施した。培地交換を２日毎に行ったＳＴＲＯ１細胞では、漸増濃度のＨＳ８＋に伴って生細胞計数が増加し、６日目までに、対照と比較して、５０００ｎｇ／ｍｌにより最も高い計数が得られた（図１２）。比較すると、培地交換を３日毎に行ったＨＭ２１細胞は、６日目までに、１００００ｎｇ／ｍｌで対照と比較してわずかに高い計数を示した（図１３）。
２種の細胞型を用いた生細胞計数において有意差が認められたので、５回継代したＳＴＲＯ１細胞およびＨＭ２１細胞を用いて６日間増殖アッセイを行い、培地交換を３日毎に行った対照と比較した。ＳＴＲＯ１はＨＭ２１細胞と比較してわずかに高い増殖計数を示したが、どちらの細胞型においても、対照および処理された細胞はほぼ同じ細胞計数をもたらした［（図１４（Ａ）］。次いで、ＳＴＲＯ１細胞、６日目の１ｃｍ２あたりの細胞計数を、培地交換の時間間隔が異なる以前の実験からのデータに基づいて算出した［図１４（Ｂ）］。興味深いことに、対照と処理された細胞のどちらにおいても、培地交換を２日毎に実施した場合、３日毎と比較して多くの細胞計数がもたらされた。さらに培地交換を２日毎に実施した場合、処理された細胞計数が処理されていない対照よりも多かった。
概要
配列１５７ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ１７２を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより、Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳから、ＦＧＦ２に高い親和性で結合するＨＳ（ＨＳ８）を調製した。
グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アッセイ結果では、ＨＳ８＋が他のＧＡＧ種と比較してＦＧＦ２との結合の最も高い親和性を有することが示された。さらに、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２ポイントにおけるＣｅｌｓｕｓ ＨＳ：ＨＳ８＋の差異の倍率は、比率が１；１．５１であった。競合の百分率を検討したヘパリンビーズ競合アッセイでは、ヘパリンは、５０μｇを添加した場合に最も競合的であり、約１３％に達し、その後、ＨＳ８＋、４３％、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ、５０％およびＨＳ８（−）、６３％と続いた。磁気活性化細胞選別によって単離したＳＴＲＯ１＋ｈＭＳＣおよび従来のプラスチック接着性によって単離したＨＭ２１ ｈＭＳＣを細胞増殖アッセイに使用し、ＨＳ８＋を独立の培地補助剤として５μｇ／ｍｌの濃度で使用した場合、および２日毎に培地交換した場合に高い細胞計数が得られた。結論として、現在では、ＦＧＦ２に対して高い結合親和性を有し、ｈＭＳＣを増殖する能力を増大させる、ＦＧＦ２に対する高い結合親和性ヘパラン硫酸（ＨＳ８）を市販のヘパラン硫酸供給源のプールから首尾よく単離した。
結論として、現在では、市販のヘパラン硫酸供給源のプールからＦＧＦ２に対する高い結合親和性ヘパラン硫酸（ＨＳ８）を首尾よく単離しており、これがヘパリンを含めた他のＧＡＧと比較して高い結合能を有することを示した。さらに、ＨＳ８＋は、独立の培地補助剤として使用した場合、培地交換を２日毎に行った場合に細胞増殖を増加させる。したがって、これらの細胞をＦＧＦ２に対して高い親和性を有するように工学的に操作したヘパラン硫酸（ＨＳ８）中で培養することによって、高品質のｅｘ ｖｉｖｏで増大させたＭＳＣの必要性に対処したと考える。
さらなる試験
ＦＧＦ２に特異的なＨＳ（ＨＳ８）の単離
ＦＧＦ２に対する高い結合親和性ＨＳであるＨＳ８の単離を首尾よく実現したが、他のＦＧＦ２ ＨＢＤペプチド配列（表１）をＬｅｅら、２００７に従って［３Ｈ］ヘパリンアッセイ、ＧＡＧ 結合アッセイおよび細胞結合アッセイによってさらに試験する。
結合親和性アッセイ
ＨＳ８の結合親和性は、すでにＧＡＧ結合プレートによって確認されており、これをドットブロットアッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００との動力学的結合（Ｃａｉｎら、２００５）によってさらに検証する。
競合アッセイ
ＥＬＩＳＡ法からの結果をウエスタンブロット法によってさらに確認する。
増殖アッセイ
増殖アッセイの結果を、より多くのｈＭＳＣ株を使用し、また細胞の継代数も減らしてさらに検証する。さらに、ＢＲＤＵ試薬（Ｒｏｃｈｅ）およびＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用することによって短期増殖アッセイを行う。
二糖分析
Ｍｕｒａｌｉら、２００９に従って陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＨＳ８の二糖分析を行い、ＨＳ８の組成が明らかになり得る。
ＦＧＦ２の安定性
安定性アッセイをＳＹＰＲＯアッセイおよびＦＧＦ２ ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイとして行う。ＳＹＰＲＯアッセイでは、ＦＧＦ２タンパク質とＧＡＧの相互作用を特異的なＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ色素によるタンパク質の変性温度として測定する（Ｕｎｉｅｗｉｃｚら、２０１０）。細胞培養物中のＦＧＦ２濃度を測定するために、ＦＧＦ２ ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイを製造者の推奨（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ、ｃａｔ ｎｏ．ＤＦＢ５０）の通り行う。結果が図４６に示されている。
ｉｎ−ｖｉｔｒｏでＨＳ８を用いて増殖させたｈＭＳＣの生物活性の確認
多分化能を、プラスチック接着性、骨形成性組織、脂肪形成性組織および軟骨形成性組織への分化、ならびに表面マーカーに関するＦＡＣＳについて確認する（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００６）。骨髄穿刺液ならびにＨＳ８を用いてまたは用いずに増大させたｈＭＳＣからＣＦＵ−Ｆアッセイを実施する（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２およびＧｕｉｌｌｏｔら、２００７）。ｈＭＳＣの免疫調節活性を混合Ｔリンパ球アッセイによって評価する。
ｉｎ−ｖｉｖｏでＨＳ８を用いて増殖させたｈＭＳＣの生物活性の確認
単離し、ＨＳ８の存在下で増殖させた細胞をマウス骨再生モデル（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏら、２０１０）において使用し、また、ＧＶＨＤの異種間ヒトＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデル（Ｔｉａｓｔｏら、２００７およびＴｏｕｂａｉら、２００９）に置いても使用する。
ＦＧＦ２に対する種々のＧＡＧの結合能力は、ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）を使用して評価された。ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）ＢＭＰ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦに対する種々のＧＡＧの結合能力もまた、ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ）を使用して評価された。使用される材料および方法は、以下に記載されている。
ＨＳ８は、ヘパリンとほぼ同様に、かつ未加工の出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ８−フロースルー画分よりも確実に良好に、ＦＧＦ−２を結合することが見出された（図１５）
ＨＳ８（ＨＳ８＋）は、試験された他のすべてのＨＢＧＦを超えてＦＧＦ２を優先的に結合し、ＦＧＦ２に対してヘパリンよりも高い結合能力を有する、すなわち、ＨＳ８は、ＦＧＦ２に特異的な結合を示す。ＨＳ８−および未加工の出発Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳは、試験されたＨＢＧＦのいずれにもほとんど選択性を示さなかった（図１６）。
材料
１．標準アッセイバッファー（ＳＡＢ） − １００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
２．ブロッキングバッファー − ０．４％アイシングラス（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３．ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、ＵＫ）
４．Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからのタンパク質：ＢＭＰ２−カタログ番号３５５ＢＭ、ＦＧＦ１−カタログ番号２３１ＢＣ、ＦＧＦ２−２３３ＦＢ、ＦＧＦ７−カタログ番号２５１ＫＧ、ＰＤＧＦ ＢＢ−カタログ番号２２０ＢＢ、ＶＥＧＦ−カタログ番号２９３ＶＥ
５．Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗体：ＢＭＰ２−カタログ番号ＢＡＭ３５５２、ＦＧＦ１−カタログ番号ＢＡＦ２３２、ＦＧＦ２−ＢＡＭ２３３、ＦＧＦ７−カタログ番号ＢＡＦ２５１、ＰＤＧＦ ＢＢ−カタログ番号ＢＡＦ２２０、ＶＥＧＦ−カタログ番号ＢＡＦ２９３
６．ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
７．Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１．ＳＡＢ中にＧＡＧを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２．ＧＡＧ結合プレート中に２００μｌのＧＡＧ溶液／ウェルを添加し、光から保護して室温で一晩インキュベートする
３．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
４．プレートを、光から保護して２５０μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで３７℃で１時間インキュベートする
５．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
６．ブロッキングバッファーでタンパク質を溶解し、連続希釈を行う：０、０．７８１、１．５６、３．１２５ｎＭ
７．ＧＡＧでコーティングされたプレートに２００μｌ／ウェルの希釈されたタンパク質を分注し、３７℃で２時間インキュベートする
８．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
９．ブロッキング溶液中の２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化された一次抗体の２００μｌ／ウェルを添加し、３７℃で１時間インキュベートする
１０．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
１１．ブロッキング溶液中の２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰの２００μｌ／ウェルを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする
１２．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
１３．２００μｌ／ウェルの発色試薬を添加する：脱イオン水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸、室温で４０分間インキュベートする
１４．４０５ｎｍで吸光度を読み取る
ｈＭＳＣ増殖に対するＨＳ８の効果を立証するために、ＢｒｄＵ取り込み増殖アッセイが行われた（以下に記載のプロトコール）。
ＨＳ８（ＨＳ８＋）に対するヒト間葉系幹細胞の用量反応は、３６時間にわたるＢｒｄＵの取り込みによってモニターされた。ＦＧＦ２は、投与陽性対照として使用された。ＨＳ８＋は、ｈＭＳＣ増殖を促進することおよび他のＧＡＧよりも有意により多くの刺激を与えることが見出された（図１７）。
プロトコール（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色） Ｒｏｃｈｅ）
１．細胞播種 − １９０μｌの培地／ウェル（９６ウェルプレート）中に５０００細胞
２．培地− ＤＭＥＭと共に１０００ｍｇ／Ｌ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋１％ ２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ｇｌｕａｔａｍｉｎｅ）＋１％ペニシリンおよびストレプトマイシン
３．３７℃かつ５％のＣＯ２中で６時間インキュベートする
４．６時間のインキュベーション後、所定のウェルについてレイアウト通りに１０μｌの培地中に種々の用量の処理剤を添加する
５．ＦＧＦ２（ｎｇ／ｍｌ）およびＧＡＧ（μｇ／ｍｌ） − １０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５
６．３７℃かつ５％のＣＯ２中で処理剤と共に３６時間インキュベートする
７．各ウェル内にＢｒｄＵを添加する。
８．細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２中でＢｒｄＵで２時間標識する（２０μｌのＢｒｄＵ標識溶液／ウェルを添加する）
９．軽くたたくことによってプレートから標識培地を除去する
１０．２００μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔを細胞に添加し、１５〜２５℃で３０分間インキュベートする
１１．振り落とすことおよび軽くたたくことによってＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を完全に除去する
１２．１００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ作用溶液を添加し、１５〜２５℃で９０分間インキュベートする
１３．振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、２５０μｌ／ウェルの洗浄溶液（１×ＰＢＳ）で３回すすぐ
１４．軽くたたくことによって洗浄溶液を除去する。
１５．１００μｌ／ウェルの基質溶液を添加し、１５〜２５℃で３０分間インキュベートする
１６．３７０ｎｍでの吸光度を測定する（参照波長：４９２ｎｍ）
ｈＭＳＣ増殖に対するＨＳ８の効果を立証するために、ＦＡＣＳに基づいた細胞増殖アッセイが行われた（以下に記載のプロトコール）。
ＨＳ８（ＨＳ８＋）に対するヒト間葉系幹細胞の用量反応は、（ＦＡＣＳに基づいた）Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ法によって６日にわたってモニターされた。ＦＧＦ２は、投与陽性対照として使用された。ＨＳ８は、ｈＭＳＣ増殖を促進することおよび有意な刺激を与えることが見出された。
細胞増殖プロトコール
材料
１．ＨＭ２０ ｈＭＳＣ − ラテンアメリカ系２０歳男性のドナー（Ｌｏｎｚａから購入された）
２．ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ．カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）
３．維持培地：ＤＭＥＭ（１０ｍｇ／ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４．ＨＳ８（＋）バッチ２、ＨＳ８（−）バッチ２、ブタ粘膜ヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３１４９）
５．Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
方法
１．ＨＭ２０細胞は、２４穴プレート上に３０００細胞／ｃｍ２で５００μｌ／ウェルの培地中に播種された（０日目）
２．１日目 − 高くなっていく濃度のＦＧＦ２（ｎｇ／ｍｌ）およびＧＡＧ（μｇ／ｍｌ）での培地交換 − ５００μｌの新鮮な培地中に１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６
３．２日毎の培地交換
４．細胞は、所定の時点（２日目、４日目および６日目）で回収される − １００μｌのトリプシンで回収され、１００μｌの培地（時＝２日目）または３００μｌの培地（４日目および６日目）で中和される
５．細胞は、Ｇｕａｖａ装置で計数された（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁液は、１：２００である）
ヒト間葉系幹細胞の単離
ヒト骨髄（ＢＭ）単核細胞の調製
密度勾配分離によるヒト骨髄（ＢＭ）の回収およびＢＭ単核細胞の調製
１．インフォームドコンセント後に、ヒト骨髄（ＢＭ）のおよそ４０ｍＬを健康な若年志願者（１８〜４０歳）から後腸骨稜（寛骨）の吸引によって回収した。ＢＭをすぐに、防腐剤を含まない、ヘパリンナトリウムを含有する５０ｍＬのチューブに入れる（１０，０００単位／チューブ）。
２．１０μＬの一定分量を取り出し、Ｗｈｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｆｌｕｉｄ（ＷＣＦ）中１：２０に希釈し、血球計算器を用いて有核細胞含有量を数え上げた。
３．次いで、等体積のブロッキング緩衝液をＢＭ吸引物に添加し、十分に混合し、次いで、７０μｍのＦａｌｃｏｎ細胞濾過器と通して濾して小さな血餅および骨断片を除去する。
４．次いで、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）溶液３ｍＬをおよそ１２個の丸底１４ｍＬポリスチレンファルコンチューブの底部に分注し、７．５ｍＬの希釈したＢＭを慎重に重ねる。
５．チューブを室温で３０分、４００ｇで遠心分離する。
６．使い捨てのプラスチックＰａｓｔｅｕｒピペットを使用して全てのチューブから白血球バンドを回収し、４×１４ｍＬのポリプロピレンチューブ中にプールする。
７．細胞を、ＨＨＦ洗浄緩衝液で希釈し、試料を４℃で１０分、４００ｇで遠心分離することによってＢＭＭＮＣをペレット化する。
８．緩衝液を吸引し、細胞を１つのチューブ中にプールする。
接着性によるＭＳＣの単離
１．ＢＭＮＣ画分を１５ｃｍのディッシュ中、維持培地（ＤＭＥＭ、１ｇ／ｌのグルコース、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン）に播種し、最初の培地交換前に３日間、細胞を接着させる。
２．細胞を３〜４日毎に培地交換しながら維持培地中で培養し、８５％集密になったら０．１２５％トリプシンを使用して常套的に継代する。再播種の際、細胞を１ｃｍ２あたり３，０００個で播種する。全ての培養物を加湿したインキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で維持する。
３．非酵素的な細胞解離溶液（ＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を使用して細胞を培養物から取り出し、ＰＢＳ中で１回洗浄した後、計数する。次いで、細胞１×１０５個を９６ウェルプレートに分注し、細胞を４５０×ｇで５分、ペレット化する。その後、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中に予め希釈した免疫表現型検査用抗体溶液を添加し、細胞を氷上で２０分インキュベートする。次いで、細胞を２％ＦＣＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄した後、２％ＦＣＳ／ＰＢＳに再懸濁させ、ＧＵＡＶＡ ＰＣＡ−９６ベンチトップフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で分析する。全ての試料を３連で測定する。
ＳＴＲＯ−１陽性ＢＭＳＳＣの磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
ＭＡＣＳの使用により、全体的な幹細胞収率を大きく損なうことなく、ＢＭＳＳＣ集団を部分的に精製すること、および多数のＢＭＭＮＣを処理することが可能になる。密度勾配遠心分離した後、４０ｍＬのＢＭ吸引物から単核細胞およそ１〜２×１０８個が回収される。免疫標識前に、ＢＭＭＮＣをブロッキング緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、氷上でおよそ３０分インキュベートして、Ｆｃ受容体媒介性の抗体の結合の可能性を低下させる。
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用したＳＴＲＯ−１＋ＢＭＳＳＣの単離
１．ＢＭＭＮＣを、４℃で１０分、４００ｇで遠心分離することによってペレット化し、ＢＭＭＮＣ ５×１０７個あたりＳＴＲＯ−１上清５００μｌに再懸濁させ、氷上で６０分、時々穏やかに混合しながらインキュベートする。
２．ＢＭＭＮＣをＨＨＦ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、次いで、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）を含有するＨＨＦ、０．５ｍＬに中に１／５０希釈で再懸濁させ、４℃で４５分インキュベートする。
３．ＢＭＭＮＣをＭＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液４５０μＬ中に再懸濁させ、それにストレプトアビジンマイクロビーズ５０μＬを添加する（ＭＡＣＳ緩衝液９０μＬ中、細胞１０７個あたりマイクロビーズ１０μＬ）。混合物を氷上で１５分インキュベートする。
４．氷冷のＭＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した後、細胞の少量の一定分量をフローサイトメトリー分析用に取り出す（前試料）。次いで、残りの細胞をミニＭＡＣＳカラム（細胞１０８個のカラム容量、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＳカラム）に置く。ＳＴＲＯ−１−細胞（陰性画分）はカラム中に保持されず、重力の下で新鮮な２ｍＬのポリプロピレンチューブを通過して流出液中に入るが、ＳＴＲＯ−１＋細胞は磁化マトリクスに結合したままになる。
５．カラムをＭＡＣｓ緩衝液０．５ｍＬで３回洗浄してあらゆる非特異的に結合したＳＴＲＯ−１−細胞を除去し、新鮮な２ｍＬのポリプロピレンチューブ中に回収する。
６．カラムを磁場から抜いた後、カラムをＭＡＣＳ緩衝液で新鮮な２ｍＬのポリプロピレンチューブ中に洗い流すことによってＳＴＲＯ−１＋細胞（陽性画分）を回収する。次いで、ＳＴＲＯ−１＋細胞を計数し、二色ＦＡＣＳのために処理する。
７．前ＭＡＣＳ画分、ＳＴＲＯ−１−画分、およびＳＴＲＯ−１＋画分のそれぞれから少量の試料（細胞０．５〜１．０×１０５個）を取り出し、別々の、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（１／５０）０．２ｍＬを含有する２ｍＬのポリプロピレンチューブに入れる。次いで、細胞試料を氷上でさらに５分インキュベートして、濃縮手順の評価を可能にする。標識されていない前ＭＡＣＳ細胞の試料（細胞１．０×０５個）が陰性対照としての機能を果たす。
８．これらの試料を ＨＨＦ中で２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｆｉｘ溶液中に固定し、その後、フローサイトメトリーによって分析して純度および回収率を評価する。
９．この時点で、部分的に精製されたＳＴＲＯ−１＋ＢＭＳＳＣの培養物を増大させることもでき、二色ＦＡＣＳによってさらに精製することもできる。
コロニー効率アッセイによる骨髄の品質の評価
ヒト骨髄穿刺液における予測されるＣＦＵ−Ｆコロニーの発生率は、播種した細胞１０５個あたりおよそ５〜１０ＣＦＵ−Ｆである。
１．ＢＭＭＮＣを６ウェル培養プレート中、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、およびβ−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）を補充したα−ＭＥＭにウェルあたり細胞０．３×１０５個、１．０×１０５個、および３．０×１０５個で播種する。培養は３連でセットアップし、５％ＣＯ２および＞９０％湿度の中、３７℃で１２日インキュベートする。
２．１２日目の培養物をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに２０分固定する。
３．次いで、固定された培養物を、０．１％（ｗ／ｖ）トルイジンブルー（１％パラホルムアルデヒド溶液中）を用いて１時間染色し、次いで、水道水ですすぎ、乾燥させる。細胞５０個を超える凝集体をＣＦＵ−Ｆとしてスコアする。
高度に精製されたＢＭＳＳＣの蛍光活性化細胞選別
測定可能なＣＦＵ−Ｆは全てＳＴＲＯ−１＋ＢＭＭＮＣ画分中に含有されるが、ＢＭＳＳＣは総ＳＴＲＯ−１＋集団のたったの２％未満にしか相当しない。大多数のＳＴＲＯ−１＋細胞はグリコホリン−Ａ＋有核赤血球およびいくつかのＣＤ１９＋Ｂ細胞である。したがって、ＳＴＲＯ−１発現に基づくＢＭＳＳＣの選択単独では、ＣＦＵ−Ｆの部分的な濃縮しかもたらされない（およそ１０倍）。クローン原性ＢＭＳＳＣは全て、有核赤血球およびリンパ球には存在しないマーカー、特にＣＤ１０６およびＣＤ１４６の発現に基づいて二色ＦＡＣＳによってさらに識別されうるＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞画分中に含有される。下記の方法により、総ＳＴＲＯ−１＋細胞画分少数の亜集団、播種した細胞２〜３個毎に１個がＣＦＵ−Ｆを形成する能力を有するＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１０６＋ＢＭＭＳＣ（１．４％±０．３；ｎ＝２０）を単離することが可能になる。この濃縮のレベルは未分画のＢＭＭＮＣで観察されるＣＦＵ−Ｆの平均発生率（播種した細胞１０，０００個あたり１ＣＦＵ−Ｆ）よりもほぼ５，０００倍高い。
フローサイトメトリー細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用したＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１０６＋ＢＭＳＳＣの単離
１．免疫標識前に、二色免疫蛍光法およびＦＡＣＳのために、ＭＡＣＳにより単離したＳＴＲＯ−１＋細胞ＢＭＭＮＣ（常套的に、ＢＭＭＮＣ１×１０８個から細胞２〜５×１０６個）を製剤中ＨＨＦ、０．５ｍＬ中に再懸濁させる。
２．ＭＡＣＳにより単離したＳＴＲＯ−１＋細胞およそ３〜５×１０５個を、以下を添加した３つの適切に標識したチューブに分注する：
（ｉ）一次抗体なし（２重陰性対照）、氷上で維持。
（ｉｉ）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（ＨＦＦ中１／１００希釈）、氷上で３０分インキュベートする（ＦＩＴＣ対照）。次いで細胞をＨＨＦ中で２回洗浄する。
（ｉｉｉ）ＨＦＦ中２０μｇ／ｍＬに希釈したマウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）０．５ｍＬ。ＳＴＲＯ−１＋細胞を氷上で３０分インキュベートし、ＨＨＦ中で２回洗浄し、ＰＥとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）０．２ｍＬ中に再懸濁させる、（ＰＥ対照）。試料をインキュベートし、洗浄し、次いでＨＦＦ中に再懸濁させる。
（ｉｖ）ＭＡＣＳにより単離したＳＴＲＯ−１＋細胞の残りの１〜２×１０６個はマウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）０．５ｍＬ中に再懸濁させ、上記の通りインキュベートし、ＨＨＦ中で２回洗浄し、ＰＥとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）およびストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲート（ＨＨＦ中１／１００希釈）０．２ｍＬ中に再懸濁させ、次いで、氷上で３０分インキュベートする（選別用試料）。次いで、細胞を前と同様に洗浄し、次いでＨＨＦ中に再懸濁させる。
３．試料をＨＨＦ中に１ｍｌあたり細胞１×１０７個の濃度で再懸濁させた後、ＦＩＴＣおよびＰＥを同時に検出することが可能な４８８ｎｍの波長で光を放出する２５０ＭＷアルゴンレーザーを取り付けた任意の選別機で選別する。試料（ｉ〜ｉｉｉ）を使用して、ＦＩＴＣとＰＥ両方の補償を確立する。５．試料（ｉｖ）から選別されたＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＶＣＡＭ−１＋細胞を、適切な増殖培地を含有するチューブ中に回収し、混合する。６．細胞計数を上記の通り実施する。次いで、選別された細胞を培養する。
ヒトＢＭＳＳＣのｅｘ ｖｉｖｏでの培養
血清が豊富な培地
１．ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１０６＋単離されたＢＭＳＳＣ集団（１ｃｍ２あたり１〜３×１０４個）を、２０％胎児ウシ血清、ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸１００μＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充した、イーグル培地のα−改変（α−ＭＥＭ）を含有する組織培養フラスコまたはプレート中、４％ＣＯ２、相対湿度＞９０％、３７℃で２週間培養する。初代ＢＭＳＳＣ集団を、培養物が８０〜９０％集密度に達したら継代する。
２．接着性培養物を無血清ＨＢＳＳで１回洗浄し、３７℃で５〜１０分にわたってＴ７５フラスコあたり０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液２ｍＬを添加することにより、酵素的な消化によって細胞を放出させる。
３．単一細胞懸濁液の０．４％トリパンブルー／ＰＢＳ中１：５希釈物を調製することによって細胞の生存能力を評価し、血球計算器を使用して生存細胞の数を決定する。
４．ＢＭＭＳＣ単一細胞懸濁液をプールし、１０％ＦＢＳ、ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸１００μＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ増殖培地中に１ｃｍ２あたり０．５〜１．０×１０４個で再播種し、５％ＣＯ２、相対湿度＞９０％、３７℃でインキュベートする。培養物を、週２回、培地を吸引して出し、３７℃に温めた等体積の新鮮に調製した培地と交換することにより供給する。
血清欠乏培地
この方法は、造血前駆細胞を増殖させるために最初に開発された血清欠乏培地（ＳＤＭ）の改変である。
１．フィブロネクチンでコーティングしたプレートまたはフラスコを、１ｃｍ２あたり５μｇのフィブロネクチン溶液を用いて室温で９０分プレコーティングすることによって調製する。この後、フィブロネクチン溶液を吸引して出し、培養容器を滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後に細胞を播種する。
２．ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１０６＋単離されたＢＭＳＳＣ集団（１ｃｍ２あたり１〜３×１０４個）を、フィブロネクチンでコーティングした組織培養フラスコまたはプレート中で、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｃｏｈｎ画分Ｖ）、１０μｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン、ヒト低密度リポタンパク質、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和型ヒトトランスフェリン、２ｍＭのＬ−グルタミン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム（１０−８Ｍ）、ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸１００μＭ、β−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、１０ｎｇ／ｍＬの血小板由来増殖因子−ＢＢ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭを含有する培地中に懸濁させて培養する。
３．次いで、培養物を４％ＣＯ２、相対湿度＞９０％、３７℃で２週間インキュベートする。初代ＢＭＳＳＣ集団を、培養物が８０〜９０％集密度に達したら継代する。
ｅｘ ｖｉｖｏで増大させたＭＳＣの凍結保存
１．常套的に、培養物で増大させたＭＰＣの単一細胞懸濁液を上記の通りトリプシン／ＥＤＴＡ消化によって調製する。次いで、細胞を低温ＨＦＦ中に希釈し、洗浄する。
２．細胞ペレットをＦＢＳ中１ｍｌあたり細胞１×１０７個の濃度で再懸濁し、氷上で維持する。次いで、等体積の凍結混合物（低温ＦＢＳ中２０％ＤＭＳＯ）を徐々に添加しながら細胞を穏やかに混合して、１０％ＤＭＳＯ／ＦＢＳ、１ｍｌあたり細胞５×１０６個の最終濃度にする。次いで、１ミリリットルの一定分量を氷上で予冷した１．８ｍＬのクライオバイアルに分注し、次いで、速度制御冷凍装置を使用して毎分−１℃の速度で凍結させる。
３．次いで、凍結させたバイアルを、長期間保管するために液体窒素に移す。凍結ストックの回収は細胞を３７℃のウォーターバスで急速に解凍することによって実現される。次いで、細胞を低温ＨＦＦ中に再懸濁させ、２８０ｇで１０分高速回転させる。
４．細胞の生存能力を評価するために、０．４％トリパンブルー／ＰＢＳ中１：５希釈物を調製し、血球計算器を使用して細胞の数を決定する。一般には、この手順により８０〜９０％の生存能力が得られる。
コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイ
ｈＭＳＣのＣＦＵ−Ｆ特性は、以下に記載の方法を使用して評価された。ｈＭＳＣは、４回の継代の間に補助剤なしの対照培地のうちの１つの中で培養され、次いで、補助剤なしの対照培地、または対照培地にヘパリン（１．２５μｇ／ｍｌ）、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（１．２５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８−（１．２５μｇ／ｍｌ）、ＨＳ８（ＨＳ８＋）（１．２５μｇ／ｍｌ）もしくはＨＳ８（ＨＳ８＋）（２．５μｇ／ｍｌ）のうちの１つを加えたもののうちの１つの中で培養された。結果は、図２４Ａおよび２４Ｂに示されている。
材料
１．ｈＭＳＣ − （Ｌｏｎｚａから購入された）。
２．維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン。
３．１００％メタノール中のクリスタルバイオレット０．５％。
方法
１．ＭＳＣは、１００×１５ｍｍのペトリ皿中に１０ｍｌ／皿の維持培地と共に１５０細胞／ｃｍ２で３通りずつ播種される。
２．細胞は、７日目に培地が交換されて１４日間培養された。
３．１４日目に、プレートは、クリスタルバイオレット（０．５％、１００％メタノール中）で以下のように染色された：
ａ．培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄する
ｂ．１０ｍｌ／皿のクリスタルバイオレットを添加し、３０分間インキュベートする
ｃ．ＰＢＳで１回およびＨ２Ｏで１回洗浄し、プレートを乾燥させる
ｄ．他のコロニーと接触していなかった、５０個を超える細胞を有するコロニーが計数された
ＭＳＣの多分化能特性
以下に記載の方法により、骨（骨形成）および脂肪（脂肪形成）に分化するＭＳＣの能力についてアッセイすることによってＭＳＣの多分化能特性の維持が試験された。結果は、図２５に示されている。
細胞
継代４回目の細胞（Ｐ４） − 通常の維持培地中で培養されたｈＭＳＣ
継代７回目の細胞（Ｐ７） − 以下の処理剤のうちの１つを含む通常の維持培地中でＰ４からＰ７まで培養されたｈＭＳＣ：
・ＨＳ８（ＨＳ８（＋）） ２．５μｇ／ｍＬ
・ＨＳ８（−） １．２５μｇ／ｍＬ
・Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ １．２５μｇ／ｍＬ
・ヘパリン １．２５μｇ／ｍＬ
・ＦＧＦ２ １．２５μｇ／ｍＬ
骨形成性の分化
材料
１．ｈＭＳＣ − （Ｌｏｎｚａから購入された）
２．維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
３．処理維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｎＭ デキサメタゾン、１０ｍＭ β−グリセロールリン酸および２５μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸
４．ＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド４％
５．アリザリンレッド溶液：１００ｍＬのＨ２Ｏ中に１．３７ｇ；ｐＨ４．１〜４．３
方法
１．細胞は、６ウェルプレート中に２４時間播種された（３，０００セル／ｃｍ２）
２．対照ウェル用の培地は、維持培地で変更された
３．処理されたウェル用の培地は、１０ｎＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロールリン酸および２５μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸を含む維持培地で変更された
４．次いで、すべての細胞は、３日毎の培地交換で２８日間培養された
５．細胞は、次いで、アリザリンレッドで染色された：
ａ．ＰＢＳで３回洗浄する
ｂ．細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定する
ｃ．ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄する
ｄ．細胞にアリザリンレッド溶液を添加し、ゆっくりと振盪させながら、３０分間インキュベートする
ｅ．ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄する
ｆ．染色された細胞を空気乾燥させる
脂肪形成性の分化
材料
１．ｈＭＳＣ − （Ｌｏｎｚａから購入された）
２．脂肪細胞維持培地：ＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
３．脂肪細胞処理培地：ＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１μＭ デキサメタゾン、１０μＭ インスリン、２０μＭ インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ）および１１５μｇ／ｍＬ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
４．ＰＢＳ中のパラホルムアルデヒド４％
５．オイルレッドＯ溶液：０．３６％、６０％イソプロパノール中
方法
１．細胞は、６ウェルプレート中に３通りずつで播種された（１８，０００／ｃｍ２）
２．細胞は、コンフルエンスまで培養された
３．対照ウェル用の培地は、脂肪細胞維持培地（４５００ｍｇ／Ｌ グルコース）で変更された
４．処理されたウェル用の培地は、１μＭのデキサメタゾン、１０μＭのインスリン、２０μＭのインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ）および１１５μｇ／ｍＬの３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含む脂肪細胞維持培地で変更された
５．その後、３日毎の培地交換で２８日間培養された
６．細胞は、次いで、オイルレッドＯで染色された：
ａ．ＰＢＳで３回洗浄する
ｂ．細胞を４％のパラホルムアルデヒドで６０分間固定する
ｃ．ｄｄＨ２Ｏで１回洗浄する
ｄ．細胞にオイルレッドＯ溶液を添加し、ゆっくりと振盪させながら、１時間インキュベートする
ｅ．６０％のイソプロパノール中で２回洗浄する
ｆ．ｄｄＨ２Ｏで３から５回洗浄する
ｇ．ｄｄＨ２Ｏをプレート上に残すまたは染色された細胞を空気乾燥させる
ＦＧＦ−２媒介性の増殖ｈＭＳＣに対するＨＳ８の効果は、以下に記載の方法を使用して調査された。ＨＳ８は、ＦＧＦ−２媒介性のＭＳＣの増殖を促進することが見出された（図２６）。
細胞
継代４回目の細胞（Ｐ４） − 以下の処理剤を含むまたは含まない通常の維持培地中で培養されたｈＭＳＣ：
・ＦＧＦ２ ０．１５６ｎｇ／ｍＬ 単独
・ＦＧＦ２ ０．１５６ｎｇ／ｍＬと共に種々の用量のＨＳ８（＋）
細胞増殖プロトコール
材料
１．ｈＭＳＣ − （Ｌｏｎｚａから購入された）。
２．ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ．カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）。
３．維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン。
４．ＨＳ８（ＨＳ８（＋））、ＨＳ８（−）、ブタ粘膜ヘパラン硫酸（Ｃｅｌｓｕｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３１４９）。
５．Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
方法
１．細胞は、２４穴プレート上に３０００細胞／ｃｍ２で５００μｌ／ウェルの培地中に播種された（０日目）
２．１日目 − 維持培地に加えてＦＧＦ２（０．１５６ｎｇ／ｍＬ）単独または多様な濃度のＨＳ８（＋）と共にＦＧＦ２（０．１５６ｎｇ／ｍＬ）を含むように培地が交換された５００μｌの新鮮な培地中に１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６（μｇ／ｍｌ）
３．２日毎の培地交換。
４．細胞は、４日目に１００μｌのトリプシンで回収され、３００μｌの培地で中和される。
５．細胞は、ＧＵＡＶＡ装置で計数された（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁液は、１：２００である）
ＥＲＫ経路を介したＦＧＦ−２シグナル伝達に対するＨＳ８の効果は、以下に記載の方法を使用して調査された。ＥＲＫ１／２およびＦＲＳ２ａのリン酸化によって測定されたように、ＨＳ８は、ＥＲＫ経路のＦＧＦ２媒介性シグナル伝達を促進する／持続させることが見出された（図２７）。
細胞
Ｐ４−ｈＭＳＣは、以下の処理剤を含むまたは含まない通常の維持培地中で培養された：
・ＦＧＦ２ ０．３１２ｎｇ／ｍＬ 単独
・ＨＳ８（ＨＳ８（＋）） ２．５ｎｇ／ｍＬ
ウエスタンブロット
材料
１．ｈＭＳＣ − （Ｌｏｎｚａから購入された）
２．ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ．カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）
３．維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４．無血清培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース）、０．２％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
５．リン酸化ＦＲＳ２ａに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．カタログ番号３８６１） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中に１：１０００
６．リン酸化ＥＲＫ１／２に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．カタログ番号９１０６Ｌ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中に１：２０００
７．全ＥＲＫ１／２に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．カタログ番号９１０２Ｌ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中に１：１０００
８．アクチンに対する抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｈｅｍｉｃｏｎ．カタログ番号ＭＡＢ１５０１Ｒ） ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡ中に１：８０００
方法
１．細胞は、６ウェルプレート上に１０，０００／ｃｍ２で維持培地中に播種される
２．１日目：培地を２ｍＬ／ウェルで無血清培地に交換する
３．３日目：ウェルに処理剤を添加する。必要とされる量のＨＳ８（＋）および／またはＦＧＦ２が無血清培地中に調剤され、１０μＬ／ウェルで添加される
４．細胞は、異なる時点（３０分間および２４時間）で１．５×ｌａｅｍｍｌｉバッファーで１００μＬ／ウェル中に回収される
５．溶解液は、９５℃で５分間加熱され、−２０℃で保存された。
６．試料は、一度だけ凍結融解される
７．２０μＬ／ウェルの試料が、Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ビス−トリス ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル、１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．カタログ番号ＮＰ０３３５ＢＯＸ）の各レーンにロードされる
８．ゲルは、１×ＭＯＰＳバッファーで１８０Ｖで５０分間泳動された
９．分離されたタンパク質バンドは、次いで、１×転写バッファー中でニトロセルロース膜に１００Ｖで１時間３０分間転写された
１０．ニトロセルロース膜は、ポンソーＳ溶液で染色され、目的のタンパク質の大きさに応じて細片に切断された
１１．膜は、次いで、ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡまたは５％脱脂乳のいずれかの中でゆっくりと振盪させながら室温で３０分から１時間ブロッキングされた
１２．推奨された希釈率の一次抗体は、次いで、ゆっくりと振盪させながら４℃で一晩インキュベートされた
１３．ブロットは、次いで、ＴＢＳＴで３回、それぞれ５分間洗浄された
１４．推奨された希釈率の二次抗体は、次いで、ゆっくりと振盪させながら室温で１時間から２時間インキュベートされた。
１５．ブロットは、ＴＢＳＴで３回、それぞれ５分間洗浄された
１６．ブロットを化学発光試薬と共にインキュベートし、バンド可視化のためにＸ線フィルムを現像するために暗室に運ぶ。
ＨＳ８のＮＭＲ分析
ＨＳ８の試料を分析するまで−２０℃で保管した。化学シフトの比較および定量化のために使用される内部標準物質ｔＢｕＯＨ（２００μＬ、δ１．２４ｐｐｍ）を含有するＤ２Ｏ（６００μＬ）中に溶解させることによってＮＭＲ分析を完了した。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳを約１ｍｇ、４ｍｇおよび７ｍｇの量に正確に秤量し、ワーキングＤ２Ｏ／ｔＢｕＯＨ溶液に入れ、ＨＳ８と同じ実行で分析した。標準溶液の直線あてはめにより、アセチルメチル領域の積分値について０．９９５またはそれよりも良好な回帰が得られ、内部標準と比較して、この領域はδ３．１５〜３．２５ｐｐｍであり、アノマー領域の最低磁場部分はδ５．１５〜５．６５ｐｐｍであった。
低シグナル対ノイズを生じさせる小さなサンプルサイズに起因して、アセチル領域データのみを使用してＨＳ８の量を算出し、０．７ｍｇの値が得られた。アセチルピークのシグナル対ノイズを比較する第２の実験を完了し、０．５ｍｇの値が記録された。これは、内部標準に関連しない絶対値である。さらなる分析前にｔＢｕＯＨを除去するための３回の凍結−乾燥ステップの後に記録された質量は１．２ｍｇであった。ＳＥＣ ＨＰＬＣデータを積分しておおよその純度値を得ることができ、それも５８％が記録され、それにより、０．７ｍｇのＨＳ−ＧＡＧが材料中に存在したことが示唆されることに注目されたい。この重量の矛盾は小さなＧＡＧ試料では新しい現象ではないので、変動する湿度および塩の割合が記録された質量に影響したに違いないと仮定した。
ＨＳ８、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ３＊の１ＨＮＭＲスペクトルが図３１に示されている。示されているプロットにおける、他のシグナル（Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳが４．８〜４．９の最も高いピークであり、ＨＳ３が中間の高さのピークである）と比較したＨＳ８の強度の差異（最低ピーク４．８〜４．６ｐｐｍ）は、全てのスペクトルをアセチルメチル共鳴の高さに対して標準化したことに起因し、このＨＳ８試料の場合では、わずかに良好なシミングが観察され、線幅が狭くなり、アセチル共鳴がわずかに鋭く高くなった。
Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳと比較したＨＳ８の化学組成の変化は２−Ｄ ＮＭＲによって正確に区別される。
ＨＳ８ １ＨＮＭＲメチン領域およびメチレン領域のより厳密な検査により、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳおよびＨＳ３と比較した差異が示された（図３２）。
［＊ＨＳ３は、ＢＭＰ−２のヘパラン結合ドメインに対して特異的かつ高い結合親和性を有する単離されたヘパラン硫酸である。ＨＳ３は、ＷＯ２０１０／０３０２４４に記載されている］
ＨＳ８および他のＨＳ製剤のＨＰＬＣ−ＳＥＣ−ＲＩ
ヘパラン硫酸製剤（およそ１ｍｇ、正確に秤量した）を水中２ｍｇ／ｍＬまで作製した。これらの製剤のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化物は水中２ｍｇ／ｍＬであった。溶液を遠心分離し（１４０００ｇ、２分）、２００μＬの一定分量を分析のために取得した。
ＳＥＣ−ＲＩ系は、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ Ａｌｌｉａｎｃｅ分離モジュールおよびＷａｔｅｒ２４１０屈折率モニター（範囲６４）からなる。ＲＩクロマトグラムからの定量化のためのｄｎ／ｄｃを０．１２９（ｒｅｆ）に設定した。試料を注射し（５０μＬ）、５０ｍＭの酢酸アンモニウムを２つのＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ペプチド１０／３００ＧＬカラムから順番に毎分０．５ｍＬの流速で用いて溶出した（３００×１０ｍｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）。データを収集し、ＡＳＴＲＡソフトウェア（バージョン４．７３．０４、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）を使用して分析した。
ＨＳ８製剤全体のサイズ−排除クロマトグラフィーにより、別個のサイズ−排除プロファイルが示された。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料は１５ｍＬで空隙化シグナルを示し、様々なサイズの追加的な材料が溶離液およそ２３ｍＬに溶出した。図３３に示されている通り、ＨＳ８材料（ＦＧＦ−２アフィニティーカラムに保持される）は、ＳＥＣカラムを空隙にする材料が豊富であるというサイズプロファイルを示す。
これは、ＨＳ８とＣｅｌｓｕｓ ＨＳプロファイルの中間のサイズプロファイルを示すＨＳ３製剤のサイズプロファイルとも別個である（図３４）。ＨＳ８クロマトグラムは、この試料を水ではなく５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中に調製したので、およそ３６ｍＬにおいて大きな塩シグナルを示す。
図３５は、Ｃｅｌｓｕｓ由来のＨＳの２つの異なるバッチについてのＳＥＣクロマトグラムを示す。バッチ＃１０６９７を、ＨＳ３およびＨＳ８の両方を調製するための出発材料として使用した。これらの両方のバッチの酵素を用いた消化は、バッチ＃１０５９５の方が、全く消化されず、カラムを空隙にする材料がより多いと思われる以外は同様である。
ＨＳ８のヘパリンリアーゼ消化物のサイズプロファイル（図３６）は、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料（図３５）ともＨＳ３（図３６）とも全く異なる。ＨＳ３について得られたサイズプロファイルは、以前の消化物について得られたものと非常に類似するものであった。ＨＳ８クロマトグラムは、ＨＳ３消化物についてと同様に、空隙容量（１５ｍＬ）ではわずかなシグナル強度を示し、これにより、この材料の大部分がいくらかの程度まで消化されたことが示唆される。しかし、２つのＨＳ３消化物はおよそ１９ｍＬで有意かつ別個のシグナル強度を示すが、ＨＳ８はおよそ１８ｍＬで広範なシグナルを示す。
［３Ｈ］ヘパリンアッセイ
ＦＧＦ２のアミノ酸配列に由来する配列番号１のヘパリン結合能力は、以下に記載のプロトコールを使用して評価された。結果は、図３７に示されている。
材料
（１）ペプチド：
Ｇａｎｄｈｉら（ＨＳ８）−Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって製作された
ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ−Ａｈｘ−（Ｋ）ビオチン
（２）３Ｈヘパリン ０．１μＣｉ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）
（３）ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）
（４）ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン４％（ｗ／ｖ）
（５）真空オーブン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）
（６）Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ液体シンチレーション分析計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）
方法
（１）ＦＧＦ２−ＨＢＤペプチドをＰＢＳで望ましい濃度（４．６６×１０−９、９．３２×１０−９、１．８６×１０−８、３．７３×１０−８モル）に作り上げる
（２）同一のニトロセルロースメンブレンを既知の濃度のペプチドで２通りずつ浸漬する
（３）メンブレンを１時間空気乾燥させる
（４）８００℃の真空オーブン内で４５分間のさらなる乾燥
（５）メンブレンをＰＢＳで３回洗浄する
（６）メンブレンに３Ｈヘパリン ０．１μＣｉを添加し、シンチレーション計数バイアル中で１６時間インキュベートする
（７）メンブレンをＰＢＳで４回洗浄する
（８）Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２８００ ＴＣＲ液体シンチレーション分析計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）で放射能を決定する
固定化されたヘパリンを結合することについてのヘパリン結合ドメインペプチド配列番号１の能力は、以下に記載のプロトコールを使用して評価された。結果は、図３８に示されている。
材料
１．標準アッセイバッファー（ＳＡＢ） − １００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
２．ブロッキングバッファー − ０．４％アイシングラス（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３．ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、ＵＫ）
４．ペプチド：
Ｇａｎｄｈｉら（ＨＳ８）−Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって製作された
ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ−Ａｈｘ−（Ｋ）ビオチン
５．ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
６．Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１．ＳＡＢ中にヘパリンを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２．ＧＡＧ結合プレート中に２００μｌのヘパリン溶液／ウェルを添加し、光から保護して室温で一晩インキュベートする
３．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
４．プレートを、光から保護して２５０μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで３７０℃で１時間インキュベートする
５．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
６．ブロッキングバッファー中にペプチドを溶解し、連続希釈を行う：０、５０、１００、２００ｎＭ
７．ＧＡＧでコーティングされたプレートに２００μｌ／ウェルの希釈されたタンパク質を分注し、３７０℃で２時間インキュベートする
８．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
９．ブロッキング溶液中の２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰの２００μｌ／ウェルを添加し、３７０℃で３０分間インキュベートする
１０．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
１１．２００μｌ／ウェルの発色試薬を添加する：脱イオン水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸、室温で４０分間インキュベートする
１２．４０５ｎｍで吸光度を読み取る
ＦＧＦ−２は、ＨＳ８を結合するその能力について評価された。これは、未加工の出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭブタ粘膜）、または糖なし、との結合と比較された。結果は、図３９に示されている。
材料
１．標準アッセイバッファー（ＳＡＢ） − １００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．２％ｖ／ｖ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
２．ブロッキングバッファー − ０．４％アイシングラス（Ｓｉｇｍａカタログ番号６７０４１）＋ＳＡＢ
３．ＧＡＧ結合プレート（Ｉｄｕｒｏｎ、ＵＫ）
４．Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからのタンパク質：ＦＧＦ２−２３３ＦＢ
５．Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗体：ＦＧＦ２−ＢＡＭ２３３
６．ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ２６３６）
７．Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｎ２７７０）
方法
１．ＳＡＢ中にＧＡＧを溶解する（５μｇ／ｍｌ）
２．ＧＡＧ結合プレート中に２００μｌのＧＡＧ溶液／ウェルを添加し、光から保護して室温で一晩インキュベートする
３．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
４．プレートを、光から保護して２５０μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで３７０℃で１時間インキュベートする
５．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
６．ブロッキングバッファーでタンパク質を溶解し、連続希釈を行う：０、０．７８１、１．５６、３．１２５ｎＭ
７．ＧＡＧでコーティングされたプレートに２００μｌ／ウェルの希釈されたタンパク質を分注し、３７０℃で２時間インキュベートする
８．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
９．ブロッキング溶液中の２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化された一次抗体の２００μｌ／ウェルを添加し、３７０℃で１時間インキュベートする
１０．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
１１．ブロッキング溶液中の２２０ｎｇ／ｍｌのＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＡＰの２００μｌ／ウェルを添加し、３７０℃で３０分間インキュベートする
１２．プレートをＳＡＢで２５０μｌ／ウェルで注意深く３回洗浄する
１３．２００μｌ／ウェルの発色試薬を添加する：脱イオン水中のＳｉｇｍａ ＦＡＳＴ ｐ−ニトロフェニルリン酸、室温で４０分間インキュベートする
１４．４０５ｎｍで吸光度を読み取る
ＨＳ８の存在下におけるプラスチック接着性間葉系幹細胞の６日にわたる増殖を分析した。結果は、図４０に示されている。
細胞増殖プロトコール
材料
１．ＨＭ２０ ｈＭＳＣ − ラテンアメリカ系２０歳男性のドナー（Ｌｏｎｚａから購入された）
２．ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ．カタログ番号２３３−ＦＢ−０２５）
３．維持培地：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌ グルコース）、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
４．ＨＳ８
５．Ｇｕａｖａ Ｆｌｅｘ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
方法
１．ＨＭ２０細胞は、２４穴プレート上に３０００細胞／ｃｍ２で５００μｌ／ウェルの培地中に播種された（０日目）
２．１日目 − 培地が交換された ＧＡＧ（μｇ／ｍｌ） − ２．５および０．５
３．２日毎の培地交換
４．細胞は、所定の時点（６日目）で回収される − １００μｌのトリプシンで回収され、３００μｌの培地で中和される
５．細胞は、Ｇｕａｖａ装置で計数された（Ｇｕａｖａ ｆｌｅｘ試薬：細胞懸濁液は、１：２００である）
未加工のＣｅｌｓｕｓ出発ＨＳ（ＨＳ−ＰＭ）、または非結合ＨＳフロースルー（ＨＳ８−）と比較した、単離されたＨＳ８の存在下におけるＳＴＲＯ−１単離間葉系幹細胞の３６時間にわたる増殖は、以下に記載のようにＢｒＤＵの取り込みによって測定された。結果は、図４１に示されている（その中でＨＳ８Ｇ＝ＨＳ８）。
プロトコール（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色）、Ｒｏｃｈｅ）
１．細胞播種 − １９０μｌの培地／ウェル（９６ウェルプレート）中に５０００細胞
２．培地−アルファＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋１％Ｌ−グルタミン（ｇｌｕａｔａｍｉｎｅ）＋１％ペニシリンおよびストレプトマイシン＋１００ｎＭ Ｌ−グルタミン酸
３．３７０℃かつ５％のＣＯ２中で６時間インキュベートする
４．６時間のインキュベーション後、所定のウェルについてレイアウト通りに１０μｌの培地中に種々の用量の処理剤を添加する
５．ＧＡＧ（μｇ／ｍｌ） − １０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５
６．３７℃かつ５％のＣＯ２中で処理剤と共に３６時間インキュベートする
７．各ウェル内にＢｒｄＵを添加する。
８．細胞を３７℃かつ５％ＣＯ２中でＢｒｄＵで２時間標識する（２０μｌのＢｒｄＵ標識溶液／ウェルを添加する）
９．軽くたたくことによってプレートから標識培地を除去する
１０．２００μｌ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔを細胞に添加し、１５〜２５℃で３０分間インキュベートする
１１．振り落とすことおよび軽くたたくことによってＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を完全に除去する
１２．１００μｌ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ作用溶液を添加し、１５〜２５℃で９０分間インキュベートする
１３．振り落とすことによって抗体コンジュゲートを除去し、２５０μｌ／ウェルの洗浄溶液（１×ＰＢＳ）で３回すすぐ
１４．軽くたたくことによって洗浄溶液を除去する。
１５．１００μｌ／ウェルの基質溶液を添加し、１５〜２５０℃で３０分間インキュベートする
１６．３７０ｎｍでの吸光度を測定する（参照波長：４９２ｎｍ）
二糖のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、Ｃｅｌｓｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＨＯ−０３１０３、ロット＃ＨＯ−１０６９７）からであった。細菌のヘパリナーゼによる高級ブタヘパリンの消化に由来する、二糖標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ；ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮ、ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮ，６Ｓ、ΔＵＡ−ＧｌｃＮ カタログ番号ＨＤ００１からＨＤ０１３、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）は、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫから購入された。天然に存在しない二硫酸化された二糖の合成誘導体（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）も、Ｉｄｕｒｏｎから、内標準としての使用のために購入された。ヘパリンオリゴ糖（ｄｐ４、ｄｐ６、ｄｐ８、ｄｐ１０、ｄｐ１２（カタログ番号ＨＯ０４、ＨＯ０６、ＨＯ０８、ＨＯ１０、ＨＯ１２））および選択的に脱硫酸化されたヘパリン標準（２−Ｏ脱硫酸化ヘパリン、６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンおよびＮ−脱硫酸化ヘパリン）（カタログ番号ＤＳＨ００１／２、ＤＳＨ００２／６、ＤＳＨ００３／Ｎ、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）も、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫから購入された。
ヘパリンリアーゼＩ（ヘパリチナーゼ、ＥＣ４．２．２．８、ヘパリチナーゼＩとしても知られる）、ヘパリンリアーゼＩＩ（ヘパリチナーゼＩＩ、指定されたＥＣ番号なし）およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（ヘパリナーゼ、ＥＣ４．２．２．７、ヘパリチナーゼＩＩＩとしても知られる）は、生化学工業株式会社、日本から得られた。凍結乾燥された粉末（０．１Ｕ／バイアル）として供給される、この酵素は、０．１％ＢＳＡ中に溶解され、０．５ｍＵ／μＬを含む溶液が得られた。各一定分量（５μＬ； ２．５ｍＵ）は、必要とされるまで冷凍された（−８０℃）。
ヘパリンリアーゼ酵素でのＨＳ製剤の消化
ＨＳ製剤（１ｍｇ）は、（１０ｍＭの酢酸カルシウムを含む）５００μＬの酢酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中にそれぞれ溶解され、各２．５ｍＵの３種の酵素が添加された。試料は、チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃で一晩（２４時間）インキュベートされた。さらに各２．５ｍＵの３種の酵素が試料に添加され、この試料は、チューブを穏やかに反転させながら（９ｒｐｍ）、３７℃でさらに４８時間インキュベートされた。消化物は、加熱（１００℃、５分）によって停止され、次いで、凍結乾燥された。消化物は、５００μＬの水中に再懸濁され、ＣＥによる分析用に一定分量（５０μＬ）が分取された。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）
キャピラリー電気泳動オペレーティングバッファーは、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４の水溶液を２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏの溶液に添加してｐＨ３．５にすることによって作製された。カラム洗浄液は、（５０％ｗ／ｗのＮａＯＨから希釈された）１００ｍＭのＮａＯＨであった。オペレーティングバッファーおよびカラム洗浄液は、０．２μｍの酢酸セルロースメンブレンフィルター（４７ｍｍφ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を取り付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターユニットを使用して、両方とも濾過された。
１２種の二糖標準の保存溶液は、水中に二糖を溶解（１ｍｇ／ｍＬ）することによって調製された。標準のための較正曲線を決定するために、１２種すべての標準を含む混合物が調製された。１２種の標準混合物の保存溶液は１０μｇ／１００μＬの各二糖を含み、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５μｇ／１００μＬを含む希釈系列が調製された；２．５μｇの内標準（ΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＣＯＥｔ，６Ｓ）を含む。ＨＳの消化物は水で希釈され（５０μＬ／ｍＬ）、同一の内標準が各試料に添加された（２．５μｇ）。溶液は、凍結乾燥され、水（１ｍＬ）中に再懸濁された。試料は、ＰＴＦＥ親水性ディスポーザブルシリンジフィルターユニット（０．２μｍ；１３ｍｍφ；Ａｄｖａｎｔｅｃ、東洋濾紙株式会社、日本）を使用して濾過された。
分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ３ＤＣＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）機器を使用して、取り付けられた未コーティングのシリカキャピラリーチューブ（７５μｍ ＩＤ、全長６４．５ｃｍおよび有効長５６ｃｍ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ、部品番号ＴＳＰ０７５３７５）上、２５℃で、２０ｍＭのオペレーティングバッファーを使用して、３０ｋＶのキャピラリー電圧で行われた。試料は、陰極（逆極性）端で流体力学的な注入（５０ｍｂａｒ×１２秒）を使用してキャピラリーチューブに導入された。
各流動の前に、キャピラリーは、１００ｍＭのＮａＯＨ（２分）、および水（２分）で洗い流され、オペレーティングバッファー（５分）で予め調整された。バッファー補充システムは、一貫した容量、ｐＨおよびイオン濃度が確実に維持されるように、入口および出口のチューブにおいてバッファーを置換した。水のみのブランクは、試料の順番の最初、中間および最後のいずれもにおいて流動された。吸光度は、２３２ｎｍでモニターされた。すべてのデータは、ＣｈｅｍＳｔｏｒｅデータベースに保存され、その後、検索されてＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して再加工された。
標準混合物中の１２種のヘパリン二糖のうちの１１種は、上に詳述した条件を使用して分離された。１２種目の二糖、ΔＵＡ−ＧｌｃＮは、これらの実験のために使用された条件下で移動しない。しかし、この二糖は、ヘパラン硫酸において生じることが報告されていない。標準較正曲線のためのＲ２値は、０．９９４９から１．０までの範囲に及んだ。
ＨＳ製剤のヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ消化は２通りずつで行われ、２通りずつのそれぞれがＣＥに２回注入された。したがって、ＨＳ消化物中の二糖の標準化された百分率は、分析の結果の相加平均である。標準混合物において分離された１１種の二糖のうち、それらのうちの８種のみが、ＨＳ消化物中に検出される。他の小さなシグナルが、消化の電気泳動図のベースライン上に認められ、これらは、オリゴ糖＞２ｄｐに該当しうる。上記のように、より大きなオリゴ糖は、二糖と比較して、より小さいＵＶ吸光度を有することになる。
Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ（Ｌｏｔ＃１０６９７）の試料に対して２連の分析を完了し、同じ試料に対する分析の以前のセットと比較した：これらの結果が図４２に示されている。２セットの分析間に優れた相関が観察された。Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ消化物中の８種の二糖の割合は他の以前の分析と同様であり、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃおよびΔＵＡ−ＧｌｃＮＳが大きな成分であり、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ，６Ｓ、ΔＵａ−ＧｌｃＮＳ，６ｓおよびΔＵＡ，２Ｓ−ＧｌｃＮＳ，６Ｓがより小さな割合であった（図４２）。これは、ＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルと一致して、大きな割合のモノ硫酸化二糖および硫酸化されていない二糖、より小さな割合のジ硫酸化二糖および小さな割合のトリ硫酸化二糖に対応する。保持されないＨＳは、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳ出発材料と比較してモノ硫酸化二糖および硫酸化されていない二糖が豊富である。この保持されない材料のパターンは、ＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムでは全く異なって見られる。ＨＳ８の分析の場合では、サンプルサイズから単一の分析のみが可能であり、したがって、この製剤に関する誤差データはもたらされない。ＨＳ８、ＨＳ３およびＣｅｌｓｕｓ ＨＳの比較が図４４に示されている。
ＨＳ８についての二糖組成は、より硫酸化された（荷電した）画分がＣｅｌｓｕｓ ＨＳから一般に調製されているという点で、ＨＳ３（ＷＯ２０１０／０３０２４４に記載の通り、Ｃｅｌｓｕｓ ＨＳから、ＢＭＰ２由来のヘパリン結合ドメインに対する親和性によって単離されたＨＳ）のものと同様である。しかし、ＨＳ８についてはＨＳ３と比較してより大きな割合のＵＡ−ＧｌｃＮＳ，６ｓおよびより小さな割合のＵＳ−ＧｌｃＮＳが存在するという点で著しい差異がある。
ＨＳ８が由来する未加工のＣｅｌｓｕｓ ＨＳの平均分子量は２０〜２５ｋＤａ（ヘパリンの約１５ｋＤａと比較して）であり、ＨＳ８をアフィニティークロマトグラフィーによって同定するプロセスではＨＳ鎖の観察される分子量に実質的な変化は生じなかった。各二糖単位の分子量は約４３０〜約６５０ＫＤａの範囲であることが予想される。二糖あたり５００ダルトンの大まかな平均（例えばヘパリン中の平均二糖は約６５０ダルトンである）を使用して、平均（２２ｋＤａ）ＨＳ８あたり約４４環のＨＳ８の鎖長を示す（基本的な近似として）。
ＨＳ８がＦＧＦ２に優先的に結合し、ｈＭＳＣの増殖速度を増大させることが同定されたので、ＨＳ８活性の機構をさらに探究した。
ＦＧＦ２中和抗体またはＦＧＦＲ１阻害剤（キナーゼ阻害剤と中和抗体の両方）は、ｈＭＳＣにおけるＨＳ８の増殖効果を低下させる能力があり（図４７〜５０）、これにより、ｈＭＳＣにおけるＨＳ８の分裂促進効果が、他の分子ではなくＦＧＦ２／ＦＧＦＲとの相互作用によるものであることが確認される。ＨＳ８の存在下ではＦＧＦ２の急速な分解が遅延し（図４６）、これにより、培地中でＨＳ８がＦＧＦ２と相互作用してそれが分解されるのを保護することがもたらされる。
ＨＳ８がｈＭＳＣ自己再生を促進する一方で多分化能を維持することを示した（上記）。ｈＭＳＣの常套的な培養物にＨＳ８を補充することにより、培養物がより速く増大するかどうかを試験するために、３つの個々のドナー由来のｈＭＳＣをＨＳ８補充培地で別々に増殖させた。３ドナーにわたって、ＨＳ８に曝露したｈＭＳＣがより多くのコロニーを形成することができ（図５１）、さらなる細胞の倍加にもかかわらず、バイオマーカーＣＤ１４、１９、３４、４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７３、９０、１０５、ＣＤ４９ａ、ＳＳＥＡ−４およびＳＴＲＯ−１についてＦＡＣＳによって測定される幹細胞様表現型を維持することを観察した（例えば、図２２に示されている通り）。ｈＭＳＣをＨＳ８補充培地で増大させた場合、「幹細胞性」を示すバイオマーカーが維持された。
これらの細胞に、３つの間葉系幹細胞系列の全てに容易に分化する能力があり（骨を含む、アリザリンレッド染色、フォンコッサ染色、オイルレッドＯ染色およびアルシアンブルー染色によって測定される）、また、骨形成が促進されることも見出し、これにより、この戦略が、整形外科の外傷療法に有効でありうることが示唆される。ＨＳ８はＭＳＣの骨に分化する能力に悪影響を及ぼさなかった。
したがって、ＨＳ８をラットの頭蓋冠欠損モデルに適用した（図５２）。骨治癒の改善が明らかであり、これにより、外傷部位においてＨＳ８がＦＧＦ２と相互作用して、ＦＧＦ−２依存性機構によって内在性幹前駆細胞および骨前駆細胞の活性を加速することが示唆され、したがって、頭蓋冠骨欠損の治療に対するこの手法の治療的可能性が強調される。
（参考文献）

Claims (38)

  1. ヘパラン硫酸ＨＳ８。
  2. 単離されたまたは実質的に精製された形態のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  3. 前記ＨＳ８が、アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号２）を有する、またはからなる、ペプチドまたはポリペプチドを結合する能力のある、請求項１または２に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  4. 前記ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸配列ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）を有する、またはからなる、請求項３に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  5. 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８が、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化ならびに次いで結果として生じる二糖断片のキャピラリー電気泳動分析の後に、以下を含む二糖組成：
    を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ８。
  6. 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８が、ヘパリンリアーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩでの消化ならびに次いで結果として生じる二糖断片のキャピラリー電気泳動分析の後に、以下を含む二糖組成：
    を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸ＨＳ８。
  7. （ｉ）アミノ酸配列ＹＣＫＮＧＧＦを有するヘパリン結合ドメインを含むポリペプチド分子が接着している固体支持体を用意するステップ；
    （ｉｉ）前記ポリペプチド分子をグリコサミノグリカンを含む混合物と接触させてポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を形成させるステップ；
    （ｉｉｉ）前記混合物の残りからポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体を分離するステップ；
    （ｉｖ）前記ポリペプチド−グリコサミノグリカン複合体からグリコサミノグリカンを解離させるステップ；
    （ｖ）解離された前記グリコサミノグリカンを回収するステップ；
    を含む方法によって得られる、請求項１から６のいずれか一項に記載の、ヘパラン硫酸ＨＳ８、または単離されたもしくは実質的に精製された形態のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  8. 前記ポリペプチドが、ＧＨＦＫＤＰＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦ（配列番号１）から選択されるアミノ酸配列を有する、またはからなる、請求項７に記載の方法。
  9. グリコサミノグリカンを含む前記混合物が、ブタ腸粘膜から得られるヘパラン硫酸製剤である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む組成物。
  11. 増殖因子、好ましくはＦＧＦ２をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む医薬組成物または医薬。
  13. ＦＧＦ２タンパク質および／または間葉系幹細胞をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物または医薬。
  14. 医療の方法における使用のための、請求項１２または１３に記載の医薬組成物または医薬。
  15. 医療の方法における使用のための、請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  16. 前記医療の方法が、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒の方法を含む、請求項１５に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  17. 前記医療の方法が、組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を含む、請求項１５に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８。
  18. 前記方法が、組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を含む、組織に対する疾患、状態または傷害の治療のための医薬の製造における請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８の使用。
  19. 患者において組織に対する疾患、状態または傷害を治療する方法であって、前記組織、好ましくは骨組織の修復および／または再生を導く、前記患者への治療有効量のヘパラン硫酸ＨＳ８の投与を含む前記方法。
  20. 組織の再生または修復が必要とされる、前記患者の身体における創傷もしくは部位またはその周囲の組織にヘパラン硫酸ＨＳ８を投与するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記患者にＦＧＦ２タンパク質を投与するステップをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 患者において組織に対する疾患、状態または損傷を治療する方法であって、前記組織の修復および／または再生を導く、バイオマテリアルおよび請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを前記患者の前記疾患、状態または傷害の部位またはその周囲の組織内に外科的に埋め込むステップを含む前記方法。
  23. バイオマテリアルおよび請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼ。
  24. 生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを形成する方法であって、バイオマテリアルを請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８でコーティングするまたは含浸させるステップを含む前記方法。
  25. 患者において骨折を治療する方法であって、前記患者への治療有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８の投与を含む前記方法。
  26. 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８を前記骨折の周囲の組織に投与するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ヘパラン硫酸ＨＳ８の投与が、前記骨折の周囲の組織への前記ヘパラン硫酸の注入を含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ヘパラン硫酸が、前記ヘパラン硫酸および薬学的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物または医薬として製剤化される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 患者において骨折を治療する方法であって、バイオマテリアルおよび治療有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む生体適合性のインプラントまたはプロテーゼを前記患者の骨折の部位またはその周囲の組織内に外科的に埋め込むステップを含む前記方法。
  30. 幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する方法であって、幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養するステップを含む前記方法。
  31. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養においてコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、ＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養するステップを含む前記方法。
  32. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養においてコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、前記方法が、培養された細胞が増殖し、かつＭＳＣの集団が増大するように、ＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養するステップを含み、増大した前記ＭＳＣ集団が、
    ・前記ＭＳＣ集団の≦２％が、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲのうちのいずれかを発現し、かつ
    ・前記ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、かつ
    ・前記ＭＳＣ集団の≧４０％が、ＣＤ４９ａを発現し、かつ／または
    ・前記ＭＳＣ集団の≧５０％が、ＳＳＥＡ−４を発現し、かつ／または
    ・前記ＭＳＣ集団の≧２０％が、ＳＴＲＯ−１を発現する
    ことを特徴とする、前記方法。
  33. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養においてコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）について濃縮する方法であって、前記方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＣを請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させて培養するステップ、および前記ＭＳＣを継代するステップを含み、１回または複数回の継代後に前記ＭＳＣ集団が、
    ・前記ＭＳＣ集団の≦２％が、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲのうちのいずれかを発現し、かつ
    ・前記ＭＳＣ集団の≧９５％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し、かつ
    ・前記ＭＳＣ集団の≧４０％が、ＣＤ４９ａを発現し、かつ／または
    ・前記ＭＳＣ集団の≧５０％が、ＳＳＥＡ−４を発現し、かつ／または
    ・前記ＭＳＣ集団の≧２０％が、ＳＴＲＯ−１を発現する
    ことを特徴とする、前記方法。
  34. 請求項１から９のいずれかに記載のヘパラン硫酸ＨＳ８を含む培地。
  35. ＦＧＦ２をさらに含む、請求項３４に記載の培地。
  36. 予め決定された量の請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８および予め決定された量のＦＧＦ２を含むキットオブパーツ。
  37. 医療の方法における同時、別個または連続の使用のための、治療有効量の
    （ｉ）請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８；と、
    （ｉｉ）ＦＧＦ２タンパク質；
    （ｉｉｉ）間葉系幹細胞；
    のうちの一方または両方と
    を含む製品。
  38. 増殖因子、好ましくはＦＧＦ２の安定性を高める方法であって、増殖因子、好ましくはＦＧＦ２を請求項１から９のいずれか一項に記載のヘパラン硫酸ＨＳ８と接触させるステップを含む前記方法。
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