WO2006098332A1 - 硬組織形成促進剤 - Google Patents

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WO2006098332A1
WO2006098332A1 PCT/JP2006/305052 JP2006305052W WO2006098332A1 WO 2006098332 A1 WO2006098332 A1 WO 2006098332A1 JP 2006305052 W JP2006305052 W JP 2006305052W WO 2006098332 A1 WO2006098332 A1 WO 2006098332A1
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WO
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residue
group
acid residue
sulfate
hydroxyl group
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PCT/JP2006/305052
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French (fr)
Inventor
Takashi Takata
Yuji Kaneda
Original Assignee
Seikagaku Corporation
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    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a hard tissue formation promoter containing glycosaminodarlican or a salt thereof.
  • ALP alkaline phosphatase
  • a MEM amost, J, essential 3 ⁇ 4 ⁇ ground (minimum essential medium alpha medium)
  • BMP-2 Bone morphogenetic protein-2
  • BSP bone sialoprotein
  • FBS fetal bovine serum
  • GAG glycosaminoglycan
  • GlcN Gnorecosamine (glucosamine)
  • HexA Hexuronic acid
  • RT reverse transcription PCR
  • 2DSH 2— O—Desulfated Hep (2-0-desulfated heparin) (Hydoxyl group at HexA residue in Hep is desulfated)
  • 6DSH 6— 0—Desulfated Hep (6-0-desulfated heparin) (Hydoxyl group at position 6 of GlcN residue in Hep is desulfated)
  • NDSH N—Desulfated Hep (N-desulfated heparin) (position 2 of GlcN residue in Hep) Of the amino group is desulfurized)
  • Patent Document 1 contains, as an active ingredient, a GAG having a sulfate group and having a repeating structure of a disaccharide consisting of a HexA residue and a GlcN residue as an active ingredient, and the GAG has a 2-position hydroxyl group.
  • an intercellular communication enhancer characterized in that it is sulfated and the HexA residue or 2-amino group is sulfaminated to contain a GlcN residue.
  • Patent Document 2 contains, as an active ingredient, a GAG having a sulfate group and having a repeating structure of a disaccharide consisting of a HexA residue and a GlcN residue as a basic skeleton.
  • an intercellular communication inhibitor characterized in that a sulfhydryl group is sulfated to contain a ⁇ Glc residue.
  • Patent Document 3 discloses a certain kind of desulfated ⁇ Hep, which is a basic fibroblast growth factor activity promoter containing this as an active ingredient, and basic fibroblast growth Disclosed is a composition in which the activity of a basic fibroblast growth factor containing the factor is enhanced for cell proliferation.
  • Patent Document 4 discloses a hyaluronic acid fraction having an osteoinductive activity having a molecular weight of 20 K Daltonka et al. And 40 K Dalton.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-113090
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-119146
  • Patent Document 3 International Publication No. 96Z01278 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3333205
  • a disaccharide repeating structure consisting of a HexA residue and a GlcN residue is retained as a basic skeleton, and the hydroxyl group at the 2-position of the HexA residue in the basic skeleton, the 6-position of the GlcN residue.
  • GAG or its salt itself directly promotes the formation of hard tissue, and the sulfate group is retained in any one or less of the hydroxyl group of GlcN residue and the amino group at the 2-position of GlcN residue. It has the effect of promoting cell differentiation and enhancing the ALP activity of cells! / Neither disclosed nor suggested! / ⁇ .
  • An object of the present invention is to provide an agent that directly acts on a cell to cause the promotion of hard tissue formation, the promotion of cell differentiation, and the enhancement of the ALP activity of the cell.
  • the present inventor directly acts on a certain type of GAG or its salt cell to promote hard tissue formation, cell differentiation and cell AL.
  • the present invention has a sulfate group and has the following properties (1) and (2):
  • a hard tissue forming agent (hereinafter referred to as “the present invention formation accelerator”) containing AG or a salt thereof as an active ingredient
  • the basic skeleton is a disaccharide repeat structure consisting of HexA residues and GlcN residues.
  • the HexA residue is preferably a GlcA residue or an IdoA residue.
  • the hard tissue is preferably bone.
  • the present invention also relates to a cell differentiation promoting agent (hereinafter referred to as "the present invention") comprising GAG having a sulfate group and having the following characteristics (1) and (2) or a salt thereof as an active ingredient. It is called “differentiation promoter”.
  • the basic skeleton is a disaccharide repeat structure consisting of HexA residues and GlcN residues.
  • the HexA residue is preferably a GlcA residue or an IdoA residue.
  • GAGs that retain sulfate groups and have the above-described characteristics are specifically Hep and Hep. Hold the sulfate group at the 2nd hydroxyl group of the xA residue! /, NA! /, Hold the sulfate group at the 6th hydroxyl group of the GlcN residue in Hep! /, NA! /, 1 or 2 or more selected from the group forces consisting of those having no sulfate group in the amino group at the 2-position of the GlcN residue in Hep.
  • the cells are preferably bone marrow-derived mesenchymal cells or osteoblasts.
  • the present invention provides a cellular ALP activity enhancer (hereinafter referred to as “this") containing GAG having a sulfate group and the following properties (1) and (2) or a salt thereof as an active ingredient.
  • this a cellular ALP activity enhancer
  • the basic skeleton is a disaccharide repeat structure consisting of HexA residues and GlcN residues.
  • the HexA residue is preferably a GlcA residue or an IdoA residue.
  • the cells are preferably bone marrow-derived mesenchymal cells or osteoblasts.
  • agents of the present invention are collectively referred to as "agents of the present invention”.
  • the agent of the present invention is extremely useful because GAG, which is an active ingredient, exerts an excellent effect by directly acting on hard tissue formation, cell differentiation promotion or cell ALP activity enhancement. It is.
  • Active ingredient of the agent of the present invention contains GAG or a salt thereof having a sulfate group and having the following properties (1) and (2) as an active ingredient.
  • the basic skeleton is a disaccharide repeat structure consisting of HexA residues and GlcN residues.
  • the HexA residue is not particularly limited, but is preferably a GlcA residue or an IdoA residue.
  • the GlcA residue is preferably a D-GlcA residue.
  • the IdoA residue is preferably a L IdoA residue.
  • the GlcN residue is not particularly limited, but is preferably a D-GlcN residue.
  • the amino group of the GlcN residue may be acetylated.
  • the GlcN residue part is N-acetylylcosamine (GlcNAc).
  • GAG which is an active ingredient of the agent of the present invention, has a basic skeleton of such a disaccharide repeating structure consisting of HexA residue and GlcN residue. That is, when the HexA residue is “a” and the GlcN residue is “b”, GAG, which is an active ingredient of the agent of the present invention, is “a-b-a-b” or “b-a-b”. “A” also means basic skeletal power. “-” Indicates a glycosidic bond. When a is a GlcA residue, the glycosidic bond (ab) between a and b is preferably a ⁇ 1 ⁇ 4 bond.
  • the glycosidic bond (a ⁇ b) between a and b is preferably an ⁇ 1 ⁇ 4 bond.
  • the glycosidic bond between b and a (b ⁇ a) is preferably an ⁇ 1 ⁇ 4 bond.
  • Such GAG which is an active ingredient of the agent of the present invention, is characterized by retaining a sulfate group.
  • the position at which the sulfate group can be retained in the basic skeleton is not particularly limited, but is selected from the hydroxyl group at the 2-position of the HexA residue, the hydroxyl group at the 6-position of the GlcN residue and the amino group at the 2-position of the GlcN residue. One or more positions are preferred. Examples of GAG in which a sulfate group is held at such a position include Hep and HS.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the HexA residue, the hydroxyl group at the 6-position of the GlcN residue, and the 2-position of the GlcN residue in the basic skeleton described above There must be no sulfate group at any one or less of the amino groups. It is important. Therefore, as an active ingredient of the agent of the present invention, for example, Hep (hydroxyl group at the 2-position of HexA residue, hydroxyl group at the 6-position of GlcN residue, and amino group at the 2-position of GlcN residue are sulfated. Groups are retained), 2DSH, 6DSH, NDSH, etc.
  • GAG is a polysaccharide (polymer), and the size of all GAG molecules present in a fraction of a GAG, the composition and arrangement of constituent sugars, the position of sulfate groups, the number of sulfate groups, etc. are completely present. It goes without saying that it is technical common sense in this technical field that it is virtually impossible to be the same.
  • the origin of GAG that is an active ingredient of the agent of the present invention is not particularly limited, and natural products that may be used as they are are processed using chemical methods, enzymatic methods, or other methods. Use a chemically synthesized material.
  • Hep when Hep is used as an active ingredient of the agent of the present invention, Hep obtained from a natural product or the like by a known method may be used as it is. Hep already sold as a pharmaceutical or reagent may be used. It may be used. Alternatively, a method in which the degree of sulfuric acid in HS is increased by a known chemical method, enzymatic method, or other methods to the same extent as Hep may be used.
  • the term “Hep” in the application documents of this application includes not only pure Hep but also what is recognized as substantially the same as Hep.
  • the size (weight average molecular weight) of GAG that can be used as an active ingredient of the agent of the present invention is as long as it is recognized as "polysaccharide" by those skilled in the art. Although not particularly limited, for example, those having a weight average molecular weight of about 5000 to 20000 are preferred, and those having a weight average molecular weight of about 10,000 to 15000 are preferred.
  • the weight average molecular weight can be measured according to the method described in WOOO / 06608.
  • the purity of GAG as an active ingredient of the agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the scene and purpose of application of the agent of the present invention.
  • the agent of the present invention when the agent of the present invention is applied to a subject requiring high sterility or cleanliness, such as a tissue in a living body or cells cultured under aseptic conditions, it is purified to a high purity, It is desirable to use a substance that does not substantially contain a substance that is not scientifically or culturically acceptable (for example, endotoxin or microorganism).
  • a substance that is not scientifically or culturically acceptable for example, endotoxin or microorganism.
  • the agent of the present invention when the agent of the present invention is applied to a subject whose sterility or cleanliness is not so much required, the degree of purification may be appropriately reduced according to the situation and purpose.
  • the "GAG salt” is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the scene and purpose of application of the agent of the present invention.
  • a medically acceptable salt may be selected.
  • the salt of GAG include alkali metal salts (sodium salts, lithium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts, salts with inorganic bases such as ammonium salts, diethanolamine salts, cyclohexylamine salts, amino acid salts, etc. And salts with organic bases. Of these, sodium salts are preferred.
  • the agent of the present invention may contain only one type of the GAG or a salt thereof as an active ingredient, or may contain a plurality of types of the GAG or a salt thereof as an active ingredient.
  • GAG or its salt By using such GAG or its salt, it can be set as the formation accelerator of this invention, this differentiation promoter, and this activity enhancer which have the outstanding effect.
  • the dosage form of the agent of the present invention contains the aforementioned GAG or a salt thereof, and has an action of promoting hard tissue formation, an action of promoting differentiation of cells, and an action of enhancing ALP activity of cells by parentheses. It is not particularly limited as long as it is exhibited, and can be appropriately selected according to the scene and purpose of applying the agent of the present invention.
  • the agent of the present invention may be a powder, granule or other solid agent as a solution-state agent containing the GAG or a salt thereof.
  • a solution agent when it is provided as a solution agent, it may be provided in a frozen state or as a solution, or it may be provided as a dissolving agent at the time of use.
  • the concentration of the GAG or a salt thereof in the agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the scene or purpose of application of the agent of the present invention.
  • Formulation of the agent of the present invention can be performed by a known method.
  • other drug-removing components such as an isotonic agent, a corrigent, a preservative, a pH adjuster, a soothing agent, a colorant, an excipient, a binder, a lubricant, and a disintegrant can be blended.
  • the agent of the present invention can be a hard tissue formation promoter, a cell differentiation promoter, or a cell ALP activity enhancer.
  • the “hard tissue” is preferably bone. “Promotion of hard tissue formation” includes the significance of promoting calcification.
  • the “cell” may be a bone marrow-derived mesenchymal cell or an osteoblast. preferable.
  • the agent of the present invention may be a single agent intended for one of these uses, or a single agent intended for a plurality of these uses.
  • the agent of the present invention can be administered or administered as long as the GAG or its salt molecule, which is the active ingredient, is in contact with the target biological tissue or cell.
  • the method of application is not limited.
  • the agent of the present invention can be used, for example, as a drug or reagent for the purpose of promoting hard tissue formation, promoting cell differentiation, or enhancing cell ALP activity.
  • the dosage is determined according to the purpose of administration (prevention, maintenance (prevention of deterioration), reduction (improvement of symptoms) or treatment), type of disease, patient symptoms, gender, year For age, weight, administration site, administration method, etc. Therefore, although it should be set individually and is not particularly limited, approximately 0.03 mg / dose site to 3 mg / dose site as GAG or a salt thereof can be generally administered per adult.
  • the agent of the present invention is used as a medicine
  • the animal to which it is administered is not particularly limited, but a human who prefers a mammal preferred by a vertebrate is particularly preferred. In this case, according to each use, it can administer to the following animals, for example.
  • a cell differentiation promoting agent When used as a cell differentiation promoting agent, it can be administered to an animal in a state where cell sorting is desired. In particular, it is preferably administered to an animal in a state where it is desired to separate bone marrow-derived mesenchymal stem cells, osteoblasts, and the like. Examples of the state in which such cell differentiation is desired are the same as in the case of the hard tissue formation promoter.
  • the agent of the present invention when used as a reagent, its application target is not particularly limited, and examples thereof include tissues and cultured cells obtained by collecting vital force.
  • the GAG or a salt thereof which is an active ingredient of the agent of the present invention, is fixed on the surface of an appropriate insoluble carrier or mixed with an appropriate material to promote hard tissue formation. It may also be used as a material for the purpose of promoting cell differentiation or enhancing cell ALP activity.
  • insoluble carriers materials
  • Such insoluble carriers have various shapes including beads, films, plates, monofilaments, non-woven fabrics, sponges, woven fabrics, knitted fabrics, short fibers, tubes, hollow fibers, fibers, idroxypatites, etc.
  • it can be used as a medical composite material for implants, bone cements, bone fillers, root canal fillers, fracture plates, artificial joints, and the like.
  • the agent of the present invention is applied as a material in the field of regenerative medicine. Say it with a word.
  • the ST2 cell line, a mouse bone marrow-derived mesenchymal cell line, and the MC3T3-E1 cell line (both obtained from RIKEN CELL BANK), a mouse osteoblast-like cell line with a higher degree of differentiation, were used.
  • these cells were all cultured under conditions of 37 ° C and 5% CO. Also these
  • Antibiotics (final concentration 100 U / ml penicillin G, final concentration 100 g / ml streptomycin and final concentration 250 g / ml gentamicin) coexisted in the medium used for cell culture.
  • Hyaluronic acid with a weight average molecular weight of 60,000 (hyaluronic acid 60,000)
  • Hyaluronic acid with a weight average molecular weight of 350,000 (hyaluronic acid 350,000)
  • Hyaluronic acid with a weight average molecular weight of 1.5 million (hyaluronic acid 1.5 million)
  • Hyaluronic acid with a weight average molecular weight of 2.5 million (hyaluronic acid 2.5 million)
  • NSH the amino group at position 2 of the GlcN residue in Hep is sulfated, and the hydroxyl group at position 2 of the HexA residue and the hydroxyl group at position 6 of the GlcN residue do not retain a sulfate group
  • 6SH 6- O-sulfated Hep; 6-0- sulfated heparin; 6-position hydroxyl of GlcN residue The group is sulfated, and the hydroxyl group at position 2 of the HexA residue and the amino group at position 2 of the GlcN residue do not retain a sulfate group.
  • CDS skin sulfate
  • Hep, 2DSH, 6DSH and NDSH used here were analyzed by the "enzymatic disaccharide analysis method combining digestion with GAG degrading enzyme and high performance liquid chromatography" described in WO00 / 06608 ( table 1).
  • DiHS-OS is 2-acetamido-2-deoxy-4-0- (4-deoxy- ⁇ -L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)-D-glucose
  • ⁇ DiHS- NS is 2-deoxy-2-sulfamino-4-0- (4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enobilanosyluronic acid)-D-glucose
  • ⁇ DiHS-6S is 2-acetamido-2- Deoxy-4-0- (4-deoxy-a-L-threo-hex- 4-enopyranosyluronic acid) -6-0-sulfo-D-glucose
  • ⁇ Di HS-US is 2-acetamido -2-deoxy-4-0- (4-deoxy-2-0-sulfo-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)-D-glucose with ⁇ DiHS-di (6 ,
  • weight average molecular weights were measured by the method described in WO00 / 06608, they were Hep force S 14000, 2DSH force 12000, 6DSH force 12500, and NDSH force S 11000.
  • the FBS manufactured by EQUITECH-BIO was used.
  • Cellular ALP activity was measured as an indicator of cell sorting.
  • Cells were seeded on a 24-well culture plate at a rate of 5 ⁇ 10 3 cells / well, and the test sample was added to ⁇ MEM containing 2% FBS at a final concentration of 50 g / ml and cultured.
  • the ALP activity was also measured in the first week by the following enzymatic chemistry method (Bessey-Lowry method).
  • the cultured cells are washed with PBS, then disrupted for 40 seconds in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, 500 1) using an ultrasonic homogenizer (Handy Sonic model UR-20P; manufactured by Tommy Industries) and stirred. did. Next, add this sample solution 25 1 to 125 ⁇ 1 of ALP buffer (0.1 M carbonate buffer pH 9.8, 6.7 mM p-diphenyl phosphate, 2 mM MgCl 2) at 37 ° C for 30 minutes.
  • ALP buffer 0.1 M carbonate buffer pH 9.8, 6.7 mM p-diphenyl phosphate, 2 mM MgCl 2
  • the reaction was terminated by adding 125 ⁇ l of 0.2N NaOH, and the absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader (Model 550, Bio-Rad Laboratories). Calculated ALP activity is in units per cell. It showed in. In addition, a test sample was used as a control without adding a test sample.
  • Figure 1 shows the results of adding various test samples to the MC3T3-E1 cell line. Separately, test samples (Hep, 2DSH, 6DSH, or NDSH) were added to the MC3 T3-E1 cell line.
  • Fig. 2 shows the results, and
  • Fig. 3 shows the results of adding the test sample (Hep, 2DSH, 6DSH, or NDSH) to the ST2 cell line.
  • Hep, 2DSH, 6DSH and NDSH all enhanced the ALP activity of the MC3T3-El cell line.
  • Hep was shown to be particularly effective for enhancing ALP activity in the MC3T3-E1 cell line.
  • FIG. 4 shows the results of adding the test sample (Hep, 2DSH, 6DSH, or NDSH) to the MC3T3-E1 cell line, and the test sample (Hep, 2DSH, 6DSH, or NDSH) to the ST2 cell line. The results are shown in Fig. 5. The calculated ALP activity was expressed as a value per cell DNA weight.
  • Hep, 2DSH, 6DSH and NDSH all enhanced the ALP activity of the MC3T3-E1 cell line under serum-free conditions.
  • Hep, 2DSH and NDSH were shown to be particularly effective for enhancing ALP activity in the MC3T3-E1 cell line.
  • Hep, 2DSH, 6DSH and NDSH are all ST2 under serum-free conditions. ALP activity of the cell line was enhanced. In particular, 2DSH was shown to be particularly effective in enhancing ALP activity in the ST2 cell line.
  • Hep, 2DSH, 6DSH and NDSH all enhance the ALP activity of bone marrow-derived mesenchymal cells and osteoblasts under serum-free conditions.
  • Hep in which a sulfate group is held at two or more positions selected from the group consisting of 2-position, 6-position and N-position in Hep skeleton, has various factors contained in serum. This indicates that it acts on these cells directly without intervening to enhance ALP activity.
  • Hep, 2DSH and NDSH particularly effectively enhanced ALP activity of osteoblasts, and 2DSH particularly effectively enhanced ALP activity of bone marrow-derived mesenchymal cells.
  • alizarin staining (AL Z staining; stained red) in accordance with a conventional method one week after the cell reaches confluence Calcification was promoted so much).
  • the cells were washed with PBS, fixed with 10 neutral buffered formalin, and stained with 0.01 Alizarin Red S (Wako Pure Chemical Industries).
  • a hydroxyapatite block (size: length 3 mm x width 2 mm x height 2 mm; absorbs about 0.1 ml of solution) is immersed in a test sample with a concentration of 3 mg / ml for 30 minutes. Used for transplantation.
  • test sample containing no test sample and using PBS was used as a control.
  • 2DSH and NDSH are bone marrow-derived mesenchymal cells It has been shown to be particularly effective for increasing ALP activity in bone and osteoblasts and forming bone (hard tissue).
  • Purified water was added to the above ingredients to make an lg cream.
  • hydroxypropyl cellulose was granulated After a 30mg followed by kneading example mosquitoes ⁇ a solution in methanol (hydroxypropylcellulose 10 weight 0/0). This was extruded through a screen with a diameter of 0.8 mm to form granules, dried, and then added with 15 mg of magnesium stearate and tableted in 200 mg to obtain tablets.
  • (A) and (B) were used as one set to produce an injection for dissolution at the time of use.
  • (A) can be dissolved in (B) and used.
  • the agent of the present invention can be used as a drug or reagent for the purpose of promoting hard tissue formation, promoting cell differentiation, enhancing cellular ALP activity, and the like.
  • Fig. 1 is a graph showing enhancement of ALP activity in MC3T3-E1 cells.
  • FIG. 2 is a graph showing enhancement of ALP activity in MC3T3-E1 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing enhancement of ALP activity in ST2 cells.
  • FIG. 4 shows enhancement of ALP activity in MC3T3-E1 cells under serum-free conditions.
  • FIG. 5 is a graph showing enhancement of ALP activity in ST2 cells under serum-free conditions.
  • FIG. 6 is a diagram showing a ratio of an area of a portion where a bone (hard tissue) is formed.
  • FIG. 7 is a diagram showing the ratio of the area of a portion where a bone (hard tissue) is formed.
  • FIG. 8 is a graph showing the influence on the proliferation of MC3T3-E1 cells.

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Abstract

 本発明は、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進、細胞のアルカリフォスファターゼ活性の増強を惹起させる剤を提供する。具体的には、硫酸基を保持し、かつ、次の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする、硬組織形成促進剤、細胞の分化誘導剤及び細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤を提供する;(1)ヘキスロン酸残基とグルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、(2)前記(1)の基本骨格におけるヘキスロン酸残基の2位のヒロドキシル基、グルコサミン残基の6位のヒドロキシル基及びグルコサミン残基の2位のアミノ基のうちいずれか1つ以下の位置には硫酸基を保持していない。なおヘキスロン酸残基は、グルクロン酸残基又はイズロン酸残基であるものが好ましい。

Description

硬組織形成促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、グリコサミノダリカン又はその塩を含有する硬組織形成促進剤等に関す る。
背景技術
[0002] 本出願の出願書類では、以下の略号を使用する。
ALP:ァノレカリフォスファターゼ (alkaline phosphatase)
a MEM: a最 ,J、必須 ¾·地 (minimum essential medium alpha medium)
BMP一 2:骨誘導因子一 2 (bone morphogenetic protein- 2)
BSP:骨シァロプロテイン (bone sialoprotein)
COLI : I型コラーゲン(type I collagen)
FBS:ゥシ胎仔血清(fetal bovine serum)
GAG:グリコサミノグリカン (glycosaminoglycan)
GlcN:グノレコサミン (glucosamine)
GlcA:グノレクロン酸 (glucuronic acid)
Hep:へノヽジン (heparin)
HexA :へキスロン酸 (hexuronic acid)
HS:へパラン硫酸(heparan sulfate)
IdoA:ィズロン酸 (iduronic acid)
PCR:ポリメフーセ連鎖反 J心 ^polymerase chain reaction)
RT—PCR:逆転写 PCR (reverse transcription PCR)
2DSH : 2— O—脱硫酸化 Hep (2-0-desulfated heparin) (Hepにおける HexA残基 の 2位のヒロドキシル基が脱硫酸ィ匕されたもの)
6DSH : 6— 0—脱硫酸化 Hep (6-0-desulfated heparin) (Hepにおける GlcN残基 の 6位のヒロドキシル基が脱硫酸ィ匕されたもの)
NDSH : N—脱硫酸化 Hep (N- desulfated heparin) (Hepにおける GlcN残基の 2位 のァミノ基が脱硫酸ィ匕されたもの)
[0003] 以下、本発明の背景技術について説明する。
特許文献 1には、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨 格とする、硫酸基を有する GAGを有効成分として含有し、該 GAGが、 2位ヒドロキシ ル基が硫酸エステル化されて 、な 、HexA残基又は 2位ァミノ基がスルファミノ化さ れて ヽな ヽ GlcN残基を含むことを特徴とする細胞間連絡亢進剤が記載されて ヽる。
[0004] 特許文献 2には、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨 格とする、硫酸基を有する GAGを有効成分として含有し、該 GAGが、 6位ヒドロキシ ル基が硫酸エステル化されて ヽな ヽ Glc残基を含むことを特徴とする細胞間連絡抑 制剤が記載されている。
[0005] 特許文献 3には、ある種の脱硫酸ィ匕 Hepが開示されており、これを有効成分として 含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤や、これと塩基性繊維芽細胞増殖 因子とを含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進され た組成物が開示されて!ヽる。
[0006] 特許文献 4には、分子量が 20Kダルトンカゝら 40Kダルトンである骨誘導活性を有す るヒアルロン酸フラクションが開示されている。
[0007] 特許文献 1:特開 2003 - 113090号公報
特許文献 2:特開 2003— 119146号公報
特許文献 3 :国際公開第 96Z01278号パンフレット
特許文献 4:特許第 3333205号公報
[0008] しかし、硫酸基を保持し、 HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を 基本骨格とし、基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置に は硫酸基を保持して ヽな 、GAG又はその塩それ自体が、直接硬組織形成を促進し たり、細胞の分化を促進したり、細胞の ALP活性を増強したりする作用を有すること につ!/ヽては開示も示唆もな!/ヽ。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0009] 本発明は、細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進、細胞 の ALP活性の増強を惹起させる剤を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種の GAG又はその塩 力 細胞に直接的に作用して、硬組織形成の促進、細胞分化の促進及び細胞の AL
P活性の増強を惹起させることを見い出し、本発明を完成するに至った。
[0011] すなわち本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有する G
AG又はその塩を有効成分とする、硬組織形成剤(以下、「本発明形成促進剤」という
。)を提供する。
(1) HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
(2)前記(1)の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置に は硫酸基を保持していない。
[0012] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を 保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力 選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、硬組織は骨であることが好ましい。
[0013] また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする、細胞の分化促進剤(以下、「本発明分化促進剤」とい う。)を提供する。
(1) HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
(2)前記(1)の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置に は硫酸基を保持していない。
[0014] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を 保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力 選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞 であることが好ましい。
[0015] また本発明は、硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする、細胞の ALP活性増強剤 (以下、「本発明活性増強剤 」という。)を提供する。
(1) HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
(2)前記(1)の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置に は硫酸基を保持していない。
[0016] この HexA残基は、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好ましい。また硫酸基を 保持し、かつ、前記の特性を有する GAGとして、具体的には Hep、 Hepにおける He xA残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの、 Hepにおける GlcN 残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を保持して!/、な!/、もの及び Hepにおける GlcN 残基の 2位のアミノ基に硫酸基を保持していないものからなる群力 選ばれる 1又は 2 以上のものであることが好ましい。また、細胞は骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞 であることが好ましい。
[0017] 以下、本発明形成促進剤、本発明分化促進剤及び本発明活性増強剤を、まとめて 「本発明の剤」という。
発明の効果
[0018] 本発明の剤は、有効成分である GAGが、硬組織形成、細胞の分化促進又は細胞 の ALP活性増強に対して直接的に作用して優れた効果を発揮することから、極めて 有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
< 1 >本発明の剤の有効成分 本発明の剤は、硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有する GAG 又はその塩を有効成分とする。
(1) HexA残基と GlcN残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。
(2)前記(1)の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6 位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうちいずれ力 1つ以下の位置に は硫酸基を保持していない。
[0020] ここで HexA残基は特に限定されないが、 GlcA残基又は IdoA残基であることが好 ましい。そのなかでも、 GlcA残基は D— GlcA残基であることが好ましぐ IdoA残基 は L IdoA残基であることが好ましい。また、 GlcN残基も特に限定されないが D—G lcN残基であることが好まし 、。
また、 GlcN残基のアミノ基はァセチル化されていてもよい。この場合、 GlcN残基の 部分は N ァセチルダルコサミン(GlcNAc)となる。
[0021] 本発明の剤の有効成分である GAGは、このような HexA残基と GlcN残基とからな る二糖の繰り返し構造を基本骨格とする。すなわち、 HexA残基を「a」とし、 GlcN残 基を「b」とすると、本発明の剤の有効成分である GAGは、「a—b— a—b 」又 は「b— a— b— a 」と 、う基本骨格力もなる。なお「―」はグリコシド結合を示す。 aが GlcA残基であるときは、 aと bとの間のグリコシド結合 (a— b)は、 β 1→4結合であ ることが好ましい。また aが IdoA残基であるときは、 aと bとの間のグリコシド結合 (a— b )は α 1→4結合であることが好ましい。また bと aとの間のグリコシド結合 (b— a)は α 1 →4結合であることが好ま 、。
[0022] 本発明の剤の有効成分であるこのような GAGは、硫酸基を保持していることを特徴 とする。前記の基本骨格における硫酸基が保持されうる位置は特に限定されないが 、 HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残 基の 2位のアミノ基力 選ばれる 1つ以上の位置であることが好ましい。このような位 置に硫酸基が保持されている GAGとしては、例えば Hepや HSが例示される。
[0023] ただし、本発明の剤の有効成分とするためには、前記の基本骨格における HexA 残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2 位のアミノ基のうち、いずれか 1つ以下の位置には硫酸基を保持していないことが必 要である。したがって、本発明の剤の有効成分としては、例えば Hep (HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミ ノ基のいずれにも硫酸基が保持されている)、 2DSH、 6DSH、 NDSH等が例示され る。
[0024] なお、 GAGは多糖 (ポリマー)であり、ある GAGの画分中に存在する全ての GAG 分子のサイズ、構成糖の組成や配列、硫酸基の位置、硫酸基の数等が完全に同一 であることが実質的にありえないことは、当技術分野の技術常識であることは言うまで もない。また、例えばこのような GAGにおいて「HexA残基の 2位のヒロドキシル基に は硫酸基を保持していない」と言った場合、「GAG分子中の全ての HexA残基の 2 位のヒロドキシル基が完全に硫酸基を保持して 、な 、」 t 、うことを意味するものでは なぐ「GAG分子中の大部分の HexA残基の 2位のヒロドキシル基が硫酸基を保持し て!、なければ足り、若干の HexA残基の 2位のヒロドキシル基に硫酸基が保持されて V、るものを排除するものではな 、」 t 、うことを意味することも、同様に当技術分野の 技術常識である。したがって本出願書類におけるこれらの記載も、このような当技術 分野における技術常識に従って解釈された 、。
[0025] 前記の基本骨格における HexA残基の 2位のヒロドキシル基、 GlcN残基の 6位のヒ ドロキシル基及び GlcN残基の 2位のアミノ基のうち、いずれ力 1つ以下の位置には硫 酸基を保持して 、な 、ことが必要である。
[0026] 本発明の剤の有効成分である GAGの由来も特に限定されず、天然物をそのまま 用いてもよぐ天然物を化学的手法、酵素的手法その他の手法によって加工したもの を用いてもよぐ化学的に合成したものを用いてもょ 、。
[0027] 例えば、本発明の剤の有効成分として Hepを用いる場合には、天然物等から公知 の方法で取得された Hepをそのまま用いてもよぐ既に医薬品や試薬として販売され ている Hepを用いても良い。また、公知の化学的手法、酵素的手法その他の手法に よって HSの硫酸ィ匕の度合いを増加させ、 Hepと同程度としたものを用いてもよい。本 願の出願書類における「Hep」の用語には、純然たる Hepのみならず、このように He pと実質的に同一の物と認識されるものも包含される。
[0028] また、例えば本発明の剤の有効成分として 2DSH、 6DSH又は NDSHを用いる場 合にも、前記の特許文献 1や特許文献 2に記載されている方法によって製造すること ができる。
[0029] 本発明の剤の有効成分とすることができる GAGのサイズ (重量平均分子量)は、当 技術分野における当業者にぉ 、て「多糖」として認識されるものである限りにお 、て 特に限定されないが、例えば重量平均分子量が 5000〜20000程度のものが好まし く、 10000〜15000程度のものカょり好ましぃ。なお重量平均分子量は、 WOOO/ 06608に記載された方法に従って測定することができる。
[0030] また、本発明の剤の有効成分とする GAGの純度も特に限定されず、本発明の剤を 適用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。
例えば、生体内の組織や、無菌条件下で培養された細胞等、高度の無菌性や清 浄性等が求められる対象に本発明の剤を適用する場合には、高純度に精製され、医 学的や培養学的に許容されない物質 (例えばエンドトキシンや微生物等)を実質的 に含有しないものを用いることが望ましい。また、それほどの無菌性や清浄性等が求 められていない対象に本発明の剤を適用する場合には、その場面や目的に応じて、 適宜精製度を低減させてもょ ヽ。
[0031] また「GAGの塩」についても特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的 等に応じて適宜選定することができる。例えば、生体内の組織に適用する場合には、 医学的に許容される塩を選定すればよい。 GAGの塩としては、例えばアルカリ金属 塩 (ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等)、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩等 の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロへキシルァミン塩、アミノ酸塩 等の有機塩基との塩等が例示される。なかでもナトリウム塩が好ましい。
[0032] 本発明の剤は、 1種類の前記 GAG又はその塩のみを有効成分として含有していて もよぐ複数種類の前記 GAG又はその塩を有効成分として含有して 、てもよ 、。 このような GAG又はその塩を用いることにより、極めて優れた効果を有する本発明 形成促進剤、本発明分化促進剤、本発明活性増強剤とすることができる。
[0033] < 2>本発明の剤の剤形等
本発明の剤の剤形等は、前記の GAG又はその塩を含有しており、かっこれによる 硬組織形成の促進作用や、細胞の分化促進作用や、細胞の ALP活性増強作用が 発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明の剤を適用する場面や目的等に応 じて適宜選定することができる。
[0034] 例えば本発明の剤を、前記の GAG又はその塩を含有する溶液状態の剤としてもよ ぐ粉末、顆粒その他の固形剤等としても良い。また、例えば溶液状態の剤として提 供する場合には、凍結状態で提供してもよぐ溶液のまま提供してもよぐ用時溶解 用の剤等として提供してもよい。
[0035] 本発明の剤中の前記 GAG又はその塩の濃度も特に限定されず、本発明の剤を適 用する場面や目的等に応じて適宜選定することができる。
[0036] 本発明の剤の製剤化は、公知の方法により行うことができる。また製剤化にあたり、 前記の GAG又はその塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない 限りにおいて、他の薬物除去成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、 等張化剤、矯味剤、保存剤、 pH調整剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢 剤、崩壊剤等の他の成分を配合することができる。
[0037] < 3 >本発明の剤の用途、使用方法等
本発明の剤は、硬組織形成の促進剤、細胞の分化促進剤又は細胞の ALP活性増 強剤とすることができる。硬組織形成の促進剤 (本発明形成促進剤)とする場合、そ の「硬組織」は骨であることが好ま ヽ。なお「硬組織形成の促進」には、石灰化の促 進の意義も包含される。また細胞の分化促進剤 (本発明分化促進剤)や細胞の ALP 活性増強剤 (本発明活性増強剤)とする場合、その「細胞」は骨髄由来間葉系細胞 又は骨芽細胞であることが好ましい。また本発明の剤は、これらの用途の 1つを目的 とする 1つの剤としてもよぐこれらの複数の用途を目的とする 1つの剤としてもよい。
[0038] 本発明の剤は、その有効成分である前記の GAG又はその塩の分子と、適用される 対象となる生体組織や細胞等が接触する状態となる限りにお ヽて、その投与や適用 の方法は限定されない。
[0039] 本発明の剤は、例えば硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞の ALP活 性増強を目的とする医薬や試薬等として利用することができる。本発明の剤を医薬と する場合、その投与量は、投与の目的 (予防、維持 (悪化防止)、軽減 (症状の改善)ま たは治療)、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、体重、投与部位、投与方法等に よって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人 1人 1回あたり概ね 、前記の GAG又はその塩として 0. 03mg/投与部位〜 3mg/投与部位程度を投与 することができる。
[0040] 本発明の剤を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎 動物が好ましぐ哺乳動物がより好ましぐヒトが特に好ましい。この場合、それぞれの 用途に応じて、例えば以下のような動物に投与することができる。
[0041] 硬組織形成促進剤として用いる場合には、硬組織の形成の促進が望まれて!/ヽる状 態にある動物に対して投与することができる。このような状態としては、例えば骨折、 骨欠損、骨粗鬆症等に罹患している場合や、歯科治療、整形外科治療、骨補填等 が施された直後の状態等が例示される。
[0042] 細胞の分化促進剤として用いる場合には、細胞の分ィ匕が望まれている状態にある 動物に対して投与することができる。特に、骨髄由来間葉系幹細胞や骨芽細胞等の 分ィ匕が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の 分化が望まれている状態の例示は、前記の硬組織形成促進剤における場合と同様 である。
[0043] 細胞の ALP活性増強剤として用いる場合には、細胞の ALP活性の増強が望まれ ている状態にある動物に対して投与することができる。このような状態の例示は、前記 における硬組織形成促進剤や細胞の分化促進剤における場合と同様である。
[0044] 例えば本発明の剤を試薬とする場合、その適用対象も特に限定されないが、例え ば生体力 採取された組織や培養細胞等を例示することができる。
[0045] また、本発明の剤の有効成分である前記の GAG又はその塩を、適当な不溶性担 体の表面に固着させたり、適当な素材と混合したりすることによって、硬組織形成の 促進や、細胞の分化の促進や、細胞の ALP活性の増強等を目的とする素材としても よい。このような不溶性担体 (素材)としては、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメ ント、不織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸、ノ、イドロキシァパタ イト等をはじめとする種々の形状のものを使用できる。具体的には、医用複合材料と してインプラント、骨セメント、骨補填剤、根管充填剤、骨折プレート、人工関節等に 用いることができる。また本発明の剤は、再生医療分野における素材として応用する ことちでさる。
実施例
[0046] 以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
< 1 >材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
1.細胞株
マウス骨髄由来間葉系細胞株である ST2細胞株と、より分ィ匕度の高いマウス骨芽細 胞様細胞株である MC3T3-E1細胞株(いずれも RIKEN CELL BANKより入手)を用い た。以下、これらの細胞の培養は全て 37°C、 5% CO条件下で行った。またこれらの
2
細胞の培養に用いる培地には、全て抗生物質 (終濃度 100 U/mlペニシリン G、終濃 度 100 g/mlストレプトマイシン及び終濃度 250 g/mlゲンタマイシン)を共存させ た。
[0047] 2.被験サンプル
被験サンプルとして以下のものを用いた。サンプルは全て生化学工業株式会社より 提供されたものを用いた。なお括弧内の記号は、図 1中に示す記号を意味する。 •重量平均分子量 1万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 1万)
•重量平均分子量 6万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 6万)
•重量平均分子量 35万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 35万)
•重量平均分子量 100万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 100万)
•重量平均分子量 150万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 150万)
•重量平均分子量 250万のヒアルロン酸(ヒアルロン酸 250万)
•Hep
•2DSH
•6DSH
•NDSH
•NSH (Hepにおける GlcN残基の 2位のアミノ基が硫酸化され、 HexA残基の 2位の ヒロドキシル基と GlcN残基の 6位のヒドロキシル基には硫酸基を保持しないもの) • 6SH (6— O—硫酸化 Hep; 6-0- sulfated heparin; GlcN残基の 6位のヒドロキシル 基が硫酸化され、 HexA残基の 2位のヒロドキシル基と GlcN残基の 2位のアミノ基に は硫酸基を保持しないもの)
• 2SH (2-0-硫酸化 Hep; 2-0- sulfated heparin; Hepにおける HexA残基の 2位 のヒロドキシル基が硫酸化され、 GlcN残基の 6位のヒドロキシル基と GlcN残基の 2位 のァミノ基には硫酸基を保持しな 、もの)
• DSH (脱硫酸化 Hep; desulfated heparin; Hepを完全に脱硫酸化したもの)
• NAH (N -ァセチノレへパロザン; N- Acetyl heparosan)
•CDS (デルマタン硫酸; dermatan sulfate)
• 60SCDS (デルマタン硫酸におけるガラクトサミン残基の 6位を硫酸ィ匕したもの) [0048] これらの糖は、全て生化学工業株式会社より入手可能である。 Hepは同社から試 薬として販売されているものを用いた。なお 2DSH、 6DSH及び NDSHは、 Hepを 原料として、特開 2003— 113090号公報及び特開 2003— 119146号公報に記載 された方法に従って製造されたものである。
[0049] ここで用いた Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHを、 WO00/06608に記載された「G AG分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖 分析法」により分析した (表 1)。表中 A DiHS- OSは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4 -デォキシ- α - L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS- N Sは 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- a - L- threo- hex- 4-エノビラノシル ゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS- 6Sは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4-デォキ シ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースを、 Δ Di HS- USは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ- a -L- threo- he x-4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ DiHS-di(6,N)Sは 2-デォキシ -2-ス ルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スル ホ- D-グルコースを、 Δ DiHS- di(U,N)Sは 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキ シ- 2-0-スルホ- a -L- threo- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- D-グルコースを、 Δ Di HS- di(U,6)Sは 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4- 0- (4-デォキシ- 2- 0-スルホ - α - L- thre o- hex- 4-エノピラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースを、 Δ DiHS- tri(U,6,N)S は 2-デォキシ -2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ- α - L-threo- hex-4-ェ ノビラノシルゥロン酸)- 6-0-スルホ -D-グルコースをそれぞれ示す,
[0050] [表 1]
Figure imgf000013_0001
[0051] またこれらの重量平均分子量を WO00/06608に記載された方法により測定したとこ ろ、 Hep力 S 14000、 2DSH力 12000、 6DSH力 12500、 NDSH力 S 11000であった
[0052] 3.その他の試薬
FBSは、 EQUITECH- BIO社製のものを用いた。
[0053] < 2 >方法と結果
1.細胞分化に対する作用(1)
細胞の分ィ匕の指標として、細胞の ALP活性を測定した。 24ゥエルの培養プレートに 、 5 X 103細胞/ゥエルの割合で細胞を播種し、 2% FBSを含有する α MEMに被験サ ンプルをを終濃度 50 g/mlで添加して培養した。細胞がコンフルェントに達した時点 力も 1週間目に以下の酵素化学的方法 (Bessey-Lowry法)によって ALP活性を測定 した。
[0054] (ALP活性の測定方法)
培養細胞を PBSで洗浄後、超音波ホモジナイザー(Handy Sonic model UR-20P;ト ミー工業製)を用いて 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4、 500 1)中で 40秒間細胞を破 砕し撹拌した。次いで、このサンプル液 25 1を ALP緩衝液 (0.1M炭酸塩緩衝液 pH 9.8、 6.7mM p—二トロフエ-ルホスフェート、 2mM MgCl ) 125 μ 1に添加し、 37°Cで 30分
2
間インキュベートした. 0.2N NaOHを 125 μ 1を添加することによって反応を終了させた 後、マイクロプレートリーダー(Model 550, Bio- Rad Laboratories製)を用いて 405nm における吸光度を測定した。算出された ALP活性は、細胞数あたりの単位 (ユニット) で示した。また被験サンプルを添カ卩しな 、ものをコントロールとした。
[0055] MC3T3-E1細胞株に対して各種被験サンプルを添カ卩した結果を図 1に、別途 MC3 T3-E1細胞株に対して被験サンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カロし た結果を図 2に、 ST2細胞株に対して被験サンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は ND SH)を添カ卩した結果を図 3にそれぞれ示す。
[0056] 図 1及び図 2より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも MC3T3- El細胞 株の ALP活性を増強させた。なかでも、 Hepは、 MC3T3-E1細胞株の ALP活性の増 強に対して特に有効であることが示された。
[0057] また図 3より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも ST2細胞株の ALP活 性を増強させた。なかでも NDSHは、 ST2細胞株の ALP活性の増強に対して特に有 効であることが示された。
[0058] これらの結果から、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも骨髄由来間葉 系細胞及び骨芽細胞の ALP活性を増強させることが示された。このことは、 Hep骨格 中にお 、て 2位、 6位及び N位力 なる群力 選択される 、ずれか 2つ以上の位置に 硫酸基が保持されて 、ることが、これらの細胞の ALP活性の増強に必要であることを 示すものである。
[0059] なかでも Hepは骨芽細胞の ALP活性を特に効果的に増強させ、 NDSHは骨髄由 来間葉系細胞の ALP活性を特に効果的に増強させることが示された。
[0060] 2.細胞分化に対する作用(2)
前記の「細胞分化に対する作用(1)」における培地を、血清を含有しな!、培地 (無 血清培地)に換えて同様に ALP活性を測定した。 MC3T3-E1細胞株に対して被験サ ンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カ卩した結果を図 4に、 ST2細胞株に 対して被験サンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を添カ卩した結果を図 5にそ れぞれ示す。なお算出された ALP活性は、細胞の DNA重量あたりの数値で示した。
[0061] 図 4より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下で MC3T3- E1細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも、 Hep、 2DSH及び NDSHは、 MC3T3 -E1細胞株の ALP活性の増強に対して特に有効であることが示された。
また図 5より、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下で ST2 細胞株の ALP活性を増強させた。なかでも 2DSHは、 ST2細胞株の ALP活性の増強 に対して特に有効であることが示された。
[0062] これらの結果から、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、いずれも無血清条件下 で骨髄由来間葉系細胞及び骨芽細胞の ALP活性を増強させることが示された。この ことは、 Hep骨格中において 2位、 6位及び N位からなる群から選択されるいずれ力 2 つ以上の位置に硫酸基が保持されている Hepは、血清中に含まれる種々の因子を 介さずに直接これらの細胞に作用して、 ALP活性を増強させる作用を有していること を示すものである。
[0063] なかでも Hep、 2DSH及び NDSHは骨芽細胞の ALP活性を特に効果的に増強さ せ、 2DSHは骨髄由来間葉系細胞の ALP活性を特に効果的に増強させることが示さ れた。
[0064] 3.細胞分化に対する作用(3)
前記の「細胞分化に対する作用(1)」において、被験サンプルの添加後 1週間目及 び 2週間目にそれぞれ細胞を回収して全 RNAを抽出し、 COLI、 ALP、ォステオカル シン(osteocalcin)、: BSP、及び BMP— 2のmRNAの発現をRT—PCRで解析した。
[0065] その結果、 ST2細胞株では、 RT-PCRによる解析によっても ALP mRNAの高 、誘導 が確認された。 MC3T3- E1細胞株では、 ALPに加えて COLI及び BSP mRNAの発 現の誘導も観察された。
[0066] 4.細胞分化に対する作用(4)
細胞の石灰化能を検討するため、前記の「細胞分化に対する作用(1)」において、 細胞がコンフルェントに達した時点から 1週間目に、常法に従ってァリザリン染色 (AL Z staining;赤く染色されるほど石灰化が促進されている)を行った。細胞を PBSで洗 浄後、 10中性緩衝ホルマリンにて固定し、 0.01ァリザリンレッド S (和光純薬)にて染色 した。
[0067] その結果、 Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHは、 ST2細胞株及び MC3T3-E1細胞 株のいずれに対しても石灰化物の形成を促進した。特に ST2細胞株では、 Hep, 2D SH及び NDSHが強!、促進を示した。
[0068] 5.細胞分化に対する作用(5) 8週齢の Wistar系ラットを、体重 100g当たり 0.5ml量の力ルバミル酸ェチル 20溶液 で全身麻酔した後、前頭部の皮膚及び骨膜を切開し、頭蓋骨膜下に、 PBSで濃度 3 mg/mlに希釈した被験サンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH ;それぞれ 100 1)を移植した。その際、ハイドロキシアパタイトを担体として用いた。
[0069] 具体的には、濃度 3mg/mlの被験サンプルにハイドロキシアパタイトのブロック(サイ ズ:縦 3mm X横 2mm x高さ 2mm;約 0.1mlの溶液を吸収する)を 30分間浸し、これを 移植に用いた。
被験サンプルを含有しな 、PBSを用いたものをコントロールとした。
[0070] 被験サンプルの移植後 4週間目と 8週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成し、 へマトキシリンーェォシン染色 (HE染色)して光学顕微鏡で観察することにより、硬組 織 (骨)の形成の程度を評価した。
[0071] その結果、コントロール群では血管や線維性結合組織のみが観察され、骨形成は 観察されなかった。一方、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、いずれ も骨形成が観察された。なかでも 2DSH群では、顕著な骨の形成が認められた。
[0072] 6.細胞分化に対する作用(6)
前記の「5.細胞分化に対する作用(5)」と同様に被験サンプルを移植後、 4週間目 と 6週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した (各群とも n= 2)。当該切片の画 像中に観察されるハイドロキシアパタイト領域の面積に対する、形成された骨 (硬組 織)の面積の割合を画像解析ソフト(Scion image; Scion Corporation)を用いて解析し た。結果を図 6に示す。なお図 6中の灰色の棒は 4週間目における結果を、黒色の棒 は 6週間目における結果をそれぞれ示す。
[0073] 図 6より、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、 4週間目及び 6週間目 ともに広い範囲で骨 (硬組織)の形成が認められた力、コントロール群においてはほと んど認められないことが示された。なかでも、 2DSHと NDSHにおいてその効果が顕 著であった。
[0074] 7.細胞分化に対する作用(7)
前記の「5.細胞分化に対する作用(5)」と同様に被験サンプルを移植後、 4週間目 、 8週間目及び 12週間目に屠殺して、移植部分の切片を作成した (各群とも n= 5)。 移植領域の切片画像中に観察される全組織の面積に対する、骨組織の面積の割合 を、画像解析ソフト(Scion image ; Scion Corporation)を用いて解析した。結果を図 7 に示す。なお図 7中の各週における棒は、いずれも左からコントロール群、 2DSH群 、 6DSH群、 NDSH群、 Hep群における結果をそれぞれ示す。
[0075] 図 7より、 Hep群、 2DSH群、 6DSH群又は NDSH群では、 4週間目、 8週間目及 び 12週間目の 、ずれにお 、ても広 、範囲で骨 (硬組織)の形成が認められた力 コ ントロール群においてはほとんど認められないことが示された。なかでも、 2DSH、 He p及び NDSHにおいてその効果が顕著であった。これらの結果は、別個独立に行つ た「5.細胞分ィ匕に対する作用(5)」及び「6.細胞分ィ匕に対する作用(6)」の結果とも 整合することから、再現性あるものであることが示された。
[0076] 8.細胞増殖に対する作用
24ゥエルの培養プレート(FALCON社製)に、細胞を 5 X 103細胞/ゥエルの割合で 播種した。播種後 1日目力ら、被験サンプル(Hep、 2DSH、 6DSH又は NDSH)を 終濃度 50 g/mlで培養液 (2% FBSを含有する α ΜΕΜ)に添加した。被験サンプル を添カロして力ら 0日目、 1日目、 3日目及び 6日目に、コーノレターカウンター (COULT ER Zl, Coulter Electronics社製)を用いて細胞数を計測した。被験サンプルを添カロ しないものをコントロールとした。 MC3T3-E1細胞株の結果を図 8に、 ST2細胞株の結 果を図 9に示す。図 8及び図 9における横軸は被験サンプル添加後の日数を、縦軸 は細胞数を示す。
[0077] 図 8より、いずれの被験サンプルも MC3T3-E1細胞株の増殖を抑制した力 2DSH 、 6DSH及び NDSHの増殖抑制効果は、いずれも Hepに比して小さかった。また図 9より、 2DSHは ST2細胞株の増殖を促進した力 Hepは逆に抑制した。
[0078] この結果から、 2DSHは、骨髄由来間葉系細胞の増殖を促進する効果を発揮する ことが示された。また、 Hepは骨髄由来間葉系細胞の増殖を抑制する効果を発揮す ることが示された。
[0079] また Hep、 2DSH、 6DSH及び NDSHのいずれも、骨芽細胞の増殖を抑制する効 果を発揮することが示された。
[0080] 以上の結果を総合的に勘案すると、 2DSH及び NDSHは、骨髄由来間葉系細胞 や骨芽細胞における ALP活性の増加や、骨 (硬組織)の形成に対して特に有効であ ることが示された。
[0081] 9.製剤例
以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の 剤形がこれらに限定されるものではない。
[0082] (1)軟膏剤
Hep 1 Omg
モノステアリン酸ソルビタン 7mg
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 7mg
パルミチン酸イソプロピル 37mg
ワセリン 37mg
流動パラフィン 37mg
セタノーノレ 50mg
グリセリン 70mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
上記成分に精製水を加えて、 lgのクリームとした。
[0083] (2)錠剤
2DSH lOOmg
乳糖 670mg
バレイショデンプン 150mg
結晶セ /レロース 60mg
軽質無水ケィ酸 50mg
上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを 30mgをメタノールに溶解した 溶液(ヒドロキシプロピルセルロース 10重量0 /0)をカ卩えて混練したのち造粒した。これ を径 0. 8mmのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネ シゥム 15mgを加え 200mgづっ打錠して錠剤を得た。
[0084] (3)カプセル剤
6DSH lOOmg 乳糖 80mg
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
[0085] (4)注射剤
NDSH 30mg
上記成分を 5%マン-トール水溶液 2mLに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプ ルに入れて密封した。
[0086] (5)用時溶解用注射剤
(A) 2DSH (凍結乾燥体) 30mg (アンプル封入した)
(B)無菌濾過した PBS 2mL (アンプル封入した)
上記 (A)および (B)を 1セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には (A) を (B)で溶解して用いることができる。
[0087] なお本発明の剤の有効成分は、前記の薬効薬理試験において細胞や動物の状態 を毎日観察したが、特段の変化は認められな力つた。これらのことから、本発明の剤 の安全性が十分に推定される。
[0088] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲 を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明ら かである。
本出願は、 2005年 3月 14日出願の日本特許出願(特願 2005-071023)及び 2005年 6月 16日出願の日本特許出願(特願 2005-176311)に基づくものであり、その内容は ここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込ま れる。
産業上の利用可能性
[0089] 本発明の剤は、硬組織形成の促進や、細胞の分化促進や、細胞の ALP活性増強な どを目的とする医薬や試薬などとして利用することができる。
図面の簡単な説明
[0090] [図 1]MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である。
[図 2]MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である。
[図 3]ST2細胞における ALP活性の増強を示す図である。 [図 4]無血清条件下での、 MC3T3-E1細胞における ALP活性の増強を示す図である
[図 5]無血清条件下での、 ST2細胞における ALP活性の増強を示す図である。 圆 6]骨 (硬組織)が形成された部分の面積の割合を示す図である。
[図 7]骨 (硬組織)が形成された部分の面積の割合を示す図である。
[図 8]MC3T3-E1細胞の増殖に対する影響を示す図である。
圆 9]ST2細胞の増殖に対する影響を示す図である。

Claims

請求の範囲 [1] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩を有効成分とする、硬組織形成促進剤。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
[2] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 1に記 載の硬組織形成促進剤。
[3] 硫酸基を保持し、かつ、前記(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へ ノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持し ていないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を 保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸 基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 1 又は 2に記載の硬組織形成促進剤。
[4] 硬組織が、骨である、請求項 1〜3の!ヽずれか 1項に記載の硬組織形成促進剤。
[5] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩を有効成分とする、細胞の分化促進剤。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
[6] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 5に記 載の分化促進剤。
[7] 硫酸基を保持し、かつ、前記(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へ ノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持し ていないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を 保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸 基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 5 又は 6に記載の分化促進剤。
[8] 細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項 5〜7のいずれか 1項 に記載の分化促進剤。
[9] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩を有効成分とする、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
[10] へキスロン酸残基が、グルクロン酸残基又はィズロン酸残基である、請求項 9に記 載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
[11] 硫酸基を保持し、かつ、前記(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカンが、へ ノ《リン、へパリンにおけるへキスロン酸残基の 2位のヒドロキシル基に硫酸基を保持し ていないもの、へパリンにおけるダルコサミン残基の 6位のヒドロキシル基に硫酸基を 保持していないもの及びへパリンにおけるダルコサミン残基の 2位のアミノ基に硫酸 基を保持していないもの力もなる群力も選ばれる 1又は 2以上のものである、請求項 9 又は 10に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
[12] 細胞が、骨髄由来間葉系細胞又は骨芽細胞である、請求項 9〜11のいずれか 1項 に記載のアルカリフォスファターゼ活性増強剤。
[13] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩の、硬組織形成促進剤の製造のための使用。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
[14] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩の、細胞の分化促進剤の製造のための使用。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
[15] 硫酸基を保持し、かつ、以下の(1)及び(2)の特性を有するグリコサミノダリカン又 はその塩の、細胞のアルカリフォスファターゼ活性増強剤の製造のための使用。
(1)へキスロン酸残基とダルコサミン残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格と する。
(2)前記(1)の基本骨格におけるへキスロン酸残基の 2位のヒロドキシル基、ダルコサ ミン残基の 6位のヒドロキシル基及びダルコサミン残基の 2位のアミノ基のうちいずれ 力 1つ以下の位置には硫酸基を保持して ヽな 、。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016520697A (ja) * 2013-05-16 2016-07-14 エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ ヘパラン硫酸

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2327480B1 (es) * 2007-06-15 2010-08-10 Bioiberica, S.A. "disacaridos para el tratamiento de tendones, ligamentos y huesos".
WO2017027474A1 (en) * 2015-08-10 2017-02-16 The Trustees Of Princetion University Nano-encapsulation using gras materials and applications thereof
TWI769176B (zh) * 2016-09-07 2022-07-01 瑞瑟勒綜合技術協會 生合成肝素

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10231251A (ja) * 1997-02-21 1998-09-02 Sunstar Inc 歯周組織再生促進薬
JP2000212204A (ja) * 1999-01-28 2000-08-02 Tokyo Ika Shika Univ 骨誘導促進剤
JP2003527109A (ja) * 2000-01-31 2003-09-16 ミューニン コーポレイション ヒトcyr61
JP2004505124A (ja) * 2000-07-31 2004-02-19 バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ,インク. 生物活性被覆組成物と方法
JP2004210715A (ja) * 2002-12-27 2004-07-29 Seikagaku Kogyo Co Ltd 破骨細胞形成抑制剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU218600B (hu) * 1994-07-01 2000-10-28 Seikagaku Corporation Eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, deszulfatált heparin alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására
JP4035629B2 (ja) * 2001-10-09 2008-01-23 生化学工業株式会社 ギャップ機能抑制剤
JP4035628B2 (ja) * 2001-10-09 2008-01-23 生化学工業株式会社 ギャップ機能亢進剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10231251A (ja) * 1997-02-21 1998-09-02 Sunstar Inc 歯周組織再生促進薬
JP2000212204A (ja) * 1999-01-28 2000-08-02 Tokyo Ika Shika Univ 骨誘導促進剤
JP2003527109A (ja) * 2000-01-31 2003-09-16 ミューニン コーポレイション ヒトcyr61
JP2004505124A (ja) * 2000-07-31 2004-02-19 バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ,インク. 生物活性被覆組成物と方法
JP2004210715A (ja) * 2002-12-27 2004-07-29 Seikagaku Kogyo Co Ltd 破骨細胞形成抑制剤

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIYOSHI A. ET AL.: "Heparin ni yoru Hakotsusaibo no Bunka oyobi Kotsukyushu Kassei no Seigyo Kiko", J.ORAL.BIOSCI., vol. 46, no. 5, 2004, pages 465, XP003005801 *
BLANQUAERT F. ET AL.: "Effects of heparin-like polymers associated with growth factors on asteoblast proliferation and phenotype expression", J.BIORMED.MATER.RES., vol. 44, 1999, pages 63 - 72, XP003005696 *
HAMADA C. ET AL.: "Lipopolysaccharide (LPS) to Heparin no Kotsukuyshu Sayo ni okeru Cytokine no Kan'yo", JUNTENDO MEDICAL JOURNAL, vol. 40, no. 1, 1994, pages 52 - 60, XP003005802 *
HURLEY M.M. ET AL.: "Expression and Regulation of Basic Fibroblast Growth Factor mRNA Levels in Mouse Osteoblastic M3T3-E1 Cells", J.BIOL.CHEM., vol. 269, no. 12, 1994, pages 9392 - 9396, XP003005803 *
IRIE A. ET AL.: "Heparan Ryusan wa Kotsukeisei Inshi Signal ni Juyo de aru", NIPPON YAKUGAKKAI NENKAI KOEN YOSHISHU, vol. 125, no. 3, 5 March 2005 (2005-03-05), pages 20, XP003005699 *
ISHIGURO M. ET AL.: "Rat Togaikan Yurai Kotsugasaibo no ALPase Kassei o Sokushin suru Ryusanka Hyaluronic Acid no Koka", FIBER, vol. 61, no. 4, 10 April 2005 (2005-04-10), pages 98 - 102, XP003005698 *
KOIKE T.: "Heparin wa in vivo ni okeru BMP-2 no Kotsuyudo Kassei o Sokushin suru", THE JAPANESE SOCIETY FOR BONE AND MINERAL RESEARCH PROGRAM SHOROKUSHU 22ND, 2004, pages 163, XP003005692 *
ONO M. ET AL.: "Acceleration of Adipose Conversion of 3T3-Li Cells by Dextran Sulfate", BIOSCI.BIOTECH.BIOCHEM., vol. 58, no. 5, 1994, pages 934 - 935, XP003005695 *
OSIP S.L. ET AL.: "Differential effects of heparin and low molecular weight heparin on osteblastogenesis and adipogenesis in vitro", THROMB.HAEMOST., vol. 92, 2004, pages 803 - 810, XP003005694 *
SAITO A. ET AL.: "Kotsugasaibo no Zoshoku, Bunka ni Oyobosu Heparin Oyobi sono Yudotai no Eikyo", NIPPON SHISHUBYO GAKKAI GAKUJUTSU TAIKAI PROGRAM OYOBI KOEN SHOROKUSHU, vol. 48, 25 March 2005 (2005-03-25), pages 116, XP003005690 *
SAKAMOTO S. ET AL.: "MINERALIZATION INDUCES BY BETA-GLYCEROPHOSPHATE IN CULTURES LEADS TO A MARKED INCREASE IN COLLAGENASE SYNTHESIS BY MOUSE OSTEOGENIC M3T3-E1 CELLS UNDER SUBSEQUENT STIMULATION WITH HEPARIN", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 162, no. 2, 1989, pages 773 - 780, XP003005805 *
SATO S. ET AL.: "FGF2, heparin dexamethasone, bisphosphonate ni yoru Rat Hakotsusaibo no Bunka Kasseika no Seigyo", NISSHI HOZONSHI, vol. 45, no. 2, 2002, pages 253 - 272, XP003005693 *
See also references of EP1859803A4 *
SHIBA A.: "Kisoteki (Shorai) Seikagakuteki Kanten ni Tatta Kotsukyushu to Kotsukeisei (Alkaline Phosphatase o Chushin ni)", THE JOURNAL OF DENTAL MEDICINE, vol. 20, no. 5, 1984, pages 753 - 759, XP003005806 *
TAKADA T. ET AL.: "BMP no Kassei wa Heparin ni yotto Sokushin Sareru", NIPPON SHISHUBYO GAKKAI GAKUJUTSU TAIKAI PROGRAM OYOBI KOEN SHOROKUSHU, vol. 47, 2004, pages 130, XP003005691 *
TAKADA T. ET AL.: "Sulfated Polysaccharides Enhance the Biological Activities of Bone Morphogenetic Proteins", J.BIOL.CHEM., vol. 278, no. 44, 2003, pages 43229 - 43235, XP002401563 *
TSUBOI R. ET AL.: "Sen'igasaibo Zoshoku Inshi (Herparin Ketsugosei Seicho Inshi)", CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 22, no. 10, 1990, pages 1537 - 1543, XP003005804 *
TSUCHIYA T. ET AL.: "Seitai Tekigosei Kinosei ni Sugureta Zairyo to Gijutsu Hyoka no Kaihatsu ni Kansuru Kenkyu", SOYAKU TO HUMAN SCIENCE KENKYU JUTEN KENKYU HOKOKUSHO, HEISEI 15 NENDO, DAI 6 BUN'YA, IYO ZAIRYO OYOBI SEIZAI SEKKEI GIJUTSU NO KAIHATSU NI KANSURU KENKYU, pages 20 - 28, XP003005700 *
WATANABE S. ET AL.: "Kotsugasaiboyo Baiyo Saibo ni Taisuru Heparin Tenka no Eikyo", JINZO, vol. 21, no. 3, 1998, pages 157 - 160, XP003005697 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016520697A (ja) * 2013-05-16 2016-07-14 エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ ヘパラン硫酸

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