CN105408361A - 硫酸乙酰肝素 - Google Patents

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Abstract

揭示了一类新型的结构和功能上相关的分离的硫酸乙酰肝素。该类新型的硫酸乙酰肝素发现可结合FGF2并增强干细胞的增殖，同时维持它们的多潜能性/多能性。

Description

硫酸乙酰肝素
发明领域
本发明涉及硫酸类肝素(heparansulphates)，具体地说，涉及结合FGF2的硫酸类肝素，但不限于此。
发明背景
人间充质干细胞(hMSC)应用于细胞治疗中的主要缺陷是难以实现充足的细胞数量以供治疗目的。目前的策略包括利用胞外基质(ECM)基片和利用成纤维细胞生长因子2(FGF2)，这些策略能够获得更高的细胞计数，但导致细胞群体中分化的祖细胞增加。
hMSC的数量很低，最低可以到骨髓单核细胞的0.01％到0.0001％，从而阻碍了其更广泛的应用。此外，目前的离体扩增策略导致多能性丧失，从而造成大量移植用细胞的质量和功能较差。
Brickman等(Glycobiology第8卷No.5第463-47页,998)描述了称为HS2的硫酸乙酰肝素，据报道其能与FGF2相互作用。如Brickman(同上)所述，可在胚胎第10天的鼠科细胞的乙酰肝素蛋白聚糖分离HS2。HS2描述为分子量约为25kDa，因此，由约60个二糖组成，假定每个二糖的平均分子量为400Da。HS2的二糖组成示于Brickman等(Glycobiology第8卷No.5第463-471页,1998)，WO2010/011185，其通过引用全文纳入本文。HS2的亚硝酸和乙酰肝素裂合酶消化概况示于图29和30。
Maccarana等(肝素/硫酸乙酰肝素结合碱性成纤维细胞生长因子所需的最小序列(MinimalSequenceinHeparin/HeparanSulfateRequiredforBindingofBasicFibroblastGrowthFactor).TheJournalofBiologicalChemistry.第268卷,No.32,第15篇,第23898-23905页,1993)描述了研究人主动脉的肝素或HS产生的几种小的寡糖结合FGF2的实验。利用一种八糖级分(B2)将作者称为HS8的归结为八糖结构。应该注意这不是本发明的HS-8，命名完全一样是巧和。
利用以下物质产生偶数或奇数的低链长寡糖：猪肠粘膜的肝素，选择性O-脱硫酸化肝素的两份样品，起始材料经优先6-O-脱硫酸化和N-硫酸化，然后重新-N-硫酸化产生的一份样品，碱性条件下选择性2-O-脱硫酸化获得的另一份样品，从人主动脉分离的低硫酸化HS，和牛肾的HS。
通过用亚硝酸作部分脱氨基切割进行解聚，从肝素产生偶数的寡糖，并用NAB3H4还原得到的2,4-脱水-D-甘露糖残基。分离标记的寡糖以产生4-14糖的偶数物质，和含有20-24糖的组分。类似处理选择性6-O-脱硫酸化的肝素以产生4-到12-糖。分离和脱盐的寡糖经温和酸处理。用肝素酶I进一步处理20-24-聚体糖得到奇数的肝素寡糖。
通过不同的策略从人主动脉HS产生4-14-聚体寡糖，包括在N-乙酰化GlcN单位占据的位点进行切割。样品经N-脱乙酰基，然后用亚硝酸脱氨基。该处理导致未取代的GlcN单位脱氨基和葡萄糖胺连接键(glucosaminidiclinkage)切割，而N-硫酸化GlcN单位保持完整。产物包括GlcA-[1-3H]aManR二糖(衍生自(-GlcNAc)-(GlcA-GlcNac)n-序列)和GlcA-GlcNSO3-HexA)n-[1-3H]aManR寡糖(衍生自(-GlcNac)-GlcA-(GlcNSO3-HexA)n-GlcNac-序列)。
这些处理产生的寡糖均是短的，通过它们的制备方法而得到化学修饰，从而使得它们与本发明的HS不同。
发明概述
本发明涉及硫酸乙酰肝素制品，硫酸乙酰肝素HS8。现已发现HS8能结合FGF2，提高干细胞的增殖，同时保持它们多潜能性或多能性。HS8是指新的一类结构和功能相关的分离硫酸乙酰肝素。本发明人鉴定HS类的几种密切相关的成员，它们具有与衍生自FGF2的肝素结合域相结合的共同特性，所述肝素结合域共有短的共有序列(YCKNGGF)。HS8类别的成员能刺激干细胞增殖和富集集落形成单位。
在一方面，本发明提供了硫酸乙酰肝素HS8。可以采用分离的形式或基本上纯化的形式提供HS8。这可包括提供一组合物，其中硫酸乙酰肝素组分是至少80％的HS8，更优选以下任一的HS8：至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在优选的实施方式中，HS8能够结合具有YCKNGGF(SEQIDNO:2)所示氨基酸序列的肽或多肽。所述肽可以在该序列的一端或两端具有一个或多个额外的氨基酸。例如，所述肽可以在该序列的一端或两端具有以下任意个氨基酸：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个。
在一些实施方式中，HS8能结合具有或由以下任一氨基酸序列构成的肽或多肽：
·YCKNGGF(SEQIDNO:2)，或
·GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)。
在其它实施方式中，所述多肽是FGF2蛋白。在一些实施方式中，HS8结合的肽具有或由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或FGF2蛋白中任一的氨基酸序列组成，其中KD小于100μΜ，更优选小于50μΜ、40μΜ、30μΜ、20μΜ、或10μΜ。
可以根据发明人的本文所述方法获得、鉴定、分离或富集HS8，包括以下步骤：
(i)提供一固体支持物，所述支持物上附着有多肽分子，其中所述多肽包含具有YCKNGGF所示氨基酸序列的肝素结合域；
(ii)将所述多肽分子与含有糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将该多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)从该多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
在一些实施方式中，附着于支持物的多肽可包含或由选自以下的氨基酸序列构成：
·YCKNGGF(SEQIDNO:2)，或
·GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)。
在本发明人的方法中，所述混合物可以包含从市售可得来源获得的糖胺聚糖。一种合适的来源是硫酸乙酰肝素级分，例如市售可得的硫酸乙酰肝素。可以在从猪肠粘膜肝素的分离中获得合适的硫酸乙酰肝素级分(例如，塞尔萨斯试验室有限公司(CelsusLaboratoriesInc)-有时称为“CelsusHS”)。
硫酸乙酰肝素的其它合适来源包括任何哺乳动物(人或非人)的硫酸乙酰肝素，尤其是来自肾、肺或肠黏膜的。在一些实施方式中，硫酸乙酰肝素来自猪或牛肠粘膜、肾或肺。
在另一方面，本发明提供包含以上任一方面的HS8和FGF2蛋白的组合物。
在一方面，本发明提供包含上述各方面的HS8的药物组合物或药物。所述药物组合物和药物还可包含药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物用于疾病的治疗方法，所述方法包括组织，例如断骨的修复和/或再生。在一些实施方式中，所述药物组合物或药物还可包含FGF2蛋白。在一些实施方式中，所述药物组合物或药物还可含有间充质干细胞。
在另一方面，本发明提供HS8用于医学治疗方法。所述医学治疗方法可包括哺乳动物或人中的体内伤口愈合、组织的修复和/或再生、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或骨的修复和/或再生。
在相关方面，本发明提供HS8在制备用于医学治疗方法的药物中的应用。在一些实施方式中，所述医学治疗方法包括哺乳动物或人中断骨的修复和/或再生。
在还有其它方面，本发明提供包含生物材料和HS8的生物相容植入物或假体。在一些实施方式中，所述植入物或假体涂覆有HS8。在一些实施方式中，所述植入物或假体浸渍有HS8。还可用FGF2蛋白和/或间充质干细胞涂覆或浸渍所述植入物或假体。
在另一方面，本发明提供形成生物相容植入物或假体的方法，所述方法包括用HS8涂覆或浸渍生物材料的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括用FGF2蛋白和间充质干细胞之一或二者涂覆或浸渍所述生物材料。
在另一方面，本发明提供治疗患者的骨折的方法，所述方法包括将治疗有效量的HS8给予该患者。在一些实施方式中，所述方法包括将HS8给予骨折周围的组织。在一些实施方式中，所述方法包括将HS8注射到骨折周围的组织。在此类方法中，可将HS8配制成包含HS8和药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂的药物组合物或药物。
在一些实施方式中，所述方法还可包括将FGF2蛋白给予患者。在此类方法中，可将HS8和FGF2蛋白配制成包含HS8和FGF2蛋白以及药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂的药物组合物。
在一些实施方式中，所述方法还可包括将间充质干细胞给予患者。在此类方法中，可将HS8、FGF2蛋白和间充质干细胞中的至少两种配制成包含HS8、FGF2蛋白和间充质干细胞中至少两种以及药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂的药物组合物。
优选分别提供治疗有效量的HS8、FGF2蛋白和间充质干细胞。在一些实施方式中，治疗骨折的方法还包括将治疗有效量的HS8和/或FGF2蛋白和/或间充质干细胞配制成包含HS8和/或FGF2蛋白和/或间充质干细胞以及药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂的药物组合物的步骤，其中将所述药物组合物给予所述患者。
在另一方面，本发明提供治疗患者的骨折的方法，所述方法包括将生物相容的植入物或假体外科植入该患者在骨折部位或周围的组织，其中所述植入物或假体包含生物材料和HS8。
在一些实施方式中，所述植入物或假体涂覆有HS8。在一些实施方式中，所述植入物和假体浸渍有HS8。在一些实施方式中，所述植入物或假体还浸渍有FGF2蛋白和间充质干细胞的一种或两种。
在还有另一方面，本发明提供培养基，所述培养基包含HS8。
在另一方面，本发明提供HS8在体外细胞培养中的应用。本发明的相关方面提供HS8在结缔组织体外生长中的应用。在另一方面，本发明提供使得结缔组织体外生长的方法，所述方法包括在与外源性添加的HS8接触下培养间充质干细胞。
在还有另一方面，本发明提供在需要此类治疗的人或动物患者中修复、替换或再生组织的方法，所述方法包括：
(i)在与HS8接触下体外培养间充质干细胞足以使得所述细胞形成组织的时间；
(ii)收集所述组织；
(iii)将所述组织植入患者身体受损或疾病部位以在该患者中修复、替换或再生组织。
所述组织可以是结缔组织。例如骨、软骨、腱或脂肪。
在一些实施方式中，所述方法还包括将间充质干细胞与外源性FGF2蛋白接触培养。
在另一方面，本发明提供在有HS8存在下，通过体外培养间充质干细胞获得的组织。在一些实施方式中，在有HS8和FGF2蛋白存在下，通过体外培养间充质干细胞获得所述组织。
在另一方面，本发明提供培养干细胞，例如间充质干细胞的方法，所述方法包括在与HS8接触下培养干细胞。
在一些方面，本发明提供体外培养干细胞的方法，所述方法包括在与硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养干细胞。HS8宜是外源性和分离的，并作为补充剂，例如作为培养基的一部分加入培养物。
在优选的实施方式中，与HS8接触的同时培养的细胞群体扩增，即，干细胞数量增加，而培养物中很高比例的细胞维持亲代干细胞的多能或多潜能特征(例如，干细胞分化成干细胞类型特征性的特定组织类型的能力)。例如，优选培养物中至少以下百分比的干细胞表现出亲代干细胞的多能或多潜能特征：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，HS8起到增加培养物中多能或多潜能细胞的比例(例如，百分比)的作用。该比例可以相对于起始培养物中多能或多潜能的细胞数进行检测。在一些实施方式中，可将多能或多潜能细胞比例的增加与经历相应培养条件的干细胞对照培养物相比较，后一培养条件的区别仅在于没有外源性HS8存在。干细胞培养物可任选含有，或不含有FGF2。
在一些实施方式中，所述方法使得集落形成单位(CFU)，即，能从单个细胞前体产生干细胞集落的单个干细胞增加。这种增加可以检测为培养物中作为CFU的细胞百分比的增加，至少以下百分比之一的增加：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。这种增加可以在培养期间检测，在一代期间检测，或在选择的代数期间检测，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代，其中相对于起始培养物中的CFU数量测定增加量。
因此，本发明培养方法能使得干细胞增殖并扩增干细胞数量，其中高比例的子代细胞是多能或多潜能的和/或是CFU。因此，本发明的方法能防止或减少体外培养干细胞扩增期间，多潜能或多能干细胞的多潜能或多能状态丧失。这优于子代细胞中干细胞的特征丧失很常见的现有干细胞培养方法。因此，本发明的方法提供富集多能/多潜能干细胞和/或CFU的干细胞培养物的手段，从而提供获得大量干细胞以供医学、诊断和科研用途的手段。
因此，本发明方法能使得干细胞培养物增殖和扩增，同时富集培养物以获得高比例(例如，百分比)的多潜能或多能或是CFU的细胞。
在一方面，本发明提供在间充质干细胞(MSC)培养物中富集集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC。
在另一方面，本发明提供在间充质干细胞(MSC)培养物中富集间充质干细胞和/或集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC，从而使得培养的细胞增殖和MSC群体扩增，其中所述扩增的MSC群体的特征在于：
·≤2％的MSC群体表达CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR中的任一种；和
·≥95％的MSC群体表达CD105、CD73和CD90；
和
·≥40％的MSC群体表达CD49a和/或
·≥50％的MSC群体表达SSEA-4和/或
·≥20％的MSC群体表达STRO-1。
在另一方面，本发明提供在间充质干细胞(MSC)培养物中富集间充质干细胞和/或集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC并传代MSC，其中在传代一代或多代后，MSC群体的特征在于：
·≤2％的MSC群体表达CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR中的任一种；和
·≥95％的MSC群体表达CD105、CD73和CD90；
和
·≥40％的MSC群体表达CD49a和/或
·≥50％的MSC群体表达SSEA-4和/或
·≥20％的MSC群体表达STRO-1。
本文所述的方法获得或产生了干细胞或MSC的群体或培养物。
MSC的群体或培养物的特征在于：
·≤2％的MSC群体表达CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR中的任一种；和
·≥95％的MSC群体表达CD105、CD73和CD90；
和
·≥40％的MSC群体表达CD49a和/或
·≥50％的MSC群体表达SSEA-4和/或
·≥20％的MSC群体表达STRO-1。
在一些实施方式中，表达CD49a的MSC群体的百分比可大于或等于以下的一种或多种：41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％。
在一些实施方式中，表达SSEA-4的MSC群体的百分比可大于或等于以下的一种或多种：51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、或80％。
在一些实施方式中，表达STRO-1的MSC群体的百分比可大于或等于以下的一种或多种：21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。
在一些实施方式中，所示传代数可以是以下任一种：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代。
本文所述的培养干细胞的方法可包括体外分离和/或维持干细胞的步骤。例如，本文所述的方法还可包括一个或多个以下步骤：
·从动物或人获得干细胞，例如基质细胞或骨髓基质细胞，
·分离干细胞，
·分隔和/或分离表达STRO-1的MSC，例如通过流式细胞术或磁力或荧光激活细胞分选，
·分隔和/或分离STRO-1+亮(bright)MSC，例如通过流式细胞术或磁力或荧光激活细胞分选，
·分隔和/或分离STRO-1亮(bright)/CD106+MSC，例如通过流式细胞术细胞分选(FACS)，
·通过，例如低温保藏储存干细胞。这可包括先储存从动物或人获得的细胞，再作富集/扩增干细胞的体外培养或扩增。
在还有另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含预定量的HS8和预定量的FGF2。所述试剂盒可包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有预定量的HS8，所述第二容器含有预定量的FGF2。所述试剂盒还可包含预定量的间充质干细胞。可提供所述试剂盒用于医学治疗方法。所述医学治疗方法可包括哺乳动物或人中的体内伤口愈合、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或骨的修复和/或再生的方法。可给所述试剂盒同时提供使用说明书以便为提供医学治疗而分别、顺序或同时给予HS8、FGF2蛋白和/或间充质干细胞。
在还有另一方面，本发明提供某种产品，所述产品含有治疗有效量的：
(i)HS8；和以下的一种或两种
(ii)FGF2蛋白；
(iii)间充质干细胞，
以便同时、分别或顺序用于医学治疗方法中。所述医学治疗方法可包括哺乳动物或人中的体内伤口愈合、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或骨的修复和/或再生的方法。所述产品可任选配制成组合制品以便共同给予。
本发明的其它方面如下所示。
在一方面，本发明提供对FGF2具有结合亲和力的GAG。所述GAG优选是硫酸乙酰肝素(HS)。在一个实施方式中，可以按照本文所述的方法，从猪肠粘膜获得的GAG混合物中分离HS(例如，获自美国辛辛那提的塞尔萨斯试验室有限公司(CelsusLaboratoriesInc)，例如INW-08-045,硫酸乙酰肝素I,塞尔萨斯试验室有限公司,HO-03102,HO-10595,10x100mg)，其中包含FGF2的肝素结合域的多肽连接于固体支持物，所述肝素结合域含有YCKNGGF所示氨基酸序列，并形成GAG-多肽复合物。GAG组分从GAG-多肽复合物中解离导致分离到独特的HS，称为“HS8”。在一个实施方式中，HS8是如下所述分离得到的HS：将多肽GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)连接于固体支持物，形成GAG-多肽复合物，并将GAG组分从GAG-多肽复合物中解离。
发明人相信可从多种来源获得的HS级分获得HS8，包括哺乳动物(人或非人)组织和/或胞外基质。
因此，在一方面，本发明提供HS8。可提供分离或纯化形式的HS8。在另一方面，提供了包含HS8的培养基。
在还有另一方面，本发明提供包含HS8的药物组合物或药物，任选与药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂组合。在一些实施方式中，药物组合物或药物还可包含FGF2蛋白。提供包含HS8的药物组合物或药物以便用于损伤或疾病的预防或治疗。还提供了HS8在制备预防或治疗损伤或疾病的药物中的应用。
在还有另一方面，本发明提供预防或治疗有此需要的患者的损伤或疾病的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的HS8。所给予的HS8可配制成合适的药物组合物或药物，还可包含药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂。任选地，所述药物组合物或药物还可包含FGF2蛋白。
在另一方面，本发明提供促进或抑制骨生成(骨细胞和/或骨组织形成)的方法，包括将HS8给予骨前体细胞或骨干细胞。
在另一方面，本发明提供促进或抑制软骨组织形成(软骨形成)的方法，包括将HS8给予软骨前体细胞或软骨干细胞。
可通过将骨或软骨前体或干细胞与HS8接触而在体外进行刺激或抑制骨生成或软骨组织形成的方法，任选在有外源性加入的FGF2蛋白存在下。前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在促进组织形成的情况下，可收集形成的组织并用于植入人或动物患者。
因此，在本发明的一方面，提供在有HS8(即，外源性HS8)存在下，任选有FGF2(即，外源性FGF2)存在下，体外培养间充质干细胞获得的结缔组织。结缔组织可以是骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。
利用HS8预防或治疗疾病可包括组织的修复、再生或替换，特别是结缔组织，例如骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。
在这些组织之一恶化的患者中，可采用将HS8给予恶化部位来刺激该部位组织的生长、增殖和/或分化。例如，刺激给药部位或其附近的存在的间充质干细胞可导致间充质干细胞增殖和分化成合适的结缔组织，优选该部位同时也存在FGF2，从而提供受破坏组织的替换/再生和伤口的治疗。
或者，可收集在与HS8接触下体外培养间充质干细胞获得的结缔组织，植入受损或患病部位以替换受破坏或恶化的组织。可任选先从受损或患病部位切除受破坏或恶化的组织。
在另一方面，可提供含有干细胞，优选间充质干细胞和HS8的药物组合物。将该组合物给予，例如注射到受损、疾病或恶化部位能在该部位提供组织的再生作用。
因此，通过将HS8，任选与FGF2和/或干细胞结合直接施用于需要治疗的患者，HS8可用于体内伤口愈合，包括组织修复、再生和/或替换(例如，疤痕组织或骨折的愈合)。HS8还可用于组织的体外再生，该组织适合植入需要组织修复、再生和/或替换的患者。
在另一方面，本发明提供了培养干细胞的体外方法，所述方法包括在与HS8接触下体外培养干细胞。HS8优选是与培养的细胞接触的外源性HS8。它可以作为培养基的一部分提供，或者单独加入培养中。所述方法优选包括干细胞的增殖。所述方法优选包括在多个群体倍增时间或传代期间维持干细胞的多潜能或多能状态，例如，在以下之一期间：至少3、4、5、6、7、8、9或10个群体倍增时间或传代。
在一个实施方式中，提供了扩增干细胞培养物的体外方法，所述方法包括将单个干细胞扩增成超过1x103个干细胞的群体，所述方法包括将干细胞培养物与HS8接触。
在另一实施方式中，提供了扩增干细胞培养物的体外方法，从每cm2约2000-5000个细胞的原始培养物大小扩增到含有至少1x103倍的干细胞的扩增培养物大小，所述方法包括将干细胞培养物与HS8接触。在一些实施方式中，在原始培养物大小和扩增培养物大小之间的扩增时间是低于以下之一：40天、30天、25天。
在另一实施方式中，提供了增加干细胞培养物中集落形成单位(CFU)数的体外方法，所述方法包括在与HS8接触下培养干细胞。在一些实施方式中，CFU表达CD49a、CD73、CD105、STRO-1或CD90中的一种或多种。
在另一实施方式中，提供了增加间充质干细胞体外培养物中STRO-1或STRO-1+亮细胞比例的方法，所述方法包括在与HS8接触下培养间充质干细胞。
在另一实施方式中，提供了预防或降低干细胞扩增期间，体外培养的多能干细胞的多潜能状态丧失的方法，所述方法包括在与HS8接触下培养干细胞。在一些实施方式中，所述方法包括将干细胞维持培养至少10个群体倍增时间。
如本文所示，HS8具有稳定FGF2的特性，从而能延长其作用。HS8防止培养基中FGF2的降解(图46)。这可用于储存FGF2制品和含培养基的FGF2制品。
因此，在一方面，本发明提供包含生长因子和分离的HS8的组合物。所述生长因子可以是蛋白生长因子，优选FGF2。所述组合物可包含分离的FGF2和分离的HS8。在一些实施方式中，所述组合物可以是培养基。在其它实施方式中，所述组合物可以是含有FGF2的药物组合物或药物。
所述组合物可以是在容器中的包含FGF2和分离的HS8的FGF2制品。合适的容器可以是瓶、小瓶、试管或注射器。
还提供了增加生长因子稳定性的方法，所述方法包括将生长因子与HS8接触。
可以根据其半衰期检测生长因子的稳定性，即，给定组合物中一半生长因子降解或丧失其活性所需的时间量。所述生长因子优选蛋白生长因子，更优选FGF2。HS8起到维持和延长FGF2半衰期的作用。所述方法可包括在其储存或运输期间，在体外将分离的HS8与生长因子(例如，FGF2)接触，例如作为生长因子(例如，FGF2)组合物制品的一部分。或者，所述方法可包括在体内将分离的HS8与生长因子(例如，FGF2)接触，例如通过将分离的HS8给予存在生长因子的组织(例如，FGF2)[在组织中天然产生或外源性加入组织]。所述方法还包括将外源性生长因子(例如，FGF2)加入组织的步骤。
可将含有分离的HS8(或加入分离的HS8)的给定组合物或组织中FGF2的稳定性与不含HS8(或其中未加入分离的HS8)的相当组合物作比较。在上述组合物和方法中，HS8可以是纯化的，如本文所述。FGF2可以是分离和/或纯化的、未分离的或部分分离的，例如作为胞外基质材料的一部分，或存在于细胞组合物中。分离或纯化的FGF2可以是重组FGF2。重组FGF2可购自许多制造商，例如蛋白技术公司-Peprotech；MM公司-MerckMillipore,马萨诸塞州；生命技术公司-LifeTechnologiesCorporation；吉比蔻公司-Gibco和英杰公司。
任选地，本发明的诸方面和实施方式不含HS1或HS2(如Brickman等(Glycobiology第8卷No.5第463-471页,1998和WO2010/011185中所述)。在一些实施方式中，本发明的硫酸乙酰肝素不包括HS2，和/或具有图29所示亚硝酸二糖消化图谱的硫酸乙酰肝素和/或具有图30所失亚硝酸二糖消化图谱的硫酸乙酰肝素。
优选实施方式描述
本发明人鉴定到新的一类硫酸乙酰肝素分子，称为HS8。它们显示HS8具有以下有利特性：
·HS8富集表达STRO-1的间充质干细胞(MSC)(图12、图14)；
·HS8导致STRO-1+ve亲和分离的MSC和通过附着于塑料而分离的MSC的生长增加(图17、18、19、20)。
·与缺乏HS8的硫酸乙酰肝素(HS8-ve部分)相反，HS8富集的人MSC群体具有的表面标记表达模式与国际公认的人MSC的定义一致(图22)；
·培养hMSC与HS8提供的人MSC群体具有高水平的CD49a、SSEA-4和STRO-1表达(图22)。相反，将FGF-2作为培养补充物加入hMSC负面影响表达STRO-1的hMSC比例，并导致hMSC的多能性丧失(图22、23和25)；
·HS8增加CFU-F形成；
·HS8增强FGF-2介导的MSC生长(图26)；
·HS8维持FGF2介导的ERK途径信号传导。
·HS8刺激间充质干细胞增殖(图42和43)。
HS8
本发明涉及一类硫酸乙酰肝素分子，称为HS8。HS8分子可由以下方法获得：富集含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述GAG结合于对应于FGF2的肝素结合域的多肽。具体地说，可通过富集硫酸乙酰肝素获得HS8分子，所述硫酸乙酰肝素结合FGF2的肝素结合域，该结构域包含或由具有以下氨基酸序列构成：YCKNGGF。所述富集过程可用于分离HS8。
本发明还涉及富集了HS8的化合物的混合物，以及利用此类混合物的方法。
除了可通过本文所述的方法获得，还可以从功能和结构上限定HS8。
在功能上，HS8能结合具有以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列构成的肽：YCKNGGF(SEQIDNO:2)。所述肽可以在该肽的一端或两端含有一个或多个额外的氨基酸。例如，所述肽可以是GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)。
优选地，HS8与该肽结合的KD小于100μΜ，更优选小于50μΜ、40μΜ、30μΜ、20μΜ、或10μΜ。
优选地，HS8与FGF2结合的KD小于100μΜ，更优选小于50μ、40μΜ、30μΜ、20μΜ、或10μΜ。HS8与FGF2蛋白之间的结合可通过以下试验方法测定。
将FGF2溶解在封闭液(0.2％明胶，SAB配制)，浓度为3μg/ml，用封闭液制备0-3μg/ml的系列稀释液。将200μl的各FGF2稀释液一式三份分配到肝素预包被的肝素/GAG结合板的诸孔中；37℃下温育2小时，用SAB小心洗涤三次，将200μl250ng/ml的生物素化抗FGF2加入封闭液。37℃下温育一小时，用SAB小心洗涤三次，将200μl200ng/ml的ExtrAvidin-AP加入封闭液。37℃下温育30分钟，用SAB和自来水小心洗涤三次以除去残留的液体，加入200μl显色剂(SigmaFAST对硝基苯磷酸酯)。在室温下温育40分钟，在一小时内读取405nm的吸光度。
在该试验中，可以通过测量吸光度测定结合情况，还可以相对于对照测定结合情况，所述对照是例如没有加入硫酸乙酰肝素的情况下的FGF2蛋白，或向其中加入不结合FGF2蛋白的硫酸乙酰肝素的情况下的FGF2蛋白。
相对于非特异性结合以及通过下述方法从其它硫酸乙酰肝素和/或GAG中选择HS8的情况而言，HS8的结合优选是特异性的，所述方法包括选择与包含YCKNGGF，例如SEQIDNO:1的肽或FGF2蛋白表现出高亲和力结合相互作用的硫酸乙酰肝素。
本发明的HS8优选增加干细胞的增殖，同时维持它们的多潜能性或多能性。
用肝素裂合酶I、II和III消化完全后，对得到的二糖片段进行毛细管电泳分析，HS8的二糖组成示于图44和45。
用肝素裂合酶I、II和III消化完全，然后对得到的二糖片段进行毛细管电泳分析测定到，本发明的HS8包括二糖组成在图45中HS8保留物质或在图44中HS8保留物质的各二糖所示标准化百分比值的±10％(更优选±9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％之一)以内的硫酸乙酰肝素。
用肝素裂合酶I、II和III消化完全，然后对得到的二糖片段进行毛细管电泳分析测定到HS8的二糖组成可具有以下任一的二糖组成：
或
或
或
或
或
在优选的实施方式中，所列8种二糖的总重量百分比是100％(任选±3.0％或略少，或±2.0％或略少，±1.0％或略少，±0.5％或略少)。
将HS8与因与生长因子BMP2具有高亲和力而分离的HS，称为HS3(描述于WO2010/030244)进行比较揭示了相比于HS3，HS8结构的不同之处可表征为以下二糖的含量：ΔUA-GlcNS,6S和ΔUA-GlcNS。具体地说，HS8中ΔUA-GlcNS,6S的组成百分比高于HS3，而ΔUA-GlcNS的组成百分比低于HS3。
因此，HS8可表征为具有以下组成百分比：15.5±4.0或更低、或±3.5或更低、或±3.0或更低、或±2.5或更低、或±2.0或更低、±1.5或更低、或±1.0或更低、或±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA-GlcNS,6S。HS8还可表征为具有以下组成百分比：15.7±4.0或更低、或±3.5或更低、或±3.0或更低、或±2.5或更低、或±2.0或更低、或±1.5或更低、或±1.0或更低、或±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA-GlcNS。
HS8还可表征为具有以下组成百分比：12.7±1.5或更低、±1.0或更低、或±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA,2S-GlcNS,6S。
HS8还可表征为具有以下组成百分比：7.2±2.0或更低、±1.5或更低、±1.0或更低、或±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA,2S-GlcNS。
HS8还可表征为具有以下组成百分比：6.5±1.5或更低、±1.0或更低、或±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA,2S-GlcNAc,6S。
HS8还可表征为具有以下组成百分比：8.9±0.5或更低、或±0.25或更低、或±0.1或更低的ΔUA-GlcNAc,6S。
在这些实施方式中，剩余二糖组分的组成百分比可以是以上列出的，或图44或45所示±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％之一。
优选根据实施例18进行肝素裂合酶I、II和III对HS8的消化和/或二糖的毛细管电泳分析。
可如下所述用肝素裂合酶消化HS制品：将HS制品(1mg)各自溶解于500μL乙酸钠缓冲液(100mM含有10mM乙酸钙,pH7.0)，加入2.5mU的各3种酶；37℃下温育样品过夜(24h)并轻柔翻转样品试管(9rpm)；再将2.5mU的各3种酶加入样品，37℃下再温育48小时轻柔翻转样品试管(9rpm)；加热(100℃,5min)停止消化，然后冻干；将消化物重悬在500μL水中，取等份试样(50μL)进行分析。
可如下所述对消化HS制品得到的二糖进行毛细管电泳(CE)：通过将20mMH3PO4的水性溶液加入20mMNa2HPO4.12H2O的溶液获得pH为3.5，从而制备毛细管电泳操作缓冲液；柱洗涤液是100mMNaOH(从50％w/wNaOH稀释)；操作缓冲液和柱洗涤液均使用配有0.2μm乙酸纤维素膜过滤器的过滤器单元过滤；将二糖溶解在水(1毫克/毫升)中制备二糖Is(例如12)的储备液；通过制备含有10μg/100μL各二糖的包含所有标准品的混合物来测定标准品的校准曲线并制备含有10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/100μL的连续稀释液；包括2.5μg的内标(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)。用水稀释HS的消化物(50μL/mL)，将相同的内标加入(2.5μg)各样品。诸溶液冻干并重悬在水(1mL)中。利用PTFE亲水性一次性注射器过滤器单元过滤样品。
如下所示进行分析：25℃下，使用毛细管电泳仪，未涂覆熔融石英毛细管，20mM操作缓冲液，毛细管电压为30kV。在阴极(负极)端采用流体力学注射将样品引入毛细管。每次运行前，用100mMNaOH(2分钟)、水(2分钟)冲洗毛细管，用操作缓冲液(5分钟)预活化。缓冲液补充系统替换入口和出口管中的缓冲液以确保维持一致的体积、pH和离子强度。水仅作为空白在样品序列的开始、中段和结束时运行。监测232nm的吸光度。所有数据存储在数据库中，随后被取出和再处理。可进行一式两份或一式三份的消化/分析，HS消化物中二糖的标准化百分比计算为分析结果的平均值。
在一些实施方式中，HS8具有的平均分子量为18-27kDa。在一些实施方式中，所述平均分子量可以是20-25kDa、21-25kDa、21-24kDa、21-23kDa、20-24kDa、20-23kDa或20-22kDa之一。
在一些实施方式中，HS8链包含至少25个二糖单位。在一些实施方式中，可以是至少26个二糖、至少27个二糖、至少28个二糖、至少29个二糖、至少30个二糖、至少31个二糖、至少32个二糖、至少33个二糖、至少34个二糖、至少35个二糖、至少36个二糖、至少37个二糖、至少38个二糖、至少39个二糖、至少40个二糖、至少41个二糖、至少42个二糖、至少43个二糖或至少44个二糖之一。
为鉴定HS8，发明人使用这样一种方法，该方法涉及富集表现出与具有肝素结合域的特定多肽结合的糖胺聚糖分子。然后鉴定并测试分离的GAG混合物和/或分子调节表达含肝素-结合域蛋白的细胞和组织生长和分化的能力。如此能在体外和体内受控分析特定GAG糖序列对于细胞和组织生长和分化的影响。该方法描述于通过引用纳入本文的PCT/GB2009/000469(WO2010/030244)。本发明人将该方法应用于成纤维细胞生长因子2(FGF2)以分离和表征与FGF2具备高结合(能力)的GAG。
因此，为鉴定HS8，本发明人提供分离能结合具有肝素/乙酰肝素-结合域的蛋白的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供一固体支持物，所述支持物上附着有多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合域；
(ii)将所述多肽分子与含有糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将该多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)从该多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
本发明人还提供通过调节细胞或组织生长或分化能力而鉴定的分离的糖胺聚糖。为此，他们提供鉴定能刺激或抑制细胞和/或组织生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供一固体支持物，所述支持物上附着有多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合域；
(ii)将所述多肽分子与含有糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将该多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)从该多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；
(v)收集解离的糖胺聚糖；
(vi)将收集的糖胺聚糖加入细胞或组织，其中存在含有肝素结合域的氨基酸序列的蛋白；
(vii)检测以下一种或多种情况：细胞的增殖、细胞的分化。一种或多种蛋白标记物的表达。
本发明人采用该方法鉴定能结合FGF2的GAG(它们称为HS8)，其中用于本发明人方法中的多肽包含GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)所示肝素结合域。
在发明人的方法中，包含GAG的混合物可含有合成的糖胺聚糖。然而，优选从细胞或组织中获得的GAG。例如，所述混合物可含有胞外基质，其中通过原位刮削活组织(即，直接从得到该材料的人或动物身体中的组织获取)或通过刮削已从人或动物身体提取的组织(活的或死的)获得所述胞外基质材料。或者，可以从培养基中生长的细胞获得所述胞外基质材料。可以从结缔组织或结缔组织细胞，例如骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱获得所述胞外基质材料。在一个实施方式中，利用市售可得的来自猪粘膜的硫酸乙酰肝素(CelsusHS)。
可以通过本领域技术人员熟知的一系列常规分离步骤(例如，阴离子交换层析)从组织或细胞样品或提取物中提取GAG组分。
GAG混合物可含有不同类型的糖胺聚糖的混合物，可包括硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。优选地，富集与固体支持物相连的GAG混合物以获得硫酸乙酰肝素。可对GAG混合物进行柱层析，例如弱、中等或强阴离子交换层析以及强高压液相色谱(SAX-HPLC)，并选择合适的级分来获得硫酸乙酰肝素富集的GAG级分。
可对收集的GAG作进一步的分析以鉴定GAG，例如测定GAG组成或序列，或测定GAG的结构特征。GAG结构通常是高度复杂的，考虑到目前可用的分析技术，在大多数情况下精确测定GAG序列结构是不可能的。
然而，可对收集的GAG分子进行部分或完全的糖消化(例如，通过亚硝酸进行化学消化或利用裂合酶，例如肝素酶III作酶消化)以产生GAG特征性和鉴别性的糖片段。具体地说，可采用消化以产生二糖(或四糖)来检测所得各二糖的百分比，从而提供GAG的特征性二糖“指纹”。
还可测定GAG的硫酸化模式，并用于测定GAG结构。例如，对于硫酸乙酰肝素，可利用氨基糖和C2、C3和C6位的硫酸化模式表征硫酸乙酰肝素。
二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可与各自提供GAG的独特图谱的其它分析技术联用，例如HPLC、质谱法和NMR。联用时，这些技术可提供确定的GAG结构表征。
例如，相比于CelsusHS(从其获得HS8)和HS3(BMP2结合性HS)，HS8的1HNMR示于图31和32。本发明的HS8可具有对应于图31或32所示HS8图谱的1HNMR图谱。在一些实施方式中，本发明的HS8具有的1HNMR图谱中，4.0-3.5ppm的图谱对应于图32中HS8的图谱(3.8-3.7ppm之间的上线)。在一些实施方式中，本发明的HS8可在约3.8ppm具有峰和/或在约3.7ppm具有峰。在一些实施方式中，HS8因其独特的次甲基和/或亚甲基1HNMR图谱而有别于其它HS8，如图32所示。
GAG和肝素-结合域之间的高亲和力结合相互作用表明GAG含有对这种高亲和力结合相互作用有贡献的特定糖序列。其它步骤可包括测定GAG的完全或部分糖序列，或GAG中参与结合相互作用的关键部分。
可用裂解糖胺聚糖链的试剂，例如裂合酶处理GAG-多肽复合物。裂合酶处理可以切割结合的GAG中未参与多肽的结合相互作用的部分。可保护GAG中参与多肽的结合相互作用的部分以免受裂合酶作用。裂合酶去除后，例如洗涤步骤后，保持与多肽结合的GAG分子代表该多肽的特定结合伴侣(“GAG配体”)。由于较短GAG分子的复杂度较低，GAG配体解离和收集后，可以预期对GAG配体进行较高程度的结构表征。例如，任意糖序列组合(即，GAG配体中所含单糖的基础(线形)序列)、硫酸化模式、二糖和/或四糖消化分析、NMR图谱、质谱法图谱和HPLC图谱可提供高水平的GAG配体结构表征。
本文所用的术语“富集”、“富集的”等描述了这样一种过程(或状态)，凭借该过程，某混合物的相对组成得到(或已得到)改变，从而使得该混合物中一种或多种那些实体的分数增加，而该混合物中一种或多种不同实体的分数降低。通过富集分离的GAG可以是纯的，即，基本上仅含有一类GAG，或者可仍然是不同类型GAG是混合物，相比于起始混合物，所述混合物中结合肝素结合域的特定GAG的比例较高。
当与表达或包含含有肝素结合域的蛋白的细胞或组织接触时，所鉴定的GAG优选表现出功能效应。功能效应可以是调节或加强效应。
所述功能效应可以是促进(刺激)或抑制某类型细胞的增殖或一类细胞类型分化成另一类，或表达一种或多种蛋白标记物。例如，GAG可促进细胞增殖，即，增加细胞数量，或促进干细胞分化成专门化的细胞类型(例如，结缔组织中的间充质干细胞)，促进或抑制表明细胞的多能性或分化状态的蛋白标记物的表达(例如，标记物，如碱性磷酸酶活性，RUNX2、osterix、胶原I、II、IV、VII、X、骨桥蛋白、骨钙蛋白、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白-a(C/EBPα)、脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白2(BSPII)、胶原2a1(Coll2a)和SOX9的检测)。
本文所用的术语“调节效应”应理解为表示第一实体对第二实体的效应，其中在另一种或多种过程中，所述第二实体的正常功能因存在所述第一实体而得到改变。调节效应可以是激动性或拮抗性。
所述调节效应可以是增强效应。术语“增强效应”应理解为表示效力增加的效应。在本发明的优选实施方式中，术语“增强效应”是指第一实体对第二实体的效应，该效应增加所述第二实体在另一种或多种过程中的效力。在本发明的进一步优选的实施方式中，所述增强效应理解为表示分离的GAG对肝素结合因子的效应，其中所述效应增加所述肝素结合因子的效力。
本文所用的“接触”过程涉及两个或多个离散的实体在物理上的密切接近。“接触”的过程涉及两个或多个离散的实体暂时的物理上的密切接近，在一些条件下，足以使得所述两个或多个离散实体的一部分在分子水平上相互作用。优选地，本文所用的“接触”过程涉及具有一种或多种GAG的化合物的混合物与对应于肝素结合因子的肝素结合域的多肽密切接近。“接触”过程的例子包括混合、溶解、溶胀、洗涤。在优选的实施方式中，GAG混合物与多肽的“接触”足以在彼此表现出高亲和力的GAG和多肽之间形成复合物，所述复合物可以是共价的，但优选非共价的。
所述多肽可包含具有肝素结合域的所选蛋白的全长或几乎全长基础氨基酸序列。由于较长多肽中可发生的折叠可能遮掩GAG混合物的肝素结合域，优选该多肽是短多肽。优选地，所述多肽具有包含肝素结合域的氨基酸序列，任选在该肽的N-和C-末端的一端或各端包含一个或多个氨基酸。这些额外的氨基酸能够在多肽中添加将该多肽连接于固体支持物所需的接头或连接分子。
在本发明方法的优选实施方式中，除了肝素结合域中氨基酸的数量外，所述多肽含有1-20，优选1-10，还有要优选1-5个额外的氨基酸。在一些实施方式中，肝素结合域的氨基酸序列占该多肽氨基酸的至少80％，优选至少90％，还要优选至少95％。为将多肽附着于固体支持物的表面，所述多肽宜经修饰以包含分子标签，而固体支持物的表面经修饰以掺入对该分子标签具有高亲和力的相应分子探针，即，分子标签和探针形成结合配对。标签和/或探针可以选自以下任一种：抗体、细胞受体、配体、生物素、这些结构的任何片段或衍生物、上述物质的任何组合、或可以设计或构建特异性结合或缔合于探针的任何其它结构。适合用作标签和探针的优选结合配对是生物素和亲和素。
多肽衍生自感兴趣的蛋白，在本案中是FGF2。“衍生自”表示该多肽因其含有感兴趣蛋白中存在的肝素结合域的氨基酸序列而被选中、选择或制备。可以从感兴趣蛋白中的氨基酸序列出发，对肝素结合域的氨基酸序列作修饰，例如研究肝素结合域序列中的改变对GAG结合的影响。
在本说明书中，所述蛋白是FGF2。优选的肝素结合域的氨基酸序列是GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)[其在人FGF2的氨基酸157-172中发现]或具有序列YCKNGGF(SEQIDNO:2)的序列。
本领域技术人员应该理解，特定多肽的氨基酸序列中的小改变可以维持该部分的固有功能。还应理解某肽内的某些氨基酸残基被等排和/或等电的其它氨基酸残基取代可维持或改进未取代肽的某些特性。这些改变也包括在本发明的范围内。例如，有时用氨基酸丙氨酸取代氨基酸甘氨酸(反之亦然)仍能维持该肽的一种或多种特性。术语“等排”是指两个实体之间的空间相似性。在适当升高温度下等排的部分的两个例子是异丙基和叔丁基。术语“等电”是指两个实体之间的电学相似性，例子是两个实体具有pKa相同或相似的官能团。
对应于肝素结合域的多肽可以是合成或重组的。
固体支持物可以是具有表面的任何基材，所述表面可通过共价键或非共价键直接或间接与分子相连。固体支持物可包括能为连接于表面的探针提供物理支持作用的任何基材。其可以是基质支持物。该材料通常能耐受与探针连接于表面相关的条件以及在试验进行期间遇到的任何后续处理、操控或加工。这些材料可以是天然产生的、合成的或经天然产生材料修饰的。固体支持物可以是塑料材料(包括聚合物，例如，聚氯乙烯)、环烯烃共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚四氟乙烯(PTFE或)、尼龙、聚丁酸乙烯酯))等，它们可以单用其自身或与其它材料联用。可以考虑其它刚性材料，例如玻璃，包括二氧化硅，还包括，例如可作为生物玻璃(Bioglass)的玻璃。可以使用的其它材料包括多孔材料，例如可控孔径玻璃珠。还考虑了本领域已知的任何其它材料，所述其它材料能够在其表面上掺入一个或多个官能团，例如氨基、羧基、巯基或羟基官能团中的任一个。
优选的固体支持物包括在其表面固定了多肽的柱。所述表面可以是柱壁，和/或可以由填入该柱中间的珠提供。
所述多肽可以固定在固体支持物上。固定方法的例子包括：吸附、共价结合、包埋和膜约束(membraneconfinement)。在本发明的优选实施方式中，多肽和基质之间的相互作用基本上是永久的。在进一步优选的本发明实施方式中，肽和基质之间的相互作用对于离子交换层析是惰性的。在优选的配置中，多肽连接于固体支持物的表面。应理解，本领域技术人员可以具有各种选择以便通过化学和/或物理方法将两个实体彼此连接。这些选择均包括在本发明的范围内。在优选的配置中，多肽通过生物素与链霉亲和素的相互作用而吸附于固体支持物。在该配置的代表性例子中，生物素分子共价连接于多肽，然后生物素-多肽偶联物结合于链霉亲和素，进而共价连接于固体支持物。在另一配置中，可利用间隔或接头部分连接生物素分子与多肽，和/或连接链霉亲和素与基质。
将GAG混合物与固体支持物接触可以形成GAG-多肽复合物。从固体支持物中除去混合物的其余部分，例如洗涤固体支持物以洗脱未结合的材料将这些复合物与混合物的其余部分分开。如果利用柱作为固体支持物，可从柱上洗脱GAG混合物中未结合的组分，留下与柱结合的GAG-多肽复合物。
应该理解，某些寡糖可与多肽以非特异性方式相互作用。在某些实施方式中，与多肽以非特异性方式相互作用的寡糖可以包括在富集了可调控肝素结合因子的一种或多种GAG的化合物的混合物中，或者排除在该混合物外。非特异性相互作用的例子是临时约束在大小和/或形状合适的分子的袋内。此外，应该理解，相比于根本不与肽显示出相互作用的那些寡糖，这些寡糖洗脱得较慢。此外，应该理解，与以特异性方式结合的那些化合物不同，非特异性结合的化合物可能无需输入相同的外部刺激(例如，通过离子交换)以使它们洗脱。本发明人的方法能将寡糖的混合物分成该混合物的以下组分：以特异性方式结合于多肽的；以非特异性方式结合于多肽的；和不结合多肽的。对于各GAG-肽配对操作性确定这些名称。
通过改变发生GAG与多肽结合的固体支持物表面上存在的条件(例如，盐浓度)，可以选择对肝素-结合域具有最高亲和力和特异性的那些GAG。因此，可以获得对于感兴趣蛋白和/或感兴趣蛋白的肝素结合域具有高结合亲和力的GAG。结合亲和力(Kd)可以选自以下一种：低于10μΜ、低于1μΜ、低于100nM、低于10nM、低于1nM、低于100pM。
所述方法获得的GAG可用于体外和/或体内的各种领域。可提供GAG以便在细胞或组织的体外培养或在体内细胞或组织中用于刺激或抑制细胞或组织生长和/或增殖和/或分化。
可以为此类目的将GAG作为制剂提供。例如，可以提供包含通过所述方法获得的GAG，即，包含HS8的培养基。
可以收集在有HS8存在下从体外细胞或组织培养物获得的细胞或组织并植入需要治疗的人或动物患者。因此，可以提供植入细胞和/或组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)体外培养与HS8接触的细胞和/或组织；
(b)收集所述细胞和/或组织；
(c)将所述细胞和/或组织植入需要治疗的人或动物对象。
在步骤(a)中，与HS8接触的细胞和/或组织的培养时期足以允许所述细胞或组织生长、增殖或分化。例如，所述时期可以选自：至少5天、至少10天、至少20天、至少30天或至少40天。
在另一实施方式中，可将HS8配制用于医学治疗方法，包括预防或治疗损伤或疾病。可提供包含HS8和药学上可接受的稀释剂、载体或辅助剂的药物组合物或药物。可提供此类药物组合物或药物以便预防或治疗损伤或疾病。还提供了HS8在制备用于预防或治疗损伤或疾病的药物中的应用。本发明的药物组合物和药物还可任选包含具有与GAG结合的肝素结合域的感兴趣蛋白(即，FGF2)。在进一步的实施方式中，所述药物组合物和药物还可包含干细胞，例如间充质干细胞。
治疗损伤或疾病可包括细胞或组织，例如结缔组织(如骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱)的修复、再生或替换。为修复组织，可将包含HS8的药物组合物或药物直接给予损伤或疾病部位以刺激新组织的生长、增殖和/或分化，从而实现损伤的修复或治愈或缓解(例如，减轻症状)疾病状况。可通过在药物组合物或药物中组合干细胞来改善组织的修复或再生。
为替换组织，可在细胞和/或组织的体外培养期间将HS8与细胞和/或组织接触以产生植入患者的损伤或疾病部位的细胞和/或组织。可采用植入细胞或组织，通过替换受损或患病组织来实现患者中受损或患病组织的修复。这可包括切除受损/患病组织和植入在与HS8接触下培养细胞和/或组织来制备的新组织。
因此，本发明的药物组合物和药物可包含以下之一：
(a)HS8；
(b)HS8与干细胞的组合；
(c)HS8与含有HS8所结合的肝素结合域(例如，SEQIDNO:1)的蛋白的组合；
(d)HS8与干细胞以及含有HS8所结合的肝素结合域(例如，SEQIDNO:1)的蛋白的组合；
(e)在与HS8接触下培养细胞或组织获得的组织或细胞。
HS8可用于修复或再生身体组织，特别是骨再生、神经再生、骨骼组织构建、心血管损伤修复及胚胎和成人干细胞的扩增和自我更新。因此，HS8可用于预防或治疗各种疾病和损伤，包括任何类型的骨关节炎、软骨置换、骨折(例如，椎间盘融合术治疗、长骨骨折、颅骨缺损)、临界或骨不连骨缺损修复。
HS8在组织修复、再生或替换中的应用可包括在伤口愈合中的应用，例如加速伤口愈合、治愈疤痕或骨组织和组织移植。
在另一方面，本发明提供包含HS8的生物学支架。在一些实施方式中，本发明的生物学支架可用于矫型、血管、假体、皮肤和角膜应用。本发明提供的生物学支架包括延长释放药物递送装置、组织瓣、组织瓣小叶(tissuevalveleaflet)、药物洗脱支架、血管移植物、创面愈合或皮肤移植、和矫型假体，例如骨、韧带、肌腱、软骨和肌肉。在本发明的优选实施方式中，所述生物学支架是导管，其中内(和/或外)表面包含连接于导管的一种或多种GAG化合物(包括HS8)。
在另一方面，本发明提供通过所述方法分离的一种或多种GAG(包括HS8)，以便用作辅助剂。所述辅助剂可以是免疫佐剂。
在另一方面，本发明提供药学上可接受的制剂，所述制剂包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集了HS8。在另一方面，本发明提供药学上可接受的制剂，包含：
(i)包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集了HS8；和
(ii)FGF2，
以供分别、同时或顺序给药。在优选的实施方式中，所述制剂包含含有一种或多种GAG的化合物并与FGF2密切混合的混合物，所述混合物富集了HS8，所述制剂同时给予需要治疗的患者。
在另一方面，本发明提供试剂盒以便用于组织的修复、或再生，所述试剂盒装有(i)预定量的HS8，和(ii)预定量的FGF2。
可以将本发明的富集混合物的化合物以其药学上可接受的盐给予对象。例如，本发明富集混合物中化合物的碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子形成的那些盐，所述阳离子是，例如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵。本发明的范围包括阳离子盐，例如钠盐或钾盐。应该理解，可将本发明富集混合物中具有羧酸基团的化合物以可给予的前药形式递送，其中酸部分被酯化(从而具有-CO2R'形式)。术语“前药”特别涉及-OR'基团在体内转化为-OH，或从其转化为羧酸酯阴离子。所以，本发明的前药可起到提高药物吸收和/或药物递送入细胞的作用。细胞酶，例如脂酶和酯酶或者化学切割，例如体内酯水解可促进前药的体内转化。可配制本发明各方面的药物和药物组合物以便通过许多途径施用，包括但不限于在疾病或损伤部位进行注射。所述药物和组合物可以配制成液体或固体形式。可以配制液体制剂以便通过注射给予至人或动物体的选定区域。
给药优选以“治疗有效量”进行，该用量足以对个体显示益处。实际给药量、给药速度和时程取决于所治疗损伤或疾病的性质和严重程度。为治疗开处方，例如决定剂量等等是普通专业人员和其它医学医师的职责所在，通常要考虑有待治疗的疾病、个体患者的条件、递送部位、给药方法和专业人员已知的其它因素。上述技术和方案的例子可见于《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences),第20版,2000出版.LWW公司(Lippincott,Williams&Wilkins)。
干细胞
与HS8接触的细胞包括干细胞。
HS8可用于干细胞的增殖和/或分化，和/或干细胞的谱系定型(lineage-commitment)。
本文培养和描述的干细胞可以是任何类型的干细胞。它们可以是全能的或多能的(多潜能的)。它们可以是任何组织的胚胎或成人干细胞，可以是造血干细胞、神经干细胞或间充质干细胞。优选地，它们是成人干细胞。
在本说明书中，干细胞表示具有分裂(如，自我更新)和维持全能或多能(多潜能)并产生专门化细胞的能力的任何细胞类型。
本发明中培养的干细胞可以获自或源自已有的培养物或细胞系，或直接来自任何成人、胚胎或胎儿组织，包括血液、骨髓、皮肤、上皮细胞或脐带(通常丢弃的组织)。
可以采用合适的试验测定干细胞的多能性。此类试验可包括检测多潜能性的一种或多种标记物，例如，碱性磷酸酶活性，检测RUNX2、成骨相关转录因子(osterix)、胶原I、II、IV、VII、X、骨桥蛋白、骨钙素、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)、脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白2、(BSPII)、胶原2a1(Coll2a)和SOX9。
在一些优选的实施方式中，所述干细胞是间充质干细胞(MSC)，例如能分化成结缔组织和/或骨细胞，例如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。
间充质干细胞可通过微创技术，方便地从骨髓中获得，可以培养扩增，并能分化成所需的细胞系。分化可以通过应用特定的生长因子来诱导。转化生长因子β(TGF-β)超家族成员蛋白，如骨形态发生蛋白(BMP)是间质干细胞的软骨细胞和成骨分化的重要影响因素。
可以使用选择标记物，例如STRO-I从CD34+级分分离和检测间充质干细胞，从而表明它们的骨髓再增殖潜能。这些细胞表面标记物只在间充质干细胞的细胞表面上发现，并且是细胞多潜能性的指示。
可以从骨髓抽吸物收集的骨髓单个核细胞(BMMNC)(例如Wexler等.成人骨髓是人间充质干细胞的丰富来源但脐带和动员成人血不是(Adultbonemarrowisarichsourceofhumanmesenchymal'stem'cellsbutumbilicalcordandmobilizedadultbloodarenot).HAEMOPOIESISANDLEUCOCYTESBritishJournalofHaematology121(2):368-374,April2003.)或脐带的华氏胶组织(例如Ta等.华氏胶组织衍生的间充质干细胞的长期扩增和多潜能标记试验分析(Long-termExpansionandPluripotentMarkerArrayAnalysisofWharton'sJelly-DerivedMesenchymalStemCells).StemCellsDev.2009年7月20日(电子公开))获得或衍生合适的间充质干细胞。
间充质干细胞可以通过施加本领域公知的合适分化因子分化多潜能干细胞，如人胚胎干细胞或诱导型多潜能干细胞而获得。
间充质干细胞是具有生成软骨、骨、肌肉、肌腱、韧带和脂肪组分的能力的多潜能能(多能)祖细胞。这些原始祖细胞出生后即存在，并表现出干细胞特征，即，低发生率和广泛的更新潜力。这些特性结合它们的发育可塑性已经在它们潜在用于替换受损组织中产生了极大兴趣。从本质上说，可以培养这些干细胞，以扩大它们的数量，然后移植到受损部位或在接种在支架内/支架上后产生适当的组织构建物。
因此，在骨结合导电或电感性支架以支持并与引导再生的情况下，骨骼、肌肉、肌腱、韧带和血液修复/再生的备选方法是选择、扩增和调节合适的祖细胞，例如成骨祖细胞(例如间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、骨干细胞或骨前体细胞)，并结合审慎选择特定的组织生长因子。
干细胞可以从任何动物或人获得，例如非人动物，如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿类动物(包括啮齿目的任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类或其它非人脊椎动物机体；和/或非人哺乳动物；和/或人。优选地，它们是人。任选地，它们是非人。任选地，它们是非胚胎干细胞。任选地，它们不是全能的。
在还有一方面，本发明提供包含本发明任何方法产生的干细胞或其它细胞或其片段或产物的药物组合物。所述药物组合物可用于医学治疗方法。合适的药物组合物还可包含药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂。
在本发明的另一方面，本发明任何方法产生的干细胞或其它细胞可用于医学治疗方法；优选地，提供一种医学治疗方法，包括给予需要治疗的个体治疗有效量的所述药物或药物组合物。
本发明的培养方法和技术获得的干细胞和其它细胞可用于分化成另一细胞类型以便用于医学治疗方法中。因此，分化的细胞类型可以源自通过所述培养方法和技术获得的干细胞(随后能进行分化)，并可视作该干细胞的产物。可提供药物组合物，包含此类分化的细胞和任选的药学上可接受的载体、辅助剂或稀释剂。此类药物组合物可用于医学治疗方法。
间充质干细胞
间充质干细胞(MSC)最初从骨髓中分离，在总共104-105个骨髓单个核细胞(BMMNC)中仅存在一个(Friedenstein等.1966)。这些细胞能产生衍生自单细胞前体的集落，复制CFU-F(集落形成单位成纤维细胞)群体。现在，在许多其它组织中鉴定到MSC，包括脂肪组织(Gimble和Guilak2003；Zuk等.2001)、脐带血(Bieback等.2004；Erices等.2000；Goodwin等.2001；Kogler等.2004；Wagner等.2005)和肌肉(Jiang等.2002)。
多能人间充质基质细胞(MSC)的最低标准见于细胞治疗国家间协会(InternationSocietyforCellularTherapy)(Dominici等Cytotherapy(2006)第8卷,No.4,315-317)。他们提出定义人MSC的3条标准：附着于塑料、特异性表面抗原表达和多能分化潜能。具体地说，他们认为“首先，当利用组织培养瓶在标准培养条件下维持时，MSC必须是塑料附着的。其次，通过流式细胞术检测到，≥95％的MSC群体必须表达CD105、CD73和CD90。此外，这些细胞必须缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和II类HLA(HLA-DR)的表达(≤2％阳性)。第三，这些细胞必须能够在标准体外分化条件下分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞”。
Dominici等还描述到MSC最独特的特性是采用标准体外组织培养-分化条件，它们的三谱系间充质分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的性能。他们确认通过Alizarin红染色或vonKossa染色可证明向成骨细胞分化，通过油红O染色证明脂肪细胞分化，通过Alcian蓝染色或II型胶原的免疫组化染色证明成软骨细胞分化。Dominici等描述到此类试验的试剂盒是市售可得的，并证实对于所有调查，分化应是可行的。
Dominici等还认识到将来可鉴定到新型表面标记物，也能用于确定人MSC。目前知晓3种此类标志物：CD49a、SSEA-4和STRO-1。
Rider等报道与未分选的细胞相比，CD49a+克隆的CD90和CD105表达增强，证实与未分选的细胞相比，CD49a+克隆易于经多谱系分化成脂肪、骨和软骨，从而支持α-1整联蛋白(CD49a)选择对于富集间充质干细胞的用途，并提供从骨髓单个核干细胞的异质库中选择大多数多能细胞的策略(Rider等.J.Mol.Hist(2007)38:449-458)。Rider等还报道CFU-F细胞与CD49a的表达相关，表达CD49a的CFU-F细胞也共表达STRO-1，CD49a可用于从除人以外的大鼠和小鼠分离MSC，从而表明它可能是用于富集的保守性标志物。
Gang等报道阶段特异性胚胎抗原SSEA-4也鉴定到成人间充质干细胞群体并可用于分离MSC，所述SSEA-4通常用作未分化的多潜能人胚胎干细胞和分裂为囊胚期胚胎的标志物(Gang等.,Blood2007；109:1743-1751)。Gang等还描述了结合表面标志物STRO-1的单克隆抗体在富集克隆源性基质细胞(CFU-F)-所谓的STRO-1+亮中的应用。
糖胺聚糖
本文所用的术语“糖胺聚糖”和“GAG”可互换使用，应理解为是指一种大的分子集合，包括其中一个或多个结合的糖具有氨基取代基的寡糖，或其衍生物。GAG的例子是硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸皮肤素、透明质酸和硫酸乙酰肝素。
本文所用的术语“GAG”还延伸至包括作为GAG偶联物的那些分子。GAG偶联物的实例是蛋白糖胺聚糖(proteoglycosaminoglycan，PGAG，蛋白聚糖)，其中肽组分共价结合到寡糖组分。
硫酸乙酰肝素(HS)
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多样化亚组，由共价连接至蛋白质骨架的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖侧链构成。核心蛋白存在三种主要形式：分泌形式，称为串珠素(perlecan)；锚定在质膜中的形式，称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)，和跨膜形式，称为多配体蛋白聚糖(syndecan)。它们是哺乳动物细胞表面和细胞最外基质的普遍存在的成分。还有其它蛋白，如集聚蛋白(agrin)或淀粉样前体蛋白，其中的HS链可以连接到不常发现的核心。
“硫酸乙酰肝素”(“硫酸乙酰肝素”或“HS”)最初在高尔基体中作为多糖合成，由串联重复的D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)组成。新生多糖随后可在一系列步骤中进行修饰：GlcNAc的N-脱乙酰化/N-硫酸化，GlcA的C5差向异构化成艾杜糖醛酸(IdoA)，IdoA和GlcA在C2的O-硫酸化，N-磺基葡糖胺(GlcNS)在C6的O-硫酸化和GlcNS在C3的临时(occasional)O-硫酸化。HS的N-脱乙酰化/N-硫酸化、2-O-、6-O-和3-O-硫酸化分别由HSN-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶(HSNDST)、HS2-O-磺基转移酶(HS2ST)、HS6-O-磺基转移酶(HS6ST)和HS3-O-磺基转移酶介导。在各修饰步骤，只有一小部分潜在的底物得到修饰，从而导致相当大的序列多样性。HS的这种结构复杂性使得难以确定其序列并难以了解HS结构与功能之间的关系。
硫酸乙酰肝素侧链由交替排列的D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸及D-葡糖胺构成，由(1->4)糖苷键连接。葡糖胺通常是N-乙酰化或N-硫酸化的，糖醛酸和葡糖胺均可以额外O-硫酸化。特定HSPG对特定结合配体的特异性是由连接于葡糖胺和糖醛酸的羧基、乙酰基和硫酸酯基的特定模式产生的。相比于肝素，硫酸乙酰肝素含有较少的N-和O-硫酸基和更多的N-乙酰基。硫酸乙酰肝素侧链通过四糖连接键(-葡糖醛酸基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→4)-木糖基-β-1-O-(丝氨酸))区域连接于核心蛋白的丝氨酸残基。
硫酸乙酰肝素链和核心蛋白均可经历一系列修饰，从而可能最终影响其生物活性。据信，HS的复杂性超过核酸的(Lindahl等,1998,J.Biol.Chem.273,24979；Sugahara和Kitagawa,2000,Curr.Opin.Struct.Biol.10,518)。HS种类中的变化源自糖残基的非随机、高度硫酸化序列的合成，所述糖残基由含N-乙酰化葡糖胺的二糖的未硫酸化区域隔开。N-乙酰氨基葡糖向N-磺基氨基葡糖的初始转化产生了可供其它修饰的焦点，包括葡糖醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸和葡糖胺或艾杜糖醛酸上O-硫酸化的复杂模式。另外，在未修饰的、低硫酸化、N-乙酰化序列内，所述六糖醛酸(hexuronate)残基保留为葡糖醛酸，而在高度硫酸化的N-硫酸化区域内，C-5差向异构体艾杜糖醛酸占优势。如此限制了任何给定链中可能的潜在二糖变体数量，但不限制各自的丰度。大多数修饰发生在N-硫酸化结构域，或直接与它们相邻，因此，在成熟链中存在由低硫酸化结构域隔开的高硫酸化区域(Brickman等.(1998),J.Biol.Chem.273(8),4350-4359,其通过引用全文纳入本文)。
据估计，高度可变的硫酸乙酰肝素链经由自分泌、近分泌和旁分泌反馈回路的复杂组合而在调节大量胞外配体的作用中起到关键作用，包括生长和附着因子的调节和呈递到细胞，从而控制胞内信号传导，藉此控制干细胞的分化。例如，即便可以在遗传学上描述硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(Alberts等(1989)加兰出版公司-GarlandPublishing，纽约和伦敦，第804和805页)，但从单一来源分离的诸硫酸乙酰肝素糖胺聚糖物质在生物学活性上可能不同。如Brickman等(1998,Glycobiology8,463)所述，基于促有丝分裂状态，从神经上皮细胞获得两个不同的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖集合可特异性激活FGF-1或FGF-2。类似地，硫酸乙酰肝素(HS)与FGF-1或FGF-2相互作用的能力描述于WO96/23003。根据本专利申请，能够与FGF-1相互作用的相应HS是在约11至约13胚胎日从鼠科细胞获得，而能够与FGF-2相互作用的HS是在约8至约10胚胎日获得。
如上所述，HS的结构在HS之间是非常复杂和可变的。实际上，HS结构的变化被认为在致使各HS具备促细胞生长和引导细胞分化的不同活性中发挥重要作用。结构复杂性被认为是超过核酸的复杂性，虽然HS结构可以表征为具有特定和独特硫酸化模式的重复二糖单位的序列，但在目前，没有对应于核酸测序的标准测序技术可用于测定HS序列结构。没有测定明确的HS序列结构的简单方法，技术人员只能通过许多分析技术现场鉴定HS分子并进行结构表征。这些技术包括以下的一种或组合：二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量测定。这些分析技术是本领域技术人员熟知和使用的。
从HS生产二-和四-糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂合酶消化。仅为举例，实施这些消化技术的方式描述如下，这样的描述并不限制本发明的范围。
亚硝酸消化
基于亚硝酸的硫酸乙酰肝素的解聚导致在完成时，碳水化合物链最终降解成其各二糖组分。
例如，可以将250μl0.5MH2SO4和0.5M的Ba(NO2)2分别在冰上冷却15分钟来制备亚硝酸。冷却后，将Ba(NO2)2和H2SO4混合，涡流振荡，然后离心以除去硫酸钡沉淀。将125μlHNO2加入重悬在20μlH2O的GAG样品，涡流振荡，然后在25℃温育15分钟，并不时混合。温育后，将1MNa2CO3加入样品，使pH为6。然后，将0.1MNaOH配制的100μl0.25MNaBH4加入样品，混合物加热到50℃，20分钟。然后将混合物冷却至25℃，加入酸化冰醋酸以使样品的pH为3。再用10MNaOH中和混合物，并通过冷冻干燥减小体积。用Bio-GelP-2柱分离最终的样品中的二-和四-糖，以验证降解程度。
裂合酶消化
肝素酶(Heparinise)III在葡糖醛酸连接键处裂解糖链。该系列肝素酶(I、II和III)通过在特定硫酸化识别位点解聚某些硫酸乙酰肝素序列而各自显示相对比活性。肝素酶I沿HS链切割含NS区域的HS链。如此破坏了硫酸化结构域。肝素酶III解聚含NA结构域的HS，从而导致碳水化合物链分成各个硫酸化结构域。肝素酶II主要在发现不同硫酸化模式的HS链的NA/NS“肩”结构域中进行切割。注意：乙酰肝素聚合物的重复二糖骨架是与氨基糖葡糖胺相连的糖醛酸。“NS”是指氨基糖在氨基上具有硫酸基团，从而能硫酸化C2、C6和C3上的其它基团。“NA”表示该氨基未硫酸化，并保持乙酰化。
例如，为用肝素酶III在NA区中解聚，在包含20mMTris-HCl,0.1mg/mlBSA和4mMCaCl2pH7.5的缓冲液中制备酶和冻干的HS样品。纯粹为举例，肝素酶III可以每微克HS5mU加入，37℃下温育16小时，然后加热至70℃,5分钟来停止反应。
可通过柱层析洗脱二-和四-糖。
骨折
在一些方面，本发明涉及HS8治疗骨折的治疗应用(人药和/或兽药)。
骨折是一种医学状况。在本申请中，“骨折”包括骨的破坏或损伤，其中骨破裂、断裂或碎裂。破碎是指骨中的不连续。骨折可以是物理冲击或机械应力或由医学状况，如骨质疏松症或骨关节炎引起。
骨折的骨科分类包括封闭或开放，单纯或多段骨折(multi-fragmentaryfracture)。在闭合骨折中，皮肤保持完整，而在开放骨折中骨头可以通过伤口部位露出，从而有较高的感染风险。单纯性骨折沿着单一线发生，趋向于将骨分成两块。多段骨折将骨分成多片。
其它骨折类型包括压缩性骨折、压缩骨折、螺旋状骨折、完全和不完全性骨折、横骨折、直骨折和斜骨折以及粉碎性骨折。
在大多数对象中，骨愈合(骨折愈合)自然发生，并在损伤后开始。出血通常导致凝血和吸引白细胞及成纤维细胞，然后生产胶原纤维。之后是骨基质(钙羟基磷灰石)沉积(矿化)，从而将胶原基质转化到骨中。不成熟的再生骨通常比成熟骨弱，随着时间的推移，不成熟的骨经历重塑过程，以产生成熟的“层状”骨。完整的骨愈合过程需要相当长的时间，通常为几个月。
发生骨折并且可从用HS8治疗中受益的骨包括所有的骨类型，尤其是所有哺乳动物的骨，包括但不限于，长骨(例如股、肱骨、指骨)、短骨(如腕骨、跗骨)、平骨(如颅骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆带)、不规则骨(如椎骨)、籽骨(如髌骨)。
发生骨折并且可从用HS8治疗中受益的骨包括骨骼骨(即骨骼的任何骨)、颅面部区域的骨、中轴骨骼的骨(如椎骨、肋骨)、附肢骨(如四肢的骨)、骨盆骨骼的骨(如骨盆)。
发生骨折并且可从用HS8治疗中受益的骨还包括头(颅骨)和颈部的那些骨，包括面部的那些骨，例如颚、鼻和面颊。HS8可以用于帮助牙科或面部或颅骨手术期间骨的修复或再生，可包括面部和/或口腔的骨(不同于牙齿)的重建，例如包括颚骨。
骨折还包括病理性孔隙，例如骨质疏松症对象表现出的。
尽管不局限于本发明，HS8的主要作用于伤口部位内、附近的细胞，或使之迁移入伤口部位，还可作用于间充质干细胞、骨干细胞，前成骨细胞或成骨细胞，或作用于创面床发现的任何辅助或血管细胞或使之因迁移入创面床。
提供HS8和含HS8的药物组合物及药物以便用于哺乳动物对象中的骨折治疗方法。治疗可以包括骨中的伤口愈合。治疗可涉及骨的修复、再生和生长。HS8通过促进新骨生长促进骨折修复。HS8起到提高骨折修复速度，使骨愈合加生，提高从损伤中恢复的时间的作用。治疗可能会导致骨强度提高。
治疗还可以包括治疗骨质疏松症或骨关节炎。
优选将HS8施用至骨折附近的组织。这可以包括直接施用于发生骨折的骨组织。可以施用于骨或骨折附近的结缔组织，或施用于骨附近的脉管系统(例如，血管)以供应骨(营养)。可以直接施用于受损部位并可施用于伤口初始愈合形成的愈伤组织。本发明的药物和药物组合物可以通过多种途径来配制以便给药。最优选将HS8配制成流体或液体形式以供注射。
在一些实施方式中，将HS8配制为控释制剂，例如配制成药物胶囊以供植入伤口部位。HS8可以附着、浸渍或浸透到载体材料(如生物材料)，如纳米纤维或生物可降解的纸或织物。
包含HS8的药物组合物、药物、植入物和假体还可包含FGF2。由于HS8结合FGF2的能力，HS8可用作FGF2的载体以协助将FGF2递送到伤口部位。
给药优选以“治疗有效量”进行，与对应的未治疗骨折相比，该用量足以改善骨折的愈合。实际给药量、给药速度和时程取决于骨折的性质和严重程度。治疗处方，例如决定剂量等等是普通专业人员和其它医学医师的职责所在，通常要考虑骨折的性质、个体患者的条件、递送部位、给药方法和专业人员已知的其它因素。可按照开处方医学专业人员的指导，给予HS8剂量的单次或多次给药。纯粹举例，HS8的递送剂量是至少1ng/ml、更优选至少5ng/ml，任选10ng/ml或更高。各HS8剂量可以在低于1mg和高于1μg的级别，例如以下之一：约5μg、约10μg、约25μg、约30μg、约50μg、约100μg、约0.5mg、或约1mg。上述技术和方案的例子可见于《雷明顿药物科学》,第20版,2000出版.LWW公司。
HS8可连同其它治疗用于治疗骨折，如给予止痛或抗炎药物，骨的固定化和安置，例如用石膏固定受损的肢体，外科手术介入，如重置骨或移动骨以纠正移位、弯曲或错位。如果需要外科手术，HS8可以在外科手术过程中直接给予(例如，施用于)骨折处。
生物材料
本发明的药物组合物和药物可采取涂覆和/或浸渍有HS8的生物材料形式。植入物或假体可以由生物材料制成。这样的植入物或假体可手术植入以帮助细胞的移植、骨生长、组织再生、组织重构和/或组织重塑。
HS8可应用于植入物或假体，以加速所需位置的新组织形成。应该理解，不同于蛋白质，硫酸乙酰肝素特别坚固，能够更好地耐受合成生物支架的制造和应用于植入物和假体所需的溶剂。
该生物材料可以涂覆或浸渍有HS8。浸渍可以包括通过混合HS8与生物材料的构成组分，例如在聚合过程中，或将HS8吸附到生物材料来形成所述生物材料。涂覆可以包括将HS8吸附到生物材料表面上。
生物材料应能使在给予或植入对象时，涂覆或浸渍的HS8从生物材料释放出来。生物材料释放动力学特征可以通过改变生物材料的结构，例如孔隙率来改变。
除了用HS8涂覆或浸渍生物材料，可以将一种或多种生物活性分子浸渍或涂覆在生物材料上。例如，选自下组的至少一种：BMP-2、BMP-4、OP-1、FGF-1、FGF-2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、VEGF、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白。除了上述生物活性分子，或替代地，可将一种或多种二膦酸盐(或酯)与HS8一起浸渍或涂覆于生物材料。有用的二膦酸盐(或酯)的实例可以包括选自下组的至少一种：依替膦酸盐(etidronate)、氯膦酸盐(clodronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、利塞膦酸盐(risedrohate)、唑来膦酸盐(zoledronate)。
用HS8涂覆或浸渍的生物材料可用于医学和兽医学目的。应该理解，本发明可改善患者的生活质量或可能延长动物的寿命，例如用于配种的昂贵赛马。
生物材料提供了支架或基质支持物。生物材料可以适于植入组织，或可以适于给药(例如，作为溶液中的微胶囊)。
植入物或假体应该是生物相容的，例如无毒和低免疫原性的(最优选无免疫原性)。生物材料可以是生物可降解的，从而使得生物材料随着伤口发生愈合而降解，最后仅在对象中原位留下再生的骨。或者，可以利用生物不可降解的生物材料，例如，以在大的不连续部位引导骨再生和/或在骨愈合期间用作结构支持物，其中在伤口成功愈合后手术去除生物材料为可选的要求。
生物材料可以是软的和/或柔性的，例如水凝胶、纤维蛋白网或网孔、或胶原海绵。“水凝胶”是在天然或合成的有机聚合物被设置或固化以产生三维开放晶格结构时形成的物质，该结构截留水或其它溶液的分子以形成凝胶。固化可通过聚集、凝聚、疏水相互作用或交联而产生。
或者，生物材料可以是相对刚性的结构，例如形成自固体材料，如塑料或生物惰性金属，如钛。
该生物材料可以具有交联聚合物提供的多孔基质结构。基质优选对骨生长所需的营养物质和生长因子是可渗透的。
基质结构可以通过交联纤维(例如，纤维蛋白或胶原)、或藻酸钠、脱乙酰壳多糖的液体膜、或其它聚糖与合适的交联剂(如钙盐、聚丙烯酸、肝素)形成。或者，支架可以形成为凝胶，通过胶原或藻酸盐制备，使用本领域技术人员熟知的方法进行交联。
基质形成的合适聚合物材料包括但不限于，可选自下组的生物可降解/生物可吸收聚合物：琼脂糖、胶原、纤维蛋白、壳聚糖、聚己内酯、聚(DL-丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、植物血凝素(polyhydroxyalcanoate)、它们的共聚物，或选自下组的生物不可降解的聚合物：醋酸纤维素、丁酸纤维素、藻酸盐、聚砜、聚氨酯、聚丙烯腈、磺化聚砜、聚酰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它们的共聚物。
胶原因其生物相容性和支持细胞附着的有利特性和功能而成为一种有前途的材料(美国专利号5,019,087；Tanaka,S.、Takigawa,T.、Ichihara,S.和Nakamura,T.生物可吸收的聚乙醇酸-胶原神经导管的机械特性(Mechanicalpropertiesofthebioabsorbablepolyglycolicacid-collagennerveguidetube)PolymerEngineering&Science2006,46,1461-1467)。临床上可接受的胶原海绵是基质的一个示例，是本领域中公知的(例如，ILS公司-IntegraLifeSciences)。
纤维蛋白支架(例如纤维蛋白胶)提供了另一种基质材料。纤维蛋白胶作为伤口封闭剂、递送生长因子的储器和放置和固定生物植入物的辅助品而具有广泛的临床应用(RajeshVasita,DhirendraSKatti.用于组织工程改造的生长因子递送系统：材料前景(Growthfactordeliverysystemsfortissueengineering:amaterialsperspective).ExpertReviewsinMedicalDevices.2006；3(1):29-47；WongC,InmanE,SpaetheR,HelgersonS.Thromb.Haemost.200389(3):573-582；PanditAS,WilsonDJ,FeldmanDS.纤维蛋白支架作为递送酸性生长因子(FGF-1)的有效运载体(Fibrinscaffoldasaneffectivevehicleforthedeliveryofacidicgrowthfactor(FGF-1)).J.BiomaterialsApplications.2000；14(3)；229-242；DeBloisCoteMF.DoillonCJ.肝素-成纤维细胞生长因子纤维蛋白复合物：体内和体外应用于基于胶原的材料(Heparin-fibroblastgrowthfactorfibrincomplex:invitroandinvivoapplicationstocollagenbasedmaterials).Biomaterials.1994；15(9):665-672)。
Luong-Van等(微囊化硫酸乙酰肝素的体外生物相容性和生物活性(Invitrobiocompatibilityandbioactivityofmicroencapsulatedheparansulphate)Biomaterials28(2007)2127-2136，通过引用纳入本文)描述了HS从聚己内酯微胶囊的延长局部递送。
生物材料的另一个例子是掺入羟基磷灰石或透明质酸的聚合物。
适合与HS8联用的生物材料的例子是JAXTM骨空隙填料(SN公司-Smith&Nephew)。Jax颗粒由高纯度硫酸钙构成，并保留它们的形状以提供具有受控的颗粒间孔隙率和颗粒迁移稳定性的支架。Jax颗粒在身体内安全和完全溶解。
其它合适的生物材料包括陶瓷或金属(例如钛)、羟磷灰石、磷酸三钙、脱矿骨基质(DBM)、自体移植物(即，来源于患者组织的移植物)、或同种异体移植物(来源于非患者的动物组织的移植物)。生物材料可以是合成的(如金属、纤维蛋白、陶瓷)或生物的(例如，从动物组织，例如非人类哺乳动物(如牛、猪)，或人制成的载体材料)。
可以给生物材料补充额外的细胞。例如，可以用未分化的骨前体细胞，例如干细胞，如间充质干细胞，更优选人间充质干细胞“接种”生物材料(或共同合成它)。
待治疗的对象可以是任何动物或人。对象优选哺乳动物，更优选人。对象可以是非人哺乳动物(例如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿类动物(包括啮齿目中任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，例如奶牛，或牛属的任何动物)、马(包括马科的任何动物)，驴和非人灵长类)。非人类哺乳动物可以是家养宠物、为商业目的豢养动物，如赛马，或养殖家畜，如猪、绵羊或牛。对象可以是雄性或雌性。对象可以是患者。
本发明的方法可以如所示在体外或体内进行。术语“体外”应包括在培养细胞的程序，而术语“体内”应包括含完整多细胞机体的程序。
细胞的传代
本文所述的方法可包括在培养期间细胞的传代或分裂。所述方法可涉及连续或不断传代。
术语“传代”通常可指这样的过程，取细胞培养物的试样、使细胞完全或部分解离、稀释和接种入培养基。传代可以重复一次或多次。试样可包含完整的细胞培养物或其一部分。试样的细胞可以是完全汇合、部分汇合或未汇合。传代可以包括以下步骤中的至少一些：抽吸、清洗、胰蛋白酶处理、温育、移位、猝灭、再接种和分成等份试样。可采用加州大学圣迭戈分校赫德里克试验室(HedrickLab,UCSanDiego)公布的方案(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。
可以将培养的细胞与基板或烧瓶解离和“分裂”，并通过用组织培养基稀释和再涂板作亚培养或传代。
传代的过程可以重复至少一次，例如两次、三次、四次、五次等等(如下面所列)。在一些情况下，可以重复任何次数，例如无限次。最优选该过程重复3次或更多次，例如5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、10次或更多次、11次或更多次、12次或更多次、13次或更多次、14次或更多次、15次或更多次、16次或更多次、17次或更多次、18次或更多次、19次或更多次、20次或更多次、21次或更多次、22次或更多次、23次或更多次、24次或更多次、25次或更多次。
可以通过任何合适的手段解离细胞，如本领域中已知的机械或酶促方法。可以通过机械解离，例如使用细胞刮棒或吸管分开细胞。细胞可以经合适筛子尺寸作筛分，例如通过100微米或500微米的筛子来解离。细胞可以通过酶促解离，例如用胶原酶或TrypLE处理收获的细胞来拆分。离解可以是完全解离或部分解离。
稀释可以是任何适当的稀释。可以任何合适的比例拆分细胞培养物中的细胞。可以以下比例拆分细胞：1:2或更高、1:3或更高、1:4或更高或1:5或更高。可以以下比例拆分细胞：1:6或更高、1:7或更高、1:8或更高、1:9或更高、或1:10或更高。可以1:10或更高的比例拆分细胞。可以是1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20或更高。拆分比例可以是1:21、1:22、1:23、1:24、1:25或1:26或更高。
因此，干细胞可以传一代或更多代。例如，干细胞可以传2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或更多代。干细胞可以传25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95代或更多代。干细胞可以在培养中无限增殖。
传代可以表示为细胞生长的代数。我们的方法和组合物适合于使得干细胞增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或更多代。干细胞可以生长25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95代或更多代。
传代还可以表示为细胞倍增时间数。我们的方法和组合物适合于使得干细胞增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个细胞倍增时间或更多个细胞倍增时间。干细胞可以生长25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多个细胞倍增时间。
干细胞可培养大于5、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于40、大于45、大于50、大于100、大于200、大于500或大于800个传代、代或细胞倍增时间。干细胞可以维持100、200、500或更多个传代、代或细胞倍增时间。
在一些实施方式中，各传代中的细胞与HS8接触。在其它实施方式中，HS8可以仅存在于所选数量的传代培养物的培养基中，例如50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％之一的传代培养物。
增殖的干细胞可以保留用于接种培养物的原始干细胞的至少一种特征。干细胞可以在传代一次或多次之后保留该特征。它们可以在多次传代后是如此。它们可以在上述传代数之后是如此。
所述特征可以包括形态学特征、免疫组织化学特征、分子生物学特征，等等。所述特征可以包括生物活性。具体地说，干细胞的特征在于表达、或维持某些分子标志物，如细胞表面标志物的表达。
可通过本领域已知的任何手段实现标志物的检测，例如免疫学方法。可采用组织化学染色、流式细胞术(FACS)、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)，等等。
生物学活性可包括所述传代数后的细胞活力。可以采用各种方式检测细胞活力，例如台盼蓝拒染法。一种活体染色的方案如下所示。将合适体积的细胞悬浮液(20-200μL)置于合适的试管中，添加等体积的0.4％台盼蓝并轻柔混匀，室温下静置5分钟。将10μL染色细胞置于血细胞计数器并计数活的(未染色的)和死的(染色的)细胞数量。计算每个象限未染色细胞的平均数，并且乘以2×104得到细胞/ml。活细胞的百分比是活细胞数除以死细胞和活细胞数之和。
细胞活力可以是50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、93％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或基本上100％。
增殖的干细胞可保持干细胞类型特征性的分化成诸谱系的能力。诱导干细胞分化成特定谱系的方法是本领域已知的，可采用这些方法检测增殖干细胞的该能力。增殖细胞的全部或实质性部分可保持该能力。可以是增殖干细胞的50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、93％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或基本上100％。
增殖的干细胞可以在增殖期间或其后保持正常核型。“正常”核型是与获得该干细胞的亲代干细胞的核型相同、相似或基本上相似的核型，或者有区别，但不是任何实质性的区别。例如，不应有任何总体上的异常，例如染色体的易位、丧失、缺失，等等。
可通过许多方法检测核型，例如在光学显微镜下目测观察。可如以下所述制备和分析核型McWhir等.(2006)、Hewitt等.(2007)及Gallimore和Richardson(1973)。还可采用标准G-显带技术检测细胞的核型(可从提供常规核型检测服务的许多临床诊断试验室获得，例如加利福尼亚州奥克兰的细胞遗传试验室-CytogeneticsLab)，并与公布的干细胞核型比较。
增殖细胞的全部或实质性部分可维持正常核型。该比例可以是50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、93％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或基本上100％。
培养基
包含HS8(优选分离的HS8)的培养基可以是任选类型，但优选液体或凝胶，该培养基可含有其它营养物质和生长因子(例如，FGF-2)。可以将培养基制备成干燥形式，例如粉末形式，以便重建成液体或凝胶。HS8优选以非痕量存在。例如，培养基中HS8的浓度可以在约1ng/ml培养基到约1000ng/ml培养基之间。培养基中HS8的浓度优选为约500ng/ml或更低、更优选以下之一：250ng/ml或更低、100ng/ml或更低、90ng/ml或更低、80ng/ml或更低、70ng/ml或更低、60ng/ml或更低、50ng/ml或更低、40ng/ml或更低、30ng/ml或更低、20ng/ml或更低、10ng/ml或更低、或5ng/ml或更低。
硫酸乙酰肝素的剂量
在体内和体外应用中，HS8的使用浓度或剂量是约500ng/ml或更低，更优选以下之一：250ng/ml或更低、100ng/ml或更低、90ng/ml或更低、80ng/ml或更低、70ng/ml或更低、60ng/ml或更低、50ng/ml或更低、40ng/ml或更低、30ng/ml或更低、20ng/ml或更低、10ng/ml或更低、5ng/ml或公司；或约100mg或更低、50mg或更低、40mg或更低、30mg或更低、20mg或更低、10mg或更低、5mg或更低、4mg或更低、3mg或更低、2mg或更低、或1mg或更低；或约0.3-5μg/ml、0.3-4、0.3-3、0.3-2.5、0.3-2、0.3-1.5、0.3-1.0、0.3-0.9、0.3-0.8、0.3-0.7、0.3-0.6、0.3-0.5、0.3-0.4、1-2、1-1.75、1-1.5、1-1.25、1.25-2、1.5-2或1.75-2μg/ml。
FGF2
在本说明书中，FGF2是指成纤维细胞生长因子2(也称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或FGF-β)，其是成纤维细胞生长因子家族的成员。
FGF2存在于许多组织的基底膜中，据认为，在没有信号刺激存在下，其保持与膜结合。FGF2参与伤口愈合、肿瘤产生和血管生成。
FGF2与其酪氨酸激酶受体结合刺激信号级联反应，包括丝裂原活化蛋白激酶(MEK)的激活和胞外信号相关酶(ERK)的磷酸化(例如，参见Ok-JinPark等.,TheJournalofBiologicalChemistry,285,(2010)3568-3574)。
智人(Homosapiens)的FGF2的氨基酸序列示于图28(肝素结合域SEQIDNO:1以下划线示出)。该序列可从Genbank以登录号NP_001997.5(Gl:53285461)获得。
在本说明书中，“FGF2”包括的蛋白或多肽具有与图28所示FGF2的氨基酸序列有至少70％，更优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性。
FGF2蛋白或多肽优选还包含具有以下氨基酸序列的肝素结合域：SEQIDNO:1所示氨基酸序列，或与SEQIDNO:1具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
FGF2蛋白或多肽可以是全长FGF2蛋白或多肽的片段或截短体。
FGF2蛋白可以来自或衍生自任何动物或人，例如非人动物，例如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括啮齿目的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括牛，如奶牛，或牛属的任何动物)、马(包括马科的任何动物)、驴和非人灵长类动物或其它非人脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人。
FGF2剂量
在体外和体内应用中，FGF2可与HS8联用。在本发明的一些细胞培养方法中，将外源性HS2加入培养物。FGF2的合适浓度或剂量包括约500ng/ml或更低，更优选以下之一：250ng/ml或更低、100ng/ml或更低、90ng/ml或更低、80ng/ml或更低、70ng/ml或更低、60ng/ml或更低、50ng/ml或更低、40ng/ml或更低、30ng/ml或更低、20ng/ml或更低、10ng/ml或更低、5ng/ml或更低；或约100mg或更低、50mg或更低、40mg或更低、30mg或更低、20mg或更低、10mg或更低、5mg或更低、4mg或更低、3mg或更低、2mg或更低、或1mg或更低；或在约0.1-5ng/ml、0.1-0.2、0.1-0.3、0.1-0.4、0.1-0.5、0.1-0.6、0.1-0.7、0.1-0.8、0.1-0.9、0.1-1.0、0.1-1.5、0.1-0.2.0、0.1-2.5、0.1-3.0、0.1-3.5、0.1-4.0、0.1-4.5、0.1-5.0ng/ml之间。
在一些实施方式中，HS8的体外和体内应用不包括加入外源性FGF2。例如，在本发明的一些细胞培养方法中，不将外源性FGF2加入培养物。
本发明包括所述各方面和优选特征的组合，除了此类组合是明显不可能的或明示排除的。
本文所用的章节标题仅是为了组织目的，不应理解为限制所述主题。
现在以举例的方式参考附图说明本发明的各方面和实施方式。进一步的方面和实施方式是本领域技术人员显而易见的。本文中提及的所有文献都通过引用并入本文。
附图简述
现在将参照附图讨论说明本发明原理的实施例和实验。
图1.该图显示在FGF2浓度为0、25、50和100ng/ml时，HS8优先结合FGF2。从图的顶部向下，数据线为：HS8+(5μg/ml)(三角形)、肝素(5μg/ml)(正方形)、CelsusHS(5μg/ml)、HS8-(5μg/ml)、无GAG(菱形)。
图2.该图显示HS8(5μg/ml)对FGF2的特异性。从图中的顶部向下，数据线为：HS8+/FGF2(菱形)、HS8+/FGF1、HS8-/FGF2、HS8+/FGF7、HS8+/BMP2、HS8+/VEGF、SAB/FGF2、HS8+/PDGFBB。
图3.该图显示STR01人间充质干细胞对HS8处理起反应，其数量在第6天有剂量依赖性增加。从左至右，棒代表：对照，HS8+50ng/ml，HS8+100ng/ml，HS8+500ng/ml，HS8+1000ng/ml，HS8+5000ng/ml，HS8+10000ng/ml。
图4.该图显示STR01人间充质干细胞对HS8+5000ng/ml(正方形)和对照(菱形)起反应，在6天期间的增殖。
图5.显示FGF2肝素结合域肽的表格。
图6.(A)不同量的肽的每分钟放射性计数(CP)；(B)通过亲和层析拉下的HS8。
图7.该图显示GAG结合亲和力测定的布置。
图8.与FGF2结合的不同GAG浓度的优化。
图9.该显示与FGF2结合的不同GAG。
图10.该图显示与不同蛋白质结合的(A)HS8(HS8+)和(B)HS8(-)。
图11.该图显示了肝素珠测定，(A)FGF2优化，(B)肝素珠与外源性肝素竞争和(C)与不同GAG竞争的百分比。
图12.该图显示了各天的STR01活细胞计数(A)和累积细胞生长(B)。
图13.该图显示了各天的HM21活细胞计数(A)和累积细胞生长(B)。
图14.该图显示了各天的STRO1HM21活细胞计数(A)和累积细胞生长(B)。
图15.该图显示通过GAG结合板(Iduron)评估不同GAG对FGF2的结合能力。HS8(HS8+)级分与FGF2的结合几乎与肝素一样，优于起始的CelsusHS和HS8-流出物。
图16.该图显示通过GAG结合板(Iduron)评估不同GAG对肝素结合生长因子(HBGF)BMP-2、FGF1、FGF2、FGF7、PDGF-BB和VEGF的结合能力。(A)CelsusHS、(B)HS8、(C)HS8-级分、(D)Heparin。HS8(HS8+)级分优先结合FGF2，超过所有其它HBGF，甚至优于肝素。HS8-和原始CelsusHS对任何HBGF几乎没有偏好。
图17.该图显示通过BrdU掺入在36小时期间监测的人间充质干细胞对HS8(HS8+)的剂量-反应情况。FGF2用作给药阳性对照。HS8+级分相比于测试的其它GAG提供显著更多的刺激。
图18.该图显示通过GuavaViaCount(基于FACS)方法在所示时间(天数)监测的人间充质干细胞对HS8(HS8+)(上图)和FGF2(下图)的剂量-反应情况。FGF2用作给药阳性对照(下图)。HS8提供显著的刺激。
图19.该图显示通过GuavaViaCount(基于FACS)方法在所示时间(天数)监测的人间充质干细胞对浓度渐增的不同GAG的剂量-反应情况。HS8(HS8+)倾向于更高的细胞数量。
图20.该图显示通过GuavaViaCount(基于FACS)细胞计数法监测最多7代的人间充质干细胞对浓度渐增的不同GAG的剂量-反应情况。单独的FGF2提供最高的刺激；与肝素类似，两种浓度的HS8(HS8+)倾向于更高的细胞数量。
图21.显示基于以下标志物的hMSC(隆萨公司-Lonza)干细胞的代表性FACS免疫表型检测结果：(A)阴性标志物：CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，和(B)阳性标志物：CD73、CD90、CD105、STRO-1、SSEA-4、CD49a。
图22.在未补充的(对照)、HS8(HS8+)、HS8-、原始CelsusHS(CHS)或单独FGF2中生长7代的FACS免疫表型检测的hMSC干细胞的定量表。该表显示表达相关细胞表面标志物的细胞百分比：CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105、CD49a、SSEA-4、STRO-1。
图23.在未补充的(对照)、HS8(HS8+)、HS8-、原始CelsusHS或单独FGF2(2.5ng/ml)中生长4-7代的FACS免疫表型检测的hMSC干细胞的图示。(A)CD49a、(B)SSEA-4、(C)STRO-1。
图24.在未补充的(对照)、含有肝素、CelsusHS、HS8-和HS8(HS8+)的培养基中培养hMSC4-7代(P4,P7)后，hMSCCFU测定的培养平板的(A)图示和(B)显微照片。
图25.在未补充的(对照)、含有HS8(HS8+)、HS8-、CelsusHS、肝素和FGF2的培养基中培养hMSC4-7代(P4,P7)后，显示hMSC分化成骨(上图，茜素红)和脂肪(下图，油红O)细胞的能力的显微照片。
图26.HS8增强FGF-2介导的MSC生长。显示了在正常维持(对照)培养基，或含有各种剂量的HS8(μg/ml)和固定剂量的FGF-2(0.156ng/ml)的培养基中培养后，hMSC的细胞数。
图27.HS8维持FGF-2信号传导。蛋白质印迹显示用HS8和/或FGF-2ERK1/2刺激后30分钟和24小时的磷酸化和FRS2a磷酸化。
图28.人FGF2的氨基酸序列。SEQIDNO:1以下划线显示。
图29.亚硝酸获得的E10神经上皮的硫酸乙酰肝素(HS2)的二糖组成。通过低pHHNO2的脱氨基切割来解聚放射性标记的HS。HNO2处理GAG后分离二糖，然后在样品在1×120cmBio-gelP-2柱上进行分离。所得二糖通过SAX-HPLC分级。峰下面积进行积分得到二糖组成，然后获得每个样品的百分比组成。
图30.肝素裂合酶处理后，E10神经上皮的硫酸乙酰肝素(HS2)的二糖组成。用肝素裂合酶的混合物完全解聚硫酸乙酰肝素。用P-2柱分离所得的不饱和二糖，通过强阴离子交换柱层析分级。得到的各曲线下面积进行积分以计算各样品中各二糖的百分比。数字代表的两次运行(对于原始GAG样品)和三次允许(对于2.3D衍生样品)的平均值。从各样品回收超过97％的二糖。
图31.CelsusHS、HS8和HS3(D2O溶液)的1HNMR。
图32.CelsusHS、HS8和HS3(D2O溶液)的1HNMR的精细描述。
图33.在2xSuperdex肽柱上分离，用50mM乙酸铵洗脱的CelsusHS#10697和HS8的HPLC-SEC-RI色谱图。
图34.硫酸乙酰肝素的HPLC-SEC-RI色谱图：CelsusHS#10697；BMP2未保留(848/HS3/001)；BMP2保留(HS3)(848/HS3/001)；初始运行(HS3-001-01)；最终运行(HS3-001-02)。HS3制品在约15ml显示高峰(0.06-0.08)。
图35.塞尔萨斯公司的HS制品HS#10697和HS#10595的肝素裂合酶I、II和III消化物的HPLC-SEC-RI。肝素裂合酶消化一式两份进行。垂直线表明二糖和聚合度(dp)大于2的寡糖洗脱的截断值。
图36.利用2xSuperdex肽柱，以50mM乙酸铵洗脱的HS8(18-20ml处的宽峰)、HS3-001-01(9-20ml处的峰)的HPLC-SEC-RI色谱图。
图37.该图显示了结合SEQIDNO:1的肝素。
图38.该图显示了HS8结合固定化肝素的能力。
图39.该图显示FGF-2结合亲和层析纯化的HS8的能力(柱用SEQIDNO:1衍生)。此与原始HS(HS-PM猪粘膜)，或无糖对照的结合进行比较。
图40.该图显示了在有HS8存在下，塑料贴壁间充质干细胞在6天期间的增殖情况。
图41.该图显示了在有分离的HS8存在下，与原Celsus起始HS(HS-PM)或非-结合HS流出物(HS8-)相比，通过BrDU检测的STRO-1-分离间充质干细胞在36小时期间的增殖情况。
图42.该图显示了CelsusHS的标准化二糖组成。
图43.该图显示HS3的标准化二糖组成。
图44.该图显示了CelsusHS、HS8和HS3的二糖组成。
图45.该表格显示了CelsusHS、HS3和HS8的二糖百分比组成。
图46.该图显示了在无HS，或有肝素、HS8、CelsusHS(HSPM)或HS8-存在下FGF-2的稳定性。FGF-2在有HS8存在下稳定。
图47.该图显示了SU5402(FGFR1抑制剂)阻断HS8刺激的hMSC增殖。
图48.该图显示了IMB-R1(FGFR1中和抗体)阻断HS8刺激的hMSC增殖。
图49.该图显示了IMB-R1(FGFR1中和抗体)阻断HS8刺激的hMSC增殖。
图50.该图显示了FGD2中和抗体抑制HS8刺激的hMSC增殖。
图51.该图显示了在补充了HS8的培养基中扩增的人MSC更具克隆源性(3个独立的供体)。
图52.显示了HS8在大鼠临界尺寸头盖骨缺陷模型中显著增强骨愈合的图片和CT分析。
发明详述
本发明的一个或多个实施方式的细节以举例的方式列于下文随附的说明，包括本发明人考虑的实施本发明的最佳方式的特定细节。本领域技术人员应明白，本发明可以实施而不限制于这些具体细节。
实施例
实施例1
我们研究了市售可得的猪Celsus硫酸乙酰肝素来源的新FGF2结合性HS的纯化方法，该方法适合大规模的硫酸乙酰肝素(HS)制备以便方便地应用于临床。
选择FGF2的肝素结合域(HBD)肽序列GHFKDPKRLYCKNGGF[SEQIDNO:1](糖胺聚糖的结构和它们与蛋白质的相互作用(Thestructureofglycosaminoglycansandtheirinteractionswithproteins)；GandhiNS和ManceraRL,ChemBiolDrugDes.2008年12月；72(6):455-82)并用于纯化与FGF2结合的特定HS物质。
合成肽后，对其进行3H肝素测定，其中将剂量依赖性方式特异性结合浸渍于硝酸纤维素膜的肽的3H肝素与3H肝素的总计数相比较。一旦显示3H肝素与FGF2-HBD肽特异性接触，该肽用于通过亲和层析从结合FGF2的猪CelsusHS中拉下特定的HS。这种新的HS命名为HS8(还给予变体名称HS8G)。
利用糖胺聚糖(GAG)结合板分析HS8结合FGF2的特异性，其中检测HS8与FGF2的特异性结合并与肝素、猪CelsusHS和HS8阴性级分作比较。
将GAG铺在GAG结合板(5μg/ml)上过夜，随后与重组人FGF2(0-100ng/ml)温育，采用ELISA方法检测GAG结合FGF2的特异性。
结果明显显示相比于其它GAG物质，HS8与FGF2结合更多(图1)。将HS8结合FGF2的能力与其它生长因子(VEGF、BMP2、PDGFBB、FGF1和FGF7)作比较，揭示HS8是FGF2特异性的(图2)。
还利用STRO1人间充质干细胞(hMSC)对HS8进行体外细胞增殖试验，以测定HS8的生物学活性。在hMSC的短期生长中，相比于对照，我们利用HS8作为不同剂量(50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml和10000ng/ml)的独立培养基补充物。不添加任何外源性生长因子，我们利用HS8观察到hMSC的剂量依赖性生长(图3和4)。
实施例2
间充质干细胞(MSC)
MSC被广泛定义为塑料贴壁细胞，其可以定向体外分化成成骨细胞、软骨细胞、成脂细胞、生肌细胞，和其它谱系；最近，细胞治疗国际协会(InternationalSocietyforCytotherapy)为MSC涉及了名称“多能间充质基质细胞”(Zulma等,2011)。MSC在骨髓、脂肪组织、皮组织、椎间盘、羊水、各种牙齿组织、人胎盘和脐带血中发现(Si等,2011和Zulma等,2011)被发现。MSC的治疗潜能已被认识到，并用于许多临床应用，例如骨组织再生和非骨架组织再生。在最近几年，MSC的免疫抑制和抗炎作用也见诸描述。这是因为MSC通过在它们的细胞表面表达低水平的主要组织相容性复合物-1分子(MHC-1)而具有弱免疫原性，以及具有抑制T和B淋巴细胞激活和增殖，修饰受损组织的微环境，同时保护受损的组织的能力(Si等,2011和Zulma等,2011)。这种MSC-介导的免疫抑制作用可有效用于治疗GVHD，该免疫抑制作用的机理具有物种差异(Ren等,2009和Shi等,2010)。细胞因子-引发的小鼠MSC由一氧化氮(NO)介导，细胞因子-引发的人MSC通过吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)实施。
肝素和硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(HSGAG)
肝素在肥大细胞中产生并存储，相比之下，HSGAG存在于所有动物组织中，它们可以作为蛋白聚糖产生，其中HS链结合到细胞表面或ECM蛋白。HS影响所有器官系统中的代谢、运输、信息传递、细胞附着、细胞生长和分化以及支持(Bishop等,2007和Gandhi等,2008)。肝素和HS是由重复的糖醛酸-(1->4)-D-葡糖胺二糖亚单位构成的线形多糖。糖醛酸可以是D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸。此外，在特定位置的修饰可导致不同N-硫酸化、O-硫酸化和N-乙酰化的复合序列[Ori等人,2008]。肝素中最丰富的二糖是IdoA(2S)-(1->4)-GlcNS(6S)，因此在整个链长上产生高度负电荷，这使得肝素结合蛋白的选择性较低或没有选择性。另一方面，HS具有未硫酸化GlcA-(1->4)-GlcNA二糖作为最常见的形式，其产生未硫酸化NA结构域的隔离区段和高度硫酸化的、肝素样ldoA-(1->4)-GlcNS二糖(NS结构域)的区段。NA和NS结构域由NA/NS过渡结构域隔开。HS结构的多样性导致了广泛的生物学功能。
成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白和肝素结合域
成纤维细胞生长因子(FGFs)是多肽生长因子的大家族，包括人中的22个成员。它们通过结合和激活称为FGF受体(FGFR)的FGF细胞表面受体酪氨酸激酶的亚家族而在发育、分化、细胞增殖、血管发生和伤口愈合中起主要作用(Ornitz等,1996)。此外，FGF是研究最好的肝素结合蛋白之一，HSGAG通过与FGFR直接的分子缔合作用来调节FGF信号传导(Pellegrini,2001)。此外，仅有FGFR1的FGF2信号传导对于MSC表达至关重要(Gronthos等.,1999)。
肝素/HS与FGF2的相互作用
各种研究已经认识到蛋白的肝素/HS结合位点的共同结构特征(Gandhi等,2008；Hileman等,1998和Ori等,2008)。Cardin和Weintraub在1989年在分析了21种肝素结合蛋白后，首次尝试确定肝素结合域(HBD)，并提出典型的肝素结合位点可以具有序列XBBXBX或XBBBXXBX，其中B是带正电的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和较少见的组氨酸)，X为亲水残基。在比较几种蛋白的X-射线和NMR后，Hileman等在1998年引入下一个共有序列TXXBXXTBXXXTBB。在此序列中，T确定了转角，B是碱性氨基酸(精氨酸或赖氨酸)和X是亲水残基。
预计GAG之间有强的离子相互作用，蛋白质和带正电荷的碱性氨基酸形成离子键，其中肝素链上有带负电荷的硫酸根或羧酸根基团。它们的作用对于与肝素和可能的，与HS内的高度硫酸化区域，例如NS结构域的相互作用是决定性的(Fromm等,1997和Ori等,2008)。此外，还有其它类型的键，即，范德华力、氢键和疏水相互作用。这些键会在与更多的异源HS在相互作用中起作用，在该情况下也需要中性氨基酸(Fromm等,1997和Ori等,2008)。考虑FGF2时，除了离子键，谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸通过与糖的羟基形成氢键而在与HS的相互作用中起重要作用(Thompson等,1994)。
根据迄今许多已发表的研究，有不同的肽序列作为FGF2的肝素结合域，那些已汇编在表1中。在此，我们采用的编号系统中，氨基酸根据完整FGF2序列(288aa)编号。
移植物抗宿主病(GVHD)
造血细胞移植(HCT)是一种用于治疗血液学恶性疾病的强化治疗方法，其中同种异体HCT程序逐年增加(Ferrara等,2009)。HCT的主要并发症是GVHD，这是主要影响胃肠道、肝脏、皮肤和肺的免疫疾病。根据Billingham,1966-67，如果发生GVHD，应满足三个要求，即，1)移植物必须含有免疫活性细胞，它们是T淋巴细胞，2)接受者必须表达移植物供体中不存在的组织抗原，和3)患者必须是不能产生有效的反应以消除移植的细胞。当采用清髓性条件化处理方案来清除宿主缺陷的骨髓时，GVHD病理生理学状况产生。宿主的抗原呈递细胞因受损的组织产生的细胞因子(TNFα、IL1、LPS)而激活。一旦在该阶段进行同种异体HCT，供体T细胞得到激活，藉此产生更多的细胞因子，从而导致细胞和炎性反应，进而导致GVHD。非-造血干细胞；MSC因强效的免疫抑制作用而能降低同种异体T-细胞反应并缓解GVHD(LeBlanc等,2008；Meuleman等,2009和Toubai等,2009)。
放大hMSC以供治疗目的的需求
hMSC应用于基于细胞的疗法中的主要缺点是难以获得足够的细胞数量，虽然它们已经用于临床。hMSC的数量较低，可以低至骨髓单个核细胞的0.01％到0.0001％，从而阻碍了它的广泛应用。根据Caplan,2009，从不同年龄的捐助者获得骨髓，分散、置于培养瓶中、随后计数CFU-FS，以10-年年龄对每个有核骨髓细胞的MSC显示。观察到每个有核骨髓细胞的MSC有显著降低，其中从出生到青少年下降10-倍的，从青少年到老年人再下降10倍。显然，随着年龄的增长，骨髓中MSC的数量减少。此外，Caplan指出，这些下降与观察到的青年和成年人的骨折愈合率相平行。相比之下，造血干细胞在骨髓中的滴度约为每104个有核骨髓细胞中一个，在整个个体年龄中保持恒定。
目前的hMSC扩增方法
研究人员认为，如果能在hMSC培养中模拟骨髓微环境，他们可以获得治疗数量的hMSC以供临床。基本上，模拟可以通过两大途径来实现，即，用ECM和补充外源性生长因子来培养hMSC。当使用ECM基材时，观察到MSC附着和累积细胞数目增加(Griinert等,2007和Matsubara等,2004)，但是扩增的细胞缺乏严格性(Cool,2005)。此外，FGF2是通常用作外源性生长因子补充物，也显示相比于用标准培养基的对照，细胞数有显著扩增(Ling等,2006和Sotiropoulou等,2006)。与用ECM基材培养的细胞一致，用FGF2培养细胞也显示相比于对照中的多能hMSC，增加了分化的祖细胞量(Gronthos等,1999和Walsh等,2000)。因此，鉴定能实现治疗数量的hMSC而不负面影响严格性的能促进hMSC增殖的分子显示，hMSC在临床应用于骨再生和骨髓移植以缓解GVHD中有巨大潜力。
HSGAG改善hMSC生长而不影响细胞严格性
Nurcombe等在1993年表明，HSGAG调节FGF对鼠科神经前体细胞的活性，该相互作用是FGF2与其受体结合所必需的。此外，HSGAG与FGF结合有显著不同，其中，在第9天，这些细胞产生的HSGAG优先结合FGF2，在第11天，HSGAG结合转向FGF1。此外，这些独特的硫酸乙酰肝素介导FGF2通过与神经前体细胞的细胞表面受体相互作用而特异性结合受体(Brickman等,1995)。在1998年，Brickman等从永生化胚胎第10天小鼠神经上皮细胞2.3D细胞分离和表征两个独立的HS集合，从而进一步支持这些结果。一个集合源于对数生长期的细胞，这增加了FGF-2的活性；另一集合源于经历接触抑制和分化的细胞，对FGF1有偏好。如本实验室先前所描述的，命名为HS2的胚胎HSGAG制品在体内移植时能提高hMSC生长而不显著损失多能性，并导致小鼠中骨形成增加。该证据提示，ECM组分HSGAG提高hMSC的生长而不负面影响多能性。因此，对HS变体有特定的需求，与HS2相比，其对FGF2具有高结合亲和力并增强其对细胞生长的活性，可以很容易地放大以便在临床环境中使用。
结果
通过柱层析分离对FGF-2具有较高结合亲和力的硫酸乙酰肝素(HS8)
根据纯化FGF2结合性HS2的策略，我们找寻了从市售可得的猪Celsus硫酸乙酰肝素来源(塞尔萨斯试验室有限公司,美国)纯化结合FGF2的另一HS的可能性以放大HS制备方法，从而方便用于临床。在表1所示的这些肽序列中，利用命名为FGF2-Gandhi-HBD的157GHFKDPKRLYCKNGGF172(Gandhi等,2008)。
[3H]肝素测定
合成肽后，对它们进行3H肝素测定，其中测试FGF2-HBD-肽结合肝素的能力。已知量的肽或饱和量的肽在相同的硝酸纤维素薄膜上干燥，首先是空气干燥，然后在80℃，真空烘箱中再干燥45分钟。然后用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤膜，在计数管中与0.1Ci[3H]肝素在4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)/PBS中温育16小时(珀金埃尔默公司-PerkinElmer，波士顿，美国)。然后，洗涤膜，通过PerkinElmerTri-Carb2800TCR液体闪烁分析仪测定放射性。
当利用已知量的肽(SEQIDNO:1)时，它们表现剂量依赖性的CPM升高，其中BMP2-HBD用作阳性对照[图6(A)]。但最高计数在硝酸纤维素膜用500μg/ml肽溶液饱和时出现。在500μg/ml溶液水平计算相对于纯[3H]肝素的各肽的CPM百分比。BMP2-HBD(7.2％)具有最高值，然后是FGF2-Gandhi-HBD(4.97％)。根据[3H]肝素测定所得结果，利用FGF2-Gandhi-HBD通过亲和层析从猪CelsusHS中拉下与FGF2以较高亲和力结合的HS(HS8)。色谱图示于图6(B)。
HS8的表征
GAG结合亲和力测定
利用96孔GAG结合板(Iduron，英国)检测HS8与FGF2和其它蛋白(RD系统公司-R&DSystems)的结合亲和力，其中相比于与肝素(Sigma)、猪CelsusHS(塞尔萨斯试验室有限公司,美国)和HS8阴性级分的结合，检测HS8+与FGF2的特异性结合。将GAGS铺在GAG结合板上(2.5-10μg/ml)过夜，37℃下，用标准分析缓冲液(SAB)配制的0.2％鱼明胶(Sigma)封闭1小时。
然后在37℃，与200μl/孔的0-100ng/ml重组人FGF2温育2小时，然后在37℃与200μl/孔的250μg/ml生物素化的一抗(RD系统公司)温育1小时。下一步骤中，在37℃，平板用200μl/孔的220ng/mlExtrAvidin-AP(Sigma)中温育30分钟。从过夜温育到这一步，在每个步骤之间用SAB洗涤平板3次。最后，与200μl/孔的SigmaFAST对硝基苯基磷酸酯(Sigma)温育40分钟，通过珀金埃尔默公司的Victor31420多标记计数器读取405nm处的吸光度。
在测试的所有3个浓度中(2.5、5和10μg/ml)，所有GAG与FGF2的结合随着FGF2用量的增加而相似地增加，在100ng/mlFGF2时达到饱和(图8)。当测试不同GAG与FGF2结合时，结果清楚显示相比于其它GAG物质，HS8+与FGF2的结合具有最高亲和力(图9)。当比较100ng/mlFGF2下GelsusHS:HS8+的差异倍数时，该比例是1:1.51。
然后我们测试了HS8+和HS8(-)级分结合不同蛋白质的能力(图10)。相比于VEGF、BMP2、PDGFBB、FGF1和FGF7，HS8+结合FGF2具有更高的亲和力[图10(A)]。另一方面，相比于其它蛋白，HS8(-)级分结合FGF1具有最高亲和力[图10(B)]。
从Ono等,1999作了改进，在此试验中测试了不同GAG与FGF2竞争与肝素(结合)的能力。室温下(RT)，将已知浓度的FGF2(RD系统公司)与不同浓度的GAG在微型管中混合30分钟。
向其中加入40μl珠溶液[20μl肝素-琼脂糖珠(I型,Sigma)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-GelP-30,Bio-Rad)]，室温下混合30分钟。通过离心(2000rpm，1分钟)与BSA-PBS(1％BSA，PBS配制)洗涤肝素珠3次，离心与PBST(PBS，含有0.02％吐温)洗涤3次，向各试管中加入100μl的1:500生物素化抗-FGF2(RD系统公司)，室温下温育1小时。如上所述洗涤后，加入100μl的1:10TMB底物(RD系统公司)，室温下混合30分钟。加入终止溶液(50μlof2NH2SO4)，将离心后的100μl上清液转移入96孔板。通过珀金埃尔默公司的Victor31420多标记计数器读取405nm处的吸光度。
首先，通过FGF2优化检测与加入量的肝素珠结合所需的FGF2用量，选择FGF2剂量20ng/ml用于随后一组实验[图11(A)]。
然后，为获得竞争测定中所用的GAG范围，我们首先利用不同量的肝素。加入50μg的肝素几乎足以与连接于珠的内部肝素竞争[图11(B)]。因此，我们在竞争测定中采用0-50μgGAGS[图11(C)]。当考虑竞争百分比时，肝素是最具竞争性的，加入50μg可以达到约13％，然后是HS8+43％、CelsusHS50％和HS8(-)63％。
增殖测定
本次测定采用两个品种的hMSC，其来自21岁西班牙裔男性捐赠者，其中通过磁性激活细胞分选分离STRO1阳性细胞(5-7代)，通过常规的塑料贴壁分离HM21细胞(5代)。细胞以3000个细胞/cm2的接种密度接种，附着于平板24小时。然后将不同浓度的HS8+用作独立培养基补充物，浓度范围50-10000ng/ml，并将2.5ng/ml人重组FGF2(RD系统公司)加入培养基作为阳性对照。在第2或第3天进行培养基变更。在STRO1细胞中，每两天进行培养基的变更，随着HS8+浓度的增加，活细胞计数增加，与对照相比，在第6天，5000ng/ml得到最高计数(图12)。相比之下，HM21细胞在每3天进行培养基的更换，与对照相比，在第6天，10000ng/ml显示计数略高(图13)。
由于用两种细胞类型观察到活细胞计数有显著差异，我们利用5代STRO1和HM21细胞进行了6天的增殖测定，并与对照作比较，其中每3天进行培养基的更换。与HM21细胞相比，STRO1显示增殖计数略高，但在两种细胞类型中，对照和处理的细胞几乎均得到相同的细胞计数[(图14A)]。然后我们利用以前实验的数据，基于培养基更换中的不同时间间隔计算了第6天的STRO1细胞的细胞计数/cm2[图14(B)]。有趣的是，相比于每3天进行培养基更换，当每2天进行培养基更换时，在对照和处理细胞中均获得更多的细胞计数。此外，如果培养基每2天进行更换，处理细胞的计数高于未处理的对照。
总结
我们利用序列157GHFKDPKRLYCKNGGF172，通过亲和层析从猪CelsusHS制备与FGF2结合亲和力较高的HS(HS8)。
在糖胺聚糖(GAG)结合测定的结果中，清楚地表明相比于其它GAG物质，HS8+结合FGF2的亲和力最高。此外，当100ng/mlFGF2时，GelsusHS:HS8+的差异倍数的比例是1:1.51。在肝素珠竞争测定中，考虑到竞争的百分比，肝素是最具竞争性的，通过加入50μg，达到约13％，其次是HS8+为43％，CelsusHS为50％和HS8(-)为63％。通过磁性激活细胞分选分离的STRO1+的hMSC和通过常规塑料贴壁分离的HM21hMSC用于细胞增殖测定，其中当5μg/ml浓度的HS8+用作独立培养基补充物并且每两天更换培养基时，获得较高的细胞计数。总之，我们现在已经从市售可得硫酸乙酰肝素来源的集合成功分离与FGF2结合亲和力更高的硫酸乙酰肝素(HS8)，它们对FGF2的结合亲和力更高和使hMSC增殖的能力增加。
总之，我们现在已经从市售可得硫酸乙酰肝素来源的集合成功分离与FGF2结合亲和力更高的硫酸乙酰肝素(HS8)，与包括肝素在内的其它GAG相比，其显示具有更高的结合亲和力。此外，当HS8+用作独立培养基补充物并且每两天更换培养基时，能够增加细胞增殖。因此，我们相信我们已经通过在经工程改造对FGF2具有高亲和力的硫酸乙酰肝素(HS8)中培养这些细胞而解决了高品质离体扩增MSC的需求。
其它研究
分离FGF2的特异性HS(HS8)
虽然我们已经成功分离了HS8，一种对FGF2具有较高结合亲和力的HS，我们根据Lee等,2007的[3H]肝素测定、GAG结合测定和细胞附着测定进一步测试了其它FGF2HBD肽序列(表1)。
结合亲和力测定
HS8的结合亲和力已经通过GAG结合板得以证实，通过斑点印迹测定和利用BIAcoreT100得到动力学结合测定得到进一步验证(Cain等,2005)。
竞争试验
通过蛋白质印迹方法进一步证实ELISA方法的结果。
增殖试验
利用更多的hMSC谱系和较低传代的细胞进一步验证增殖试验的结果。此外，利用BRDU(罗氏公司-Roche)和WST-1(罗氏公司)试剂进行短期增殖试验。
二糖分析
根据Murali等,2009，采用阴离子交换层析进行HS8的二糖分析，可揭示HS8的组成。
FGF2的稳定性
如SYPRO测定和FGF2Quantikine测定所述进行稳定性试验。在SYPRO测定中，通过特定的Sypro橙染料将FGF2蛋白与GAG的相互作用测量为蛋白的变性温度(Uniewicz等,2010)。按照制造商(RD系统公司ELISA目录号DFB50)的推荐进行FGF2Quantikine测定，以检测细胞培养物中FGF2的浓度。结果示于图46。
检测用HS8体外培养的hMSC的生物学活性
检测多能性的塑料附着性能，分化成骨、脂肪和软骨组织(的性能)和进行表面标志物的FACS(Dominici等,2006)。利用骨髓抽吸物和在有或没有HS8下扩增的hMSC进行CFU-F测定(Cawthon,2002和Guillot等,2007)。通过混合T淋巴细胞试验评估hMSC的免疫调节活性。
检测用HS8体内培养的hMSC的生物学活性
在有HS8存在下分离和生长的细胞用于小鼠骨再生模型(Zannettino等,2010)，也用于GVHD的异种人NOD-SCID小鼠模型(Tiasto等,2007和Toubai等,2009)。
实施例3
利用GAG-结合板(Iduron)评估不同GAG与FGF2的结合能力。还利用GAG-结合板(Iduron)评估不同GAG与肝素结合生长因子(HBGF)BMP-2、FGF1、FGF2、FGF7、PDGF-BB和VEGF的结合能力。所用的材料与方法如下所述。
发现HS8结合FGF-2几乎与肝素一样好，而且肯定优于原始CelsusHS和HS8-流出物级分(图15)。
相比于测试的所有其他HBGF，HS8(HS8+)优先结合FGF2，对FGF2的结合能力高于肝素，即，HS8表现出特异性结合FGF2。HS8-和原始CelsusHS显示对测试的任何HBGF几乎无偏好(图16)。
材料
1.标准测定缓冲液(SAB)–100mMNaCl,50mM乙酸钠,0.2％v/v吐温20,pH7.2；
2.封闭缓冲液-0.4％鱼胶(Sigma目录号67041)+SAB
3.GAG结合板(Iduron,英国)
4.RD系统公司的蛋白质：BMP2-目录号355BM，FGF1-目录号231BC，FGF2-233FB，FGF7-目录号251KG，PDGFBB-目录号.220BB，VEGF–目录号293VE
5.RD系统公司的抗体：BMP2-目录号BAM3552，FGF1-目录号BAF232，FGF2-BAM233，FGF7-目录号BAF251，PDGFBB-目录号BAF220，VEGF-目录号BAF293
6.ExtraAvidin-AP(Sigma目录号E2636)
7.SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯(Sigma,N2770)
方法
1.将GAG溶解于SAB(5μg/ml)
2.将200μlGAG溶液/孔加入GAG结合板，室温下避光温育过夜
3.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
4.37℃，用250μl/孔封闭缓冲液避光温育平板过夜
5.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
6.用封闭缓冲液溶解蛋白，进行连续稀释：0、0.781、1.56、3.125nM
7.将200μl/孔的稀释蛋白分配到GAG包被板，37℃温育2小时
8.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
9.以200μl/孔加入250ng/ml的封闭缓冲液配制的生物素化一抗，37℃温育1小时
10.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
11.以200μl/孔加入220ng/ml的封闭缓冲液配制的ExtraAvidin-AP，37℃温育30分钟
12.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
13.加入200μl/孔的显色试剂：DI水配制的SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯，室温下温育40分钟
14.读取405nm的吸光度
实施例4
进行BrdU掺入增殖测定以获知HS8对hMSC增殖的影响(如下所述)。
通过BrdU掺入监测36小时期间人间充质干细胞与HS8(HS8+)的剂量-响应。FGF2用作给药阳性对照。发现HS8+能增强hMSC增殖，相比于其它GAG，提供显著更多的刺激(图17)。
方案(细胞增殖ELISA，BrdU(比色法)罗氏公司)
1.细胞接种-每孔在190μl培养基中5000个细胞(96孔板)
2.培养基–DMEM，含有1000mg/L+10％胎牛血清(FCS)+1％2mML-谷氨酰胺+1％青霉素和链霉素
3.37℃和5％CO2下温育6小时
4.温育6小时后，按照计划，为指定的孔加入10μl培养基配制的不同剂量处理试剂
5.FGF2(ng/ml)和GAGs(μg/ml)–10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125
6.37℃和5％CO2下用处理试剂温育36小时
7.将BrdU加入各孔
8.37℃和5％CO2下，用BrdU标记细胞2小时(加入20μlBrdU标记溶液/孔)
9.扣干平板以除去标记培养基
10.将200μl/孔FixDenat加入细胞，并在15-25℃温育30分钟
11.通过轻弹和扣干彻底除去FixDenat溶液
12.加入100μl/孔抗-BrdU-POD工作溶液，15-25℃温育90分钟
13.通过轻弹和用250μl/孔洗涤溶液(1xPBS)洗涤3次除去抗体偶联物
14.通过扣干除去洗涤溶液
15.加入100μl/孔底物溶液，在15-25℃温育30分钟
16.检测370nm的吸光度(参比波长：492nm)
实施例5
进行基于FACS的细胞增殖试验以获知HS8对hMSC增殖的影响(方案如下所述)。
通过GuavaViaCount(基于FACS)方法在6天期间监测人间充质干细胞对HS8(HS8+)的剂量-响应。FGF2用作给药阳性对照。发现HS8能增强hMSC增殖并提供显著的刺激。
细胞增殖方案
材料
1.HM20hMSC–20岁西班牙裔男性捐赠者(购自隆萨公司)
2.FGF2(RD系统公司目录号233-FB-025)
3.维持培养基：DMEM(10mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺
4.HS8(+)批次2,HS8(-)批次2,猪粘膜硫酸乙酰肝素(塞尔萨斯试验室有限公司，美国),肝素(Sigma目录号H3149)
5.GuavaFlex试剂(密理博公司)
方法
1.将HM20细胞以3000个细胞/cm2、500μl/孔培养基涂布在24-孔板上(第0天)
2.第1天–更换培养基，FGF2(ng/ml)和GAG(μg/ml)浓度渐增–10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156在500μl新鲜培养基中
3.每2天更换培养基
4在指定的时间点收集细胞(第2、4和6天)–含100μl胰蛋白酶并用100μl培养基(t＝第2天)或300μl培养基(第4和6天)中和
5.用Guava仪器(Guavaflex试剂:细胞悬液为1:200)计数细胞
实施例6-人间充质干细胞分离
人骨髓(BM)单个核细胞的制备
通过密度梯度分离来收集人骨髓(BM)和制备BM单个核细胞
1.按照知情同意，通过抽吸从健康的年轻志愿者(18-40岁)的后髂嵴(胯骨)收集约40mL的人骨髓(BM)。将BM立即放入不含防腐剂、含肝素钠的50-mL试管中(10,000单位/试管)。
2.取出10-μL等分试样，用白细胞液(WCF)作1:20稀释，利用血球计数器计算有核细胞含量。
3.然后将等体积的封闭缓冲液加入BM抽吸物，充分混合，然后通过70-μmFalcon细胞过滤器过滤以去除任何小的凝块和骨碎片。
4.然后将3mlFicoll-Hypaque(Lymphoprep)溶液分配到约12个圆底14-mL聚苯乙烯Falcon试管的底部，用7.5mL稀释BM小心层叠其上。
5.试管在室温下以400g离心30分钟。
6.利用一次性塑料巴斯德移液器从所有试管回收白细胞带，合并入4X14mL聚苯乙烯试管。
7.用HHF洗涤缓冲液稀释细胞，在4℃以400g离心样品10分钟以沉淀BMMNC。
8.吸出缓冲液，将细胞合并在一个试管中。
通过贴壁分离MSC
1.将BMNC级分接种入15cm平皿的维持培养基中(DMEM,1g/l葡萄糖,10％FCS,2mML-谷氨酰胺,50U/ml青霉素和50U/ml链霉素)，细胞贴壁3天，然后作第一次培养基更换。
2.将细胞培养在维持培养基中，每3-4天更换培养基，利用0.125％胰蛋白酶作常规传代直至85％汇合。再涂布，将细胞以3,000/cm2接种。所有培养物维持在37℃、5％CO2的加湿孵育箱中。
3.利用无酶细胞解离溶液(美国医学仪器公司的细胞剥离器-CellStripper,Mediatech,USA)从培养物中分离细胞，用PBS洗涤一次，再计数。然后将1x105个细胞等份加入96-孔板，450xg离心5分钟以沉淀细胞。然后加入2％FCS/PBS预稀释的免疫表型检测抗体溶液，在冰上温育细胞20分钟。然后用2％FCS/PBS洗涤细胞两次，再重悬于2％FCS/PBS中，用GUAVAPCA-96台式流式细胞仪(美国瓜瓦技术公司-GuavaTechnologiesInc.)分析。所有的样品一式三份检测。
STRO-1阳性BMSSC的磁性激活细胞分选(MACS)
采用MACS能部分纯化BMSSC群体以及加工大量的BMMNC而不影响整体干细胞收率。按照密度梯度离心，从40mLBM抽吸物中回收约1-2×108个单个核细胞。免疫标记前，将BMMNC悬于0.5mL封闭缓冲液并在冰上温育约30分钟，以降低Fc受体-介导的抗体结合的可能性。
采用磁性激活细胞分选(MACS)分离STRO-1+BMSSC
1.4℃下，通过400g离心10分钟以沉淀BMMNC，以500μlSTRO-1上清液每5×107个BMMNC重悬，冰上温育60分钟，并作偶尔的轻柔混合。
2.BMMNC用HHF洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于含有生物素化山羊抗小鼠IgM(μ-链特异性)的0.5mlHHF中作1/50稀释，在4℃温育45分钟。
3.用MACS缓冲液洗涤BMMNC三次，重悬于其中加入50μl链霉亲和素微珠(10μl微珠/107个细胞，90μlMACS缓冲液中)的450μlMACS缓冲液。将混合物在冰上温育15分钟。
4.用冰冷却的MACS缓冲液洗涤一次后，取小等分试样的细胞作流式细胞术分析(预取样)。然后将剩余的细胞置于miniMACS柱(柱容量为108个细胞，美天旎生物技术公司，MS柱)。所述STRO-1-细胞(阴性级分)未保留在柱内并在重力作用下流过柱，进入流出物，收集在新的2ml聚丙烯试管中，而STRO-1+细胞保持连接于磁化基质。
5.用0.5mlMAC缓冲液洗涤柱3次，以除去任何非特异性结合的STRO-1-细胞，其收集在新的2毫升聚丙烯试管中。
6.将柱从磁场取出后，用MACS缓冲液冲洗柱，从而将STRO-1+细胞(阳性级分)回收到新的2毫升聚丙烯试管。然后计数STRO-1+细胞并作处理以便用于双色FACS。
7.取预-MACS、STRO-1-和STRO-1+各级分的小样品(0.5-1.0x105个细胞)，置于含0.2ml链霉亲和素-FITC偶联物的不同2mL聚丙烯试管中(1/50)。然后将细胞样品在冰上温育5分钟，以评估富集过程。未标记的预-MACS细胞的样品(1.0x105个细胞)作为阴性对照。
8.这些样品用HHF洗涤两次，用FACSFix溶液固定，随后通过流式细胞术分析，以评估纯度和回收率。
9.此时，部分纯化的STRO-1+BMSSC可以培养扩增或通过双色FACS作进一步纯化。
通过集落效率测定评估骨髓质量
人骨髓抽吸物中CFU-F集落的预期发生率是每涂布的105个细胞约5-10个CFU-F。
1.将BMMNC以0.3、1.0和3.0x105个细胞每孔接种在6-孔培养板中补充有20％(v/v)FBS,2mMl-谷氨酰胺,100μMl-抗坏血酸-2-磷酸酯,50U/mL青霉素,50mg/mL链霉素和β-巯基乙醇(5x10-5M)的α-MEM中。培养物为一式三份，在37℃、5％CO2和>90％湿度下温育12天。
2.用PBS洗涤第12天的培养物两次，然后在PBS配制的1％(w/v)低聚甲醛中固定20分钟。
3.然后用0.1％(w/v)甲苯胺蓝(1％低聚甲醛溶液配制)染色固定的培养物1小时，再用自来水冲洗并使其干燥。超过50个细胞的聚集体评定为CFU-F。
高度纯化BMSSC的荧光激活细胞分选
虽然所有可检测的CFU-F包含在STRO-1+BMMNC级分内，BMSSC仅占总STRO-1+群体的不到2％。大多数STRO-1+细胞是血型糖蛋白-A+有核红细胞，一些是CD19+B-细胞。因此，基于STRO-1表达的BMSSC选择仅获得部分富集CFU-F(约10倍)的结果。克隆源性BMSSC均包含在STRO-1亮细胞级分中，该级分通过基于标志物表达的双色FACS可以进一步判别，所述标志物不存在于有核红细胞和淋巴细胞上，特别是CD106和CD146。下述方法能分离总STRO-1+细胞级分中的较小亚群，STRO-1亮/CD106+BMMSC(1.4％±0.3；n＝20)，其中涂布的每2-3个细胞中有1个具有形成CFU-F的性能。该富集水平几乎比未分级BMMNC观察到的CFU-F的平均发生率(涂布的每10,000个细胞有1个CFU-F)高5,000-倍。
采用流式细胞术细胞分选(FACS)分离STRO-1亮/CD106+BMSSC
1.免疫标记前，将MACS-分离的STRO-1+细胞BMMNC(一般是1x108个BMMNC中2-5x106个细胞)重悬于0.5mLHHF，以为2-色免疫荧光和FACS作准备。
2.约3-5x105个MACS-分离的STRO-1+细胞分散入3个适当标记的试管，向其中加入以下物质：
(i)无一抗(双阴性对照)，维持于冰上。
(ii)链霉亲和素-FITC偶联物(1/100稀释，HFF配制)在冰上温育30分钟(FITC对照)。然后用HHF洗涤细胞两次。
(iii)0.5mL鼠科IgG抗人CD106(VCAM-1)用HFF稀释至20μg/ml。STRO-1+细胞在冰上温育30分钟，用HHF洗涤两次，重悬于0.2mLPE-偶联的山羊抗-小鼠IgG(γ-链特异性),(PE对照)。样品经温育和洗涤，然后重悬于HFF。
(iv)其余的1-2x106个MACS-分离的STRO-1+细胞重悬在0.5mL鼠科IgG抗-人CD106(VCAM-1)并如上所述温育，用HHF洗涤两次，重悬于0.2mLPE-偶联的山羊抗-小鼠IgG(γ-链特异性)和链霉亲和素-FITC偶联物(1/100稀释度，HHF配制)，然后在冰上温育30分钟(分选样品)。之后如上述那样洗涤这些细胞，并重悬于HHF中。
3.将样品以每毫升1x107个细胞的浓度重悬在HHF中，然后利用配有波长为488nm的250MW氩激光发射光的任何分选仪作分选，从而能同时检测FITC和PE。
样品(i-iii)用于补偿FITC和PE。
5.将样品(iv)的经分选STRO-1亮7/VCAM-1+细胞收集在含有合适生长培养基的试管中并混合。
6.如上所述进行细胞计数。然后培养分选的细胞。
人BMSSC的离体培养
含血清培养基
1.在37℃、4％CO2和>90％的相对湿度下，将STRO-1亮/CD106+分离的BMSSC群体(1-3x104/cm2)在含有Eagle培养基的α-改进(α-MEM)的组织培养烧瓶或平板中培养2周，所述培养基补充了20％胎牛血清、100μMl-抗坏血酸-2-磷酸酯、2mMl-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素。当培养物达到80-90％汇合时，原始BMSSC群体传代。
2.用无血清HBSS洗涤贴壁培养物一次，通过在每个T75烧瓶中加入2mL0.5％胰蛋白酶/EDTA溶液，37℃温育5-10分钟进行酶促消化以解离细胞。
3.通过在0.4％台盼蓝/PBS中制备单细胞悬液的1:5稀释液来评估细胞活力，采用血细胞计数器测定活细胞数。
4.合并BMMSC单细胞悬液，以0.5-1.0x104/cm2再接种在补充了10％FBS、100μMl-抗坏血酸-2-磷酸酯、2mMl-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的α-MEM生长培养基中，在37℃、5％CO2和>90％相对湿度下温育。通过抽出培养基并用升温至37℃的等体积的新鲜制备培养基替换来对培养物补料。
血清消除培养基
该方法是最初为培养造血组细胞开发的血清消除培养基(SDM)的改进。
1.通过在室温下用纤连蛋白溶液以5μg/cm2预包被90分钟来制备纤连蛋白包被的板或烧瓶。此后，纤连蛋白溶液吸出并用无菌PBS洗涤培养容器一次，然后接种细胞。
2.STRO-1亮/CD106+分离的BMSSC群体(1-3x104/cm2)悬浮在培养基中，从而培养在纤连蛋白包被的组织培养瓶或板中，所述培养基含有补充了2％(w/v)牛血清白蛋白(CohnfractionV)、10μg/mL重组人胰岛素、人低密度脂蛋白、200μg/mL铁饱和的人转铁蛋白、2mMl-谷氨酰胺、地塞米松磷酸钠(10-8M)、100μMl-抗坏血酸-2-磷酸酯、β-巯基乙醇(5x10-5M)、10ng/mL血细胞衍生的生长因子-BB、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的α-MEM。
3.然后将培养物在37℃、4％CO2和>90％相对湿度下温育2周。当培养物达到80-90％汇合时，原始BMSSC群体传代。
离体扩增的MSC的冷冻保存
1.一般通过上述的胰蛋白酶/EDTA消化来制备，培养扩增的MPC的单细胞悬液。然后用冷HFF稀释并洗涤细胞。
2.将细胞沉淀物以1x107个细胞每毫升FBS的浓度重悬，并保持在冰上。然后逐渐加入等体积的冷冻混合物(20％DMSO，冷FBS配制)，同时轻轻混合细胞，在10％DMSO/FBS中得到最终浓度为5×106个细胞每毫升。1ml等分试样再分装入在冰上预冷的1.8-ml冷冻管，然后利用控速冷柜以-1℃每分钟的速率冷冻。
3.然后将冷冻的小瓶转移到液氮中长期贮存。将细胞37℃水浴中迅速解冻恢复冻结的储备物。然后将细胞重悬于冷的HFF并以280g离心10分钟。
4.为评估细胞活力，在0.4％台盼蓝/PBS中制备1:5稀释液，并且使用血细胞计数器测定细胞数。通常，此过程得到80-90％的活力。
实施例7-集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)测定
采用下述方法评估hMSC的CFU-F特性。将hMSC在未作补充的对照培养基之一中培养4代，然后在未作补充的对照培养基之一或添加以下之一的对照培养基中培养：肝素(1.25μg/ml)、CelsusHS(1.25μg/ml)、HS8-(1.25μg/ml)、HS8(HS8+)(1.25μg/ml)或HS8(HS8+)(2.5μg/ml)。结果示于图24A和24B。
材料
1.hMSC-(购自隆萨公司)。
2.维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺。
3.100％甲醇配制的结晶紫0.5％。
方法
1.将MSC以150个细胞/cm2一式三份涂布在100x15mm培养皿中，10ml培养基/皿。
2.细胞培养14天，在第7天更换培养基。
3.在第14天，如下所示用结晶紫(0.5％，100％甲醇配制)染色平板：
a.去除培养基并用PBS洗涤两次
b.加入10ml/皿的结晶紫，并温育30分钟
c.用PBS洗涤一次，用H2O洗涤一次并干燥平板
d.计数含超过50个细胞并且不与其它集落接触的集落。
实施例8-MSC的多能特征
按照下述方法，通过检验MSC分化成骨(成骨作用)和脂肪(脂肪生成作用)的能力测试MSC的多能特征。结果示于图25。
细胞
4代细胞(P4)–普通维持培养基中培养的hMSC
7代细胞(P7)–含有以下处理试剂之一的普通维持培养基中培养的P4到P7的hMSC：
·HS8(HS8(+))2.5ug/mL
·HS8(-)1.25ug/mL
·CelsusHS1.25ug/mL
·肝素1.25ug/mL
·FGF21.25ug/mL
成骨分化
材料
1.hMSC-(购自隆萨公司)。
2.维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺
3.处理维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺,10nM地塞米松,10mMβ-甘油-磷酸酯和25μg/mLL-抗坏血酸-2-磷酸酯
4.PBS配制的4％低聚甲醛
5.茜素红溶液：1.37g，100mLH2O配制；pH4.1-4.3
方法
1.将细胞接种(3,000个细胞/cm2)在6-孔板中，24小时。
2.对照孔的培养基更换为维持培养基
3.处理孔的培养基更换为含有10nM地塞米松、10mMβ-甘油-磷酸酯和25μg/mlL-抗坏血酸-2-磷酸酯的维持培养基
4.然后培养所有的细胞28天，每3天更换培养基
5.然后用茜素红染色细胞：
a.用PBS洗涤3次
b.用4％低聚甲醛固定细胞10分钟
c.用ddH2O洗涤3次
d.向细胞中加入茜素红溶液，温育30分钟，缓慢振荡
e.用ddH2O洗涤3次
f.空气干燥染色的细胞
成脂肪分化
材料
1.hMSC-(购自隆萨公司)。
2.脂肪细胞维持培养基：DMEM(4500mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺
3.脂肪细胞处理培养基：DMEM(4500mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺,10μM地塞米松,10μM胰岛素,20μM吲哚美辛和115μg/mL3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
4.PBS配制的4％低聚甲醛
5.油红O溶液：0.36％，60％异丙醇配制
方法
1.将细胞接种(18,000个细胞/cm2)在6-孔板中，一式三份
2.将细胞培养至汇合
3.对照孔的培养基更换为脂肪细胞维持培养基(4500mg/L葡萄糖)
4.处理孔的培养基更换为含有1μM地塞米松,10μM胰岛素,20μM吲哚美辛和115μg/mL3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的脂肪细胞处理培养基
5.然后培养28天，每3天更换培养基
6.然后用油红O染色细胞：
a.用PBS洗涤3次
b.用4％低聚甲醛固定细胞60分钟
c.用ddH2O洗涤1次
d.向细胞中加入油红O溶液，温育1小时，缓慢振荡
e.用60％异丙醇洗涤2次
f.用ddH2O洗涤3-5次
g.除去板上的ddH2O或空气干燥染色的细胞
实施例9
采用下述方法研究HS8对FGF-2介导的hMSC生长的影响。发现HS8能增强FGF-2介导的MSC生长(图26)。
细胞
4代细胞–在含和不含以下处理试剂的普通维持培养基中培养的hMSC：
·仅含FGF20.156ng/mL
·FGF20.156ng/mL与不同剂量的HS8(+)
细胞增殖方案
材料
1.hMSC-(购自隆萨公司)。
2.FGF2(RD系统公司目录号233-FB-025)。
3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺。
4.HS8(HS8(+)),HS8(-),猪粘膜硫酸乙酰肝素(塞尔萨斯试验室有限公司,美国),肝素(Sigma目录号H3149)。
5.GuavaFlex试剂(密理博公司)。
方法
1.将细胞以500μl/孔培养基、3,000个细胞/cm2接种在24-孔板中(第0天)
2.第1天–培养基更换为含有维持培养基加单独的FGF2(0.156ng/mL)或FGF2(0.156ng/mL)与各种浓度的HS8(+)：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156(μg/ml)，500μl新鲜培养基中
3.每2天更换培养基
4.在第4天用100μl胰蛋白酶处理收集细胞，用300μl培养基中和
5.用GUAVA仪器(Guavaflex试剂:细胞悬液为1:200)计数细胞。
实施例10
采用下述方法研究HS8对经由ERK途径的FGF-2信号传导的影响。通过ERK1/2和FRS2a的磷酸化检测发现HS8能增强/维持FGF2介导的ERK途径信号传导(图27)。
细胞
P4–在含和不含以下处理试剂的普通维持培养基中培养hMSC：
·仅含FGF20.312ng/mL
·HS8(HS8(+))2.5μg/mL
蛋白质印迹
材料
1.hMSC-(购自隆萨公司)。
2.FGF2(RD系统公司目录号233-FB-025)。
3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺。
4.无血清培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),0.2％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺
5.针对磷酸-FRS2a的抗体(细胞信号传导公司-CellSignaling.目录号3861)1:1000，TBST配制的5％BSA
6.针对磷酸-ERK1/2的抗体(细胞信号传导公司目录号9106L)1:2000，TBST配制的5％BSA
7.针对总ERK1/2的抗体(细胞信号传导公司目录号9102L)1:1000，TBST配制的5％BSA
8.针对肌动蛋白的抗体(密理博化学公司-MilliporeChemicon.目录号MAB1501R)1:8000，TBST配制的5％BSA
方法
1.将细胞以10,000个细胞/cm2接种在6-孔板的维持培养基中
2.第1天：将培养基更换为无血清培养基，2mL/孔
3.第3天：将处理试剂加入孔中。所需量的HS8(+)和/或FGF2在无-血清培养基中给予，以10μL/孔加入
4.在不同时间点(30分钟和24小时)，用1.5Xlaemmli缓冲液收集细胞，100μL/孔
5.裂解物在95℃加热5分钟，保存在-20℃
6.样品经冻融一次
7.将20μL/孔的样品加载入Novex4-12％Bis-TrisSDSPAGE凝胶的各道，10孔(英杰公司.目录号NP0335BOX)
8.在180V，利用1XMOPS缓冲液跑凝胶50分钟
9.然后在100V，1X转移缓冲液中将分辨的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜，1小时30分钟
10.用PonceauS溶液染色硝酸纤维素膜，根据感兴趣蛋白质的大小切成条带
11.然后在室温下，用TBST配制的5％BSA或5％脱脂奶封闭膜30分钟到1小时并缓慢振荡
12.然后将推荐稀释度的一抗在4℃温育过夜并缓慢振荡
13.然后用TBST洗涤印迹3次，每次5分钟
14.然后将推荐稀释度的二抗在室温下温育1小时至两小时并缓慢振荡
15.然后用TBST洗涤印迹3次，每次5分钟
16.印迹与化学发光试剂温育并在暗示处理使得x-射线薄膜显色以供目测观察条带
实施例11-HS8的NMR分析
分析前，将HS8的样品保存在-20℃。通过溶解于含有内标tBuOH(200μL,δ1.24ppm)的D2O(600uL)完成NMR分析，该内标用于化学位移比较的定量测定。精确称重约1、4和7mg量的CelsusHS，制成工作D2O/tBuOH溶液，在与HS8相同的运行中分析。标准溶液的拟合线得到回归为0.995或更好以便相比于内标，积分乙酰基甲基区域，δ3.15-3.25ppm的区域和异头区域δ5.15-5.65ppm的最低场部分。
样品的小尺寸导致低信噪比，因此，仅有乙酰基区域数据用于计算递送0.7mg值的HS8量。完成第二实验，比较乙酰基峰的信噪比，记录0.5mg的值。这是与内标无关的绝对值。在进一步分析之前通过3个冻干步骤除去tBuOH，记录的质量是1.2mg。值得注意的是，可积分SECHPLC数据以便得到大致的纯度值，其也记录到58％，提示材料中存在0.7mgHS-GAG。此类质量差异在小GAG样品中不是什么新的现象，因此，估计改变湿度和盐的比例肯定影响记录的质量。
HS8、CelsusHS和HS3*的1HNMR图谱显示于错误！参考源未知.31。所示图中相比于其它信号(CelsusHS在4.8-4.9有最高峰，HS3是中等高度峰)的HS8强度差异(在4.8-4.6ppm有最低峰)是因为所有图谱根据乙酰基甲基共振的高度标准化：就该HS8样品而言，观察到略好的匀场，其中线宽较窄，从而导致乙酰基共振较尖锐和较高。
通过2-DNMR区分HS8相比于CelsusHS的组成改变。
密切检查HS81HNMR的次甲基和亚甲基区域显示相比于CelsusHS和HS3的差异(错误！参考源未知.32)。
[*HS3是对BMP-2的乙酰肝素结合域具有特异性和高结合亲和力的分离的硫酸乙酰肝素。HS3描述于WO2010/030244]
实施例12-HS8和其它HS制品的HPLC-SEC-RI
用水制成2mg/mL的硫酸乙酰肝素制品(约1mg，精确称重)。这些制品在水中的肝素裂合酶I、II和III消化物是2mg/ml。溶液经离心(14000g,2min)，取200μL等份试样作分析。
SEC-RI系统由Waters2690Alliance分离模块和Water2410折射率监视器(范围64)构成。从RI色谱图进行定量的dn/dc设定为0.129(参比)。注射样品(50μL)，用50mM乙酸铵，以0.5ml/分钟从串联的两根SuperdexTM肽10/300GL柱(300x10mmGE保健公司-GEHealthcare,白金汉郡,英国)洗脱。利用ASTRAsoftware(4.73.04版,雅特技术公司-WyattTechnologyCorp)收集数据和分析。
全HS8制品的尺寸-排阻层析显示不同的尺寸排阻图。CelsusHS起始材料在15mL显示空信号(voidingsignal)，其余各种尺寸的材料在约23mL洗脱剂时洗脱。如错误！参考源未知.33所示，HS8材料(FGF-2亲和柱保留)显示富集在排空SEC柱的物质中的尺寸图。
这再次与于HS3制品的尺寸图不同，从而显示HS8和CelsusHS图之间的中等尺寸图(错误！参考源未知.34)。HS8色谱图在约36mL显示大的盐信号，因为该样品在50mM乙酸钠缓冲液(pH7)而非水中制备。
图35显示Celsus的两个不同批次的HS的SEC色谱图。第10697批用作起始材料以便制备HS3和HS8。用酶对两批次的消化是相似的，除了第10595批看起来根本未消化的和排空柱的物质量较大。
HS8的肝素裂合酶消化物的尺寸图(错误！参考源未知.36)与CelsusHS起始材料(错误！参考源未知.35)或HS3(错误！参考源未知.36)的极为不同。HS3所得的尺寸图与以前的消化物所得的非常类似。与HS3消化物的类似，HS8色谱图在排空体积(15mL)几乎不显示强度，提示大多数材料消化到相同的程度。然而，两种HS3消化物在约19mL显示显著不同的信号强度，而HS8在约18mL显示较宽的信号。
实施例13-[3H]肝素试验
采用下述方案评估源自FGF2的氨基酸序列的SEQIDNO:1的肝素结合能力。结果示于图37。
材料
(1)肽：
Gandhi等(HS8)–南洋理工大学(NanyangTechnologicalUniversity)制备
GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)生物素
(2)3H肝素0.1μCi(珀金埃尔默公司-PerkinElmer,波士顿,美国)
(3)硝酸纤维素膜(伯乐公司-Bio-Rad,美国)
(4)牛血清白蛋白4％(w/v)，PBS配制
(5)真空电炉(TF科技公司-ThermoFisherScientific,美国)
(6)Tri-Carb2800TCR液体闪烁分析仪(珀金埃尔默公司,波士顿,美国)
方法
(1)用PBS补足FGF2-HBD-肽至所需浓度(4.66x10-9,9.32x10-9,1.86x10-8,3.73x10-8摩尔)
(2)用已知浓度的肽一式两份浸渍相同的硝酸纤维素膜
(3)空气干燥膜1h
(4)在80℃用真空电炉进一步干燥45分钟
(5)用PBS洗涤膜3次
(6)将3H肝素0.1pCi加入膜，在闪烁计数小瓶中温育16小时
(7)用PBS洗涤膜4次
(8)用Tri-Carb2800TCR液体闪烁分析仪(珀金埃尔默公司,波士顿,美国)测定放射性。
实施例14
采用下述方案评估肝素结合域肽SEQIDNO:1结合固定化肝素的能力。结果示于图38。
材料
1.标准试验缓冲液(SAB)–100mMNaCl,50mM乙酸钠,0.2％v/v吐温20,pH7.2
2.封闭缓冲液-0.4％鱼明胶(Sigma目录号67041)+SAB
3.GAG结合板(Iduron,英国)
4.肽：
Gandhi等(HS8)-南洋理工大学制备
GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)生物素
5.ExtraAvidin-AP(Sigma目录号E2636)
6.SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯(Sigma,N2770)
方法
1.将肝素溶解于SAB(5μg/ml)
2.将200μl肝素溶液/孔加入GAG结合板，室温下避光温育过夜
3.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
4.37℃下用250μl/孔封闭缓冲液避光温育平板1小时
5.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
6.将肽溶解于封闭缓冲液，并进行连续稀释：0、50、100、200nM
7.将200μl/孔的稀释蛋白分配入GAG包被平板，在37℃温育2小时
8.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
9.加入200μl/孔的封闭溶液配制的220ng/mlExtraAvidin-AP，并在37℃下温育30分钟
10.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
11.加入200μl/孔的显色剂：DI水配制的SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯，室温下温育40分钟
12.读取405nm的吸光度
实施例15
评估FGF-2结合HS8的能力。这与和原始HS的结合(HS-PM猪粘膜)，或无糖情况相比较。结果示于图39。
材料
1.标准试验缓冲液(SAB)–100mMNaCl,50mM乙酸钠,0.2％v/v吐温20,pH7.2
2.封闭缓冲液-0.4％鱼明胶(Sigma目录号67041)+SAB
3.GAG结合板(lduron,英国)
4.RD系统公司的蛋白：FGF2-233FB
5.RD系统公司的抗体：FGF2-BAM233
6.ExtraAvidin-AP(Sigma目录号E2636)
7.SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯(Sigma,N2770)
方法
1.将GAG溶解于SAB(5μg/ml)
2.将200μlGAG溶液/孔加入GAG结合板，室温下避光温育过夜
3.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
4.37℃下用250μl/孔封闭缓冲液避光温育平板1小时
5.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
6.将蛋白溶解于封闭缓冲液，并进行连续稀释：0、0.781、1.56、3.125nM
7.将200μl/孔的稀释蛋白分配入GAG包被平板，在37℃温育2小时
8.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
9.加入200μl/孔的封闭溶液配制的250ng/ml生物素化一抗，并在37℃下温育1小时
10.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
11.加入200μl/孔的封闭溶液配制的220ng/mlExtraAvidin-AP，并在37℃下温育30分钟
12.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次
13.加入200μl/孔的显色剂：DI水配制的SigmaFAST对-硝基苯基磷酸酯，室温下温育40分钟
14.读取405nm的吸光度。
实施例16
分析在有HS8存在下，塑料贴壁间充质干细胞在6天期间的增殖情况。结果示于图40。
细胞增殖方案
材料
1.HM20hMSC–20岁西班牙裔男性捐赠者(购自隆萨公司)
2.FGF2(RD系统公司目录号233-FB-025)
3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mML-谷氨酰胺
4.HS8
5.GuavaFlex试剂(密理博公司)
方法
1.将HM20细胞以3000个细胞/cm2、500μl/孔培养基涂布在24-孔板上(第0天)
2.第1天–更换培养基，GAG(μg/ml)–2.5和0.5
3.每2天更换培养基
4.在指定的时间点收集细胞(第6天)–用100μl胰蛋白酶并用300μl培养基中和
5.用Guava仪器(Guavaflex试剂:细胞悬液为1:200)计数细胞
实施例17
与原始Celsus起始HS(HS-PM)或非-结合性HS流出物(HS8-)相比，通过如下所述的BrDU掺入检测在有分离的HS8存在下，STRO-1-分离的间充质干细胞在36小时期间的增殖情况。结果示于图41(其中HS8G＝HS8)。
方案(细胞增殖ELISA，BrdU(比色法)罗氏公司)
1.细胞接种-每孔在190μl培养基中的5000个细胞(96孔板)
2.培养基–αMEM+10％胎牛血清(FCS)+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素和链霉素+100nML-谷氨酸
3.37℃和5％CO2下温育6小时
4.温育6小时后，按照计划，为指定的孔加入10μl培养基配制的不同剂量处理试剂
5.GAGs(μg/ml)–10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125
6.37℃和5％CO2下用处理试剂温育36小时
7.将BrdU加入各孔
8.37℃和5％CO2下，用BrdU标记细胞2小时(加入20μlBrdU标记溶液/孔)
9.扣干平板以除去标记培养基
10.将200μl/孔FixDenat加入细胞，并在15-25℃温育30分钟
11.通过轻弹和扣干彻底除去FixDenat溶液
12.加入100μl/孔抗-BrdU-POD工作溶液，15-25℃温育90分钟
13.通过轻弹和用250μl/孔洗涤溶液(1xPBS)洗涤3次除去抗体偶联物
14.通过扣干除去洗涤溶液
15.加入100μl/孔底物溶液，在15-25℃温育30分钟
16.检测370nm的吸光度(参比波长：492nm)
实施例18-二糖的毛细管电泳(CE)分析
硫酸乙酰肝素(HS)来自塞尔萨斯试验室有限公司(HO-03103,批号HO-10697)。利用细菌肝素酶消化高级别猪肝素得到的二糖(ΔUA,2S-GlcNS,6S；ΔUA,2S-GlcNS,ΔUA,2S-GlcNAc,6S,ΔUA-GlcNS,6S,ΔUA-GlcNS,UA-GlcNAc,ΔUA,2S-GlcNAc,ΔUA-GlcNAc,6S,ΔUA,2S-GlcN,ΔUA,2S-GlcN,6S,ΔUA-GlcN,6S,ΔUA-GlcN目录号HD001到HD013,艾度仑有限公司-IduronLtd,曼彻斯特,英国)购自英国曼彻斯特艾度仑有限公司。非天然产生的二硫酸化二糖的合成衍生物(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)也购自艾度仑有限公司以便用作内标。肝素寡糖(dp4,dp6,dp8,dp10,dp12(目录号HO04,HO06,HO08,HO10,HO12))和选择性脱硫酸化的肝素标准品(2-O,6-O和N-脱硫酸化肝素)(目录号DSH001/2,DSH002/6,DSH003/N,艾度仑有限公司,曼彻斯特,英国)也购自英国曼彻斯特的艾度仑有限公司。
肝素裂合酶I(乙酰肝素酶-Heparitinase,EC4.2.2.8,也称为乙酰肝素酶I)、肝素裂合酶II(乙酰肝素酶II,未指定EC编号)和肝素裂合酶III(肝素酶,EC4.2.2.7,也称为乙酰肝素酶III)获自日本生化学株式会社(SeikagakuCorporation)。将以冻干粉末(0.1U/小瓶)提供的这些酶溶解于0.1％BSA以提供含有0.5mU/μL的溶液。将等份试样(5μL；2.5mU)冷冻(-80℃)备用。
用肝素裂合酶消化HS制品
将各HS制品(1mg)溶解于500μL乙酸钠缓冲液(100mM含有10mM乙酸钙,pH7.0)，加入2.5mU的各3种酶。将样品在37℃温育过夜(24小时)并轻柔颠倒(9rpm)试管。再将2.5mU的各3种酶加入样品，在37℃再温育48小时并轻柔颠倒(9rpm)试管。通过加热(100℃，5分钟)来停止消化，然后冻干。将消化物重悬于500μL水中，取等份试样(50μL)用于CE分析。
毛细管电泳(CE)
将20mMH3PO4的水性溶液加入20mMNa2HPO4.12H2O的溶液得到pH3.5，从而制备毛细管电泳操作缓冲液。柱洗涤液是100mMNaOH(从50％w/wNaOH稀释)。利用配有0.2μm醋酸纤维素滤膜(SS公司-SchleicherandSchuell,达瑟尔,德国)的密理博过滤单元过滤操作缓冲液和柱洗涤液。
将二糖溶解于水中(1mg/mL)来制备12种二糖标准品的储备液。为测定标准品的校准曲线，制备含有12种标准品的混合物。12种标准品混合物的储备溶液含有10μg/100μL的各二糖，并制备含有10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/100μL的连续稀释液；包含2.5μg内标(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)。用水稀释HS的消化物(50μL/mL)，向各样品中加入相同的内标(2.5μg)。将溶液冻干并重悬在水(1mL)中。利用PTFE亲水性一次性注射器过滤单元(0.2μm；Advantec,TRK公司-ToyoRoshiKaisha,Ltd.,日本)过滤样品。
25℃，利用20mM操作缓冲液和Agilent3DCE(安捷伦技术公司-AgilentTechnologies,瓦尔特布隆,德国)仪器，在未涂覆的熔融石英毛细管(75μmID,64.5cm总长和56cm有效长度,聚微技术公司-PolymicroTechnologies,菲尼克斯,亚利桑那州,零件号TSP075375)上进行分析，毛细管电压为30kV。采用水力注射(50mbarx12sec)将样品引入毛细管的阴极(负极)端。
每次运行之前，用100mMNaOH(2分钟)、水(2分钟)冲洗毛细管，并用操作缓冲液预条件化(5分钟)。缓冲液补充系统替换入口管和出口管中的缓冲液以确保维持一致的体积、pH和离子强度。水在样品序列的开始、中段和结束时仅作为空白运行。监测232nm的吸光度。所有的数据储存在ChemStore数据库中，随后利用ChemStation软件取回和再加工。
采用以上详述的条件分离标准品混合物中12种肝素二糖的11种。在这些实验所用的条件下，第12种二糖ΔUA-GlcN不迁移。然而，该二糖未报道见于硫酸乙酰肝素中。标准品校准曲线的R2值范围从0.9949到1.0。
一式两份制备HS制品的肝素裂合酶I、II和III消化物，将一式两份样品的每一份注射入CE两次。因此，HS消化物中二糖的标准化百分比是分析结果的平均值。在标准混合物中分离的11种二糖中，仅有8种是HS消化物中检测到。其它小的信号在消化物的电泳图谱的基线上发现，这些可能对应于>2dp的寡糖。如上所述，与二糖相比，较大的寡糖具有较低的UV吸光度。
基于CelsusHS(批号10697)的样品完成一式两份分析，并与同一样品以前的一组分析作比较：这些结果示于图42。观察两组分析之间优异的相关性。CelsusHS消化物中8种二糖的比例类似于大组分ΔUA-GlcNAc和ΔUA-GlcNS以及较小比例的ΔUA-GlcNAc,6S、ΔUA-GlcNS,6S和ΔUA,2S-GlcNS,6S的其它以前分析(图42)。这对应于大比例的单-硫酸化和未硫酸化二糖，比例低一些的二硫酸化二糖和小比例的三硫酸化二糖，与HPLC-SEC图谱相一致。相比于CelsusHS起始材料，未保留的HS富集在单-硫酸化和未硫酸化二糖中。在HPLC-SEC色谱图中也发现未保留物质的这种模式是极为不同的。就HS8的分析而言，样品大小仅能进行单次分析，因此该制品未提供误差数据。HS8、HS3和CelsusHS的比较示于图44。
HS8的二糖组成与HS3(通过与BMP2的肝素结合域的亲和力从CelsusHS分离的HS，如WO2010/030244所述)的相当，其中整体上从CelsusHS制备了更高硫酸化(荷电)的级分。然而，明显的不同在于相比于HS3，HS8的UA-GlcNS,6s比例更高，US-GlcNS的比例较低。
获得HS8的原始CelsusHS的平均分子量为20-25kDa(相比之下，肝素约15kDa)，通过亲和层析鉴定HS8的过程未导致观察到的HS链分子量有实质性改变。预计各二糖单位的分子量范围在约430到约650KDa。采用每个二糖500道尔顿的大致平均分子量(例如，肝素中二糖的平均分子量约为650道尔顿)表明(基本近似值)每个平均(22kDa)HS8的HS8链长约44个环。
实施例19
鉴定到HS8优先结合FGF2并增加hMSC生长率后，我方进一步研究了HS8活性的机制。
FGF2中和抗体或FGFR1抑制剂(均是激酶抑制剂和中和抗体)均能降低HS8在hMSC中的增殖效应(图47-50)，从而证实HS8在hMSC中的促有丝分裂作用是通过其与FGF2/FGFR而非其它分子相互作用产生的。有HS8存在下，FGF2的快速降解延迟(图46)，从而证实HS8与FGF2相互作用以免其从培养基中降解。
我们已经证明(上文)HS8增强hMSC自我-更新，同时维持多能性。为验证在hMSC常规培养基中补充HS8是否能更快扩增培养物，我们在补充了HS8的培养基中培养分别来自3位独立捐献者的hMSC。通过FACS检测3位捐献者的生物标志物CD14、19、34、45、HLA-DR、CD73、90、105、CD49a、SSEA-4和STRO-1(例如，图22)，我们注意到暴露于HS8的hMSC能形成更多的集落(图51)并维持干细胞-样表型，而无论额外的细胞倍增时间。当hMSC在补充了HS8的培养基中扩增，表明“干细胞特性”的生物标志物得以维持。
我们还发现这些细胞能方便地分化成所有3种间充质干细胞谱系(包括骨，如通过茜素红、VonKossa、油红O和爱茜蓝染色测定的)并且具有增强的成骨作用，提示该策略可能对于矫型外伤治疗是有效的。HS8不负面影响MSC分化成骨的能力。
因此，我们将HS8施用于大鼠的头盖骨缺陷模型(图52)。改善的骨愈合明显提示HS8在外伤部位与FGF2相互作用，从而通过依赖于FGF-2的机制加速内源性干细胞和成骨祖细胞的活性，因而提高了该方法在治疗头盖骨缺陷中的治疗可能性。
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Claims (38)

1.硫酸乙酰肝素HS8。
2.分离的或基本上纯化形式的硫酸乙酰肝素HS8。
3.如权利要求1或2所述的硫酸乙酰基肝素HS8，其特征在于，所述HS8能结合具有或由氨基酸序列YCKNGGF(SEQIDNO:2)构成的肽或多肽。
4.如权利要求3所述的硫酸乙酰基肝素HS8，其特征在于，所述肽或多肽具有或由氨基酸序列GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)构成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的或基本上纯化的硫酸乙酰基肝素HS8，其特征在于，用肝素裂合酶I、II和III消化后，对所得二糖片段进行毛细管电泳分析，所述硫酸乙酰肝素HS8具有的二糖组成包括：
6.如权利要求1-4中任一项所述的分离的或基本上纯化的硫酸乙酰基肝素HS8，其特征在于，用肝素裂合酶I、II和III消化后，对所得二糖片段进行毛细管电泳分析，所述硫酸乙酰肝素HS8具有的二糖组成包括：
7.如权利要求1-6中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8、或分离的或基本上纯化形式的硫酸乙酰基肝素HS8，通过以下方法获得，所述方法包括：
(i)提供一固体支持物，所述支持物上附着有多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合域，所述肝素结合域具有氨基酸序列YCKNGGF；
(ii)将所述多肽分子与含有糖胺聚糖的混合物接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)从该多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多肽具有，或由选自GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO:1)的氨基酸序列构成。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，含有糖胺聚糖的所述混合物是从肠猪粘膜获得的硫酸乙酰肝素制品。
10.一种组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，还包含生长因子，优选FGF2。
12.一种药物组合物或药物，其包含权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。
13.如权利要求12所述的药物组合物或药物，其特征在于，所述药物组合物或药物还包含FGF2蛋白和/或间充质干细胞。
14.如权利要求12或13所述的药物组合物或药物，用于医学治疗方法。
15.如权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8，用于医学治疗方法。
16.如权利要求15所述的硫酸乙酰肝素HS8，其特征在于，所述医学治疗方法包括体内的伤口愈合方法。
17.如权利要求15所述的硫酸乙酰肝素HS8，其特征在于，所述医学治疗方法包括组织，优选骨组织的修复和/或再生。
18.如权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8在制备治疗组织的疾病、病症或损伤的药物中的应用，其中，所述方法包括组织，优选骨组织的修复和/或再生。
19.一种治疗患者中组织的疾病、病症或损伤的方法，所述方法包括将治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8给予该患者，从而导致组织，优选骨组织的修复和/或再生。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法包括将硫酸乙酰肝素HS8给予伤口处或伤口附近的组织或患者身体上需要再生或修复组织的位置。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将FGF2蛋白给予该患者。
22.一种治疗患者中组织的疾病、病症或损伤的药物，所述方法包括将生物相容的植入物或假体通过外科手术植入所述疾病、病症或损伤部位处或附近的患者组织，从而导致该组织的修复和/或再生，其中植入物或假体包含生物材料和权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。
23.一种生物相容植入物或假体，包含生物材料和权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。
24.一种形成生物相容植入物或假体的方法，所述方法包括用权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8涂覆或浸渍生物材料的步骤。
25.一种治疗患者中骨折的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8给予该患者。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述硫酸乙酰肝素HS8给予骨折附近的组织。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，给予所述硫酸乙酰肝素HS8包括将该硫酸乙酰肝素注射到骨折附近的组织。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，将所述硫酸乙酰肝素配制成包含所述硫酸乙酰肝素和药学上可接受的运载体、辅助剂或稀释剂的药物组合物或药物。
29.一种治疗患者中骨折的方法，所述方法包括将生物相容植入物或假体通过外科手术植入该患者骨折部位处或附近的组织，所述植入物或假体包含生物材料和治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。
30.一种体外培养干细胞的方法，所述方法包括在与权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养干细胞。
31.一种富集间充质干细胞(MSC)培养物中的集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC。
32.一种富集间充质干细胞(MSC)培养物中的集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC，从而使得培养的细胞增殖和MSC群体扩增，其中所述扩增的MSC群体的特征在于：
·≤2％的MSC群体表达CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR中的任一种；和
·≥95％的MSC群体表达CD105、CD73和CD90；
和
·≥40％的MSC群体表达CD49a和/或
·≥50％的MSC群体表达SSEA-4和/或
·≥20％的MSC群体表达STRO-1。
33.一种富集间充质干细胞(MSC)培养物中的集落形成单位(CFU-F)的方法，所述方法包括在与权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8接触下体外培养MSC，并且对MSC传代，其中一代或多代后，MSC群体的特征在于：
·≤2％的MSC群体表达CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR中的任一种；和
·≥95％的MSC群体表达CD105、CD73和CD90；
和
·≥40％的MSC群体表达CD49a和/或
·≥50％的MSC群体表达SSEA-4和/或
·≥20％的MSC群体表达STRO-1。
34.包含权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8的培养基。
35.如权利要求34所述的培养基，其还包含FGF2。
36.一种多部件试剂盒，所述试剂盒装有预定量的权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8和预定量的FGF2。
37.包含治疗有效量的以下物质的产品：
(i)权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8；和以下的一种或两种
(ii)FGF2蛋白；
(iii)间充质干细胞，
以便同时、分别或顺次用于医学治疗方法。
38.一种增加生长因子，优选FGF2的稳定性的方法，所述方法包括将生长因子，优选FGF2与权利要求1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素接触。
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